CN110699288A - 防治马铃薯黑痣病的解淀粉芽孢杆菌菌株及菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种有效防治马铃薯黑痣病的解淀粉芽孢杆菌菌株及菌剂和应用，具体公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB33604，以及HMB33604菌株在防治马铃薯黑痣病中的应用，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18469。本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB33604的发酵液和发酵上清液对马铃薯黑痣病的病原菌立枯丝核菌具有较强的抑制作用；此外，本发明所述微生物菌剂对人、畜安全，不存在环境污染等问题，并且其制备方法简单、成本低，使用简单。

Description

防治马铃薯黑痣病的解淀粉芽孢杆菌菌株及菌剂和应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种有效防治马铃薯黑痣病的 解淀粉芽孢杆菌菌株及其菌剂和应用。

背景技术

马铃薯是我国重要的粮食作物，对保障粮食安全具有重要的意义。我国已 将马铃薯列为继水稻、小麦、玉米之后的第四大主粮。我国马铃薯的种植面积 和总产量均位居世界首位，但单产水平因病虫害等瓶颈因素的制约低于世界平 均水平。近年来，由于马铃薯连作导致土传病害有逐年加重的趋势，其直接影 响马铃薯的产量及品质，给马铃薯产业带来了较大的经济损失。

马铃薯黑痣病又称立枯丝核菌病、黑色粗皮病等，国内外学者普遍认为是 由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)AG-3融合群引起的一种土传真菌病害。由于 近年来我国大力提倡发展马铃薯产业，马铃薯的种植面积也随之扩大，由于某 些种植区无法合理的轮作倒茬，造成土壤中立枯丝核菌积累导致马铃薯黑痣病 越来越严重。据报道，在马铃薯产区黑痣病的发病率达到了10％-15％，在河北 内蒙古的某些种植区的重症田块马铃薯黑痣病发病株率高达70％-80％。

近年来我国对于马铃薯黑痣病的防治主要集中于化学药剂防治，随着人们 生活水平的提高，对于食品的标准也随之增高，人们更趋向选择安全、健康的 食品，因此生物防治这种安全、不污染环境这种防治方式变成了国内外学者研 究的热点。

发明内容

为了解决目前生产上存在的上述问题，本发明提供了一种有效防治马铃薯 黑痣病的解淀粉芽孢杆菌菌株及菌剂和应用，所述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB33604的发酵液和发酵上清液对马铃薯黑痣病的病原菌立枯丝核菌具有较 强的抑制作用。

本发明所采用的技术方案为：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB33604，已于2019年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号 为CGMCC No.18469；建议的分类命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；拉丁学名为：BacillusamyloliquefaciensHMB33604。

所述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB33604在防治马铃薯黑痣病中的应用。

利用所述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB33604生产的微生物菌剂。

进一步地，所述微生物菌剂的剂型为液体制剂。

所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将所述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB33604在LB平板培养基上活化，挑取 单菌落在LB斜面培养基上培养，得到培养后菌株；

(2)将所述培养后菌株接种于LB液体培养基中震荡培养，得到种子液；

(3)将所述种子液接入发酵培养基中进行震荡培养，得到所述微生物菌剂。

进一步地，步骤(1)中，所述LB平板培养基或LB斜面培养基的组份均包 括：胰蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L、氯化钠4-6g/L、琼脂粉12-18g/L； 所述活化温度为28-34℃，所述活化时间为20-24h；所述培养的时间为12-18h， 所述培养温度为25-35℃。

进一步地，步骤(2)中，所述LB液体培养基的组份包括：胰蛋白胨8-12g/L、 酵母提取物4-6g/L、氯化钠4-6g/L；所述培养时间为20-28h，所述培养温度 为28-32℃，所述震荡速度为160-200r/min。

进一步地，步骤(3)中，所述发酵培养基包含以下原料组份：葡萄糖 12-18g/L、黄豆粉13-17g/L，氯化钠4-6g/L，硫酸锰0.3-0.5g/L。

进一步地，步骤(3)中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:(45-55)， 所述培养时间为44-52h，所述培养温度为28-32℃，所述震荡速度为 160-200r/min。

所述微生物菌剂在防治马铃薯黑痣病中的应用。

本发明的有益效果为：

(1)本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB33604发酵液，对马铃薯黑痣病 的病原菌(立枯丝核菌)的抑制率为82.53％，相比于现有技术中对立枯丝核菌 的抑制率具有大幅度提升，其主要抑菌物质为LP-1、LP-2、LP-3，可以将该菌 株制备成的微生物菌剂有效的应用于马铃薯的种植中，以提高马铃薯的产量及 品质。

(2)本发明所述微生物菌剂，能够降低化学杀菌剂的使用次数和用量，减 少成本；延缓抗药性的产生，无毒，无农药残留，环境友好；调节土壤微生物 生态区系，促进作物生长，并具有增产作用；可根据不同情况合理使用，节约 人力及使用成本。

(3)本发明所述微生物菌剂的制备方法是通过将解淀粉芽孢杆菌PHODG36 发酵液制备为微生物菌剂，制备方法简单、成本低、生物安全性高、适宜工业 化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为解淀粉芽孢杆菌菌株HMB33604对立枯丝核菌的抑制效果；

图2为拮抗菌HMB33604处理对马铃薯黑痣病的温室盆栽试验；

图3为菌株HMB33604的16SrDNA基因序列扩增电泳图；

图4为菌株HMB33604的16SrDNA基因序列构建的系统发育树；

图5为菌株HMB33604的gyrB基因序列扩增电泳图；

图6为菌株HMB33604的gyrB基因序列构建的系统发育树；

图7为不同发酵培养基下菌株HMB33604发酵液的含菌量；

图8为不同优化发酵培养基下菌株HMB33604发酵液的含菌量；

图9为指肽提取物(LPs)和脂肽HPLC3个组分对立枯丝核菌的抑制作用；

图10为菌株HMB33604的脂肽类物质的HPLC分析图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方 案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不 是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创 造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种有效防治马铃薯黑痣病的微生物菌剂的制备方法，具体 步骤包括：

(1)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌HMB33604菌株在LB平板培养基(胰 蛋白胨8g、酵母提取物4g、氯化钠4g、琼脂粉12g、水1000mL)上在28℃下 活化培养20h，挑取单菌落于LB斜面培养基(胰蛋白胨8g、酵母提取物4g、 氯化钠4g、琼脂粉12g、水1000mL)上，在25℃下培养12h，得到培养后菌株；

(2)将所述培养后菌株接种于LB液体培养基(胰蛋白胨8g、酵母提取物 4g、氯化钠4g、水1000mL)中，在28℃下震荡培养20h，震荡速度为160r/min， 得到种子液；

(3)将所述种子液接入体积为种子液45倍的发酵培养基(葡萄糖12g、 黄豆粉13g，氯化钠4g，硫酸锰0.3g、水1000mL)中，28℃下震荡培养44h， 震荡速度为160r/min，得到所述防治马铃薯黑痣病的微生物菌剂。

实施例2

本实施例提供一种有效防治马铃薯黑痣病的微生物菌剂的制备方法，具体 步骤包括：

(1)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌HMB33604菌株在LB平板培养基(胰 蛋白胨12g、酵母提取物6g、氯化钠6g、琼脂粉18g、水1000mL)上在34℃下 活化培养24h，挑取单菌落于LB斜面培养基(胰蛋白胨12g、酵母提取物6g、 氯化钠6g、琼脂粉18g、水1000mL)上，在35℃下培养18h，得到培养后菌株；

(2)将所述培养后菌株接种于LB液体培养基(胰蛋白胨12g、酵母提取 物6g、氯化钠6g、水1000mL)中，在32℃下震荡培养28h，震荡速度为200r/min， 得到种子液；

(3)将所述种子液接入体积为种子液55倍的发酵培养基(葡萄糖18g、 黄豆粉17g，氯化钠6g，硫酸锰0.5g、水1000mL)中，32℃下震荡培养52h， 震荡速度为200r/min，得到所述防治马铃薯黑痣病的微生物菌剂。

实施例3

本实施例提供一种有效防治马铃薯黑痣病的微生物菌剂的制备方法，具体 步骤包括：

(1)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌HMB33604菌株在LB平板培养基(胰 蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g、琼脂粉15g、水1000mL)上在31℃下 活化培养22h，挑取单菌落于LB斜面培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、 氯化钠5g、琼脂粉15g、水1000mL)上，在30℃下培养15h，得到培养后菌株；

(2)将所述培养后菌株接种于LB液体培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取 物5g、氯化钠5g、水1000mL)中，在30℃下震荡培养24h，震荡速度为180r/min， 得到种子液；

(3)将所述种子液接入体积为种子液50倍的发酵培养基(葡萄糖15g、 黄豆粉15g，氯化钠5g，硫酸锰0.4g、水1000mL)中，30℃下震荡培养48h， 震荡速度为180r/min，得到所述防治马铃薯黑痣病的微生物菌剂。

实验例

一、本发明所述菌株HMB33604的筛选

1、供试病原菌和生防菌

马铃薯黑痣病病原菌立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKuhnAG-3)以及由本实 验室分离保存的土壤细菌。

2、供试马铃薯品种

荷兰15号。

3、筛选过程

①通过平板对峙实验筛选具有拮抗马铃薯黑痣病菌的拮抗菌株

以马铃薯黑痣病病原菌立枯丝核菌为靶标菌，将病原菌提前接种于PDA平 板上，25℃恒温培养，直至平板上长满整个培养皿后，用打孔器打取直径6mm 的菌块，接种在预先倒好的9cm的PDA平板中央。四周对称点接活化好的细菌， 每个培养皿上接4个细菌菌株，以接种病原菌的PDA平板为对照CK。27℃培养 箱培养4d，筛选得到具有拮抗马铃薯黑痣病菌的菌株，测量抑菌带宽度。

②利用苗期温室盆栽试验筛选马铃薯黑痣病生防菌株

生防菌发酵液的制备：将平板对峙试验复筛得到的拮抗菌株接种于5ml的 LB液体培养基试管中，37℃恒温下180r/min震荡培养12h之后，按接种量1％ 转接于200ml的LB液体培养基中，37℃恒温下180r/min震荡培养48h，得到 发酵液。并且用稀释平板法计算其浓度。

马铃薯黑痣病病土的制备：用打孔器打取直径6mm的菌块，接种在预先倒 好的9cm的PDA(20mL/皿)平板中央，25℃培养7d后，用豆浆机打碎与灭好 菌的细土混匀(1皿/1.3kg)，装入花盆中，每个花盆装入1.3kg的混菌土。

拮抗菌株盆栽效果测定：马铃薯进行表面消毒后，切取得到带有两个芽眼 的薯块。用拮抗菌株发酵液浸种1h，包衣种植于混有带菌土的花盆中，设置三 次重复试验，以清水处理作为对照，25d后调查发病情况，计算病情指数和防 效，筛选得到马铃薯黑痣病的生防菌。

苗期马铃薯黑痣病的分级标准：根据病斑的横向平均长度总和占地下茎周 长的比例衡量发病面积，即发病程度＝[(病斑的横向平均长度×病斑个数)/ 地下茎周长]×100％

分级标准：

0级：植株没有病斑

1级：发病程度为1％-25％

2级：发病程度为26％-50％

3级：发病程度为51％-75％

4级：发病程度为76％-100％

病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表 值)×100

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

③田间实验评价生防菌株HMB33604对马铃薯黑痣病的防效

2019年度，在河北省承德市围场县8号村黑痣病发病严重地块评价了 HMB33604对马铃薯黑痣病的田间防效。采用滴灌的方式施用HMB33604发酵液， 施用量为500L/亩。在马铃薯开花期调查黑痣病的发病率，生长期结束后测产 比较HMB33604处理区和非处理区马铃薯产量。每个处理4×10米，4次重复。 设清水处理为对照。

4、筛选结果

本试验第①步骤中通过对本实验室保存的2106株土壤细菌样品进行划线 分离，并通过平板对峙方法对土壤细菌进行拮抗测试，筛选得到61株马铃薯黑 痣病菌的拮抗菌株，抑菌带在6mm-16mm(如表1和图1所示，图1a中为对照 CK组，图1b为HMB33604菌株组)。

表1-部分土壤细菌对立枯丝核菌的抑制效果

本试验第②步骤中对立枯丝核菌拮抗菌进行温室盆栽测定防效实验，采用 病原菌拌土以及发酵液浸种马铃薯芽眼的方式进行测定，得到3个菌株对马铃 薯黑痣病具有较好的防治作用(如表2所示)，但是其中HMB33604菌株对马铃 薯黑痣病的防治作用最好达到43.18％(如图2所示，图2a为空白对照组，图 2b为HMB33604菌株发酵液浸种组)，HMB32830居中，HMB28363次之。

表2-部分拮抗菌对立枯丝核菌的防治效果

本试验步骤③在田间评价了HMB33604对马铃薯黑痣病的防效以及增产情 况。结果表明，空白对照区马铃薯黑痣病的发病率达到23％，而菌株HMB33604 处理区黑痣病的发病率仅为11％，同时增加了马铃薯产量32％。

5、结论

从2106株菌株样本中，筛选出61株对马铃薯立枯丝核菌具有拮抗作用的 拮抗菌株，抑菌带达到6mm-16mm。并通过温室盆栽试验测定防治效果，筛选得 到三株菌株对马铃薯黑痣病有显著防治效果，分别为菌株HMB33604、HMB28363、 HMB32830，对马铃薯黑痣病的防效依次为43.18％，34.10％和37.60％。而菌株 HMB33604对马铃薯黑痣病的防治效果最高。田间试验表明，菌株HMB33604发 酵液能有效防治马铃薯黑痣病，并且表现增产效果。

二、本发明所述菌株HMB33604的分子生物学鉴定

1、试验过程

采用改良的CTAB法提取菌株HMB33604基因组；分别采用16SrDNA、gyrB 基因序列的引物对HMB33604进行扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳检测 委托上海生工生物工程有限公司进行测序；将所得序列在NCBI的GenBank数据 库中进行同源性分析和多序列比对，根据比对结果应用MEGA软件构建系统发育 树。

16SrDNA序列的通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R： 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'[10]；

gyrB基因引物gyrB--up-1s：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3'， gyrB-up-2sr：5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3'[12]；依次如SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2所示；

引物由上海生物工程有限公司合成。

2、试验结果

(1)16SrDNA序列鉴定结果

采用通用引物27F和1492R对菌株HMB33604进行鉴定(如图3所示)，并 且进行BLAST比对以及构建系统发育树(如图4所示)，结果显示其与芽孢杆 菌同源相似性均大于99％，因此菌株HMB33604为芽孢杆菌属。

(2)gyrB基因序列鉴定结果

采用引物gyrB--up-1s和gyrB-up-2sr进行鉴定(如图5所示)，进行BLAST 比对以及构建系统发育树(如图6所示)，结果显示其与解淀粉芽孢杆菌同源 相似性均大于99％，因此菌株HMB33604为解淀粉芽孢杆菌。

3、结论

本试验对菌株HMB33604通过Biolog鉴定以及16SrDNA和gyrB基因序列的 系统发育树分析，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。

三、菌株HMB33604发酵培养基的优化

1、试验对象

11种发酵培养基分别编号1号-11号培养基：

1号：葡萄糖20g，玉米淀粉40g，蛋白胨1g，磷酸氢二钠18.3g，磷酸氢 二钾3g，硫酸镁1g，碳酸钙0.9g，水1000mL；

2号：玉米粉30g，葡萄糖2g，酵母提取物3g，黄豆粉15g，磷酸氢二钠 2g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙2g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化铵1g，硫 酸锰0.2g，水1000mL；

3号：玉米粉30g，葡萄糖1.5g，麸皮5g，酵母提取物3g，黄豆粉15g， 磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙2g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯 化铵1g，硫酸锰0.2g，水1000mL；

4号：玉米淀粉5g，葡萄糖15g，黄豆粉30g，酵母提取物1g，磷酸二氢 钾1.5g，磷酸氢二钾3g，硫酸锰1g，硫酸镁0.5g，碳酸钙0.1g，氯化铁0.3g， 水1000mL；

5号：玉米粉30g，葡萄糖2g，黄豆粉20g，麸皮5g，氯化钠4g，水1000mL；

6号：玉米粉40g，黄豆粉20g，酵母提取物5g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁 1.5g，水1000mL；

7号：玉米粉20g，葡萄糖5g，黄豆粉15g，鱼蛋白胨4g，碳酸钙5g，硫 酸铵1g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.2g，水1000mL；

8号：玉米粉10g，葡萄糖5g，黄豆粉15g，鱼蛋白胨5g，碳酸钙5g，硫 酸铵1g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.2g，水1000mL；

9号：黄豆粉20g，尿素1g，玉米粉1.5g，玉米淀粉10g，磷酸氢二钾3g， 磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1g，硫酸锰0.2g，水1000mL；

10号：葡萄糖10g，黄豆粉10g，氯化钠5g，硫酸锰0.6g，水1000mL

11号：黄豆粉60g，蔗糖25g，硫酸铵7g，柠檬酸三钠3g，磷酸氢二钾0.3g， 硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.05g，水1000mL。

2、试验过程

将活化好的菌株HMB33604接种于5ml的LB液体培养基试管中，30℃恒下 180r/min震荡培养24h之后，按接种量2％转接于100ml的发酵培养基中，30℃ 恒温下180r/min震荡培养48h，得到发酵液；采用平板菌落计数法比较不同发 酵培养基的含菌量；通过以上试验结果，选定10号培养基为初始发酵培养基， 设计4因素3水平的正交试验，试验设计采用正交设计助手Ⅱ(versionv3.1)， 数据分析采用spss软件。

3、试验结果

本试验使用11种发酵培养基，在相同条件下培养菌株HMB33604的发酵液， 采用平板计数法比较了不同发酵培养基的活菌含量(如图7所示)，通过试验 得到第10种发酵培养基最适合菌株的生长，因此选用第10号培养基作为初始 发酵培养基。

以10号培养基作为初始培养基，设计4因素3水平试验，分别测定其发酵 液含菌量。其中黄豆粉的极差最大，方差分析中黄豆粉的F也最大，但是低于 F临界值，认为此四种因素对实验都没有显著性影响，不必进行各因素间的多 重比较，在4因素3水平正交试验表中选择平均数最大的水平组合成最优水平， 4因素的最优水平分别为A3、B3、C3、D1，即最佳发酵工艺为葡萄糖15g，黄 豆粉15g，氯化钠5g，硫酸锰0.4g最适用量。极差分析中RB＞RD＞RC＞RA表 明黄豆粉对发酵液含菌量影响最大。同时4因素3水平正交试验方差分析表中 FB＞FD＞FC＞FA，表明黄豆粉对发酵液含菌量最大同极差分析结果一致，结果 如表3、表4和图8所示。

表3-4因素3水平正交试验结果

表4-4因素3水平正交试验的方差分析结果

4、结论

本试验对菌株生物量的发酵条件进行优化，发现黄豆粉对发酵液生物量影 响最大，获得最佳发酵培养基为葡萄糖15g/L，黄豆粉15g/L，氯化钠5g/L， 硫酸锰0.4g/L。

四、菌株HMB33604发酵液不同成分的盆栽防效试验

1、试验过程

将活化好的菌株HMB33604接种于5ml的LB液体培养基试管中，30℃恒下 180r/min震荡培养24h之后，按接种量2％转接于100ml的发酵培养基中，30℃ 恒温下180r/min震荡培养48h，得到发酵液。采用平板菌落计数法比较不同发 酵培养基的含菌量。

发酵液上清液的制备：发酵液8000r/min离心20min，取上清即为上清液。

发酵液菌悬液的制备：发酵液8000r/min离心20min，弃上清，用灭菌水 悬浮至原有体积即为菌悬液。

利用发酵液不同成分浸种带有芽眼的马铃薯薯块，以不接菌的优化发酵培 养基做对照，设置三个重复试验，25d后调查发病情况，并计算防治效果。

2、试验结果

采用上述方法测定发酵液不同成分对立枯丝核菌的防治效果。发酵液经8000rpm/min离心20min即为上清液，发酵液沉淀用同样体积的无菌水定容混 匀即为菌悬液。经过温室盆栽实验，发现菌株HMB33604发酵上清液对立枯丝核 菌的防效最好，因此该菌株上清液主要对立枯丝核菌起抑菌作用，具体结果如 表5所示。

表5-HMB33604发酵液不同成分对立枯丝核菌的防治效果

3、结论

在发酵液不同成分对马铃薯黑痣病防治效果的温室盆栽实验中，发现其发 酵液和上清液的防治效果相当，但是菌悬液的防治效果仅为16.90％，表明该菌 株发酵上清液对马铃薯黑痣病起主要抑制作用。

五、菌株HMB33604抑菌物质的分离鉴定

1、菌株脂肽类物质的提取

利用盐酸沉淀以及甲醇溶解方法提取脂肽类物质。将菌株HMB33604接种于 装有5mlLB液体培养基的试管中，30℃180r/min培养12h。按1％接种量接入 100mlLandy培养基三角瓶中，30℃180r/min培养48h。4℃8000r/min离心20min， 收集上清，用6mol/L的HCL调节pH＝2.0左右，4℃静置过夜。第二天4℃ 8000r/min离心20min，收集沉淀，干燥后，加甲醇15ml溶解，经0.22μm细菌 过滤器过滤后于4℃保存。

2、菌株抑菌物质的鉴定

采用高效液相色谱(HPLC)对过滤液中抑菌活性物质进行分离和纯化。色谱 柱为SOURCE15RPCST4.6/100柱。流动相A液含有0.065％三氟乙酸和2％乙腈水 溶液。流动相B液含有0.05％三氟乙酸和80％乙腈水溶液。检测波长为215nm， 流速为1mL/min。梯度洗脱过程为50min内流动相A由100％到0；手动收集HPLC 的各组分，并用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分离鉴 定其成分。

3、菌株指肽类物质的抑菌活性测定

利用牛津杯法分别比较菌株脂肽类物质和甲醇对立枯丝核菌的抑菌活性。 在PDA培养基板上均匀放置2个牛津杯，每个牛津杯分别加入100μL菌株指肽 提取物和甲醇，PDA培养基中央接立枯丝核菌盘，25℃静置培养10d，比较其菌 株指肽类物质对立枯丝核菌的抑菌活性。

4、测定结果

采用牛津杯法测定脂肽类物质对立枯丝核菌的抑菌活性，结果表明，脂肽 类物质对立枯丝核菌具有较强的抑菌活性，结果如图9a所示，经HPLC分离纯 化(如图10所示)后的三类组分(LP-1、LP-2、LP-3)对立枯丝核菌的抑制作 用(如图9b所示)，说明解淀粉芽孢杆菌HMB33604脂肽类物质的主要抑菌成 分为LP-2，即为fengycin。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应 以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 防治马铃薯黑痣病的解淀粉芽孢杆菌菌株及菌剂和应用

<130> 2010

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagtcatca tgaccgttct gca 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcagggtac ggatgtgcga gcc 23

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株，已于2019年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18469，该菌株命名为HMB33604。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株在防治马铃薯黑痣病中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株生产的微生物菌剂。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述剂型为液体制剂。

5.一种制备权利要求4所述的微生物菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB33604在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上培养，得到培养后菌株；

(2)将所述培养后菌株接种于LB液体培养基中震荡培养，得到种子液；

(3)将所述种子液接入发酵培养基中进行震荡培养，得到所述微生物菌剂。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述LB平板培养基或LB斜面培养基的组份均包括：胰蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L、氯化钠4-6g/L、琼脂粉12-18g/L；所述活化温度为28-34℃，所述活化时间为20-24h；所述培养的时间为12-18h，所述培养温度为25-35℃。

7.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述LB液体培养基的组份包括：胰蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L、氯化钠4-6g/L；所述培养时间为20-28h，所述培养温度为28-32℃，所述震荡速度为160-200r/min。

8.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述发酵培养基包含以下原料组份：葡萄糖12-18g/L、黄豆粉13-17g/L，氯化钠4-6g/L，硫酸锰0.3-0.5g/L。

9.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:(45-55)，所述培养时间为44-52h，所述培养温度为28-32℃，所述震荡速度为160-200r/min。

10.权利要求3或4所述的微生物菌剂在防治马铃薯黑痣病中的应用。

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