CN115053915B - 一种利用芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，该栽培方法应用于青钱柳种植中，可以促进青钱柳植株生长、提高青钱柳叶的药用品质。具体包括如下步骤：（1）制备解淀粉芽孢杆菌发酵液；（2）于8月下旬进行接菌处理，每隔10天施用1次，共施用3次。采用环施法，施用位置为在距离根基部约4‑8倍地径的圆圈内，将发酵液均匀灌根。（3）10月下旬采集叶子。相比于不接菌的对照组，接菌组的植株生物量更高，叶药用物质含量更高。另外，解淀粉芽孢杆菌的添加对土壤有一定的改善作用。因此，本发明所涉及的经营措施在药用青钱柳定向栽培中具备很高的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及青钱柳栽培技术领域，具体涉及一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法。
技术背景
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ACCC05742是革兰氏阳性菌中的一株模式菌株，它的基因组、转录组、蛋白质组学等相关信息已建立了详细的综合数据库，它的许多特征与植物紧密相关。ACCC05742不仅能通过产生大量抗菌的次级代谢产物，从而具有抵抗多种植物病原体的能力，而且还能够有效地定殖植物根部并促进植物生长。
青钱柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja]是我国独有的胡桃科（Juglandaceae）青钱柳属（Cyclocarya）的单属种乔木，主要分布于我国南方山区，具观赏、用材、药用等多方面价值。随着青钱柳药用价值的发掘和利用，青钱柳需求量日益增长。天然林资源已不能满足需求，人工林培育将成为未来增产的主要方向。目前药用青钱柳人工林栽培方式，主要是通过矮化种植、通过常规管理如施用速效肥有效提高了叶生物量，但主要生物活性物质含量没有变化、甚至出现了下降。因此在采用青钱柳叶进行提取深加工时，尽管主要活性物质的产量有一定的增加，但提取成本也显著上升，从经济角度来看得不偿失。因此如何在提高叶生物量的同时也提高药用成分含量是叶用青钱柳人工林培育技术的难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有栽培技术的缺陷，提供一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，该方法能够提高青钱柳生物量的同时促进次生代谢产物的积累，药用成分含量的提高降低了工业大量提取的成本，为后续青钱柳叶用林培育技术奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种解淀粉芽孢杆菌ACCC05742的应用，将解淀粉芽孢杆菌或其生物制剂在促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物中的应用。
优选的，将解淀粉芽孢杆菌制成发酵液，施于青钱柳根部，促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物。
本发明提供了一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，包括以下步骤
步骤一，制备解淀粉芽孢杆菌发酵液：解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742接种于营养琼脂固体培养基，后转入LB液体培养基，180r/min，25℃，震荡24h制备种子液；将种子液接种在YMB培养基中进行扩增培养，培养13-14h通过稀释或继续发酵至发酵液OD600为0.8-1.2，此时发酵液活菌数大于1×107 CFU·ml-1，即得解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742发酵菌液，然后密封储存在4℃条件下备用。
OD600 0.8-1.2是根据测定解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742生长曲线所得该菌株培养状态为对数生长期时所对应的吸光度范围。对数生长期为该菌经过短暂的适应期后进入的快速生长时期，此时期的微生物会以对数生长，活力达到最高，接种该时期的微生物效果可达到最大。
步骤二，于8月下旬进行接菌处理，每隔10天施用1次，共施用3次；每次施用量为200×D ml（D为植株地径，单位为cm）；具体实施方式采用环施法，施用位置为在距离根基部4-8倍地径的圆圈内，将发酵液均匀灌根；
8月下旬是青钱柳植株中次生代谢物积累的一个高峰期；另外，8-9月是植物生长的高峰期，光合作用强烈；在8月下旬进行接菌，可以极大的促进青钱柳植株的光合生产，为后续的代谢调控提供物质基础。
4倍苗木胸径距离处为植物根系分布大致范围，可让菌液直接接触到植物的细根，可以极大的提高解淀粉芽孢杆菌发酵液的效果，更好地发挥该栽培方法的效果。
步骤三，于10月下旬，所述青钱柳植株的叶片即可用于叶片收获。
优选的，步骤一中所述营养琼脂固体培养基的组成和含量为：蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g、琼脂15g、200ml去离子水，pH 7.2-7.4，用去离子水定容至1L。。
优选的，步骤一中所述LB液体培养基的配制方法为：容器内加入去离子水200ml、胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.2-7.4，用去离子水定容至1L。优选的，步骤一中所述YMB培养基的组成和含量为：甘露醇10g、七水硫酸镁.2g、氯化钠0.1g、酵母粉3g、磷酸氢二钾0.25g、磷酸二氢钾0.25g、碳酸钙3g、200ml去离子水，pH 7.2-7.4，用去离子水定容至1L。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
（1）.本发明提供的一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，利用一种解淀粉芽孢杆菌菌株，发酵工艺容易优化，菌剂制备成本低，易于商业化大规模推广，具有很高的田间普遍使用价值；
（2）.本发明提供的一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法，使用的解淀粉芽孢杆菌可以直接制成发酵液使用或者制成生物菌剂，代替全部或部分化肥，降低化肥的施用量，减少青钱柳栽培成本；
（3）.本发明提供的一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法可以提高青钱柳对土壤养分的吸收率；
（4）.本发明提供的一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法提高青钱柳抗性，促进次生代谢产物的积累；
（5）.本发明提供的一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法在保护生态环境的同时提升青钱柳的药用价值，降低了药用物质的提取成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
以下实施例中所述的供试植株为两年生青钱柳平茬苗，平茬高度为10cm，试验地位于江苏省镇江市下蜀镇空青村下蜀林场，试验中用到的试剂、培养基均为化学纯。
以下实例所用微生物：解淀粉芽孢杆菌菌ACCC05742，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC05742。
植株的准备：
于2018年11月采集广西金钟山（24°62', 104°95'）30号家系青钱柳种子，使用质量体积分数0.2%赤霉素浸种 1 周后，在江苏溧水白马教学科研基地进行层积催芽处理。待种子发芽后将发芽的种子播种到无纺布容器中。2021年3月26日将选取生长健壮且长势基本一直的幼苗移栽到盆中（顶径：21厘米，底径：15厘米，高：20厘米），每盆一株，在苗高10cm处进行平茬处理，基质配方为V(黄心土)：V(醋糠)=8：2。移至江苏省镇江市下蜀镇南京林业大学实习林场温室内培育，自然光照，每日浇水，保持土壤湿润。于8月25日处理，处理时植株平均苗高为117.7cm，平均地径为1.1cm。
培养基的准备：
营养琼脂固体培养基的配制方法为：容器内加入蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g、琼脂15g、200ml去离子水，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.2-7.4，用去离子水定容至1L。
LB液体培养基的配制方法为：容器内加入胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、200ml去离子水，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.2-7.4，用去离子水定容至1L。
YMB培养基的配制方法为：容器内加入甘露醇10g、七水硫酸镁.2g、氯化钠0.1g、酵母粉3g、磷酸氢二钾0.25g、磷酸二氢钾0.25g、碳酸钙3g、200ml去离子水，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.2-7.4，用去离子水定容至1L。
一种利用解淀粉芽孢杆菌促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物的栽培方法，包括以下步骤：
步骤一，制备解淀粉芽孢杆菌发酵液：解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742接种于营养琼脂固体培养基，后转入LB液体培养基，180r/min，25℃，震荡24h制备种子液；将种子液接种在YMB培养基中进行扩增培养，培养13-14h通过稀释或继续发酵至发酵液OD600为0 .8-1.2，此时发酵液活菌数大于1×107 CFU·ml-1，即得解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742发酵菌液，贮存于4℃条件备用。
步骤二，于8月25日进行接菌处理，每隔10天施用1次，共施用3次；每次施用量为200 ml；具体实施方式采用环施法，施用位置为在距离根基部约8cm的圆圈内，将发酵液均匀灌根；
步骤三，于10月25日，所述青钱柳植株的叶片即可用于叶片收获。
实验例1
试验采用单因素完全随机设计，设CK与B两个处理，B处理为接菌处理，对照处理施用等量自来水。每处理3个重复，每个重复20棵植株。于8月下旬，采用灌根法施用，每10天施用一次，共3次。
于10月25日采集青钱柳土样，并检测土壤养分，如表1：
表1土壤养分检测结果
数据进行统计学分析，不同小写字母表示不同处理间在P < 0.05水平差异显著，下同。
由表1可知，本发明提供的栽培方法增加了土壤中速效养分的含量，碱解氮与有效磷的含量均高出对照100%以上，并且解淀粉芽孢杆菌ACCC05742有利于青钱柳对土壤中养分的转运吸收。
实验例2
按照实验例1的方法进行接菌处理，于10月25日，每小区随机收集同一高度同一方向成熟功能叶，用干冰带回实验室待测定；检测青钱柳叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性。
青钱柳抗逆性酶活性测定结果如表2所示。
表2接菌处理后青钱柳抗逆性酶活性测定结果
由上表2可以看出，接菌处理的青钱柳植株有更高的抗逆酶活性，接菌处理诱导青钱柳产生更多的抗逆性酶，提升青钱柳植株的抗逆性，有明显的诱抗效果。
实验例3
按照实验例1的方法进行接菌处理，于10月25日，每小区採挖9株，流水冲洗，除去根和表面的泥土，烘干后称重；检测青钱柳叶中各次生代谢产物含量与产量；通过高效液相色谱HPLC法检测青钱柳叶子次生代谢产物单体的含量。
产量计算公式为含量×叶生物量
表3接菌处理后青钱柳单株各器官干重测定结果(g/per)
由上表3可以看出，接菌处理的青钱柳植株各器官表现出更高的生物量，其中接菌处理的叶生物量高出对照14.4%，有明显的促生效果。
各次生代谢产物含量与产量检测结果如表4、5、6所示。
表4接菌处理后青钱柳次生代谢产物含量测定结果(mg/g)
表5接菌处理后青钱柳次生代谢产物产量测定结果(mg/per)
由表4、5可见，接菌组显著提高了青钱柳叶片中次生代谢产物的含量，与此同时，接菌对青钱柳初生生长表现出促进的效果，因此单株产量得到了极大地提升。
表6接菌处理后青钱柳次生代谢产物单体测定结果(mg/g)
由表6可见，通过高效液相色谱HPLC法测定青钱柳叶片中次生代谢产物单体的含量，接菌处理对青钱柳叶中次生代谢产物单体有明显的促进效果，其中青钱柳酸B为青钱柳所特有的三萜类药用成份，接菌处理后其含量高出对照200% 。表明本发明所述一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法显著提升了青钱柳药效成分的含量，具有显著的提质功效。
综上所述，本发明所述的一种利用解淀粉芽孢杆菌提高青钱柳叶药用品质的栽培方法可以提高青钱柳对养分的吸收率，诱导抗逆性酶活性提高从而提高青钱柳抗性，提高叶生物量的同时促进次生代谢产物的积累。在保护生态环境的同时提升青钱柳的药用价值，降低了药用物质的提取成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，做出的若干改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种解淀粉芽孢杆菌ACCC05742的应用，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌制成发酵液，施于青钱柳根部，促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物；
利用解淀粉芽孢杆菌促进青钱柳植株生长和提高青钱柳叶次生代谢物的栽培方法，包括以下步骤：
步骤一，制备解淀粉芽孢杆菌发酵液：解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742接种于营养琼脂固体培养基，后转入LB液体培养基，180r/min恒温震荡24h制备种子液；将种子液接种在YMB培养基中进行扩增培养，培养13-14h通过稀释或继续发酵至发酵液OD600为0.8-1.2，此时发酵液活菌数大于1×107 CFU·ml-1，即得解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742发酵菌液；
步骤二，于8月下旬进行接菌处理，每隔10天施用1次，共施用3次；每次施用时将解淀粉芽孢杆菌发酵液稀释4倍，施用量为200×D ml，D为植株地径，单位为cm；具体实施方式采用环施法，施用位置为在距离根基部4-8倍地径的圆圈内，将发酵液均匀灌根；
步骤三，于10月下旬，采集叶片。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，制备解淀粉芽孢杆菌发酵液的具体步骤如下：从保存完好的斜面上分别挑取解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742的菌体接种在营养琼脂固体培养基上，25℃活化48h；将活化后的解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742用接种环挑取一环菌泥加入到LB液体培养基中，25℃，180r/min恒温震荡24h制备种子液；将种子液按10％的接种量接种在YMB培养基中进行扩增培养，25℃，200r/min摇床振荡培养13-14h通过稀释或继续发酵至发酵液OD600为0.8-1.2，即得解淀粉芽孢杆菌菌株ACCC05742发酵菌液。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述营养琼脂固体培养基的组成和含量为：蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g、琼脂15g、1000ml去离子水，pH 7.2-7.4。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述LB液体培养基的配制方法为：容器内加入去离子水200ml、胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.2-7.4，用去离子水定容至1L。
5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述YMB培养基的组成和含量为：甘露醇10g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠0.1g、酵母粉3g、磷酸氢二钾0.25g、磷酸二氢钾0.25g、碳酸钙3g、200ml去离子水， pH 7.2-7.4，用去离子水定容至1L。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述青钱柳叶中的次生代谢物具体指黄酮类、三萜类和多酚类。
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