CN114085793B - 一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法及其应用 - Google Patents

一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法及其应用，可有效解决防止植物茎基腐病用菌剂的问题，方法是，将皮氏类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae）LS20‑2‑2接种到LB斜面培养基上，25～30℃培养24～48h，得活化的种子，用灭菌接种环刮取菌苔，接种于营养肉汤液体培养基中，摇床培养，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；将种子培养液接种于发酵培养基中发酵培养，得LS20‑2‑2菌悬液，将LS20‑2‑2菌悬液用载体吸附，晾干，加入黄腐酸钾、壳聚糖、褐藻寡糖、保水剂、糖醇钙、糖醇锌，混合均匀，得LS20‑2‑2固体菌剂；本发明制备的皮氏类芽孢杆菌菌剂有效用于防治茎基腐病，保证作物良好生长和作物丰产，有显著的经济和社会效益。

Description

一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法及 其应用
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法及其应用。
背景技术
病虫害是植物种植中常见危害，严重影响着植物的生长和农作物的丰产丰收，因此，在植物种植中必需加以防治。据统计，世界范围内，植物病害直接或间地接造成经济损失约400亿美元/年，其中真菌性病害约占全部植物病害的80％～90％，真菌病害是植物的侵染性病害，种类多、分布广，病原物一般都是寄生真菌，由菌丝或孢子、菌核，借昆虫、风雨、人为活动传播扩散，造成作物减产、危害果实品质，一些真菌产生的毒素还能引起人畜致癌或中毒。随着全球化时代人员和各种物品大范围流通，原来仅限于某地的真菌感染也更容易扩散，趋势有加重迹象，不仅影响食品安全，甚至威胁生物多样性。
传统防治以化学防治为主，对于土传病害防治效果欠佳。另外杀菌剂的使用一定程度上增强了病原菌的产毒能力，导致病原菌的抗药性增强，且长期过度使用导致了严重的环境污染和生态破坏。
生物防治是解决这些问题最经济、安全的方法。目前商品化的生防菌株主要是芽孢杆菌、酵母菌和一些木霉属真菌，防治效果不稳定，因此需要进一步寻找对环境因子的适应能力强、抗病因子稳定的微生物菌种，为植物病害生物防治提供新的生防菌资源。进一步研究发现，皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)LS20-2-2，2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13053，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；是从青藏高原采集的土壤样品中分离筛选出来的菌株，具有拮抗真菌之功效，访菌株及其所产低温蛋白酶的方法获得专利授权(ZL201710738747.0)。那么能否利用该菌株进一步制备防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂，用于有效防治植物的茎基腐病至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法及其应用，可有效解决防止植物茎基腐病用菌剂的问题。
本发明解决的技术方案是，一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化
将保藏的皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)LS20-2-2，分类命名为皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)，2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13053，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；是从青藏高原采集的土壤样品中分离筛选出来的菌株(已公知)，接种到LB斜面培养基上，25～30℃培养24～48h，得活化的种子；
所述的LB斜面培养基是胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeast extract)5g、氯化钠(NaCl)10g和琼脂粉15g～20g加蒸馏水至1000mL制成(公知技术)；
(2)制备种子培养液：
将活化的种子用灭菌接种环刮取菌苔，接种于2mL营养肉汤液体培养基中，25～30℃、120～180r/min摇床培养24h，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；
所述的营养肉汤液体培养基是蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g和水1000mL制成；
(3)制备LS20-2-2菌悬液：
将种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为培养基体积的2～5％，发酵温度25～37℃，pH5～8，发酵时间18～32h，得LS20-2-2菌悬液，含所述皮氏类芽孢杆菌LS20-2-2的量为1.0×108～1.0×1010cfu/mL；
所述的发酵培养为酪蛋白胨0.5％、鱼蛋白0.2％、酵母粉0.2％、蔗糖1％、尿素0.5％、KH2PO40.1％、MgSO40.05％、MnSO4 0.05％、FeSO40.02％、羧甲基纤维素钠0.05％，加蒸馏水至100％制成；
(4)制备LS20-2-2固体菌剂：
将LS20-2-2菌悬液用载体按照质量比0.5～0.8︰1进行吸附，再晾干，得干燥物，然后加入干燥物质量黄腐酸钾3～5％、壳聚糖0.1～0.5％、褐藻寡糖0.1～0.5％、保水剂4～6％、糖醇钙0.2％、糖醇锌0.1％，混合均匀，得LS20-2-2固体菌剂；
所述的载体为草炭(泥炭)、菌渣(如栽培灵芝后的菌渣)或生物炭中的一种；
所述的保水剂为聚谷氨酸或羧甲基纤维素钠中的一种。
该LS20-2-2固体菌剂有效用于防治茎基腐病，实现在制备防治植物茎基腐病制剂中的应用。
本发明利用已保藏的皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)LS20-2-2作菌种，经培养基发酵和吸附制备成的一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂，具有很好的抑制植物茎基腐病菌的作用，可有效用于防治茎基腐病，保证作物良好生长和作物丰产，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明菌株LS20-2-2的抑菌谱测定图(A：Fusarium oxysporumf.sp.Vasinfectum；B：Pythium graminicola；C：Fusarium graminearum；D：Fusariumoxysporum f.sp.niveum；E：Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersic；F：Sclerotiniasclerotiorum；G：Phytophthora infestans；H：Pseudocercosporaactinidiae Deighton；I：Colletotrichum gloeosporioides；J：Pythium aphanidermatum；上排是抑菌圈，下排为对照)。
图2为本发明菌株LS20-2-2的部分功能特性图(A：产蛋白酶水解圈；B：产纤维素酶透明圈；C：产甘露聚糖酶透明圈；D：产铁载体能力E：在无机磷平板上的透明圈；F：对金黄色葡萄球菌抑菌圈；G：对大肠杆菌抑菌圈；H：对沙门氏菌抑菌圈)。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化
将保藏的皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)LS20-2-2，分类命名为皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)，2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13053，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；是从青藏高原采集的土壤样品中分离筛选出来的菌株(已公知)，接种到LB斜面培养基上，28℃培养36h，得活化的种子；
(2)制备种子培养液：
将活化的种子用灭菌接种环刮取菌苔，接种于营养肉汤液体培养基中，28℃、150r/min摇床培养24h，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；
(3)制备LS20-2-2菌悬液：
将种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为培养基体积的3％，发酵温度31℃，pH6.5，发酵时间25h，得LS20-2-2菌悬液，含所述皮氏类芽孢杆菌LS20-2-2的量为1.0×109cfu/mL；
(4)制备LS20-2-2固体菌剂：
将LS20-2-2菌悬液用载体草炭按照质量比0.7︰1进行吸附，再晾干，得干燥物，然后加入干燥物质量黄腐酸钾4％、壳聚糖0.3％、褐藻寡糖0.3％、保水剂聚谷氨酸5％、糖醇钙0.2％、糖醇锌0.1％，混合均匀，得LS20-2-2固体菌剂。
实施例2
本发明一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化
将保藏的皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)LS20-2-2，分类命名为皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)，2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13053，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；是从青藏高原采集的土壤样品中分离筛选出来的菌株(已公知)，接种到LB斜面培养基上，26℃培养47h，得活化的种子；
(2)制备种子培养液：
将活化的种子用灭菌接种环刮取菌苔，接种于2mL营养肉汤液体培养基中，26℃、130r/min摇床培养24h，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；
(3)制备LS20-2-2菌悬液：
将种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为培养基体积的4％，发酵温度26℃，pH5.5，发酵时间31h，得LS20-2-2菌悬液，含所述皮氏类芽孢杆菌LS20-2-2的量为1.0×1010cfu/mL；
(4)制备LS20-2-2固体菌剂：
将LS20-2-2菌悬液用载体生物炭按照质量比0.6︰1进行吸附，再晾干，得干燥物，然后加入干燥物质量黄腐酸钾3％、壳聚糖0.5％、褐藻寡糖0.15％、保水剂羧甲基纤维素钠6％、糖醇钙0.2％、糖醇锌0.1％，混合均匀，得LS20-2-2固体菌剂。
实施例3
本发明一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂的生产方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化
将保藏的皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)LS20-2-2，分类命名为皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)，2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13053，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；是从青藏高原采集的土壤样品中分离筛选出来的菌株(已公知)，接种到LB斜面培养基上，29℃培养25h，得活化的种子；
(2)制备种子培养液：
将活化的种子用灭菌接种环刮取菌苔，接种于2mL营养肉汤液体培养基中，29℃、170r/min摇床培养24h，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；
(3)制备LS20-2-2菌悬液：
将种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为培养基体积的2％，发酵温度37℃，pH7.5，发酵时间31h，得LS20-2-2菌悬液，含所述皮氏类芽孢杆菌LS20-2-2的量为1.0×108cfu/mL；
(4)制备LS20-2-2固体菌剂：
将LS20-2-2菌悬液用载体菌渣按照质量比0.8︰1进行吸附，再晾干，得干燥物，然后加入干燥物质量黄腐酸钾5％、壳聚糖0.2％、褐藻寡糖0.5％、保水剂羧甲基纤维素钠4％、糖醇钙0.2％、糖醇锌0.1％，混合均匀，得LS20-2-2固体菌剂。
实施例1～3方法所制备的防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂具有很好的拮抗植物茎基腐病菌的作用，可有效用于防治茎基腐病，保证作物良好生长和作物丰产，并经试验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
一、拮抗活性试验
1、供试细菌为前期从西藏、云南分离、保藏的产蛋白酶菌株。
供试植物病原菌见表1
表1 LS20-2-2对常见的十种植物病原菌抑制效果
抑菌谱用细菌：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichiacoli、沙门氏菌Salmonella choleraesuis。
2试验方法
2.1菌株活化、初选
吸取冻存管中保藏的菌种20μL至含有质量浓度0.8-1.2％脱脂奶粉的LB平板培养基平板边缘，划线法接种于培养基，30℃培养至有透明圈产生。选择透明圈大的单菌落重复活化2-3次。
2.2拮抗菌的筛选及抑菌谱试验
采用平板对峙法，将病原菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板，28℃培养3-5d，沿菌落边缘用直径为5mm的打孔器打取圆形菌饼，接入PDA平板中央，28℃培养2d后用灭菌牙签在距菌饼25mm处点接活化好的细菌，28℃培养3-5d后观察记录抑菌圈。对照为只接种病原菌的平板，每个处理重复3次，有抑菌圈的菌株即为拮抗菌株。
选取表1所示的10种多发的植物病原真菌进行抑菌谱试验，结果见图1，菌株LS20-2-2对这些常见的植物病原菌有明显的抑制作用。用十字交叉法测定抑菌圈直径D和菌落直径d，计算抑菌率，结果如表1所示。
2.3拮抗特性及促生性能实验
表2菌株LS20-2-2功能特性
实验1：对玉米茎基腐病应用效果
试验在温室进行，设4个处理，分别为(1)出苗后用细菌悬液稀释500倍灌根100mL/株；(2)出苗后用细菌悬液稀释200倍灌根100mL/株；(3)出苗后用细菌悬液稀释100倍灌根100mL/株；(4)不使用菌剂为空白对照CK；每个处理设3次重复。
将玉米种子(郑单958)，用2％次氯酸钠表面消毒5min，用无菌蒸馏水洗涤3次，然后5粒/盆播种。病原菌接种采用埋种法，玉米茎基腐病主要由腐霉菌(Pythiumgraminicola)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)共同侵染造成，用玉米种子做培养基扩繁两种菌种等量混合50g/盆，埋在茎基部开的l0cm左右小沟内，浇水至完全定殖。接种15d后调查植株发病情况，计算其发病率。
病害防治效果(％)＝(对照的发病率-处理的发病率)/(对照的发病率)×100％。
试验结果显示，与未接种病原菌的相比，施用稀释100倍、200倍、500倍的LS20-2-20菌悬液100mL(109cfu/mL)使玉米茎腐病发病率由74.6％降低至35.2％以下，防效达到了52.8％以上，与对照相比差异显著。尤其以施用LS20-2-2细菌悬液稀释200倍灌根100mL/株在该病害控制方面更有效，发病率降低至29.7％，防效达到了60.2％。结果表明，LS20-2-2能够有效减少玉米茎腐病的发生，对玉米在表观上无药害产生。
实验2：对小麦应用效果实验
供试小麦品种为丰德存麦20号，试验地河南新乡市某村。
试验设2个处理，每个处理4个重复小区，每个小区面积为200m2。种植前将LS20-2-2微生物菌剂作为底肥(30公斤～50公斤/亩)均匀撒施在农田土壤表面，施用后对麦田旋耕，深度为15cm～30cm左右，将微生物菌剂与土壤均匀混合。
试验设2个处理：LS20-2-2微生物菌剂；空白对照CK：不施用任何农药和肥料。追肥于小麦返青期，每亩10kg尿素。
出苗情况观察：小麦出苗后7d，观察处理之间出苗差异。大约60％出苗时的天数为出苗时间。齐苗后，每处理5点调查，每点随机取1m2，折算每亩基本苗和出苗率。
小麦茎基腐病防效调查：小麦返青期、拔节期每处理5点调查，每点50株，记录茎基腐病病级，计算病指防效。
分级标准为：0级，整株无变褐症状；
1级，植株第1叶鞘变褐，变褐面积不超过1/2；
2级，植株第1叶鞘变褐，变褐面积超过1/2；
3级，植株第1叶鞘变褐，变褐面积超过1/2，且褐色加深；
4级，植株第2叶鞘变褐；
5级，植株第3叶鞘变褐或植株死亡。
小麦灌浆期每处理5点调查，每点随机取1m2，调查面积内小麦总穗数及白穗数，计算病情指数和防治效果。
分级标准：0级，整株无变褐症状；
1级，根部有变褐现象；
3级，地上部分第1茎节有变褐腐烂现象；
5级，地上部分第2茎节有变褐腐烂现象；
7级，病斑超过第2茎节，但无白穗；
9级，病斑超过第2茎节，出现白穗。
病情指数(％)＝∑(各病级株数×相对级数值)/(调查总株数×发病最重级的代表数值)×100
防治效果(％)＝(对照区平均病情指数－处理区平均病情指数)/对照区平均病情指数×100
收获前，每处理5点取样，每点1m2样方，计算亩穗数、穗粒数及产量。
表3 LS20-2-2菌剂对小麦应用效果
从表3可以看出，该微生物菌剂对减轻小麦茎基腐病发病率有明显的作用，并且，与常规种植方法相比，本发明可以提高小麦的出苗率、增加千粒重和亩产量。还可以提高小麦在苗期的根系的生长状况以及后期茎秆发育情况，从而提高抗逆性能，经计算，产量提高20％以上。
总之，本发明利用皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)制备的防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂，对多种植物病原真菌有良好的防治效果，且具有使用简单，条件要求简单，菌株生长速度快，耐热、耐紫外线、耐盐性好，对环境适应性强的优点；有固氮、溶磷作用，产生植物激素，能分泌多种酶，具有植物防病、植物促生、改良土壤的作用；且对人畜安全无污染，对环境友好。符合农业绿色、可持续发展方向，可有效用于防治植物真菌病害，特别是用于玉米、小麦的茎基腐病的防治，促进植物生长，增加产量，是农作物防治真菌病害制剂上的一大创新，市场广阔，经济和社会效益巨大。

Claims (4)

1.一种防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂在制备防治植物茎基腐病制剂中的应用，所述的植物为玉米或小麦，所述的菌剂的制备方法包括以下步骤：
（1）菌种活化
将保藏的皮氏类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae）LS20-2-2，分类命名为皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)，2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13053，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号；是从青藏高原采集的土壤样品中分离筛选出来的菌株，接种到LB斜面培养基上，25～30℃培养24～48h，得活化的种子；
所述的LB斜面培养基是胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和琼脂粉15g～20g加蒸馏水至1000mL制成；
（2）制备种子培养液：
将活化的种子用灭菌接种环刮取菌苔，接种于2mL营养肉汤液体培养基中，25～30℃、120～180r／min摇床培养24h，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；
所述的营养肉汤液体培养基是蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g和水1000mL制成；
（3）制备LS20-2-2菌悬液：
将种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为培养基体积的2～5%，发酵温度25～37℃，pH5～8，发酵时间18～32h，得LS20-2-2菌悬液，含所述皮氏类芽孢杆菌LS20-2-2的量为1.0×108～1.0×1010cfu/mL；
所述的发酵培养为酪蛋白胨0.5％、鱼蛋白0.2％、酵母粉0.2％、蔗糖1％、尿素0.5%、KH2PO40.1％、MgSO40.05％、MnSO4 0.05％、FeSO40.02％、羧甲基纤维素钠0.05%，加蒸馏水至100%制成；
（4）制备LS20-2-2固体菌剂：
将LS20-2-2菌悬液用载体按照质量比0.5～0.8︰1进行吸附，再晾干，得干燥物，然后加入干燥物质量黄腐酸钾3～5%、壳聚糖0.1～0.5%、褐藻寡糖0.1～0.5%、保水剂4～6%、糖醇钙0.2％、糖醇锌0.1％，混合均匀，得LS20-2-2固体菌剂；
所述的载体为草炭、菌渣或生物炭中的一种；
所述的保水剂为聚谷氨酸或羧甲基纤维素钠中的一种。
2.根据权利要求1所述的防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂在制备防治植物茎基腐病制剂中的应用，其特征在于：
所述的步骤（1）菌种活化，28℃培养36h，得活化的种子；
所述的步骤（2）制备种子培养液，28℃、150r／min摇床培养24h，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；
所述的步骤（3）制备LS20-2-2菌悬液，接种量为培养基体积的3%，发酵温度31℃，pH6.5，发酵时间25h，得LS20-2-2菌悬液，含所述皮氏类芽孢杆菌LS20-2-2的量为1.0×109cfu/mL；
所述的步骤（4）制备LS20-2-2固体菌剂，将LS20-2-2菌悬液用载体草炭按照质量比0.7︰1进行吸附，再晾干，得干燥物，然后加入干燥物质量黄腐酸钾4%、壳聚糖0.3%、褐藻寡糖0.3%、保水剂聚谷氨酸5%、糖醇钙0.2％、糖醇锌0.1％，混合均匀，得LS20-2-2固体菌剂。
3.根据权利要求1所述的防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂在制备防治植物茎基腐病制剂中的应用，其特征在于：
所述的步骤（1）菌种活化，26℃培养47h，得活化的种子；
所述的步骤（2）制备种子培养液，26℃、130r／min摇床培养24h，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；
所述的步骤（3）制备LS20-2-2菌悬液，接种量为培养基体积的4%，发酵温度26℃，pH5.5，发酵时间31h，得LS20-2-2菌悬液，含所述皮氏类芽孢杆菌LS20-2-2的量为1.0×1010cfu/mL；
所述的步骤（4）制备LS20-2-2固体菌剂，将LS20-2-2菌悬液用载体生物炭按照质量比0.6︰1进行吸附，再晾干，得干燥物，然后加入干燥物质量黄腐酸钾3%、壳聚糖0.5%、褐藻寡糖0.15%、保水剂羧甲基纤维素钠6%、糖醇钙0.2％、糖醇锌0.1％，混合均匀，得LS20-2-2固体菌剂。
4.根据权利要求1所述的防治植物真菌病害的皮氏类芽孢杆菌菌剂在制备防治植物茎基腐病制剂中的应用，其特征在于：
所述的步骤（1）菌种活化，29℃培养25h，得活化的种子；
所述的步骤（2）制备种子培养液，29℃、170r／min摇床培养24h，调节细胞浓度至1×108个/mL制成种子培养液；
所述的步骤（3）制备LS20-2-2菌悬液，接种量为培养基体积的2%，发酵温度37℃，pH7.5，发酵时间31h，得LS20-2-2菌悬液，含所述皮氏类芽孢杆菌LS20-2-2的量为1.0×108cfu/mL；
所述的步骤（4）制备LS20-2-2固体菌剂，将LS20-2-2菌悬液用载体菌渣按照质量比0.8︰1进行吸附，再晾干，得干燥物，然后加入干燥物质量黄腐酸钾5%、壳聚糖0.2%、褐藻寡糖0.5%、保水剂羧甲基纤维素钠4%、糖醇钙0.2％、糖醇锌0.1％，混合均匀，得LS20-2-2固体菌剂。
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