CN112624840A - 一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物药肥 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物药肥。所述生物药的质量百分含量组成如下：甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂5％～10％，草炭20％～30％，锯末60％～70％；甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂中的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12218。本发明生物药肥施于花生根部，能够防治花生白绢病和花生茎腐病，并能促进花生生长，具体能提高地上部鲜重、提高地下部鲜重、提高根长以及提高株高。本发明甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对花生茎腐病菌和花生白绢病病原菌抑制率均达90％以上；利用本发明生物药肥对花生进行灌根，对花生茎腐病和花生白绢病的防治效果达75％以上，并对花生生长具有明显的促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物药肥，属于农药技术领域。
背景技术
花生是重要的经济作物之一，同时也是优质食用油的主要油料品种，在多个地区被广泛地种植，花生具有促生长、抗衰老、止血造血等良好功效，因而又被称为“长生果”。近年来，随着农业生产的快速发展，受花生连作等不良种植方式及气候变化等环境因素的影响，花生病害也呈明显上升的趋势，严重影响花生的产量与质量。
花生茎腐病是危害较为严重的一种病害，国内各花生主产区均有发生，尤以山东、江苏等地区发生最重。一般地块发病率为10～20％，重病地块发病面积常达50％以上，严重的达60～70％。病株常整株枯死，形成成片发病中心。花生白绢病是由齐整小核菌引起的土传真菌病害，在花生产区普遍发生，温暖地区发病更严重，轻者减产50％，重者绝收，造成巨大的经济损失。
目前花生病害的防控主要采用化学药剂防治，而长期使用化学药剂导致的食品安全、病原菌抗药性及生态破坏驱使人们寻找更安全、高效的解决措施。生物防治作为一种病害防治手段虽然不像化学农药那么高效、简便，但其对环境友好，而且防效稳定、持久，不产生抗药性，必将对农业的可持续发展起到十分重要的作用。
微生物肥料是用有活性的微生物制成的肥料产品，微生物可在植物根际、体表或体内及土壤中定殖，施入土壤后可在植物根际先占领生存空间，形成优势种群，减少病原菌对植物根部的侵害，对土传病害有很好的防效；微生物肥料必然是未来可持续发展的重要方向之一。因此，有必要提供一种防治花生土传病害的微生物肥料。
发明内容
本发明的目的是提供一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物药肥，所述生物药肥施于花生根部，可达到控制花生白绢病和花生茎腐病病害的目的，并对花生生长具有明显的促进作用。
本发明生物药肥采用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，于2016年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.12218。
本发明所提供的生物药肥，其质量百分含量组成如下：
甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂5％～10％，草炭20％～30％，锯末60％～70％；或，
甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂8％，草炭25％，锯末67％；
所述生物药肥中有效活菌数≥100亿/g；
其中，所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的质量百分含量组成如下：
甲基营养型芽孢杆菌母药粉10～30％、分散剂NNO 1～20％、十二烷基硫酸钠0.1～5％、余量的高岭土；或，
甲基营养型芽孢杆菌母药粉30％、分散剂NNO 10％、十二烷基硫酸钠2％、余量的高岭土。
其中，所述甲基营养型芽孢杆菌母药粉的质量百分含量组成如下：
甲基营养型芽孢杆菌发酵液90～99％，硅藻土1～10％；或，
甲基营养型芽孢杆菌发酵液98％，硅藻土2％。
其中，所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液按照下述方法制备得到：
1)将甲基营养型芽孢杆菌活化，然后接种于LB液体培养基中进行振荡培养，得到一级种子液；
2)将所述一级种子液接种于种子罐中进行培养，得到二级种子液；
3)将所述二级种子液接种于发酵罐中进行培养，当发酵液中90％以上的菌体转化为芽孢时，停止发酵，即得到所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液。
上述方法中，步骤1)中，活化的步骤如下：将所述甲基营养型芽孢杆菌接种于LB斜面培养基上，30℃～37℃下培养16～24h，然后挑取一环斜面菌接种于另一支LB斜面培养基上，30℃～37℃下培养16～24h后得到活化的菌种；
所述LB斜面培养基的组成为：蛋白胨10g/L、Yeast Extract 5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L、蒸馏水1L，pH 7.3；
步骤1)中，将所述甲基营养型芽孢杆菌接种于LB斜面培养基上，于30℃～37℃下培养16～24h；
所述振荡培养的条件如下：转速为150～180rpm，温度为30℃～37℃，时间为12～16h；
步骤2)中，所述一级种子液的接种量为1～5％；
在37℃下培养12～16h；
所述种子罐中培养基的组成为：黄豆饼粉15g/L、玉米粉10g/L、氯化钠10g/L、磷酸二氢钾8g/L、碳酸钙5g/L、pH 6.0～7.0；
步骤3)中，所述二级种子液的接种量为2～8％；
所述发酵罐中培养基的组成为：黄豆饼粉10g/L、玉米粉10g/L、麸皮5g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾5g/L、碳酸钙5g/L、pH 6.0～7.0。
所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液经过陶瓷膜进行浓缩2～10倍后得到浓缩液，然后与硅藻土混匀后通过喷雾干燥得到所述甲基营养型芽孢杆菌母药粉；然后与上述物料混合均匀制成甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，备用。
本发明还进一步提供了所述生物药肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)按配比将草炭、锯末混匀，粉碎后过60目筛，121℃湿热灭菌1h，冷却备用；
(2)按配比将所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂加入步骤(1)所得物料中，混合均匀即可。
本发明生物药肥施于花生根部(如稀释100倍)，能够防治花生白绢病和花生茎腐病，并能促进花生生长，具体能提高地上部鲜重、提高地下部鲜重、提高根长以及提高株高。
本发明甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对花生茎腐病菌和花生白绢病病原菌抑制率均达90％以上；利用本发明的生物药肥对花生进行灌根，对花生茎腐病和花生白绢病的防治效果达75％以上，并对花生生长具有明显的促进作用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、制备生物药肥
(1)制备甲基营养型芽孢杆菌发酵液
1)菌种活化：将甘油管保藏的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)取一环划线接种于LB斜面培养基上，37℃下培养20h，然后挑取一环斜面菌接种于另一支LB斜面培养基上，37℃下培养20h后得到活化的菌种。所述LB斜面培养基的组成为：蛋白胨10g/L、Yeast Extract 5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L、蒸馏水1L，pH7.3。
2)种子液制备：挑取活化后的单菌落接种于LB液体培养基中，160rpm、37℃下振荡培养14h，得到种子液；所述LB液体培养基的组成为：蛋白胨10g/L、Yeast Extract 5g/L、氯化钠10g/L、蒸馏水1L，pH 7.3。
3)种子罐种子液培养：将制备好的种子液按接种量3％(体积比)接入种子罐中，37℃下培养14h。种子罐培养基组成为：黄豆饼粉15g/L、玉米粉10g/L、氯化钠10g/L、磷酸二氢钾8g/L、碳酸钙5g/L、pH 6.0～7.0。
4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按接种量5％(体积比)接入发酵罐中，37℃下培养，当发酵液中90％以上的菌体转化为芽孢时，停止发酵，得到甲基营养型芽孢杆菌的发酵液；发酵培养基组成为：黄豆饼粉10g/L、玉米粉10g/L、麸皮5g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾5g/L、碳酸钙5g/L、pH 6.0～7.0。
(2)制备甲基营养型芽孢杆菌母药粉
将步骤(1)得到的发酵液经过陶瓷膜进行浓缩7倍后得到浓缩液，将98质量份浓缩液与2质量份硅藻土混匀后通过喷雾干燥塔制成甲基营养型芽孢杆菌母药粉。
(3)制备甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂
将步骤(2)得到的甲基营养型芽孢杆菌母药粉与分散剂NNO、十二烷基硫酸钠和高岭土混合均匀得到甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂；其中，各组分的质量百分含量为：甲基营养型芽孢杆菌母药粉30％、分散剂NNO 10％、十二烷基硫酸钠2％、高岭土58％。
(4)生物药肥
1)按配比将草炭、锯末混匀，粉碎后过60目筛，121℃湿热灭菌1h，冷却备用；
其中，各组分的质量百分含量为：甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂8％、草炭25％、锯末67％；
2)按配比将步骤(3)得到的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂加入步骤1)所得物料中，混合均匀即可。
实施例2、甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对花生茎腐病菌和花生白绢病菌的抑制效果
(1)试验方法：采用菌丝生长速率法，取甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂(有效活菌数100亿/g)10g加入带玻璃珠的100mL无菌水中，静置10min，在150rpm下充分振荡30min，制成菌悬液，取1mL菌悬液液加入到50mL融化冷却的PDA培养基中混匀后倒平板，制成含菌的PDA平板，在平板中央接种直径为5mm的病原菌菌饼(花生茎腐病菌-棉色二孢菌(Diplodia gossypina)，花生白绢病菌-齐整小核菌(Sclerotium rolfsii))，对照为空白PDA平板，每个处理设3个重复，待对照长满3/4培养皿时，十字交叉法测量对照组及处理组菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径mm-处理菌落直径mm)/对照菌落直径mm×100
(2)结果与分析：试验结果表明：当甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂中有效活菌数为0.2亿/g时，对花生茎腐病菌和花生白绢病菌的抑制率分别为97.5％和91.2％。
实施例3、生物药肥促生长作用的研究
(1)花生品种：鲁花13号。
(2)试验设计：将花生种子用2％次氯酸钠溶液表面消毒3min后用无菌水冲洗干净，将表面消毒的花生种子在无菌水中浸种12h，然后将种子置于垫湿纱布的培养皿中催芽至芽长2～3cm，播种于装有灭菌河沙的花盆中，每盆3粒，每个处理设置5个重复。置于25℃光照培养箱中培养30d，每隔7d浇一次生物药肥稀释液，并保持河沙湿润。
分为以下处理：①生物药肥稀释100倍进行灌根；②生物药肥稀释200倍进行灌根；③生物药肥稀释500倍进行灌根；对照用清水进行灌根。培养30d后将花生幼苗拔出，用清水将根上的河沙冲洗干净后用滤纸将根表面的水吸干，测量地上部鲜重、地下部鲜重、株高及主根长。
(3)结果分析：从表1可知，施用生物药肥不同稀释倍数进行灌根，花生幼苗地上部鲜重、地下部鲜重、根长和株高与对照相比均有不同程度的提高。当生物药肥稀释100倍进行灌根时，地上部鲜重、地下部鲜重、根长和株高较对照分别提高41.4％、53.6％、42.8％和29.1％。
表1生物药肥对花生幼苗的生长结果
实施例4、生物药肥对花生茎腐病菌和花生白绢病菌的田间效果验证
(1)花生品种：鲁花13号。
(2)病原菌麦粒菌种的制备：称取小麦200g，在清水中浸泡12h，控水捞出后加入到500mL三角瓶中进行灭菌，121℃湿热灭菌1h，灭2次；将活化后的茎腐病菌和白绢病菌分别接种到麦粒培养基中，25℃下培养7d后取出，放在干燥处风干，备用。
(3)试验设计：田间试验设置于山东省农科院试验基地，每个小区25m2，试验随机区组排列，花生种植行距为40cm，株距为10cm。试验前先将病原菌麦粒菌种按50g/行撒播于田中。将花生种子用2％次氯酸钠溶液表面消毒3min后用无菌水冲洗干净，将表面消毒的花生种子在无菌水中浸种12h，然后播种于含病原菌麦粒菌种的地块中，以不含病原菌麦粒菌种的地块为对照。每个处理设置3个重复，出苗后每7d浇一次水保湿以利于发病。待花生有零星发病时开始，以每株100mL进行灌根处理，每隔7d灌根一次，分别在茎腐病和白绢病发生的高峰时期记载和计算病情指数及防治效果。
分为以下处理：①生物药肥稀释100倍进行灌根；②生物药肥稀释200倍进行灌根；③生物药肥稀释500倍进行灌根；对照用清水进行灌根。
(4)调查方法：花生白绢病调查分级标准为：0级：植株无症状；1级：仅在茎基部产生病斑；2级：茎基部产生缢缩症状，整株的1/3以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；3级：整株的2/3以下表现系统症状；4级：整株的2/3以上表现系统症状。调查数据并计算防治效果。
花生茎腐病调查分级标准为：0级：枝叶生长旺盛，无萎蔫症状；1级：萎蔫枝叶不到整株的25％，茎部出现水渍状小病斑；3级：26％～50％的枝叶萎蔫，茎部形成黄褐色水渍状不规格病斑；5级：51％～75％的枝叶萎蔫，茎部出现深褐色坏死斑；7级：整株枯死，茎部组织黑色、腐烂，病部出现子实体。调查数据并计算防治效果。
病情指数(％)＝【Σ(病级株数×该值代表值)/(调查总株数×最高级代表值)】×100防效(％)＝【(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数】×100
(5)生物药肥对花生茎腐病菌和花生白绢病菌的田间防治效果
生物药肥在田间进行灌根处理，经过4周的调查发现(表2)，对照病情指数为54.57，处理1、处理2及处理3的病情指数分别为12.03、15.50及23.24，处理1发病情况比较轻，防效分别为77.95％、68.21％和52.33％，处理1的防治效果最佳。说明在田间试验中，生物药肥稀释100倍进行灌根，对花生茎腐病有较好的防效。
从表3中可以看出，4次调查后，对照的病情指数均高于其他三个处理，发病情况比较严重，说明用生物药肥进行灌根来防治花生白绢病是有效果的，处理1、处理2及处理3的防效分别为75.66％、61.14％及48.36％，处理1的防效比处理2和处理3更好，说明在田间试验中，生物药肥稀释100倍进行灌根，对花生白绢病有较好的防效。
表2生物药肥灌根田间试验防治花生茎腐病的效果测定
表3生物药肥灌根田间试验防治花生白绢病的效果测定
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生物药肥，其质量百分含量组成如下：
甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂5％～10％，草炭20％～30％，锯末60％～70％；
所述生物药肥中有效活菌数≥100亿/g；
所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂中的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12218。
2.根据权利要求1所述的生物药肥，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的质量百分含量组成如下：
甲基营养型芽孢杆菌母药粉10～30％、分散剂NNO 1～20％、十二烷基硫酸钠0.1～5％、余量的高岭土。
3.根据权利要求2所述的生物药肥，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌母药粉的质量百分含量组成如下：
甲基营养型芽孢杆菌发酵液90～99％，硅藻土1～10％。
4.根据权利要求3所述的生物药肥，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液按照下述方法制备得到：
1)将甲基营养型芽孢杆菌活化，然后接种于LB液体培养基中进行振荡培养，得到一级种子液；
2)将所述一级种子液接种于种子罐中进行培养，得到二级种子液；
3)将所述二级种子液接种于发酵罐中进行培养，当发酵液中90％以上的菌体转化为芽孢时，停止发酵，即得到所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液。
5.根据权利要求4所述的生物药肥，其特征在于：步骤1)中，将所述甲基营养型芽孢杆菌接种于LB斜面培养基上，于30℃～37℃下培养16～24h；
所述振荡培养的条件如下：转速为150～180rpm，温度为30℃～37℃，时间为12～16h。
6.根据权利要求4或5所述的生物药肥，其特征在于：步骤2)中，所述一级种子液的接种量为1～5％；
在37℃下培养12～16h；
所述种子罐中培养基的组成为：黄豆饼粉15g/L、玉米粉10g/L、氯化钠10g/L、磷酸二氢钾8g/L、碳酸钙5g/L、pH 6.0～7.0；
步骤3)中，所述二级种子液的接种量为2～8％；
所述发酵罐中培养基的组成为：黄豆饼粉10g/L、玉米粉10g/L、麸皮5g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾5g/L、碳酸钙5g/L、pH 6.0～7.0。
7.权利要求1-6中任一项所述生物药肥在防治花生白绢病和花生茎腐病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：在花生生育期内，将所述生物药肥施于花生根部。
9.权利要求1-6中任一项所述生物药肥在促进花生生长中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：将所述生物药肥施于花生根部；
所述应用具体表现为下述任一种：
a)提高地上部鲜重；
b)提高地下部鲜重；
c)提高根长；
d)提高株高。
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