CN116515716B - 屎鞘氨醇杆菌及其应用 - Google Patents

屎鞘氨醇杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116515716B
CN116515716B CN202310736157.XA CN202310736157A CN116515716B CN 116515716 B CN116515716 B CN 116515716B CN 202310736157 A CN202310736157 A CN 202310736157A CN 116515716 B CN116515716 B CN 116515716B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
sphingobacterium faecium
sphingobacterium
faecium
microbial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310736157.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN116515716A (zh
Inventor
刘晓迪
李铭刚
孔垂思
唐蜀昆
赵江源
杨佩文
李建宇
梁松国
冯路遥
申云鑫
施竹凤
杨明英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan University YNU
Institute of Agricultural Environment and Resources of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Yunnan University YNU
Institute of Agricultural Environment and Resources of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan University YNU, Institute of Agricultural Environment and Resources of Yunnan Academy of Agricultural Sciences filed Critical Yunnan University YNU
Priority to CN202310736157.XA priority Critical patent/CN116515716B/zh
Publication of CN116515716A publication Critical patent/CN116515716A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116515716B publication Critical patent/CN116515716B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00—Plant growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一株屎鞘氨醇杆菌及其应用。本发明提供的屎鞘氨醇杆菌CCTCCNO：M2023004具有很好地固氮、解磷功能，能够有效提高无机磷的溶解量。该菌株还具有高产IAA的能力，能够利用不额外添加色氨酸的培养基中发酵获得含有较高含量IAA的发酵液，最高达到28.211mg/L。此外，采用该菌株对番茄幼苗进行灌根处理后，有效促进了番茄幼苗的生长，其株高、根长、地径以及植株的地上和地下干重都得到了大幅提高。

Description

屎鞘氨醇杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株屎鞘氨醇杆菌及其应用。
背景技术
土壤微生物群落丰富，各具有不同的生物学功能。植物根际促生菌(Plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR)生存于植物根际和根表，具有促进植物生长，拮抗病原微生物，提高植物抗性，修复土壤，维持土壤质量健康等功能。研究发现，PGPR促进植物生长的方式主要包括：通过磷、钾等植物生长必须的营养元素的溶解和固氮作用，或者通过分泌植物激素等来改善土壤和植物的营养状况，或者通过分解土壤中的有害物质，提高土壤质量来促进植物生长；其防治植物病害的方式主要包括：通过拮抗作用、诱导系统抗性、竞争营养和空间位点等方式防治植物病害。
鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)的部分细菌已被证实能够作为PGPR用于农用微生物制剂开发，目前包含鞘氨醇杆菌属细菌的农用微生物制剂主要用于降解土壤中多环芳烃类高分子有机物和缓解土壤重金属污染这两方面，通过改善土壤质量来促进植物的生长。例如，CN201911378511.6公开了保藏编号为CGMCC No.10851的Sphingobacterium multivorum能够快速高效的对土壤和水体中的农作物秸秆进行有效的降解，CN202111182074.8公开了保藏编号为CCTCC NO：M2021648的Sphingobacterium multivorum可以将难溶的无机磷酸盐（磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、磷矿粉）转化为可直接供植物吸收利用的可溶性磷。但是，目前鲜少有关于具有多种营养元素转化功能的鞘氨醇杆菌属细菌及其应用于植物促生方面的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一株屎鞘氨醇杆菌及其应用。本发明提供的屎鞘氨醇杆菌具有较好的固氮、解磷功能，能够利用不额外添加色氨酸的培养基发酵高产吲哚乙酸（IAA），并且在灌根施用后对于植物具有较好的促生效果，是极具应用潜力的植物根际促生菌。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一株屎鞘氨醇杆菌，该菌株的保藏编号为CCTCC NO: M 2023004。
本发明第二方面提供第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌在固氮、解磷或产吲哚乙酸中的应用。
本发明第三方面提供一种生产吲哚乙酸的方法，所述方法包括将第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌进行发酵培养，并收集培养产物。
本发明第四方面提供一种具有促进植物生长功能的菌剂，所述菌剂中的活性成分包括第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌。
本发明第五方面提供第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌，或者，第四方面所述的菌剂在促进植物生长中的应用。
本发明第六方面提供一种促进植物生长的方法，所述方法包括将第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌或第四方面所述的菌剂施用于植物。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
（1）本发明提供的屎鞘氨醇杆菌是由草地根际土壤中分离获得的天然菌株，相比于实验室诱导突变菌株更易定殖，也更加安全环保，具有作为一种新型的微生物菌株资源开发应用的潜力。
（2）本发明提供的屎鞘氨醇杆菌能够有效促进作物生长。经实验验证，番茄幼苗施用该菌株28天后，相对于对照组（CK）株高和地径的净增长量分别提高了69%和41％，说明该菌株具有较好的植物促生效果。
（3）本发明提供的屎鞘氨醇杆菌具有很好的固氮、解磷功能，而且能够利用不额外添加色氨酸的培养基发酵高产吲哚乙酸，为吲哚乙酸生产提供了新的材料和方法。
附图说明
图1是实施例1中菌株YIM B11473的系统发育树。
图2是实施例1中菌株YIM B11473在NA培养基上的菌落形态图。
图3是实施例2中菌株YIM B11473的（A）固氮效果图；（B）解磷效果图。
图4是实施例2中菌株YIM B11473培养液中溶解磷的含量变化对比图。
图5是实施例3中菌株YIM B11473发酵液中IAA含量变化对比图。
图6是实施例5中实验组和对照组番茄幼苗的（A）株高生长量对比图；（B）地径生长量对比图。
生物保藏
本发明提供的屎鞘氨醇杆菌，分类命名为Sphingobacterium faeciumYIMB11473，已于2023年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023004。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
PGPR对土壤和植物的有益功能使得其成为农用微生物制剂的主要原料之一，PGPR的开发和使用弥补了化学防治带来的农药残留、环境污染以及食品安全等问题，符合农业的可持续发展、对环境友好和人畜安全等原则。为了提高开发效率，目前本领域开发效用较好的PGPR菌株的方法主要依赖于人工诱变或基因工程改造，从而筛选获得具有优异植物促生和/或防病效果的新菌株。然而，人工诱变或基因工程改造获得的试验菌株通常在实验室环境中选育，对于自然环境的适应能力较差，而且菌株在植物体内或土壤中的定殖情况也难以在实验室中得到很好地验证，导致许多实验室开发的高质量PGPR菌在实际应用中难以表现出与研究中同样水平的促生或防病效果。
本发明的发明人在研究中偶然间发现了一株细菌，经检测鉴定为屎鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium faecium）。发明人发现，该菌株具有很好的固氮、解磷作用，并且能够在不额外添加色氨酸的培养基中高效发酵生产吲哚乙酸（IAA）。经过进一步研究还发现，该菌株在灌根施用给番茄等植物时，能够有效提高植物幼苗的株高和干重，具有较好的植物促生效果。
基于上述发现，本发明一方面提供一株屎鞘氨醇杆菌，该菌株的保藏编号为CCTCCNO: M 2023004。
本发明第二方面提供第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌在固氮、解磷或产吲哚乙酸中的应用。
本发明中，“固氮”、“解磷”是指通过本发明提供的屎鞘氨醇杆菌的作用使得土壤中可供植物利用的N、P含量提高。例如解磷可以为促使土壤中的无机磷成分（例如Ca3(PO4)2、FePO4等）转化为植物可利用的形式，从而促进植物对土壤中磷元素的吸收和利用。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述磷为无机磷。优选为Ca3(PO4)2。
本发明第三方面提供一种生产吲哚乙酸的方法，所述方法包括将第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌进行发酵培养，并收集培养产物。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养的条件包括：培养温度25-35℃，培养时间20-120h，起始pH 6-7.5。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，当采用摇床发酵的方式进行发酵培养时，所述发酵培养过程中可以在摇床转速120-200rpm的条件下进行。
本发明中，对于所述发酵培养采用的培养基没有特别限制，任意本领域中能够用于屎鞘氨醇杆菌发酵培养的培养基均可适用于本发明。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述培养基为营养琼脂培养基（NA培养基）、Luria-Bertani培养基（LB培养基）和胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA培养基）中的至少一种。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述培养基中不含色氨酸。
本发明第四方面提供一种具有促进植物生长功能的菌剂，所述菌剂中的活性成分包括第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌。
本发明中，对于所述菌剂的具体剂型没有特别限制，任意本领域中常用于农业微生物制剂的菌剂剂型均可适用于本发明。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
优选地，所述液态菌剂中，所述屎鞘氨醇杆菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL，优选为1×106-1×109CFU/mL。更优选为1×106-1×108CFU/mL。
优选地，所述固态菌剂中，所述屎鞘氨醇杆菌的有效活菌数不低于1×105CFU/g，优选为1×106-1×109CFU/g。更优选为1×106-1×108CFU/g。
为了提高菌剂中屎鞘氨醇杆菌的活性和稳定性，或者使得该菌剂更加便于运输、储存和使用，根据本发明的优选实施方式，其中，所述菌剂中还可以含有辅料。任意本领域中能够用于农业用菌剂产品中的辅料均可适用于本发明。优选所述辅料选自赋形剂（例如木薯淀粉、山梨醇等）、保护剂（例如糖类保护剂、谷氨酸钠、氯化钙等）和缓冲剂（例如磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠、氧化镁等）中的至少一种。
发明人在长期研究过程中发现，在微生物制剂中，若仅存在单一菌种，容易出现作用单一、效果不稳定等情况，通过在微生物制剂中添加辅料和/或添加其他菌种，可以使其功能更全面，使用效果更好也更稳定。
在研究过程中，发明人偶然间发现，本发明提供的屎鞘氨醇杆菌与某些伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）的细菌（例如白色伯克霍尔德氏菌(Burkholderia alba) CCTCCNO：M 2023003）能够在NA培养基上共同存活，经过进一步研究发现，将其混合使用时具有协同作用，不仅能够使得本发明提供的屎鞘氨醇杆菌的性质更加稳定，还能够进一步提高对植物的促生效果。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述菌剂还包括辅助菌，所述辅助菌为白色伯克霍尔德氏菌(Burkholderia alba)。
优选地，所述白色伯克霍尔德氏菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2023003。
优选地，所述菌剂中，屎鞘氨醇杆菌和白色伯克霍尔德氏菌的活菌数比为1-5：1-2。
本发明提供的菌剂中，所述辅助菌可以单独包装，在使用时与本发明提供的屎鞘氨醇杆菌共同施用，也可以在制备时就将二者混合，使用时直接施用于植物。
本发明第五方面提供第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌，或者，第四方面所述的菌剂在促进植物生长中的应用。
本发明中，所述“促进植物生长”可以包括提高植物的生长速度、提高产量、提高农产品质量（例如提高单果重量等）等。
本发明第六方面提供一种促进植物生长的方法，所述方法包括将第一方面所述的屎鞘氨醇杆菌或第四方面所述的菌剂施用于植物。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述屎鞘氨醇杆菌的用量不低于1×107CFU/株/次，优选为1×108-1×1012CFU/株/次。更优选为1×109-1×1010CFU/株/次。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述菌剂的用量使得其中屎鞘氨醇杆菌的施用量不低于1×107CFU/株/次，优选为1×108-1×1012CFU/株/次。更优选为1×109-1×1010CFU/株/次。
优选地，所述屎鞘氨醇杆菌或菌剂的施用频率为每茬作物1-3次。
优选地，所述植物选自茄科植物，优选为番茄。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，未做特殊说明的情况下，采用的试剂和材料均为购自化学/生物试剂或材料供应商的商购产品，试剂均为分析纯。
以下实施例中，未进行特殊说明的情况下，操作温度均为室温（25±5℃）。
实施例1
本实施例用于说明屎鞘氨醇杆菌CCTCC NO：M 2023004的获得、鉴定和保藏。
（一）菌株分离纯化
菌株分离纯化过程中采用的培养基为营养琼脂固体培养基（NA培养基）。
发明人在研究过程中，采用稀释涂布平板法和平板划线法从云南省昭通市药山国家自然保护区采集的草地根际土壤中分离纯化得到一株细菌，命名为YIM B11473。
（二）菌株鉴定
1、分子鉴定
采用Chelex提取法提取菌株YIM B11473的总DNA作为模板，采用27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）作为上游引物，1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）作为下游引物，采用表1中的反应体系和条件进行DNA扩增。
表1 PCR体系和条件
扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序结果经BLAST搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）后与GenBank数据库中相关种属的基因序列进行比较分析，选用同源性较高的模式菌株序列作为参比对象，用Clustal X 1.8软件进行多序列比对，计算供试菌株与参比菌株序列的相似性。系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用邻接法（Neighbor-joining analysis）用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。其中，Bootstrap 值设定为1000，其余均为默认值。
图1示出了绘制的菌株YIM B11473的系统发育树，从中可以看出，YIM B11473与屎鞘氨醇杆菌Sphingobacterium faeciumDSM 11690（AJ438176）同源性最高，同源率达99.72％。
2、细菌形态特征及生理生化特征鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株YIM B11473进行生理生化测定，描述菌落形态、特性。
菌落形态：图2示出了菌株YIM B11473在NA培养基上的菌落形态，从图中可以看出，该菌株菌落为圆形、完整、低凸、光滑、不透明的菌落，并且可以产生黄色的非荧光色素。
细胞形态：革兰氏阴性杆菌，无芽孢，无鞭毛，不运动。
生理生化特征：菌株YIM B11473革兰氏染色为阴性，氧化酶、过氧化氢酶阳性，甲基红和Voges-Proskauer实验阴性，盐耐受范围为0-3%（w/v），能够正常生长的温度在4-40℃；能水解七叶皂苷、明胶、尿素；不能还原硝酸盐和亚硝酸盐，不产生吲哚；能同化葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酰葡萄糖胺和麦芽糖，不能同化甘露醇、葡萄糖酸钾、羊蜡酸、己二酸、苹果酸、苯乙酸和枸橼酸钠。
3、鉴定结果
结合菌株YIM B11473的分子检测结果以及细菌形态特征及生理生化特征检测结果，鉴定该菌株为屎鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium faecium)。
（三）菌株保藏
将上述获得的菌株Sphingobacterium faeciumYIM B11473于2023年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023004。
实施例2
本实施例用于说明屎鞘氨醇杆菌CCTCC NO：M 2023004的固氮、解磷效果。
（一）固氮效果测试
阿须贝氏葡萄糖固体培养基制备方法：称取葡萄糖20g、CaCO35g、K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.2g、K2SO40.1 g，加入到1000mL水中溶解，调节pH至7.4±0.2，加入琼脂15g。121℃高压灭菌20min。
将实施例1中获得的菌株YIM B11473采用点接法接种在阿须贝氏葡萄糖固体培养基中，每个处理4次重复，置于30℃恒温培养箱培养60h，观察菌株的生长状况和透明圈产生情况。
结果如图3（A）所示。从图中可以看出，将菌株YIM B11473接种在阿须贝氏葡萄糖固体培养基上能够产生透明圈，且透明圈的直径较大，说明该菌株具有很好的固氮性能。
（二）解磷效果测试
1、解磷性能初步检测
无机磷细菌固体培养基制备方法：称取葡萄糖10g、硫酸铵0.5g、氯化钠0.3g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、磷酸钙5g，加入到1000mL水中溶解，调节pH至7.4±0.2，加入琼脂15g。121℃高压灭菌20min。
将实施例1中获得的菌株YIM B11473采用点接法接种在无机磷细菌固体培养基中，每个处理4次重复，置于30℃恒温培养箱培养60h，观察菌株的生长状况和透明圈产生情况。
结果如图3（B）所示。从图中可以看出，将菌株YIM B11473接种在无机磷细菌固体培养基上能够产生透明圈，且透明圈的直径较大，说明该菌株具有很好的解磷性能。
2、磷酸钙溶磷能力测定
无机磷液体培养基配制方法：称取葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5g，加入到1000mL水中溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min。
营养肉汤液体培养基（NB液体培养基）配制方法：称取蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g，加入到1000mL水中溶解，调节pH至7.2±0.2，121℃高压蒸汽灭菌15min。
采用NB液体培养基对菌株YIM B11473进行活化，按5±2体积%的接种量将活化液（活菌数含量约为1×107CFU/mL）接种到装有200mL无机磷液体培养基的300ml三角瓶中，30℃下150r/min摇床培养。以未接种菌株YIM B11473的无机磷液体培养基为空白对照，每个处理2个重复。从接种后第2天开始直至培养第7天，每隔24小时取样，采用钼锑抗比色法检测培养液中水溶性磷的含量。
具体计算方法：每次取2mL发酵液12000rpm离心10min后，取1mL上清液加入50mL容量瓶，加2滴2,6-二硝基苯酚作指示剂，缓慢加入5mL钼锑抗显色剂，用蒸馏水定容，摇匀后静置30min，在700nm波长下比色。读出待测液的吸光值，代入标准曲线与式（1）的公式中计算。
标准曲线：Y =2.5699X -0.1103，R2=0.9982
P=K×V/V1式（1）
式（1）中，P为培养液中可溶性磷含量；K为从标准曲线得到的可溶性磷含量(mg/L)；V为定容的体积(mL)；V1为吸取上清液的体积(mL)
图4示出了菌株YIM B11473培养液中溶解磷的含量变化情况，从图中可以看出，前五天培养液中的溶磷量在逐步上升，在第五天时溶磷量达到最大值（约150.15mg/L），随后开始下降，培养到第七天时溶磷量降低到约108.59mg/L。经分析，这种现象可能是因为菌体大量繁殖消耗了部分可溶性磷，或是因为渗透压改变使磷在菌体内富集造成的。
实施例3
本实施例用于说明屎鞘氨醇杆菌CCTCC NO：M 2023004分泌吲哚乙酸的效果。
Salkowski试剂配制方法：将150 mL浓硫酸缓缓加入到250 mL去离子水中，边加边搅拌，待溶液冷却后加入7.5 mL的FeCl3•6H2O溶液（0.5mol/L）即可。
（一）定性检测
YIM B11473发酵液制备方法：挑取菌株YIM B11473的单菌落接入NB培养基中，30℃恒温摇床条件发酵培养72h（至培养液OD值约为1.5±0.2），获得发酵液。
用无菌枪头吸取4mL的YIM B11473发酵液于无菌离心管中，向其中加入4 mL的Salkowski试剂，迅速充分混合，室温下避光反应40min后观察颜色变化。
经观察发现，反应后的混合体系呈现出红色，说明菌株YIM B11473具有产IAA的能力。
（二）定量检测
精确称取纯IAA 10mg，先用少量乙醇溶解，再用蒸馏水定容至100mL，配制成浓度为100mg/L的IAA母液。然后将IAA母液按照0、4mg/L、8mg/L、12mg/L、16mg/L、20mg/L、24mg/L的浓度稀释成IAA标准溶液。取不同浓度的IAA标准溶液各1mL，分别与1mL的Salkowski试剂混合，室温下避光反应40min，测定OD535值。根据测量结果，以OD535值为y轴，IAA含量（mg/L）为x轴，绘制得到标准曲线（y=0.006x+0.0054，R2=0.9963）。
YIM B11473发酵液制备及取样方法：挑取菌株YIM B11473的单菌落接入NB培养基中，30℃恒温摇床条件下进行发酵培养，自菌株接种后每隔24h取样直至培养结束（培养5天）为止。
将取样得到的YIM B11473发酵液和空白对照（未接种YIM B11473菌株，并于同样条件下进行摇床培养的NB培养基）于10000rpm离心5min后各取上清液1mL加入等体积Salkowski试剂混合，室温下避光反应40min。反应结束后取出立即用分光光度计测定OD535值，每个样品重复测3次，以加入Salkowski试剂的空白对照调零，对比标准曲线计算菌株YIM B11473的IAA分泌量。
图5中示出了YIM B11473发酵液中IAA含量随着培养时间延长的变化情况。从图中可以看出，培养24h时，YIM B11473的发酵液中已经含有少量IAA（浓度约为4.683mg/L），随着培养时间的延长，发酵液中的IAA含量逐步增高，48h和72h的IAA含量分别约为11.933mg/L和21.156 mg/L，培养96h时，发酵液中IAA含量达到最大值（约为28.211mg/L），随后继续延长培养时间，IAA含量有所下降，培养120h时发酵液中的IAA含量约为25.322 mg/L。
实施例4
本实施例用于说明屎鞘氨醇杆菌CCTCC NO：M 2023004与白色伯克霍尔德氏菌CCTCC NO：M 2023003的混合培养效果。
本实验室从采集自无量山国家自然保护区的华山松根际土壤样品中分离纯化得到一株细菌，命名为YIM B08401。经鉴定，该菌株为白色伯克霍尔德氏菌(Burkholderia alba)。该菌株于2023年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023003。
在实验过程中，偶然发现YIM B11473与YIM B08401能在营养琼脂培养基上共同存活，为了进一步检测这两株菌株能否进行混合培养，分别对其进行摇床培养24h（温度30±2℃，摇床转速150rpm），获得YIM B11473与YIM B08401的培养液，测得YIM B11473培养液的OD600值为0.723±0.124，YIM B08401培养液的OD600值为0.609±0.074。
将YIM B11473与YIM B08401的培养液按照2:1的体积比混合，在30±2℃，150rpm的条件下继续摇床培养24h，获得混合菌液。测得该混合菌液的OD600值为1.139±0.173，而前述培养24h的YIM B11473培养液在相同条件下继续培养24h后获得的继续培养液的OD600值为0.930±0.164。根据其OD600值对比可以看出这两株菌在营养琼脂液体培养基中生长良好，互不拮抗，可以进行混合培养。因此，这两株菌具备共同施用的可行性。
实施例5
本实施例用于说明屎鞘氨醇杆菌CCTCC NO：M 2023004对植物幼苗的促生效果。
菌剂制备：
（1）屎鞘氨醇杆菌YIM B11473液体菌剂
实施例1中获得的菌株YIM B11473接种于NA固体培养基上，于30℃培养24h后挑取单菌落接种于1L营养琼脂液体培养基中，30℃下150rpm震荡培养72h。将所得培养液稀释至活菌数含量约为1.5×107CFU/mL，该稀释液即为屎鞘氨醇杆菌YIM B11473液体菌剂。
（2）混合液体菌剂
实施例1中获得的菌株YIM B11473接种于营养琼脂固体培养基上，于30℃培养24h后挑取单菌落接种于1L营养琼脂液体培养基中，30℃下150rpm震荡培养24h，获得YIMB11473菌液。采用相同方式和条件培养白色伯克霍尔德氏菌YIM B08401，获得YIM B08401菌液。将YIM B11473菌液与YIM B08401菌液按照2:1的体积混合，在30℃，摇床转速150rpm的条件下对该混合菌液继续震荡培养48h。将所得混合培养液稀释至总活菌数约为1.5×107CFU/mL，该稀释液即为屎鞘氨醇杆菌YIM B11473+白色伯克霍尔德氏菌YIM B08401的混合液体菌剂。
植株种植：将珍珠岩（购自信阳市中森珍珠岩应用有限公司）与土壤以1：1的重量比混合制成混合土壤。在每个的花盆中加入1kg混合土壤，按照每个处理3盆随机分组，每盆中栽种6株长势相近的番茄幼苗，并测量每株苗的初始株高和地径。
促生效果验证：在番茄幼苗移栽到花盆后第8天用200mL/株的上述液体菌剂对番茄幼苗进行灌根处理，同时采用等量无菌水进行相同处理作为对照组（CK）。
灌根处理后的番茄幼苗置于植物培养室中使其自然生长，生长期间每3天浇水1次，设置日夜温度分别为25℃和20℃，光照时长14h，黑暗时长10h。番茄植株生长四周时间内，在第三周（第21天）和第四周（第28天）测量番茄植株的地径和株高，在第四周（第28天）将番茄植株拔出，测量番茄植株的根长，以及地上干重和地下干重。
具体测量方法如下：
株高：利用直尺测量每株番茄植株顶端到花盆土壤表层的高度，数据取平均值±标准差即为番茄植株的株高。
地径：在离花盆土壤表面1-1.5cm处用游标卡尺测量每株番茄茎的直径大小，各组数据取平均值±标准差即为该组番茄植株的地径。
地上干重：将每株番茄植株的地上部分剪下，放入烘箱，190±10℃烘干至恒重，各组数据取平均值±标准差即为该组番茄植株地上部分的干重。
地下干重：将每株番茄植株的地下部分完整挖出，清洗后放入烘箱，190±10℃烘干至恒重，各组数据取平均值±标准差即为该组番茄植株地下部分的干重。
根长：将每株番茄植株地下部分挖出后，用卷尺测量从根端到根尖顶端的距离，各组数据取平均值±标准差即为该组番茄植株的根长。
表2中示出了生长第三周和第四周，对照组和实验组番茄幼苗的生长指标测量结果。根据表中数据计算可知，相对于对照组，在第三周，实验组I的番茄株高提高了约58%，地径提高了约44%，实验组II的番茄株高提高了约51%；在第四周，实验组I的番茄株高提高了约69%，地径提高了约41%，地上部分干重提高了约278%，地下部分干重提高了约550%，根长提高了约58%，实验组II的番茄株高提高了约86%，地径提高了约62%，地上部分干重提高了约352%，地下部分干重提高了约778%，根长提高了约72%。
表2 番茄幼苗植株生长状况
*实验组I施用屎鞘氨醇杆菌YIM B11473液体菌剂；实验组II施用混合菌剂。
经观察发现，实验组和对照组的植株，从第三周开始，株高生长量和地径生长量存在显著性差异。图6中示出了实验组I和对照组的番茄幼苗株高生长量（图6(A)）和地径生长量（图6(B)）的测量结果对比情况。从图中可以看出，实验组I和对照组的番茄幼苗生长量具有显著差异，说明菌株YIM B11473菌剂的施用对番茄幼苗的生长有显著的促进作用。而根据表2中的数据可以明显看出，实验组II的番茄幼苗生长量与对照组差异更为显著，说明混合菌剂中的屎鞘氨醇杆菌和白色伯克霍尔德氏菌之间具有协同作用，共同施用时对于番茄幼苗的促生效果更为显著。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (17)

1.一株屎鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium faecium），其特征在于，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2023004。
2.权利要求1所述的屎鞘氨醇杆菌在固氮、解磷或产吲哚乙酸中的应用。
3.一种生产吲哚乙酸的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的屎鞘氨醇杆菌进行发酵培养，并收集培养产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述发酵培养的条件包括：培养温度25-35℃，培养时间20-120h，起始pH 6-7.5。
5.一种具有促进植物生长功能的菌剂，其特征在于，所述菌剂中的活性成分包括权利要求1所述的屎鞘氨醇杆菌。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其中，所述菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其中，所述液态菌剂中，所述屎鞘氨醇杆菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL；
或者，所述固态菌剂中，所述屎鞘氨醇杆菌的有效活菌数不低于1×105CFU/g。
8.根据权利要求7所述的菌剂，其中，所述液态菌剂中，所述屎鞘氨醇杆菌的有效活菌数为1×106-1×109CFU/mL；
或者，所述固态菌剂中，所述屎鞘氨醇杆菌的有效活菌数为1×106-1×109CFU/g。
9.根据权利要求5所述的菌剂，其中，所述菌剂中还含有辅料；
和/或，所述菌剂还包括辅助菌，所述辅助菌为白色伯克霍尔德氏菌(Burkholderia alba)。
10.根据权利要求9所述的菌剂，其中，所述辅料选自赋形剂、保护剂和缓冲剂中的至少一种；
和/或，所述白色伯克霍尔德氏菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2023003。
11.根据权利要求9或10所述的菌剂，其中，所述菌剂中，屎鞘氨醇杆菌和白色伯克霍尔德氏菌的活菌数比为1-5：1-2。
12.权利要求1所述的屎鞘氨醇杆菌，或者，权利要求5-11中任意一项所述的菌剂在促进植物生长中的应用，所述植物为茄科植物。
13.一种促进植物生长的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的屎鞘氨醇杆菌或权利要求5-11中任意一项所述的菌剂施用于植物，所述植物选自茄科植物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述屎鞘氨醇杆菌的用量不低于1×107CFU/株/次；
或者，所述菌剂的用量使得其中屎鞘氨醇杆菌的施用量不低于1×107CFU/株/次。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述屎鞘氨醇杆菌的用量为1×108-1×1010CFU/株/次；
或者，所述菌剂的用量使得其中屎鞘氨醇杆菌的施用量为1×108-1×1010CFU/株/次。
16.根据权利要求13-15中任意一项所述的方法，其中，所述屎鞘氨醇杆菌或菌剂的施用频率为每茬作物1-3次。
17.根据权利要求13所述的方法，其中，所述植物选自为番茄。
CN202310736157.XA 2023-06-20 2023-06-20 屎鞘氨醇杆菌及其应用 Active CN116515716B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310736157.XA CN116515716B (zh) 2023-06-20 2023-06-20 屎鞘氨醇杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310736157.XA CN116515716B (zh) 2023-06-20 2023-06-20 屎鞘氨醇杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116515716A CN116515716A (zh) 2023-08-01
CN116515716B true CN116515716B (zh) 2024-03-08

Family

ID=87404980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310736157.XA Active CN116515716B (zh) 2023-06-20 2023-06-20 屎鞘氨醇杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116515716B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116573970B (zh) * 2023-07-12 2023-09-22 云南省农业科学院农业环境资源研究所 含有伯克霍尔德氏菌的组合物及其在植物病害中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2010154237A (ru) * 2010-12-29 2012-07-10 Государственное научное учреждение Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Российской академии сельско Штамм sphingobacterium multivorum, используемый для получения бактериального удобрения под томаты и огурцы
CN103436467A (zh) * 2013-06-27 2013-12-11 浙江树人大学 一种屎鞘氨醇杆菌及其应用
CN113717902A (zh) * 2021-10-11 2021-11-30 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种鞘氨醇杆菌Sphingobacterium multivorum及其应用
CN113755401A (zh) * 2021-10-11 2021-12-07 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种新鞘氨醇杆菌Novosphingobium capsulatum及其应用
CN114058552A (zh) * 2021-12-06 2022-02-18 楚雄云泉酱园有限责任公司 一株用于豆瓣酱发酵的食鞘氨醇杆菌

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2010154237A (ru) * 2010-12-29 2012-07-10 Государственное научное учреждение Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Российской академии сельско Штамм sphingobacterium multivorum, используемый для получения бактериального удобрения под томаты и огурцы
CN103436467A (zh) * 2013-06-27 2013-12-11 浙江树人大学 一种屎鞘氨醇杆菌及其应用
CN113717902A (zh) * 2021-10-11 2021-11-30 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种鞘氨醇杆菌Sphingobacterium multivorum及其应用
CN113755401A (zh) * 2021-10-11 2021-12-07 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种新鞘氨醇杆菌Novosphingobium capsulatum及其应用
CN114058552A (zh) * 2021-12-06 2022-02-18 楚雄云泉酱园有限责任公司 一株用于豆瓣酱发酵的食鞘氨醇杆菌

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of aerobic oil and grease-degrading bacteria in wastewater;Alexis Nzila 等;《Environmental technology》;第38卷(第6期);全文 *
Isolation, identification, phylogeny and growth promoting characteristics of endophytic diazotrophs from tuber and root crops;Li YanXing等;《Scientia Agricultura Sinica》;第50卷(第1期);全文 *
Purification and characterization of the glucoside 3-dehydrogenase produced by a newly isolated Sphingobacterium faecium ZJF-D6 CCTCC M 2013251;Jian-Fen Zhang等;《Applied biochemistry and biotechnology》;第172卷(第8期);全文 *
一株鞘氨醇杆菌代谢咔唑的分子机制研究;盖忠辉;《中国博士学位论文全文数据库》;全文 *
鞘氨醇杆菌的研究进展;蔡训辉等;《基因组学与应用生物学》;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116515716A (zh) 2023-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106987541B (zh) 一株具有抗逆、促生性能的高效苜蓿根瘤菌及其应用
CN109182199B (zh) 一株具有植物促生作用的油菜假单胞菌
CN107586743B (zh) 一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌及应用
CN116515716B (zh) 屎鞘氨醇杆菌及其应用
CN115975855A (zh) 暹罗芽孢杆菌、菌剂和生物有机肥及其应用
CN111187737B (zh) 一种耐盐碱促生菌及其在盐碱地改良中的应用
WO2023115830A1 (zh) 一种对大豆促生和提高益生微生物种群丰度的复合菌剂
CN113755347A (zh) 一种促进油茶氮素吸收的内生真菌am1
CN117106614B (zh) 一株根际细菌青岛假单胞菌yim b08402和其微生物菌剂及应用
CN106929433B (zh) 解磷青霉菌及其应用
CN113528398A (zh) 一种具有解磷解钾作用的枯草芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用
CN111187740B (zh) 一种盐碱地改良微生物及其应用
CN110791459B (zh) 一株用于防控连作百合土传枯萎病的枯草芽孢杆菌及其应用
CN101451112A (zh) 一种防治果树根癌病的土壤杆菌及其菌剂和制备方法
CN108130303B (zh) 一株沃氏食酸菌tcp2011036及其应用
CN114752538B (zh) 具有土壤改良功能的油茶内生放线菌及其应用
CN110699288A (zh) 防治马铃薯黑痣病的解淀粉芽孢杆菌菌株及菌剂和应用
CN116083305A (zh) 甲基营养型芽孢杆菌和生物复合肥以及它们的应用
CN111662846B (zh) 一种溶磷菌p5及其发酵产物、菌剂与应用
CN115851502B (zh) 拟蕈状芽孢杆菌、菌剂和液态生物有机肥以及它们的应用
CN116676227B (zh) 白色伯克霍尔德氏菌、菌剂及其应用以及促进植物生长的方法
CN117070396B (zh) 假单胞菌及其应用以及促进植物生长的方法
CN116590195B (zh) 假黄单胞菌、微生物制剂以及它们的应用
CN117859769B (zh) 耐盐芽孢杆菌及其生物有机肥与应用
CN117431166B (zh) 短密木霉菌新菌株tb2及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant