CN116083305A - 甲基营养型芽孢杆菌和生物复合肥以及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物和作物病害防治技术领域，具体涉及甲基营养型芽孢杆菌和生物复合肥以及它们的应用。本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌和生物复合肥均能够培肥地力、有效提升土壤生物活性和修复土壤，且对土传真菌和细菌病害具有显著的防控效果，有利于提高作物的产量和品质，并且其二者具有协同增效作用，共同施用时的作物促生增产以及病害防治效果能得到进一步提高。

Description

甲基营养型芽孢杆菌和生物复合肥以及它们的应用
技术领域
本发明涉及微生物和作物病害防治技术领域，具体涉及甲基营养型芽孢杆菌和生物复合肥以及它们的应用。
背景技术
施用有机肥被认为是土地培肥、实现农业循环发展、保持土壤健康和粮食安全的重要举措，由于有机肥中富含氮、磷、钾等作物生长所需的营养元素，通常具有提高耕地地力和土壤生物功能活性，实现资源的循环利用的功能。施加有机肥可以有效减少化肥的施用量，降低因过量施用化肥所带来的环境污染。与施用化肥相比，施用有机肥更能提高土壤细菌、真菌以及原生生物的数量和多样性，并显著改变微生物和原生生物的群落结构。施加有机肥还可以改善土壤理化性质，阻控土壤酸化，增加土壤的酶活性和有效氮磷含量，促进了土壤肥力和作物产量快速提升。有机肥输入的有机质和养分元素会通过自下而上的作用影响土壤微食物网中生物的多样性和生态功能。对调控农田生态系统养分转化、作物增产以及降低作物土传病害发病率中发挥着至关重要作用。
然而，现有的生物有机肥常采用的菌株通常是经过突变筛选，或定向改造的菌株，其虽然在实验室研究阶段能够获得较好的促生参数指标数据，但是实际应用中却易表现出难以在土壤或植物中定殖，或受到环境因素(例如复杂的种植环境变化、土壤中其他微生物的互作等)的影响而难以增殖或难以发挥促生作用等问题。因此，基于天然菌株的微生物肥料研发逐渐成为本领域的热门研究课题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供甲基营养型芽孢杆菌和生物复合肥以及它们的应用。本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌是一株天然的植物根际菌，具有良好的土壤和植物根际定殖能力，并且能够有效防治真菌和细菌导致的植物土传病害。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，所述甲基营养型芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 20221661。
本发明第二方面提供第一方面所述的甲基营养型芽孢杆菌在生物有机肥制备中的应用。
本发明第三方面提供一种生物复合肥，所述生物复合肥包含生物有机肥和基础有机肥；
其中，所述生物有机肥包括：中药渣40-60重量份、生物炭20-30重量份、茶渣20-30重量份、油枯10-15重量份和任选的微生物发酵菌剂2-5重量份；
所述基础有机肥包括：矿源黄腐酸钾10-15重量份、海藻酸源8-13重量份、中微量元素源5-10重量份、小檗碱1-2重量份。
本发明第四方面提供第一方面所述的甲基营养型芽孢杆菌和第三方面所述的生物复合肥在作物土传病害防控中的应用。
本发明第五方面提供一种防控作物土传病害的方法，所述方法包括将微生物制剂和/或生物复合肥施用于土壤中，和/或，将微生物制剂和/或生物复合肥与作物植株接触，其中，所述微生物制剂中含有第一方面所述的甲基营养型芽孢杆菌和/或第一方面所述的甲基营养型芽孢杆菌的代谢产物，所述生物复合肥为第三方面所述的生物复合肥。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
(1)本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌是一株从植物根际分离的天然菌株，其相比于本领域中目前常用于微生物肥料制备的诱导突变菌株或基因工程菌株而言具有更好的土壤定殖能力，将该菌株添加到特定成分的肥料中更利于发挥菌株的防病和增产特性，从而能取得优良的病害防控和增产效果。
(2)本发明提供的生物复合肥对于作物的生长具有良好的促进效果，且能够抑制细菌和真菌导致的土传病害，施用该生物复合肥可降低土传病害发病率，能够有效解决目前土传病害发病率高、难以长期持续防治的问题。且该生物复合肥与本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌具有协同增效作用，将其配合使用，对降低作物土传病害发病率具有显著的提升效果。
(3)本发明提供的生物复合肥原料采用中药渣、茶渣、油枯等生产副产品(废弃物)作为主要原料，具有原料来源广、成本低、绿色环保等特点，实现了废弃物资源化，能够促进产业结构调整，对于农业总产值提高和农民增收具有积极意义。同时，该生物符合肥还具有制备方法简单、存储稳定性高等优点。
(4)本发明提供的防控作物土传病害的方法简单易行，所采用的甲基营养型芽孢杆菌和生物复合肥具有绿色环保的特点，不会对环境安全产生不利影响，能够促进农业生产可持续发展。
生物保藏
本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，已于2022年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20221661。
附图说明
图1是实施例1中构建的甲基营养型芽孢杆菌N02的系统发育树。
图2是实施例1中甲基营养型芽孢杆菌N02与对比菌株CICC 10048的解磷效果对比图。
图3是实施例1中甲基营养型芽孢杆菌N02与对比菌株CICC 10048的固氮效果对比图。
图4是实施例1中甲基营养型芽孢杆菌N02对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、土赤壳菌、青枯病菌和软腐果胶杆菌的拮抗效果图。
图5是实施例1中对比菌株CICC 10048对尖孢镰刀菌的拮抗效果图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，甲基营养型芽孢杆菌N02和甲基营养型芽孢杆菌CCTCC NO：M 20221661是同一菌株，其二者意义相同，其名称(编号)可以互换使用。
本发明的发明人在研究的过程中分离获得一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，命名为N02，于2022年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221661。经过进一步研究，发明人巧妙地发现，将该甲基营养型芽孢杆菌施用于土壤中时，能够有效降低作物土传病害发病率，尤其是对于一些细菌和真菌导致的作物土传病害具有极好的防控效果。另外，发明人在研究过程中还发现，通过将中药渣、生物炭、茶渣、油枯等农副产业废弃物与矿源黄腐酸、海藻酸、小檗碱以及少量化肥混合制成的有机肥料不仅能够有效促进作物生长，对于细菌类和真菌类土传病害也具有良好的防治效果。并且，通过甄选有机肥的原料，将其按照特定比例进行复配，获得的生物复合肥与前述甲基营养型芽孢杆菌CCTCC NO：M 20221661具有良好的协同增效效果，一同施用时能够进一步提高对作物土传病害的防治效果。
基于上述发现，本发明一方面提供一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，所述甲基营养型芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M20221661。
本发明第二方面提供第一方面所述的甲基营养型芽孢杆菌在生物有机肥制备中的应用。
本发明中，采用所述甲基营养型芽孢杆菌进行生物有机肥制备时，可以直接将其与其他生物有机肥原料混合，进行生物有机肥发酵制备，也可以将所述甲基营养型芽孢杆菌制成菌剂，然后将该菌剂与成品生物有机肥混合。
本发明中，对于所述菌剂的具体剂型没有特别限制，任意本领域常用的菌剂类型均可适用于本发明。例如可以为固体菌剂、液体菌剂或是半固体(浓缩)菌剂等常见的菌剂类型。所述菌剂中，可以仅含甲基营养型芽孢杆菌CCTCC NO：M 20221661作为活性组分，也可以额外添加其他菌株或化合物一同作为活性组分。另外，所述菌剂中还可以含有辅料。本发明对于所述菌剂中选用的辅料和其他活性组分及其含量没有特别限制，只要其对于甲基营养型芽孢杆菌CCTCC NO：M 20221661的作用没有不利影响，或基本没有不利影响(例如加入辅料或其他共同活性组分后，该菌株的作用效果不低于仅采用该菌株时的80％)即可。本领域中常用于菌剂制备的辅料均可适用于本发明，例如保护剂、缓冲剂、赋形剂、黏合剂、填充剂等。
本发明第三方面提供一种生物复合肥，所述生物复合肥包含生物有机肥和基础有机肥；
其中，所述生物有机肥包括：中药渣40-60重量份、生物炭20-30重量份、茶渣20-30重量份、油枯10-15重量份和任选的微生物发酵菌剂2-5重量份；
所述基础有机肥包括：矿源黄腐酸钾10-15重量份、海藻酸源8-13重量份、中微量元素源5-10重量份、小檗碱1-2重量份。
本发明中，对于用作生物复合肥的原料(如生物有机肥中的中药渣、生物炭、茶渣和油枯等，以及基础有机肥中的矿源黄腐酸钾、海藻酸源、中微量元素源和小檗碱等)没有特别限制，其可以是本领域任意能够用于复合肥制备的相关产品，既可以是商购获得的相关产品，也可以是按照现有技术自行制备的相关产品。
本发明中，“任选的”是指该成分属于非必须成分，本领域技术人员可以根据实际情况选择是否添加该成分。本发明提供的技术方案中，不添加“任选的”成分时即可实现本发明的目的(例如降低土传病害发病率，促进作物生长，提高作物产量等)，但是若添加该“任选的”成分，则可以进一步提高效果。
也即，本发明提供的生物复合肥中所含的生物有机肥为以下任意一种：
(1)中药渣40-60重量份、生物炭20-30重量份、茶渣20-30重量份、油枯10-15重量份；
(2)中药渣40-60重量份、生物炭20-30重量份、茶渣20-30重量份、油枯10-15重量份和微生物发酵菌剂2-5重量份。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述生物有机肥中，中药渣、生物炭、茶渣和油枯的重量比为1-8∶1-3∶1-3∶1。优选为3-6∶1.5-2.5∶1.5-2.5∶1。
本发明中，所述生物有机肥中的微生物发酵菌剂用于提供能够促进作物生长和/或能够防控作物土传病害的微生物和/或其代谢物。任意具有上述作用的微生物均可适用于本发明。根据本发明的优选实施方式，其中，所述微生物发酵菌剂中含有保藏编号为CCTCC NO：M 20221661的甲基营养型芽孢杆菌。本发明中，所述微生物发酵菌剂可以仅含甲基营养型芽孢杆菌CCTCC NO：M 20221661(和/或其代谢物)作为活性组分，也可以还含有其他具有相同或类似效果的菌株共同作为活性组分。为了避免不同菌株共同使用对菌株效果造成不良影响，本发明优选所述微生物发酵菌剂中仅含甲基营养型芽孢杆菌CCTCC NO：M20221661(和/或其代谢物)作为活性组分。
优选地，所述微生物发酵菌剂的含量占所述生物有机肥总重量的5-25重量％。优选为10-20重量％。更优选为10-15重量％。
更优选地，所述微生物发酵菌剂的含量使得甲基营养型芽孢杆菌在所述生物有机肥中的含量不低于1×107cfu/g。优选为1×108-1×1010cfu/g。更优选为1×109-5×109cfu/g。进一步优选为1.5×109-3×109cfu/g。
进一步优选地，所述微生物发酵菌剂的含量使得甲基营养型芽孢杆菌在所述生物复合肥中的含量不低于1×107cfu/g。优选为1×108-1×1010cfu/g。更优选为1×109-3×109cfu/g。进一步优选为1.5×109-2×109cfu/g。
本发明的发明人在研究中还发现，当用于制备上述生物复合肥的原料中某些成分的含量在特定范围内时，获得的生物复合肥具有更好的作物促生和病害防控效果。
基于此，根据本发明的优选实施方式，其中，所述中药渣中水分含量为50-80重量％。优选为50-70重量％。更优选为55-65重量％。
优选地，所述中药渣中，以干物质计，粗蛋白含量为1-10重量％，粗脂肪含量为0.5-3重量％，木质素含量为10-30重量％，(游离)氨基酸含量为1-15重量％，油脂含量为10-25重量％，糖类含量为1-15重量％，维生素含量为5-20重量％，氮、磷、钾(分别以N、P2O5和K2O计)的总含量为1-10重量％。
更优选地，所述中药渣中，以干物质计，粗蛋白含量为3-6重量％，粗脂肪含量为1-2重量％，粗纤维含量为20-25重量％，木质素含量为15-25重量％，(游离)氨基酸含量为5-10重量％，油脂含量为15-20重量％，糖类含量为5-10重量％，维生素含量为8-15重量％，氮、磷、钾(分别以N、P2O5和K2O计)的总含量为3-7重量％。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述生物炭中水分含量为10-30重量％，优选为10-20重量％。
优选地，所述生物炭中，以干物质计，腐殖酸含量为40-60重量％，蛋白质含量为40-60重量％，氮(以N计)含量为5-15重量％，磷(以P2O5计)含量为1-5重量％，钾(以K2O计)含量为1-5重量％。
更优选地，所述生物炭中，以干物质计，腐殖酸含量为50-55重量％，蛋白质含量为52-58重量％，氮(以N计)含量为5-10重量％，磷(以P2O5计)含量为1-3重量％，钾(以K2O计)含量为1-3重量％。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述油枯中水分含量为10-30重量％，优选为10-20重量％。
优选地，所述油枯中，以干物质计，有机质含量为50-70重量％，腐殖酸含量为10-20重量％，粗蛋白含量为50-70重量％，粗纤维含量为1-10重量％，氮(以N计)含量为1-10重量％，磷(以P2O5计)含量为1-7重量％，钾(以K2O计)含量为1-5重量％。
更优选地，所述油枯中，以干物质计，有机质含量为60-70重量％，腐殖酸含量为14-18重量％，粗蛋白含量为55-65重量％，粗纤维含量为5-10重量％，氮(以N计)含量为3-7重量％，磷(以P2O5计)含量为2-5重量％，钾(以K2O计)含量为1-3重量％。
更优选地，所述油枯选自豆饼、菜籽饼、芝麻饼、油茶饼及花生饼中的至少一种。也即，所述油枯为采用大豆、菜籽、芝麻、油茶及花生等压榨食用油后剩余的残渣。优选所述油枯为菜籽饼。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述茶渣中水分含量不超过30重量％，优选为10-20重量％。
优选地，所述茶渣中，以干物质计，有机碳含量为40-70重量％，腐殖酸含量为15-30重量％，全氮含量(以N计)为2-10重量％。
更优选地，所述茶渣中，以干物质计，有机碳含量为55-65重量％，腐殖酸含量为20-28重量％，全氮含量(以N计)为5-10重量％。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述基础有机肥中，矿源黄腐酸、海藻酸源、中微量元素源和小檗碱的重量比为1-5∶1-3∶0.1-1∶1。优选为1-3∶1-2∶0.1-0.5∶1。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述矿源黄腐酸钾中水分含量不超过30重量％，优选为10-20重量％。
优选地，所述矿源黄腐酸钾中，以干物质计，黄腐酸含量为40-60重量％，腐殖酸含量为20-50重量％，全钾含量(以K2O计)为10-20重量％。
更优选地，所述矿源黄腐酸钾中，以干物质计，黄腐酸含量为40-50重量％，腐殖酸含量为30-40重量％，全钾含量(以K2O计)为12-16重量％。
本发明中，海藻酸源是指能够为基础有机肥提供海藻酸的物质，其可以是单纯的海藻酸(凝胶)，也可以含有少量的其他物质(例如形成商业产品过程中可能添加的赋形剂、防腐剂、缓冲剂等对于有机肥效果没有影响，或基本没有影响的成分)。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述海藻酸源中，海藻酸含量为45-65重量％。优选为45-55重量％。
本发明中，中微量元素源是指能够为基础有机肥提供中微量元素的物质，其可以为采用多种试剂复配的混合物。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述中微量元素源中，以干物质计，P2O5含量为5-15重量％，CaO含量为5-15重量％，MgO含量为1-10重量％，SiO2含量为0.01-0.05重量％。
小檗碱，又称为黄连素，是一种从黄连中分离出的季铵生物碱。根据本发明的优选实施方式，其中，所述小檗碱中水分含量不超过5重量％，优选为0.5-2重量％。
优选地，所述小檗碱的纯度为95-99％。
本发明中，对于所述生物复合肥中的生物有机肥和基础有机肥的用量配比没有特别限制，只要获得的生物复合肥能够促进作物生长，防治土传病害即可。为了进一步提高该生物复合肥的作物促生和病害防控效果，根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述生物有机肥和基础有机肥的重量比为1-7∶1。优选为2-6∶1。更优选为2-5∶1。进一步优选为2-4∶1。例如，可以为2∶1、2.2∶1、2.5∶1、2.8∶1、3∶1、3.2∶1、3.4∶1、3.5∶1、3.8∶1、4∶1，或者也可以为上述任意两个比值之间的任意中间值。
本发明第四方面提供第一方面所述的甲基营养型芽孢杆菌和第三方面所述的生物复合肥在作物土传病害防控中的应用。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述病害选自真菌类病害和/或细菌类病害。
优选地，造成所述真菌类病害的病原体包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和土赤壳菌(Ilyonectria liriodendri)中的至少一种，优选为尖孢镰刀菌。
优选地，造成所述细菌类病害的病原体包括青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和/或软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)，优选为青枯病菌。
本发明第五方面提供一种防控作物土传病害的方法，所述方法包括将微生物制剂和/或生物复合肥施用于土壤中，和/或，将微生物制剂和/或生物复合肥与作物植株接触，其中，所述微生物制剂中含有第一方面所述的甲基营养型芽孢杆菌和/或第一方面所述的甲基营养型芽孢杆菌的代谢产物，所述生物复合肥为第三方面所述的生物复合肥。
本发明提供的方法中采用的甲基营养型芽孢杆菌以及生物复合肥的具体特征如前所述，在此不再赘述。
本发明提供的方法中，对于微生物制剂以及生物复合肥的具体用量没有特别限制，只要能够起到促进作物生长、降低土传病害发病率的作用即可。由于本发明提供的生物复合肥中的生物有机肥和基础有机肥的成分与甲基营养型芽孢杆菌N02共同施用时具有协同增效作用，因此，当单独施用(含甲基营养型芽孢杆菌N02的)微生物制剂时，可适当提高用量。
当单独施用微生物制剂时，根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述微生物制剂的施用量使得甲基营养型芽孢杆菌的用量为1×1011-1×1013cfu/株/次。优选为1×1012-1×1013cfu/株/次。更优选为1×1012-5×1012cfu/株/次。进一步优选为2×1012-4×1012cfu/株/次。
根据本发明的另一种优选实施方式，其中，所述微生物制剂的施用量使得甲基营养型芽孢杆菌的用量为1×1014-1×1017cfu/亩/次。优选为1×1015-1×1017cfu/亩/次。更优选为1×1015-5×1016cfu/亩/次。进一步优选为4×1015-1×1016cfu/亩/次。
当施用含有微生物发酵菌剂的生物复合肥(即将微生物制剂与生物复合肥共同施用)时，所述生物复合肥的用量使得甲基营养型芽孢杆菌的用量为1×1013-1×1016cfu/亩/次。优选为1×1014-1×1015cfu/亩/次。更优选为2×1014-5×1015cfu/亩/次。进一步优选为4×1014-4×1015cfu/亩/次。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述生物复合肥施用于土壤中的用量可以为200-2000kg/亩/次。对于不同种类的作物，本发明提供的生物复合肥的施用量可以有所不同。例如，对于烟草、蔬菜(例如黄瓜、番茄、魔芋等)等草本作物，可以采用200-500kg/亩/次的施用量，对于果树类(例如苹果等)的木本作物，可以采用1000-2000/亩/次的施用量。
优选地，所述微生物制剂和/或生物复合肥的施用频率为每个作物周期1-5次。
优选地，所述接触的方式包括将所述微生物制剂和/或生物复合肥与水混合配制成混悬液后喷淋在植株表面，或者，将所述微生物制剂和/或生物复合肥与水混合配制成混悬液浇淋在植株根际。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌N02的分离、纯化、鉴定以及保藏。
(1)菌株分离和鉴定
发明人在研究过程中，从云南省丽江市长期轮作健康的烟草根际土壤分离获得一株甲基营养型芽孢杆菌，命名为N02。菌株分离的方法包括：稀释涂布平板法。
菌株形态学鉴定及生理生化特征：参照《伯杰氏系统分类手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行。
菌株分子生物学鉴定：菌株将菌株接种至纯化液体培养基中，37℃恒温摇床中180r/min振荡培养过夜，无菌条件下取样于紫外分光光度计下读取培养菌液OD600值，当OD600值近似于1.00(约1×109cfu/mL)时停止培养。采用TaKaRa MiniBEST BacteriaGenomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取拮抗菌的基因组DNA(具体操作步骤参考试剂盒附带说明书)。采用细菌16S rDNA通用引物27F/1492R(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性60s；53℃退火60s；72℃延伸2min；35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。反应结束后，取5μL反应产物，经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果经BLAST搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后与GenBank数据库中相关种属的基因序列进行比较分析，选用同源性较高的模式菌株序列作为参比对象，用Clustal X 1.8软件进行多序列比对，计算供试菌株与参比菌株序列的相似性。系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用邻接法(Neighbor-joining a nalysis)用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。其中，Bootstrap值设定为1000，其余均为默认值。
形态学鉴定及生理生化鉴定结果如下：菌株N02为革兰氏阳性细菌，菌落形态呈白色、扁平状，接触酶、淀粉水解、硝酸还原反应、吲哚反应、柠檬酸反应、精氨酸双水解、蔗糖发酵反应、葡萄糖发酵反应、固氮作用及明胶反应等均为阳性，MR反应和尿素酶反应则为阴性。
分子生物学鉴定鉴定结果如下：经NCBI Blast分析，N02的16S rDNA序列与甲基营养型芽孢杆菌KC790236相似度为100％，利用邻接法构建的系统发育树如图1所示。
结合形态学生理生化特征及分子生物学鉴定结果，菌株N02为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)
(2)菌株特征研究
解磷效果检测：将纯化的菌株N02接种至溶无机磷细菌选择培养基(葡萄糖10.0g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母浸粉0.5g/L，氯化钠0.3g/L，氯化钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，磷酸钙5.00g/L，pH 7-7.5)上，置于30℃培养箱中培养72h，观察记录溶磷圈产生情况。
采用上述溶磷检测方法，将其中的甲基营养型芽孢杆菌替换为等量的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种号为CICC 10048)。
结果如图2所示，从图中可以看出，菌株N02具有较好的溶磷能力，溶磷圈平均直径为18.66mm；而甲基营养型芽孢杆菌CICC 10048的溶磷圈平均直径为5.12mm。
固氮活性检测：将纯化的菌株N02接种至固氮菌选择培养基(KH2PO4 0.2g/L、MgSO40.2g/L、NaCl 0.2g/L、CaCO3 5.0g/L、甘露醇10.0g/L、CaSO4 0.1g/L、琼脂18.0g/L、pH6.8-7)，置于30℃培养箱中培养72h，观察记录具透明圈产生情况。
采用上述固氮活性检测方法，将其中的甲基营养型芽孢杆菌替换为等量的对照甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10048)。
结果如图3所示，从图中可以看出，菌株N02可在固氮菌选择培养基上产生透明圈)，且透明圈直径较大，说明菌株N02具有较好的固氮活性；而对照菌株CICC 10048不具有固氮活性。
拮抗病原物检测：采用平板对峙法进行实验，具体步骤包括在PDA培养基中心接种3mm的病原菌菌饼，并按照十字形在其距离其25mm处接种拮抗菌株，未接种的平板作为对照，每菌株3个重复，置于25-28℃的恒温培养箱黑暗条件培养5-7天(培养温度和时间视病原菌耳钉)，观察抑菌圈的产生情况并计算抑菌率。
为了对比菌株N02与现有生防菌的拮抗效果，采用上述拮抗活性检测方法，将其中的甲基营养型芽孢杆菌替换为等量的对照甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种号为CICC 10048)进行测试。
根据平板对峙实验结果可知，甲基营养型芽孢杆菌N02对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、土赤壳菌(Ilyonectria liriodendri)青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)均具有抑制作用(图4)，经计算，抑菌率分别为92.3％、89.6％、90.5％、90.2％、91.1％；而对照甲基营养型芽孢杆菌CICC 10048仅对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有抑制作用(图5)，经计算，抑菌率为85.6％。
(3)菌株保藏
发明人于2022年10月26日将上述甲基营养型芽孢杆菌N02保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221661。
实施例2
按照表2中的配方配制生物复合肥。具体配制方法包括：按照表2中的用量比例称取原料，将其混合均匀即获得生物复合肥。
其中采用的中药渣购自山东旭杰化工有限公司，生物炭购自河南星源环保材料有限公司，矿源黄腐酸钾购自济南裕沅生物科技有限公司，茶渣购自华秣(山东)生物科技有限公司，油枯为采集自昆明明溪榨油厂生产过程中产生的废弃油枯(成分为菜籽饼)，海藻酸购自河南万永生物科技有限公司，其中海藻酸含量约为50重量％，小檗碱购自四川维克奇生物科技有限公司，其中水分含量约为0.8重量％，小檗碱纯度约为98％。中微量元素源为采用市售复合肥和中微量元素肥复配的混合物，其中，以干物质计，P2O5含量约为8重量％，CaO含量约为10重量％，MgO含量约为4重量％，SiO2含量约为0.01重量％。微生物发酵菌剂为通过将甲基营养型芽孢杆菌N02扩培、干燥后制备的固体菌剂，其中甲基营养型芽孢杆菌含量为2×1010cfu/g。
对采用的物料中的成分进行检测，所有物料中，糖类含量采用硫酸苯酚法测定，粗蛋白含量采用凯式定氮法测定，黄腐酸含量采用重铬酸钾氧化比色法测定，腐殖酸含量采用焦磷酸钠碱液提取法测定，粗纤维含量采用酸碱消煮法法测定，氨基酸含量采用茚三酮比色法测定，油脂含量采用乙醚提取法法测定，维生素含量采用光谱分析法法测定，木质素含量采用硫酸法(Klason法)测定，氮含量(以N计)采用凯氏消解方法测定，磷含量(以P2O5计)采用钼锑抗比色法测定，钾含量(以K2O计)采用火焰光度计法测定。
检测结果如表1所示(其中水含量以物料总重量为基准计算，其余成分以物料中干物质为基准计算)。
表1生物复合肥物料成分
Figure BDA0004031208740000161
表2生物复合肥配方
Figure BDA0004031208740000171
*微生物发酵菌剂的添加量为占生物有机肥总重的百分比。
实施例3
采用表2中生物复合肥B1的配方，将其中的矿源黄腐酸钾替换为等重量的生化黄腐酸钾(成分详见表3)。获得生物复合肥B6。
表3替换生化黄腐酸钾成分
Figure BDA0004031208740000172
测试例1
按照表4中的用量，在植株根际土壤中施用上述实施例中获得的生物复合肥，并在其他条件均保持一致的情况下同时进行培养。具体施肥方式如下：
苹果：于秋季苹果采收完后和春季萌芽期各施用于土壤中一次，施肥时在植株根周进行刨坑处理，即用刨土铲沿植株四周3-5cm且距离地面10-13cm深刨土，将生物复合肥均匀撒入坑中再覆土即完成施肥处理。
魔芋：种植前10天播撒施用1次，在生长期施用1次。
番茄：种植前播撒施用1次，于第一穗果膨大期再施用1次。
黄瓜：种植前播撒施用1次，于第一穗果膨大期再施用1次，盛瓜期每收获1-2次施用1次。
烟草：于移栽前播撒施用1次，于团棵期再施用1次。
在不同区域划分处理组(按照表4的用量施用生物复合肥)和对照组(不施用任何肥料)，按照以下标准于收获期调查发病情况，并计算防治效果。
根腐病调查分级标准：
0级：根部和茎基部正常；
1级：根部和茎基部有少数病斑；
3级：根部和茎基部病斑多，面积点根部或茎基部总面积的25％-50％；
5级：根部和茎基部病斑较大，面积点根部或茎基部总面积的50％-75％；
7级：根部和茎基部病斑连片，形成绕根茎现象，但根系并未死亡；
9级：根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。
番茄青枯病调查分级标准：
0级：无症状；
1级：1片叶片萎蔫；
2级：2-3片叶片萎蔫；
3级：除顶部2-3片叶外，其他叶片萎蔫；
4级：整株叶片萎蔫。
魔芋软腐病调查分级标准：
0级：无发病症状；
1级：<25％植株出现软腐症状；
2级：25％-75％植株出现软腐症状；
3级：＞75％植株出现软腐症状
防治效果的计算采用下列两公式：
病情指数＝[(∑(病级株数×代表级数))/(总株数×最高代表级值)]×100
防治效果(％)＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100％
表4施用生物复合肥对土传病害的防治效果
Figure BDA0004031208740000191
注：表4中各组数据均为测量数据的平均值，“化肥”是指施用化肥的对照组，其中所用的化肥采用尿素、过磷酸钙和硫酸钾自行配制获得，其中的N、P、K的重量比为8∶16∶26。
测试例2
采用NB培养基(购自海博科技有限公司，制备方法为用天平称取18g培养基粉末，加1000mL去离子水溶解后分装。121℃，高温蒸汽灭菌15分钟)对甲基营养型芽孢杆菌N02进行培养，获得活菌数约为2×1010cfu/mL的甲基营养型芽孢杆菌培养液。
按照以下方式对供试植物进行处理，菌株培养液和菌剂施用方法与测试例1中的生物复合肥的施用方法相同：
实验组I：将甲基营养型芽孢杆菌培养液浇淋至植株根际。
实验组II：将甲基营养型芽孢杆菌菌剂(即实施例2中用于配制生物复合肥的固体菌剂，活菌数约为2×1010cfu/g)施用于植株根际土壤中。
对照组：土壤中不施用任何菌剂。
按照测试例1中的调查方法，对各组病害发病率进行调查(苹果于秋季采收期进行调查，黄瓜、烟草、番茄和魔芋于施用后3个月进行调查)。并计算病害防治效果结果详见表5。
表5甲基营养型芽孢杆菌制剂对土传病害的防治效果
Figure BDA0004031208740000201
注：表5中，实验组I的施用量按1mL培养液重量为1g计算。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 20221661。
2.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌在生物有机肥制备中的应用。
3.一种生物复合肥，其特征在于，所述生物复合肥包含生物有机肥和基础有机肥；
其中，所述生物有机肥包括：中药渣40-60重量份、生物炭20-30重量份、茶渣20-30重量份、油枯10-15重量份和任选的微生物发酵菌剂2-5重量份；
所述基础有机肥包括：矿源黄腐酸钾10-15重量份、海藻酸源8-13重量份、中微量元素源5-10重量份、小檗碱1-2重量份。
4.根据权利要求3所述的生物复合肥，其中，所述生物有机肥和基础有机肥的重量比为1-7∶1；
优选地，所述生物有机肥中，中药渣、生物炭、茶渣和油枯的重量比为1-8∶1-3∶1-3∶1；
优选地，所述基础有机肥中，矿源黄腐酸、海藻酸源、中微量元素源和小檗碱的重量比为1-5∶1-3∶0.1-1∶1；
和/或，所述微生物发酵菌剂中含有保藏编号为CCTCC NO：M 20221661的甲基营养型芽孢杆菌；
优选地，所述微生物发酵菌剂的含量占所述生物有机肥总重量的5-25重量％；
更优选地，所述微生物发酵菌剂的含量使得甲基营养型芽孢杆菌在所述生物有机肥中的含量不低于1×107cfu/g。
5.根据权利要求3或4所述的生物复合肥，其中，所述中药渣中水分含量为50-80重量％，优选为50-70重量％；
优选地，所述中药渣中，以干物质计，粗蛋白含量为1-10重量％，粗纤维含量为15-30重量％，木质素含量为10-30重量％，氨基酸含量为1-15重量％，油脂含量为10-25重量％，糖类含量为1-15重量％，维生素含量为5-20重量％，氮、磷、钾的总含量为1-10重量％；
和/或，所述生物炭中水分含量为10-30重量％，优选为10-20重量％；
优选地，所述生物炭中，以干物质计，腐殖酸含量为40-60重量％，蛋白质含量为40-60重量％，氮含量为5-15重量％，磷含量为1-5重量％，钾含量为1-5重量％；
和/或，所述油枯中水分含量为10-30重量％，优选为10-20重量％；
优选地，所述油枯中，以干物质计，有机质含量为50-70重量％，腐殖酸含量为10-20重量％，粗蛋白含量为50-70重量％，粗纤维含量为1-10重量％，氮含量为1-10重量％，磷含量为1-7重量％，钾含量为1-5重量％；
和/或，所述茶渣中水分含量不超过30重量％，优选为10-20重量％；
优选地，所述茶渣中，以干物质计，有机碳含量为40-70重量％，腐殖酸含量为15-30重量％，全氮含量为2-10重量％；
和/或，所述矿源黄腐酸钾中水分含量不超过30重量％，优选为10-20重量％；
优选地，所述矿源黄腐酸钾中，以干物质计，，黄腐酸含量为40-60重量％，腐殖酸含量为20-50重量％，全钾含量为10-20重量％；
和/或，所述海藻酸源中，以干物质计，海藻酸含量为45-65重量％；
和/或，所述中微量元素源中，以干物质计，P2O5含量为5-15重量％，CaO含量为5-15重量％，MgO含量为1-10重量％，SiO2含量为0.01-0.05重量％；
和/或，所述小檗碱中水分含量不超过5重量％，优选为0.5-2重量％；
优选地，所述小檗碱的纯度为95-99％。
6.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌和权利要求2-5中任意一项所述的生物复合肥在作物土传病害防控中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述病害选自真菌类病害和/或细菌类病害；
优选地，造成所述真菌类病害的病原体包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和土赤壳菌(Ilyonectria liriodendri)中的至少一种，优选为尖孢镰刀菌；
优选地，造成所述细菌类病害的病原体包括青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和/或软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)，优选为青枯病菌。
8.一种防控作物土传病害的方法，其特征在于，所述方法包括将微生物制剂和/或生物复合肥施用于土壤中，和/或，将微生物制剂和/或生物复合肥与作物植株接触，其中，所述微生物制剂中含有权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌和/或权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌的代谢产物，所述生物复合肥为权利要求3-5中任意一项所述的生物复合肥。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述病害选自真菌类病害和/或细菌类病害；
优选地，造成所述真菌类病害的病原体包括尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌和土赤壳菌中的至少一种，优选为尖孢镰刀菌；
优选地，造成所述细菌类病害的病原体包括青枯病菌和/或软腐果胶杆菌，优选为青枯病菌。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述微生物制剂和/或生物复合肥的施用量使得所述甲基营养型芽孢杆菌的用量为1×1011-1×1013cfu/株/次，或者为1×1014-1×1017cfu/亩/次，或者为1×1013-1×1016cfu/亩/次；
和/或，所述生物复合肥施用于土壤中的用量为200-2000kg/亩/次；
优选地，所述微生物制剂和/或生物复合肥的施用频率为每个作物周期1-5次；
优选地，所述接触的方式包括将所述微生物制剂和/或生物复合肥与水混合配制成混悬液后喷淋在植株表面，或者，将所述微生物制剂和/或生物复合肥与水混合配制成混悬液浇淋在植株根际。
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