CN104388335A - 一种解淀粉芽孢杆菌fs6及其应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌fs6及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌FS6及其应用。所述解淀粉芽孢杆菌FS6，其保藏号为CGMCC No.9538，并提供了所述解淀粉芽孢杆菌FS6菌剂的制备方法。本发明的解淀粉芽孢杆菌FS6及其菌剂对人参根部和叶部病原菌具有较高抑菌活性，可诱导人参的过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等与防卫相关的酶活性升高，提高人参对病原菌的抗性，可稳定定殖于人参植株和土壤中，在施用对象表面形成一层保护膜阻止病原菌侵入，有效减少人参根部和叶部病害的发生，并且对人参无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发潜力和应用前景。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌FS6及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体地涉及一种解淀粉芽孢杆菌FS6及其应用。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)作为名贵中药材，在我国栽培面积最大、产量最高。我国已成为世界上主要的人参生产国和出口国，每年生产的人参产量占世界总产量的78％以上，出口量占国际市场的60％以上，但产生的经济效益却很低。中国的人参产量约为韩国的3倍，而产值却仅为韩国的1/4，这主要是由于人参中农药残留超标，农药使用不合理造成的。
人参生育期较长，一般4～6年，同时人参对生产条件的要求较高，在其整个生长过程中极易遭受各种病原菌的侵袭，由此造成多种病害发生。已有记载的人参病害有40余种，我国约有25种以上。其中侵染性病害主要有人参灰霉病和人参黑斑病等。人参灰霉病是由葡萄孢属灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致，为半知菌类葡萄孢属真菌，主要危害人参的叶片、叶柄、花和果实，严重发生时亦可危害茎及根部。自2002年起，人参灰霉病在我省人参产区发病率逐年上升，防治不及时，可造成严重损失。人参黑斑病是由人参链格孢(Alternaria panax)侵染所致，为半知菌交链孢属真菌。人参黑斑病是人参生产上发生最普遍，危害最严重的病害之一，发病率为20％～30％，严重时可达100％，可危害叶片、茎、果实和根。
对于人参病害的防治，目前应用较多的主要有化学农药防治、农业防治和生物防治，其中生物防治具有无毒、无残留、病原菌不易产生抗药性等优点，应用前景广阔。从人参主产区采集土样，从中分离生防菌株，应用于田间防治，具有重要的实践意义。
发明内容
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌FS6及其应用，目的是提供一株来源于人参主产区土壤中，可用于防治人参病害的解淀粉芽孢杆菌，可定殖于人参植株和土壤中，可增强人参多种防御酶活性，可与化学农药防治相结合，降低人参农药残留量。
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FS6，已于2014年8月25号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编：100101，保藏编号CGMCC No.9538。
本发明一种实施方式是含有所述解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
本发明所述菌剂的活菌数为109cfu。
本发明解淀粉芽孢杆菌FS6菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于固体培养基上，于28℃下培养1-2天；
(2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min震荡培养24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：将种子液接入KMB培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min震荡培养36h，制得解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
上述步骤(1)菌株活化培养用固体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉15g，pH7.0。
上述步骤(2)发酵种子培养所用的液体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
上述步骤(3)菌剂发酵中KMB培养基配方为：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H201.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
上述步骤(3)中种子液的接种量为6％。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌在防治植物灰霉病和黑斑病的应用。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌在防治人参灰霉病和黑斑病的应用。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌FS6及其发酵液菌剂对人参植株有诱导抗性作用，可诱导人参过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的提高。菌株FS6可稳定定殖于人参植株和土壤中，利于增强菌剂的抗病原菌活性。此外，解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参灰霉病和黑斑病均有较好田间防效。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂用于植物灰霉病和黑斑病，尤其是人参灰霉病和黑斑病的防治。
本发明的有益效果是：解淀粉芽孢杆菌FS6及其菌剂对人参植株有增强防卫能力作用，在人参植株和土壤中具有较强的定殖能力，并且在大田防治中，对人参灰霉病和黑斑病有良好的防治效果。有效减少人参病害的发生，降低农药在人参中的残留量，并且对人参无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发前景。
附图说明
图1A是解淀粉芽孢杆菌FS6在NA平板上的菌落形态图；
图1B是用透射电镜观察到的FS6菌体形态图；
图2A是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后POD酶活性的变化图；
图2B是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后PPO酶活性的变化图；
图2C是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后PAL酶活性的变化图；
图2D是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后CAT酶活性的变化图；
图2E是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后SOD酶活性的变化图；
图3A是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂进行叶面喷雾处理后在人参根、茎、叶及土壤中体内的定殖动态图；
图3B是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂进行灌根处理后在人参根、茎、叶及土壤中体内的定殖动态图。
具体实施方式
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FS6，已于2014年8月25号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编：100101，保藏编号CGMCC No.9538。
本发明一种实施方式是含有所述解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
本发明所述菌剂的活菌数为109cfu。
本发明解淀粉芽孢杆菌FS6菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于固体培养基上，于28℃下培养1-2天；
(2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min震荡培养24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：将种子液接入KMB培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min震荡培养36h，制得解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
上述步骤(1)菌株活化培养用固体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉15g，pH7.0。
上述步骤(2)发酵种子培养所用的液体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
上述步骤(3)菌剂发酵中KMB培养基配方为：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H201.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
上述步骤(3)中种子液的接种量为6％。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌在防治植物灰霉病和黑斑病的应用。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌在防治人参灰霉病和黑斑病的应用。
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1解淀粉芽孢杆菌FS6的分离、筛选及鉴定
1.1细菌的分离
采用稀释分离法对采集到的人参主产区土壤样品进行分离。取3g土壤样品加入30mL无菌水中，以240r/min，28℃，振荡培养30min后取出待用。在无菌条件下将土壤悬浮液用无菌水逐级稀释为10-3、10-4、10-5三个浓度梯度。依次取100μL涂布于NA培养基表面，每个处理设3次重复，置于28℃恒温培养箱培养48h。培养期间定期观察，选择优势菌落的细菌菌落进行纯化，保存备用。
牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。
1.2解淀粉芽孢杆菌FS6的筛选获得
初筛：采用平皿对峙培养法对1.1中分离纯化得到的各细菌菌株进行拮抗筛选。用内径为8mm的打孔器打取活化好的病原菌(人参灰霉病和黑斑病菌)置于PDA平板的中央，在距平板中心2.4cm处呈十字形交叉形分别用打孔器(内径8mm)打洞，用移液枪吸取30μL拮抗菌菌液于孔洞内。每处理设3个重复，25℃培养3-7d后测量抑菌带宽度，将具有拮抗作用的菌株保存备用。
PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂16g，蒸馏水1000ml。
复筛：将初筛获得的拮抗菌株置牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48h，取各菌苔一环分别接入100mL种子培养液中培养48h作种子液，再分别吸取100μL种子液注入150ml菌剂发酵培养液中，于摇床中180r/min、28℃的条件下培养48h。取各培养液于10000r/min离心10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤得上清滤液，吸取各上清滤液与温度约为45℃PDA培养基混合制成含上清滤液浓度为8％的平板，采用生长速率法筛选出对人参灰霉病菌和人参黑斑病菌菌丝生长抑制作用最强的菌株，得到目标菌株FS6。
牛肉膏蛋白胨固体培养基配方：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉15g，pH7.0。
种子培养液配方：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
菌剂发酵培养液配方：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H201.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
1.3解淀粉芽孢杆菌FS6的鉴定
形态观察的结果表明，菌株FS6在NA培养基上形成乳白色菌落，菌落不透明，表面干燥粗糙且有褶皱现象，菌落形状不规则，边缘不整齐。为革兰氏阳性杆菌，细胞呈直杆状，周生鞭毛，具有运动性，能产生椭圆形芽孢(如图1所示)。菌株生理生化特性结果表明，接触酶、氧化酶、葡萄糖氧化发酵、淀粉水解、V-P、硝酸盐还原、明胶液化、二羟基丙酮等反应为阳性，能利用柠檬酸盐、水解酪朊、淀粉，pH5.7和6.8、10-50℃、2-10％NaCl、有溶菌酶均能良好生长，能使明胶液化、淀粉水解，生长良好，能利用D-葡萄糖、阿拉伯糖、D-甘露醇和D-木糖。16S rRNA序列分析结果表明，该菌的16S rRNA序列与已报道的解淀粉芽孢杆菌具有较高的同源性。此外，采用BD Phoenix-100微生物自动鉴定系统对菌株FS6进行鉴定，根据微生物鉴定专家数据库信息设计鉴定反应最佳组合进行鉴定，置信度值为99％。综上，通过形态特征、生理生化反应、分子鉴定及BD Phoenix-100微生物自动鉴定系统对菌株FS6进行鉴定，将菌株FS6鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
实施例2解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液的制备
(1)菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于固体培养基上，于28℃下培养1-2天；
(2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min震荡培养24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：
按6％的接种量，将上述种子液接种到菌剂发酵培养液中，于28℃条件下在摇床中180r/min震荡培养36h，制得解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂(活菌数约为3.0×109cfu/ml)。
菌株活化培养用固体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉15g，pH7.0。
菌株发酵种子培养用液体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
菌剂发酵培养基KMB配方为：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H201.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
实施例3解淀粉芽孢杆菌FS6滤液对人参防御酶活性的影响
3.1解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液对人参过氧化物酶(POD)活性的影响
将实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌FS6种子液以4％的接种量接种于LB培养基，相同培养条件培养48h，细菌悬浮液采用分光光度计测OD600值，稀释至浓度为6×l08cfu/mL后，将其喷施于人参叶面，以等量的清水为空白对照每个处理设3次重复。于处理后0、1、2、3、4、5、6d采用对角线五点随机取样，采集人参叶片50g，置于-20℃冰箱保存备用。
称取人参样品0.5g，放入预冷的研钵中，液氮下迅速研磨成粉末，加5mL 0.1M(pH 5.5)的乙酸-乙酸钠缓冲液，在冰浴条件先研磨成匀浆，于4℃、5000r/min离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
POD测定：25mM愈创木酚溶液5mL 50mM H2O2溶液100μL，粗酶液10μL，空白不加粗酶液，用缓冲液代替，均匀混合，于37℃水浴5min，冰浴终止反应，在470nm测定吸光度，每个处理3次重复。在上述条件下，每毫克鲜重每分钟OD470值变化0.01为一个酶活力单位。
其中：ΔD：反应体系吸光度变化值；
Vt：提取酶液总体积(mL)；
Vs：测定时酶液体积(mL)；
W：样品鲜重(mg)；
T：反应时间(min)。
试验结果表明：解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后，过氧化物酶(POD)活性始终高于对照(未经FS6处理的人参)的过氧化物酶活性，并且在处理后3d时，处理的过氧化物酶(POD)活性明显升高，达到最高值，之后逐渐下降(如图2A所示)。
3.2解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液对人参多酚氧化酶(PPO)活性的影响
将实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌FS6种子液以4％的接种量接种于LB培养基，相同培养条件培养48h，细菌悬浮液采用分光光度计测OD600值，稀释至浓度为6×l08cfu/mL后，将其喷施于人参叶面，以等量的清水为空白对照每个处理设3次重复。于处理后0、1、2、3、4、5、6d采用对角线五点随机取样，采集人参叶片50g，置于-20℃冰箱保存备用。
称取人参样品0.5g，放入预冷的研钵中，液氮下迅速研磨成粉末，加5mL0.1M(pH 5.5)的乙酸-乙酸钠缓冲液，在冰浴条件先研磨成匀浆，于4℃、5000r/min离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
PPO测定：0.05M(pH5.5)乙酸-乙酸钠缓冲液3.9mL，0.05M邻苯二酚溶液1.0mL，粗酶液0.2mL，空白不加粗酶液，用缓冲液代替，均匀混合，于37℃水浴10min，冰浴终止反应，在525nm测定吸光度，每个处理3个重复。在上述条件下，每克鲜重每分钟内OD525值变化0.01为一个酶活力单位。
其中：ΔD：反应体系吸光度变化值；
Vt：提取酶液总体积(mL)；
Vs：测定时酶液体积(mL)；
W：样品鲜重(g)；
T：反应时间(min)。
试验结果表明：菌株FS6发酵液处理人参后，在处理后1-3d，处理与对照(未经FS6处理的人参)的多酚氧化酶(PPO)活性没有明显差异，在处理后4-6d，处理的多酚氧化酶(PPO)活性明显升高，在第5d达到最高值，之后逐渐下降(如图2B所示)。
3.3解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液对人参苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响
将实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌FS6种子液以4％的接种量接种于LB培养基，相同培养条件培养48h，细菌悬浮液采用分光光度计测OD600值，稀释至浓度为6×108cfu/mL后，将其喷施于人参叶面，以等量的清水为空白对照每个处理设3次重复。于处理后0、1、2、3、4、5、6d采用对角线五点随机取样，采集人参叶片50g，置于-20℃冰箱保存备用。
PAL测定：0.05M(pH 8.8)硼酸-硼砂缓冲液3.0mL，0.02M L-苯丙氨酸溶液0.5mL，粗酶液0.5mL，空白不加粗酶液，用缓冲液代替，均匀混合，于37℃水浴30min，冰浴加入0.1mL 6M HCl终止反应，在290nm测定吸光度，每个处理3个重复。在上述条件下，每克鲜重每分钟内OD290值变化0.01为一个酶活力单位。
其中：ΔD：反应体系吸光度变化值；
Vt：提取酶液总体积(mL)；
Vs：测定时酶液体积(mL)；
W：样品鲜重(g)；
T：反应时间(min)。
试验结果表明：菌株FS6发酵液处理人参后，在处理后1-3d，处理与对照(未经FS6处理的人参)的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性没有明显差异，在处理后4-6d，处理的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性明显升高，在第5d达到最高值，之后逐渐下降(如图2C所示)。
3.4解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液对人参过氧化氢酶(CAT)、活性的影响
将实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌FS6种子液以4％的接种量接种于LB培养基，相同培养条件培养48h，细菌悬浮液采用分光光度计测OD600值，稀释至浓度为6×l08cfu/mL后，将其喷施于人参叶面，以等量的清水为空白对照每个处理设3次重复。于处理后0、1、2、3、4、5、6d采用对角线五点随机取样，采集人参叶片50g，置于-20℃冰箱保存备用。
CAT测定：酶促反应体系由2.9mL 20mM过氧化氢溶液和0.1mL粗酶液组成。以蒸馏水为参比空白，在240nm处测定反应体系吸光度值，作为初始值，然后每隔30s测定一次，连续测定5min，待所有管测定完后，计算酶活性。以每克鲜重每分钟内OD240值减少0.1为一个酶活力单位(U)。
其中：ΔA240：反应体系吸光度变化值；
Vt：提取酶液总体积(mL)；
Vs：测定时酶液体积(mL)；
W：样品鲜重(g)；
T：反应时间(min)。
试验结果表明：菌株FS6发酵液处理人参后，在处理后1-2d，处理与对照(未经FS6处理的人参)的过氧化氢酶(CAT)活性没有明显差异，在处理后3-6d，处理的过氧化氢酶(CAT)活性明显升高，在第3d达到最高值，之后逐渐下降(如图2D所示)。
3.5解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液对人参超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
将实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌FS6种子液以4％的接种量接种于LB培养基，相同培养条件培养48h，细菌悬浮液采用分光光度计测OD600值，稀释至浓度为6×l08cfu/mL后，将其喷施于人参叶面，以等量的清水为空白对照每个处理设3次重复。于处理后0、1、2、3、4、5、6d采用对角线五点随机取样，采集人参叶片50g，置于-20℃冰箱保存备用。
SOD测定：取5支干净的试管，按照下表所列内容加入各种溶液。注意最后加入核黄素溶液。其中3支为测定管，2支为对照管。混匀后将1支对照管置于暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应15min后立即取出，置于暗处终止反应。以不照光管做空白参比调零，于560nm处分别测定各管的吸光度值。
显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值(ODS)和照光对照管反应混合液的吸光度值(ODC)。以每分钟每克鲜重样品的反应体系对氮蓝四唑(NBT)光化还原的抑制为50％为一个SOD活性单位(U)表示。
其中：ODC：照光对照管反应混合液的吸光度值；
ODS：样品管反应混合液的吸光度值；
V：样品提取液总体积(mL)；
Vs：测定时所用酶液体积(mL)；
t：照光反应时间(min)；
m：样品质量(g)。
试验结果表明：菌株FS6发酵液处理人参后，在处理后3d，处理与对照(未经FS6处理的人参)的超氧化物歧化酶(SOD)活性达到最高值，之后逐渐下降，处理与对照的超氧化物歧化酶(SOD)活性没有明显差异(如图2E所示)。
实施例4解淀粉芽孢杆菌FS6抗利福平突变菌株在人参植株和土壤中的定殖能力测定
4.1FS6发酵液菌剂进行叶面喷雾处理后在人参根、茎、叶及土壤中体内的定殖动态
将解淀粉芽孢杆菌FS6转入含5μg/mL利福平(Rif)的NA平板培养基上划线，于28℃培养48h。挑取可以生长的突变体菌株，再接入同一Rif浓度的NA培养基，传代1次后转入含10μg/mL Rif浓度培养基上，利用同样方法直至筛选出能在浓度为300μg/mL Rif的NA培养基上稳定生长，且菌落形态，生理生化特性及对病原菌的拮抗作用等保持不变的突变体菌株。
发酵液菌剂浓度为108cfu/mL，均匀喷施于人参叶片表面，24h后重复操作1次，分别于接种后1、3、7、14、21、28、35d取样，每株一个处理，以清水为对照组，每个处理3次重复，测定生防细菌在人参植株中的定殖情况。
称取上述各处理植株样品0.5g，经75％酒精浸泡30s后，用0.1％升汞浸泡灭菌5min，再用无菌水洗涤6次，取灭菌样品在NA平板上做印迹检验表面灭菌效果。将样品晾干后剪碎并加入1mL无菌水磨碎，静置10min后吸取上清液100μL做梯度稀释10-1，10-2，10-3，分别取100μL上清液及稀释液涂布含Rif(300μg/mL)的NA培养基平板，每稀释浓度重复3次，置于28℃恒温箱中培养24～48h后，计菌落数。根据每皿出现菌落数折算为每克鲜组织中的细菌数(cfu/g)。结合原始菌株的主要鉴定指标对回收菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16S rRNA序列分析。
抗利福平突变菌株FS6发酵液通过叶面喷雾处理后，从第1d起在人参叶，茎和土壤中检测到FS6菌株，其在人参根、茎和土壤中的定殖动态趋势一致，变化趋势均为先升后降，而在土壤中的定殖量则为逐渐从高到低变化，后趋于平缓趋势(如图3A所示)，表明解淀粉芽孢杆菌FS6菌剂可稳定定殖于人参植株中。
4.2为FS6发酵液菌剂进行灌根处理后在人参根、茎、叶及土壤中体内的定殖动态
将解淀粉芽孢杆菌FS6转入含5μg/mL利福平(Rif)的NA平板培养基上划线，于28℃培养48h。挑取可以生长的突变体菌株，再接入同一Rif浓度的NA培养基，传代1次后转入含10μg/mL Rif浓度培养基上，利用同样方法直至筛选出能在浓度为300μg/mL Rif的NA培养基上稳定生长，且菌落形态，生理生化特性及对病原菌的拮抗作用等保持不变的突变体菌株。
将生防细菌发酵液灌根接种于人参根部，发酵液菌体浓度为108cfu/mL，每株人参灌根量为50mL。分别于接种后1、3、5、7、14、21、28、35、60d取样，以人参苗浇灌等量清水为对照，每处理重复3次，测定生防细菌在人参根和土壤中的定殖情况。
称取上述各处理植株样品0.5g，经75％酒精浸泡30s后，用0.1％升汞浸泡灭菌5min，再用无菌水洗涤6次，取灭菌样品在NA平板上做印迹检验表面灭菌效果。将样品晾干后剪碎并加入1mL无菌水磨碎，静置10min后吸取上清液100μL做梯度稀释10-1，10-2，10-3，分别取100μL上清液及稀释液涂布含Rif(300μg/mL)的NA培养基平板，每稀释浓度重复3次，置于28℃恒温箱中培养24～48h后，计菌落数。根据每皿出现菌落数折算为每克鲜组织中的细菌数(cfu/g)。结合原始菌株的主要鉴定指标对回收菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16S rRNA序列分析。
抗利福平突变菌株FS6发酵液灌根处理后，从第1d起在土壤中检测到FS6菌株，人参根中从第3d起，茎和叶从第5d起至60d在植株体内均能检测到FS6菌株，其在根、茎和叶内的定殖动态趋势一致，变化趋势均为先升后降，而在土壤中的定殖量逐渐从高到低变化，后趋于平缓趋势(如图3B所示)，表明解淀粉芽孢杆菌FS6菌剂可稳定定殖于人参根际土壤中。
实施例5解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参灰霉病和人参黑斑病的田间防治效果试验
田间试验每个小区面积为5m2，小区排列为随机区组排列，每个试验设3次重复。药剂处理每小区喷液量1.0kg，对照喷等量清水。细菌悬浮液采用分光光度计测OD600值，代入标准曲线后计算出其浓度，然后稀释至浓度为l08cfu/mL。将发酵液5倍稀释(处理1)、10倍稀释(处理2)、20倍稀释(处理3)3个处理，以有效成分含量为500g a.i./hm2的50％嘧菌环胺水分散粒剂(处理4)为药剂对照。在发病初期用药前及最后一次用药后7d后对病害的病情指数(严重度分级标准)进行调查，调查及防效计算方法如下。
试验地点：抚松县兴参镇榆树村人参种植基地。试验品种：5年生大马牙。
根据发病区域，选择地势平坦、种栽相对一致的地块，每种药剂配比设3个质量浓度，3次重复，对照喷施等量清水。小区面积15m2，随机区组排列。药剂处理每小区喷药液1.0kg，对照喷等量清水。2010年7月1日，11日，18日各施药1次。
施药时间：2012年7月5日和2012年7月12日，施药2次。调查时间：2012年7月19日。
调查方法：在发病初期用药前及最后一次用药后7d对病害的病情指数(严重度分级标准)进行调查，调查每小区的总株数，总叶数，以及各叶片发病级数，分级记载。按公式(5-1)计算出各处理的病情指数，再按公式(5-2)计算防治效果分级标准如下：
0级：叶片完整，无病斑；
1级：有少量病斑(占叶片面积的1％～5％)；
3级：病斑形成中等数量(占叶片面积的6％～10％)；
5级：病斑数量较多(占叶片面积的11％～20％)；
7级：病斑很多且较大(占叶片面积的21％～50％)；
9级：病斑很多且较大(占叶片面积的51％～100％)。
病情指数＝Σ(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100(5-1)
EF＝1-[(T-T0)CK0(1-CK)]/[(CK-CK0)T0(1-T)](5-2)。其中EF为病情防治效果，T0为防治区初始病情指数，T为防治区终期病情指数；CK0为对照区初始病情指数，CK为对照区终期病情指数。
解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参灰霉病的田间防治试验结果见表1。由表1可知，不同浓度处理FS6菌株发酵液对人参灰霉病均有一定防效。发酵液5倍稀释液处理的防效最高，为84.56％，仅次于有效成分含量为500g a.i./hm2的50％嘧菌环胺水分散粒剂，但差异不显著，稀释10倍和20倍的处理防效较低，分别为79.16％和68.35％，表明解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参灰霉病具有较好防效。
表1解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参灰霉病的田间防治效果试验
解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参黑斑病的田间防治试验结果见表2。由表2可知，不同浓度处理FS6菌株发酵液对人参黑斑病均有一定防效。发酵液5倍稀释液处理的防效最高，为81.55％，仅次于有效成分含量为500g a.i./hm2的50％嘧菌环胺水分散粒剂，但差异不显著，稀释10倍和20倍的处理防效较低，分别为66.39％和56.80％，表明解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参黑斑病具有较好防效。
表2解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参黑斑病的田间防治效果试验
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可对此作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌FS6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.9538，保藏日期2014年8月25号。
2.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活菌数为109cfu。
4.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于固体培养基上，于28℃下培养1-2天；
(2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min震荡培养24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：将种子液接入KMB培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min震荡培养36h，制得解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
5.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述固体培养基为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉15g，pH7.0。
6.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述液体培养基为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
7.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述KMB培养基配方为：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H201.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
8.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中种子液的接种量为6％。
9.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌FS6在防治植物灰霉病和黑斑病中的应用。
10.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌FS6在防治人参灰霉病和黑斑病中的应用。
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