CN114931150B - 一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，包括如下步骤（1）制备棘孢木霉孢子液；（2）于8月下旬进行接菌处理，每隔10天施用1次，共施用3次。采用环施法，施用位置为在距离根基部约4‑8倍地径的圆圈内，将发酵液均匀灌根。（3）10月下旬采集树叶。本发明的优点在于：本发明通过对生长旺盛的青钱柳植株进行“接菌”处理，以改善青钱柳土壤养分吸收情况，提高青钱柳植株生长和促进青钱柳次生代谢产物积累为主要目标，兼治土壤病害，提高青钱柳抗性；仅利用一种木霉菌株，发酵工艺容易优化，菌剂制备成本低，易于商业化大规模推广，具有很高的田间普遍使用价值。
Description
技术领域
本发明涉及青钱柳栽培技术领域，具体涉及一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法。
技术背景
木霉菌(Trichoderma)是植物根系生态系统中常见的真菌。它们因其产生抗生素、寄生其他真菌以及与有害植物微生物竞争的能力而被广泛研究。迄今为止，木霉菌作为一种生防益菌在预防病害、提升植物抗逆性、促进生长在生产上被大量使用。木霉菌因产生丰富的次生代谢物而具有丰富的生物活性，通过这些化合物，木霉可以定殖在植物根部，诱导植物抗性，促使植物积累更多的次生代谢产物。木霉菌还可以通过调节植物生长素代谢提高目标侧根的数目，改变根的构型，改善植物的养分吸收状况，达到促进植物生长的效果。棘孢木霉(T. asperellum)是近年我国新记录的木霉菌菌种，对其开发利用尚处于起步阶段。
青钱柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja]是我国独有的胡桃科（Juglandaceae）青钱柳属（Cyclocarya）的单属种乔木，主要分布于我国南方山区，具观赏、用材、药用等多方面价值。随着青钱柳药用价值的发掘和利用，青钱柳需求量日益增长。天然林资源已不能满足需求，人工林培育将成为未来增产的主要方向。目前药用青钱柳人工林栽培方式，主要是通过矮化种植、常规管理如施用速效肥有效提高了叶生物量，但主要生物活性物质含量没有变化、甚至出现了下降。因此在采用青钱柳叶进行提取深加工时，尽管主要活性物质的产量有一定的增加，但提取成本也显著上升，从经济角度来看得不偿失。因此如何在提高叶生物量的同时也提高药用成分含量是叶用青钱柳人工林培育技术的难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，该方法能够提高青钱柳生物量的同时促进次生代谢产物的积累，药用成分含量的提高降低了工业大量提取的成本，为后续青钱柳叶用林培育技术奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种棘孢木霉ACCC30536的应用，将棘孢木霉或其生物制剂在促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物中的应用。
优选的，将棘孢木霉制成孢子液，施于青钱柳根部，促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物。
本发明提供了一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，包括以下步骤：
步骤一，制备棘孢木霉孢子液：棘孢木霉菌株ACCC30536接种于PDA培养基，后转入液体种子培养基培养；将所得发酵液接入产孢培养基平板中培养8~10d，经冲洗过滤，得到木霉孢子液，孢子液经离心重悬后调整浓度为107个/ml。
步骤二，于8月下旬进行接菌处理，每隔10天施用1次，共施用3次。每次施用时将木霉孢子液稀释4倍，施用量为200×D ml（D为植株地径，单位为cm）；具体施用方式采用环施法，施用位置为在距离根基部约4-8倍地径的圆圈内，将发酵液均匀灌根。
8月下旬是青钱柳植株中次生代谢物积累的一个高峰期；另外，8-9月是植物生长的高峰期，光合作用强烈；在8月下旬进行接菌，可以极大的促进青钱柳植株的光合生产，为后续的代谢调控提供物质基础。
4倍苗木胸径距离处为植物根系分布大致范围，可让菌液直接接触到植物的细根，可以极大的提高木霉的定殖效率，更好地发挥该栽培方法的效果。
步骤三，于10月下旬，所述青钱柳植株的叶片即可用于叶片收获。
优选的，步骤一中所述PDA培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000ml。
优选的，步骤一中所述液体种子培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml。
优选的，步骤一中所述液体培养的培养条件为：转速180r/min，温度28℃， pH为7。
优选的，步骤一中所述产孢培养基制备方法为：将绿豆20g、水1000ml煮沸去渣后所得滤液用蒸馏水补充至1000ml，加入15g琼脂后灭菌备用。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
（1）.本发明提供的一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，利用一种木霉菌株，发酵工艺容易优化，菌剂制备成本低，易于商业化大规模推广，具有很高的田间普遍使用价值；
（2）.本发明提供的一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，使用的棘孢木霉可以直接制成孢子液使用或者制成生物菌剂，代替全部或部分化肥，降低化肥的施用量，减少青钱柳栽培成本；
（3）.本发明提供的一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法可以提高青钱柳对土壤养分的吸收率；
（4）.本发明提供的一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法提高青钱柳抗性，促进次生代谢产物的积累；
（5）.本发明提供的一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法在保护生态环境的同时提升青钱柳的药用价值，降低了药用物质的提取成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
以下实施例中所述的供试植株为两年生青钱柳截干苗，截干高度为10cm，试验地位于江苏省镇江市下蜀镇空青村下蜀林场，试验中用到的试剂、培养基均为化学纯。
以下实例所用微生物：棘孢木霉菌ACCC30536，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC30536。
植株的准备
于2018年11月采集广西金钟山（24°62', 104°95'）30号家系青钱柳种子，使用质量体积分数0.2%赤霉素浸种 1 周后，在江苏溧水白马教学科研基地进行层积催芽处理。于2019年3月将发芽的种子播种到无纺布容器中。2021年3月26日将选取生长健壮且长势基本一直的幼苗移栽到盆中（顶径：21厘米，底径：15厘米，高：20厘米），每盆一株，在苗高10cm处进行截干处理，基质配方为V(黄心土)：V(醋糠)=8：2。移至江苏省镇江市下蜀镇南京林业大学实习林场温室内培育，自然光照，每日浇水，保持土壤湿润。于8月25日处理，处理时植株平均苗高为117.7cm，平均地径为1.1cm。
培养基的准备
PDA培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000ml。
种子培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml。
产孢培养基制备方法为：将绿豆20g、水1000ml煮沸后去渣，所得滤液用蒸馏水补充至1000ml，加入15g琼脂后灭菌制得。
栽培方法
一种利用棘孢木霉促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物的栽培方法，包括以下步骤：
步骤一，制备棘孢木霉孢子液：将棘孢木霉菌株ACCC30536活化后采用涂布平板法将约1ml母液接种于PDA培养基上培养10d，用直径为5mm的打孔器打菌饼，以3片/20ml的接菌量，将菌饼与无菌玻璃球接入液体种子培养基7d；培养条件为：转速180r/min，温度28℃，pH为7，避光；制得的棘孢木霉发酵液约1ml接入产孢培养基平板中，以28℃培养10d；用无菌水冲洗平板，经过四层灭菌纱布，得到木霉孢子液；木霉孢子液用血球计数板计数，将孢子液离心后沉淀中加入蒸馏水重悬，调整终浓度为107个/ml；
步骤二，于8月25日进行接菌处理，每隔10天施用1次，共施用3次；每次施用时将木霉孢子液稀释4倍，施用量为200 ml；具体施用方式采用环施法，施用位置为在距离根基部约8cm的圆圈内，将发酵液均匀灌根；
步骤三，于10月25日，采集叶片。
实验例1
试验采用单因素完全随机设计，设CK与F两个处理，F处理为接菌处理，对照处理施用等量自来水。每处理3个重复，每个重复20棵植株。于8月下旬，采用灌根法施用，每10天施用一次，共3次。
于10月25日采集盆栽基质，并检测栽培基质养分，如表1：
表1栽培基质养分检测结果
数据进行统计学分析，不同小写字母表示不同处理间在P < 0.05水平差异显著，下同。
由表1可知，本发明提供的栽培方法增加了土壤中速效养分的含量，并且棘孢木霉ACCC30536有利于青钱柳对土壤中养分的转运吸收。
实验例2
按照实验例1的方法进行接菌处理，于10月25日，每小区随机收集同一高度同一方向成熟功能叶，用干冰带回实验室待测定；检测青钱柳叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性。
青钱柳抗逆性酶活性测定结果如表2所示。
表2接菌处理后青钱柳抗逆性酶活性测定结果
由上表2可以看出，接菌处理的青钱柳植株有更高的抗逆酶活性，接菌处理诱导青钱柳产生更多的抗逆性酶，提升青钱柳植株的抗逆性，有明显的诱抗效果。
实验例3
按照实验例1的方法进行接菌处理，于10月25日，每小区採挖9株，流水冲洗，除去根和表面的泥土，烘干后称重；检测青钱柳叶中各次生代谢产物含量与产量；通过高效液相色谱HPLC法检测青钱柳叶子次生代谢产物单体的含量。
产量计算公式为含量（mg/g）×叶生物量（g/株）
表3接菌处理后青钱柳单株各器官干重测定结果(g/株)
由上表3可以看出，接菌处理的青钱柳植株各器官表现出更高的生物量，其中接菌处理的叶生物量高出对照28.8%，有明显的促生效果。
各次生代谢产物含量与产量检测结果如表4、5、6所示。
表4接菌处理后青钱柳次生代谢产物含量测定结果(mg/g)
表5接菌处理后青钱柳次生代谢产物产量测定结果(mg/株)
由表4、5可见，接菌组显著提高了青钱柳叶片中次生代谢产物的含量，与此同时，接菌对青钱柳初生生长表现出促进的效果，因此单株产量得到了极大地提升。
表6接菌处理后青钱柳次生代谢产物单体测定结果(mg/g)
由表6可见，通过高效液相色谱HPLC法测定青钱柳叶片中次生代谢产物单体的含量，接菌处理对青钱柳叶中次生代谢产物单体有明显的促进效果，其中青钱柳酸B为青钱柳所特有的三萜类药用成份，接菌处理后其含量与产量分别高出对照77.8%、152% 。表明本发明所述一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法显著提升了青钱柳药效成分的含量，具有显著的提质功效。
综上所述，本发明所述的一种利用棘孢木霉提高青钱柳叶药用品质的栽培方法可以提高青钱柳对养分的吸收率，诱导抗逆性酶活性提高从而提高青钱柳抗性，提高叶生物量的同时促进次生代谢产物的积累。在保护生态环境的同时提升青钱柳的药用价值，降低了药用物质的提取成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，做出的若干改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种棘孢木霉ACCC30536的应用，其特征在于，将棘孢木霉制成孢子液，施于青钱柳根部，促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物；
利用棘孢木霉促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物的栽培方法，包括以下步骤：
步骤一，制备棘孢木霉孢子液：将棘孢木霉菌株ACCC30536活化后采用涂布平板法将1ml母液接种于PDA培养基上28℃避光培养8~10d，用直径为5mm的打孔器打菌饼，以3片/20ml的接菌量，将菌饼与无菌玻璃球接入液体种子培养基5~7d；制得的棘孢木霉发酵液1ml接入产孢培养基平板中，以28℃避光培养8~10d；用无菌水冲洗平板，经过四层灭菌纱布过滤，得到木霉孢子液；木霉孢子液用血球计数板计数，将孢子液离心后沉淀中加入蒸馏水重悬，调整终浓度为107个/ml；
步骤二，于8月下旬进行接菌处理，每隔10天施用1次，共施用3次；每次施用时将木霉孢子液稀释4倍，施用量为200×D ml，D为植株地径，单位为cm；具体实施方式采用环施法，施用位置为在距离根基部4-8倍地径的圆圈内，将发酵液均匀灌根；
步骤三，于10月下旬，采集叶片。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PDA培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000ml。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述液体种子培养基成份为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述液体种子培养的培养条件为：转速180r/min，温度28℃， pH为7，避光。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产孢培养基制备方法为：将绿豆20g、水1000ml煮沸后去渣，所得滤液用蒸馏水补充至1000ml，加入15g琼脂后灭菌制得。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述青钱柳叶中的次生代谢物为黄酮类、三萜类和多酚类。
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| Isolation of Trichoderma from forestry model base and the antifungal properties of isolate TpsT17 toward Fusarium oxysporum;Chang Zhou等;《Microbiological Research》;第231卷;第126371-126381页 * |
| 棘孢木霉T46 的筛选、生产及诱导山新杨抗性机理研究;于泽洋;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;D049-47 * |
| 真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮、类胡萝卜素和单宁含量的影响;刘生财;段俊朋;徐小萍;潘君飞;程春振;林玉玲;赖钟雄;;《热带作物学报》(第9期);第1778-1785页 * |
| 青钱柳内生真菌多样性及其代谢产物的特性;寇晓琳等;《福建农林大学学报( 自然科学版)》;第48卷(第4期);第493-500页 * |
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