CN117431166B - 短密木霉菌新菌株tb2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及短密木霉菌新菌株TB2及其应用，本发明申请人自行筛选的菌株TB2是从梨园中分离出来的，经鉴定，该菌株能在盐碱地上有很好的生长表现，在NaCl浓度为0.4M和pH为8.0的条件下均能良好生长；此外，该菌株还具有高产IAA、铁载体和溶解难溶性铁能力，对西瓜和黄瓜枯萎病病原菌均有良好的抑制作用；经过模拟盐碱条件发现：该菌株对植物具有良好的促生作用，由此说明，本申请的TB2菌株有良好的耐盐碱特性，在盐碱条件下仍对植物有促生作用，是一株性状优良的生防菌株，该菌株在制备盐碱地改良剂、生物有机肥、生物农药等领域都有很好的应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及短密木霉菌新菌株TB2及其应用。
背景技术
石灰性土壤广泛分布于南北纬10°～40°的干旱、半干旱地区，约占世界农业用地总面积的30%。石灰性土壤中一般含有较高浓度的重碳酸盐，pH值处在7.5～9.0的较高范围，导致土壤中有效性铁和有效性磷含量低，严重影响了梨等经济果树的产量及品质。
木霉不仅具有生防功能能直接抑制病原菌的生长，还可以定殖于植物根部，通过多种作用机制与植物互作，从而直接或间接地促进植物生长。除此之外木霉能够通过分泌有机酸溶解土壤中微溶性或难溶性矿物质，使土壤中的矿物质转化成植物可吸收利用的活化态，对植物生长起到促进作用。因此外源添加木霉菌剂是改善石灰性土壤障碍的有效方法。然而在实际工作中我们发现，同属同种的不同菌株，其生理上有较大差别，比如，目前市场上常见的木霉产品NJAU 4742在碱性条件下生长较差其促生及其他功能无法充分发挥。
因此，菌株的筛选、研发工作是一项永无止境的研究领域，新菌株的发现将为后续盐碱地改良、植物保护、生物菌肥等各个领域提供坚实的基础，本申请主要是为了筛选出具有耐盐碱、促生效果明显同时还兼具抗病性的多功能微生物，该菌株的筛选对石灰性土壤上梨树的正常生长及其产量和品质的提升有重要意义。
发明内容
鉴于上述内容，有必要筛选出具有耐盐碱、促生效果明显同时还兼具抗病性的多功能微生物，该菌株的筛选对石灰性土壤上梨树的正常生长及其产量和品质的提升有重要意义。
为达到上述目的，本发明筛选出了一株新菌株：短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2，分类命名为Trichoderma brevicompactum TB2，其保藏编号为CCTCC NO：M20231913；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏日期为2023年10月16日。
本发明还包括包含所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2的菌剂。
本发明还包括所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或如所述菌剂在制备盐碱地改良剂上的应用。
本发明还包括所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或所述菌剂在抑制西瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum,FOC）和黄瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum,FON）生长上的应用。
本发明还包括所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或所述菌剂在促进梨树生长上的应用。
本发明还包括所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或所述菌剂在制备生物肥料、生物农药和/或土壤修复剂上的应用。
本发明还包括应用所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或所述菌剂促进植物生长的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株TB2的孢子制备成悬浮液然后将该悬浮液对栽培好的植物进行灌根处理，其他管理方法采用常规管理方法即可。
进一步的，所述植物为梨树。
进一步的，所述悬浮液的孢子浓度为107cfu/ml。
本发明的有益效果为：本发明申请人自行筛选的菌株TB2是从梨园中分离出来的，经鉴定，该菌株能在盐碱地上有很好的生长表现，在NaCl浓度为0.4M和pH为8.0的条件下均能良好生长；此外，该菌株还具有高产IAA、铁载体和溶解难溶性铁能力，对西瓜和黄瓜枯萎病病原菌均有良好的抑制作用；经过模拟盐碱条件发现：该菌株对植物具有良好的促生作用，由此说明，本申请的TB2菌株有良好的耐盐碱特性，在盐碱地上仍对植物有促生作用，是一株性状优良的生防菌株，该菌株在制备盐碱地改良剂、植物生物肥、生物农药等领域都有很好的应用。
附图说明
图1 为菌株TB2的系统发育树图。
图2 为菌株TB2的平皿图。
图3 为菌株TB2对西瓜枯萎病病原菌的平板对峙实验结果图。
图4 为菌株TB2对黄瓜枯萎病病原菌的平板对峙实验结果图。
图5 为不同接种处理的梨苗生长情况图。
图6 为不同接种处理的梨苗根部情况图。
图7 为不同接种处理的植株鲜重和干重结果图；左图为植株鲜重，右图为植株干重。
图8 为不同接种处理的植株全磷积累量图。
图9 为不同接种处理的植株总根长和根表面积结果图；左图为总根长，右图为根表面积。
图10为不同接种处理的土壤有效铁含量结果图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
本实施例使用的益生菌为短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2，分类命名为Trichoderma brevicompactum TB2，其保藏编号为CCTCC NO：M20231913；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏日期为2023年10月16日。
该菌株从北京梨园土壤中分离而得。
1、菌株的分子鉴定：基于ITS序列的比对及针对rpb2、tef1基因片段的系统发育进化树分析鉴定，得到的结果如图1所示，从图中可见：TB2菌株与Trichoderma属聚为一类，与Trichoderma brevicompactum种具有99%的同源性；因此，将TB2菌株鉴定为Trichoderma brevicompactum种。
2、形态学鉴定：将TB2孢子液接种于PDA培养基上，置于恒温培养箱中进行培养，培养3d后，平皿上菌落直径约为9cm，呈蛛丝状，白色，散射光下由于产孢表面呈绿色，孢子分布呈同心圆，无需光照即可产生成熟孢子。综合分子鉴定，认为该菌株为短密木霉菌。
实施例2
短密木霉菌株TB2的盐碱性实验，具体为：将菌株TB2 的孢子液接种到普通PDA培养基上，28℃培养2d。待到菌丝长满平板后使用9mm打孔器取最边缘的菌饼接种至含0.2M和0.4M 的NaCl PDA培养基上，设置5个重复。在28℃下黑暗培养，24h后测定其菌落直径。使用9mm打孔器取最边缘的菌饼接种至pH为4.0、6.0、8.0的PDA培养基上，设置5个重复。在28℃下黑暗培养，24h和48h后测定其菌落直径。得到的结果如表1所示。
从表1中可知，在NaCl浓度为0.4M 和pH为8.0的条件下菌株TB2能够良好的生长。
实施例3
菌株TB2的促生特性分析，具体包括以下步骤。
1、菌株TB2生长素IAA产量测定：IAA 产量的检测采用 Salkowski 比色法(Glickmann and Dessaux, 1995)。将菌株TB2孢子液以1%的接种量加入含200 mg·L-1色氨酸的PDB培养基中，黑暗下28°C， 170 r·min-1 振荡培养5d。然后将菌悬液在8000 r·min-1，4°C离心10 min 取发酵液上清100μL，以 1:1 的比例加入Salkowski 显色液，避光反应30 分钟，若反映液变为红色，则说明发酵液中含 IAA 类似物，且颜色越深表示IAA含量越高。用酶标仪测定 OD530值，用相应的标准曲线计算出该菌株产IAA的量。 标准曲线采用IAA 标准品(Sigma)制作。配置的 IAA 溶液浓度依次为 0，10，20，30，40，50 mg/L，按上述梯度溶液分别吸取100μL，加入100μL比色液，暗处反应30 min后测定 OD530nm。加入比色液的PDB空白培养基为对照，各设置三个重复，绘制标准曲线。
2、菌株TB2铁载体产量测定：取1 mL新鲜木霉孢子悬液加入到100 m L的LNM 缺铁培养基中，28 ℃，170 r·min-1 振荡培养5 d。然后将菌悬液在8000 r·min-1，4°C离心10min 取发酵液上清100μL，加入等体积 CAS 检测液，充分混匀，黑暗静置 0.5~1 h，用酶标仪测定 630 nm 处的吸光值 (As)，并用超纯水作为对照进行调零。另取未加孢子的培养基与 CAS 检测液液等体积混合，颠倒混匀，黑暗处理相同的时间，以其吸光值作为参比值(Ar)。然后根据[(Ar-As)/Ar]×100%此公式计算出铁载体的相对含量。
3、菌株TB2溶铁能力测定：在24孔板中预先加入1.45 mL的 LNM 培养基，称取 1 g氧化铁粉末于50 mL 离心管中，115°C，灭菌 30 min 后，加入 50 mL 10%LNM培养基，摇匀后，每个孔加入50μL，其中对照组加入15μL的无菌水，处理组加入15μL的TB2木霉孢子液，每个处理设三个重复，一式五份，28 °C，170 r·min-1 恒温摇床振荡，在第24h、48h、72h、96h破坏性取样测定菌液pH。在第96h吸取菌液置于离心管中，离心后吸取上清液过0.22μm 滤膜，加混酸(浓 HNO3: HClO4=4:1) 消煮后，ICP-OES测铁浓度。得到的结果如表2所示。
从表2中可见，菌株TB2有较强的产IAA、产铁载体能力，也有一定的溶铁能力，说明菌株TB2对植物具有一定的促生潜力。
菌株TB2与氧化铁的共培养pH如表3所示，表中可见，在前48h TB2实验组与空白组的pH值相差不大，72h时，TB2实验组的pH显著下降，说明，菌株TB2在培养24h-48h时间段可以通过大量产酸溶解难溶性铁。
实施例4
本实施例研究菌株TB2对多种植物病原真菌的抑制作用，具体如下(图3中所注B2即为菌株TB2）。
菌株TB2对西瓜枯萎病（Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum,FOC）的影响：申请人将获得的相关病原菌后采用平板对峙实验进行抑菌效果的研究，具体为，将上述西瓜枯萎病的病原菌用灭菌打孔器取直径约9mm大小的菌块分别接种在9cm的PDA平板一侧，将木霉TB2接种于平板另一侧，在 28℃下黑暗培养，拍照记录真菌对峙情况。具体如图3所示，图中A为未接种TB2的对照组，B为接种了TB2的实验组，从图中可见，实验组的西瓜枯萎病的病原菌的菌丝明显受到TB2菌株的抑制。
2、菌株TB2对黄瓜枯萎病（Fusarium oxysporum f. sp. niveum,FON）的影响：申请人将获得的相关病原菌后采用平板对峙实验进行抑菌效果的研究，具体为，将上述黄瓜枯萎病的病原菌用灭菌打孔器取直径约9mm大小的菌块分别接种在9cm的PDA平板一侧，将木霉TB2接种于平板另一侧，在 28℃下黑暗培养，拍照记录真菌对峙情况。具体如图4所示，图中A为未接种TB2的对照组，B为接种了TB2的实验组，从图中可见，实验组的黄瓜枯萎病的病原菌的菌丝明显受到TB2菌株的抑制。
实施例5
本实施例研究石灰性土壤上菌株TB2对杜梨幼苗的促生作用。
1、本实施例的供试土壤采自江苏省徐州市，基本理化性质如表4所示。
2、实验方法具体包括以下步骤。
（1）孢子悬浮液制备：将菌株TB2菌株接种于PDA培养基上，28℃培养7d至完全产孢。刮取孢子，用去无菌水将孢子悬液浓度调至108cfu/ml。
（2）育苗：杜梨种子提前用无菌去离子水浸泡一天，75%酒精浸泡 1 min， 无菌水冲洗 3~5 次，2%次氯酸钠溶液浸泡 20 min，无菌水冲洗 5 次。消毒好的杜梨种子均匀地平铺在灭菌的滤纸上催芽 3~5 天，挑选萌发的种子点播在灭菌的穴盘基质中，至梨幼苗长出三片真叶。
（3）移苗：将土壤和河沙灭菌后按照3:1（v/v）的比例混合置于塑料盆钵中，250g每钵，选取长势一致的梨苗幼苗移栽到含混合土壤的盆钵中，缓苗10d后进行木霉孢子悬液灌根处理，每株梨苗根部接种木霉TB2孢子悬液10 ml（接种浓度为107 cfu/ml)，设置不接菌处理为空白对照CK。接种10天后进行二次接菌，操作与一次接菌一致，培养2月后收获。
（4）收苗：培育2月后对梨苗的生长情况进行测量，包括株高、地上部与根系干鲜重、地上部与根系全铁、全磷含量、叶片活性铁含量、土壤pH、有效铁和有效磷含量。并对番茄苗根系进行扫描分析其总根长和根表面积。
（5）实验结果：图5为不同接种处理的梨苗生长情况，可见，在石灰性土壤上，接种菌株TB2的梨苗长势明显优于不接菌的对照处理；不同接种处理的梨苗的根部情况如图6所示，可见，在石灰性土壤上，接种菌株TB2的梨苗根系明显比不接菌的对照处理更发达。
不同接种处理的梨苗鲜重和干重如图7所示，左图为鲜重，右图为干重，从图中可见，与CK相比，接种菌株TB2的梨苗鲜重显著提高了25.0%和梨苗干重显著提高了23.0%。
不同接种处理的梨苗全磷积累量如图8所示，从图中可见，与CK相比，接种菌株TB2的梨苗全磷积累量显著提高了23.8%。
不同接种处理的梨苗总根长和根表面积如图9所示，图中左图为总根长，右图为根表面积，从图中可见，与CK相比，接种菌株TB2梨苗总根长显著提高74.3%，梨苗根表面积显著提高118.0%。
不同接种处理的土壤有效铁含量如图10所示，从图中可见，与CK相比，接种菌株TB2土壤中有效铁含量显著提高了49.3%。
综上所述，本发明申请人自行筛选的菌株TB2能在盐碱地上有很好的生长表现，在NaCl浓度为0.4M和pH为8.0的条件下均能良好生长，且还发现该菌株能高产IAA、铁载体和溶解难溶性铁能力，经过模拟盐碱条件发现：该菌株对植物还具有良好的促生作用，经过与病原菌的平板对峙实验，还发现该菌株对西瓜和黄瓜枯萎病病原菌有良好的抑制作用，由此说明，本申请的TB2菌株有良好的耐盐碱特性，在盐碱地上仍对植物有促生作用，是一株性状优良的生防菌株，该菌株在制备盐碱地改良剂、生物有机肥、生物农药等领域都有很好的应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2，其保藏编号为CCTCC NO：M20231913。
2.包含权利要求1所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2的菌剂。
3. 如权利要求1所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或如权利要求2所述菌剂在抑制黄瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）和西瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）生长中的应用。
4. 如权利要求1所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或如权利要求2所述菌剂在促进梨树生长中的应用。
5. 如权利要求1所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或如权利要求2所述菌剂在制备生物肥料或生物农药中的应用。
6. 应用如权利要求1所述短密木霉菌(Trichoderma brevicompactum)菌株TB2或如权利要求2所述菌剂促进梨树生长的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株TB2的孢子制备成悬浮液，然后将该悬浮液对栽培好的梨树进行灌根处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述悬浮液的孢子浓度为107cfu/ml。
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