CN109182146A - 一种脐孢木霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种脐孢木霉菌株及其应用。本发明与设施蔬菜土传病害生物防治技术领域相关。从蔬菜作物根际土壤中分离筛选得到一种拮抗真菌脐孢木霉(Trichoderma brevicompactum)Tb12菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018649。通过系统试验，验证了分离株脐孢木霉Tb12具有较强的稳定性，较高的孢子悬浮液活性和发酵滤液活性，对土传蔬菜病害特别是豇豆枯萎病菌具有良好的生物防治效果。

Description

一种脐孢木霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种分离的脐孢木霉菌株及其应用。本发明与与蔬菜土传病害的生物防治领域相关。
背景技术
我国设施蔬菜产业发展迅速，2014年全国设施蔬菜面积超过380万hm2(5700万亩)，蔬菜生产方式得到进一步丰富，对于保障蔬菜周年供应和调整蔬菜品种结构意义重大。与露地栽培相比，设施栽培棚室湿度高、轮作倒茬困难，为病虫害的发生流行提供了有利条件。设施地土壤的次生盐渍化、酸化，土壤养分失衡，土传病害严重，造成蔬菜产量下降、品质恶劣，严重制约了设施蔬菜生产的可持续发展。
对设施蔬菜基地调查结果表明，猝倒病、立枯病、枯萎病、根腐病、黄萎病、青枯病、根结线虫等土传病害呈加重趋势。目前，针对这些病害主要以化学防治为主，但化学农药的长期和过量使用会导致生态环境破坏、次要病害猖獗、蔬菜农药残留超标等问题，直接影响了设施蔬菜的产量和品质，生物防治是一种环境友好且能够有效防治植物病害的方法，已成为继农业防治、化学防治之后的又一重要防治方法，并且有修复土壤生物多样性的作用，极具开发潜力。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺陷，为了解决设施蔬菜土传病害化学防治中的环境安全问题，提供一种脐孢木霉菌株的分离筛选及其在蔬菜土传病害防治中的应用。
本发明的技术方案如下所述：
申请人于2017年7月，在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖蔬菜基地土传病害发生严重的地块，从设施蔬菜作物根际土壤中分离筛选得到一种拮抗真菌，申请人将该菌株命名为脐孢木霉Tb12，Trichoderma brevicompactum Tb12，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号：CCTCC NO：M2018649。
脐孢木霉Tb12的菌学特征：
在PDA培养基平板上，脐孢木霉Tb12初期菌落生长平整呈白色，经过3d培养，白色菌丝基本长满培养皿，且边缘有致密的白色孢子层，随培养时间的延长，孢子层逐渐变成深绿色，分生孢子梗主分支呈树状排列，其上有2-3个次级分支，基部变细、中间膨大、以大角度伸出，分生孢子近球形。
本发明分离的脐孢木霉(Trichoderma brevicompactum)Tb12可在防治蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用。
上述脐孢木霉(Trichoderma brevicompactum)Tb12的应用，包括以下步骤：
A、以豇豆枯萎病菌作为指示菌
用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.)JWS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014314；
B、脐孢木霉Tb12的稳定性测定
在PDA培养基平板上对保藏编号为CCTCC NO：M 2018649的脐孢木霉Tb12进行连续10代的继代培养，以豇豆枯萎病菌JWS-1为指示菌，采用平板对峙法测定脐孢木霉Tb12拮抗活性的稳定性；
C、脐孢木霉Tb12孢子悬浮液活性测定
取培养好的脐孢木霉Tb12斜面菌种，加入适量的无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，采用血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，在该平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，并以仅接种指示菌的为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d后测量菌落直径；
D、脐孢木霉Tb12发酵滤液活性测定
用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的脐孢木霉Tb12菌丝，接种于50mL的PD培养基中，在180rpm/min，28℃恒温振荡培养5d，用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，并以仅接种指示菌的为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d后测量菌落直径；
E、活体盆栽
将豇豆种子用55℃温水浸泡30min，清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗得到干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子数为2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，接种豇豆枯萎病菌JWS-1，7d后用8.55×107cfu/mL的脐孢木霉Tb12发酵滤液灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查，在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理；每处理3次重复，每重复10株，按时统计幼苗发病情况(参照张衍荣等，2005年的报道)，计算病情指数和防治效果。计算公式如下所述：
PDA培养基及制备方法：去皮马铃薯200g，切成厚约2mm的片，加入1000mL蒸馏水煮沸30min，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g，加热溶解后再补足蒸馏水至1000mL，自然pH，于121℃湿热高压灭菌30min，之后在超净工作台上倒平板，得到PDA培养基；
PD培养基及制备方法：称取200g马铃薯，洗净去皮切片，加水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加水补足至1000mL，再加12g葡萄糖，煮沸至固体充分溶解后分装到三角瓶中，于121℃湿热高压灭菌20min，得到PD培养基。
本发明具有以下有益效果：
1、脐孢木霉Tb12从设施蔬菜根际土壤分离获得，该菌株对蔬菜作物安全，且对豇豆枯萎病具有防治作用，可用于设施蔬菜土传病害的防治。
2、脐孢木霉Tb12稳定性好，防效较高，连续10代继代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1抑菌效果稳定在72％以上，田间盆栽防效达到77.13％，适合设施蔬菜土传病害防治要求。
3、脐孢木霉Tb12防治设施蔬菜土传病害，使用方法简单，只需将菌株进行发酵培养，然后取发酵滤液对作物灌根即可，使用特别方便。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是脐孢木霉的18S rDNA序列表。
图1：脐孢木霉Tb12菌落形态及分生孢子和分生孢子梗形态。
图2：脐孢木霉Tb12的18S rDNA-ITS系统发育树。
图3：脐孢木霉Tb12发酵滤液对豇豆枯萎病的防治效果。附图标记说明：图3中的A为脐孢木霉Tb12发酵滤液处理组；图3中的B为对照组(仅接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1)。
具体实施方式
实施例1候选菌株的分离与鉴定
A、土样采集
2017年7月在中国.湖北.武汉市.武汉市农业科学院武湖蔬菜基地土传病害发生严重的地块，采用5点取样法，取地下15-20cm处土样，采集设施蔬菜作物根际土壤，自然风干后保存备用。
B、菌株分离纯化
称取5g土样倒入三角瓶中，加无菌水至50mL，28℃振荡30min后静置，即为10-1土壤悬液，再从上述溶液中取出1mL，加入9mL无菌水充分振荡制成10-2的土壤稀释液，吸取100μL稀释液涂于马丁氏培养基(配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，孟加拉红0.03g，琼脂20g，补充蒸馏水定容至1L，自然pH，分装后在121℃湿热蒸汽中高压灭菌30min)。试验时每mL培养基中加入30μg链霉素以抑制放线菌生长，将灭菌后的培养基置于28℃培养箱中培养，生长5天后挑取单菌落(候选菌株)于PDA培养基上，进行分离纯化，4℃保存备用。
C、菌株形态学观察
将候选菌株接种到PDA培养基平板上，置于28℃恒温培养，观察菌落形态和颜色，5d后制作玻片在光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征。
候选菌株在PDA培养基平板上，初期菌落生长平整呈白色，经过3d培养，白色菌丝基本长满培养皿，且边缘有致密的白色孢子层，随培养时间的延长，孢子层逐渐变成深绿色，分生孢子梗主分支呈树状排列，其上有2-3个次级分支，基部变细、中间膨大、以大角度伸出，分生孢子近球形。
D、菌丝收集
用接种针挑取少量菌丝，在无菌条件下接种至装有100mL PD培养基的三角瓶内，28℃、180rpm/min振荡培养4d，取10mL上述菌液至无菌离心管内，13000rpm/min离心10min，弃上清收集菌丝备用；
E、DNA提取
采用OMEGA HP Fugal DNA Kit提取基因组DNA，利用通用引物ITS1/ITS4对候选菌株18s rDNA的ITS片段进行扩增，引物序列为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(PCR方法为常用方法)。
F、测序
采用常用1.0％琼脂糖凝胶法对扩增产物进行检测，并用紫外凝胶成像系统进行拍照保存，PCR扩增产物直接送武汉擎科创新生物技术有限公司进行测序。
G、分子鉴定
将测得的序列与NCBI BlAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库中进行比对，确定待鉴定菌株的遗传来源，用MEGA6.0.6软件与已知菌种ITS序列作同源性比较，并对检索获得的同源性较近的菌株采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树(Boot-strap＝1000)，分析亲缘关系和系统发育，结合微生物形态学检索，将所得的候选菌株即分离株Tb12命名为脐孢木霉Tb12，Trichoderma brevicompactum Tb12，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2018649。
实施例2脐孢木霉Tb12在防治设施蔬菜土传病害-豇豆枯萎病中的应用
具体实施步骤如下：
A、脐孢木霉Tb12菌株的稳定性的测定
在PDA培养基平板上对筛选得到的脐孢木霉Tb12进行连续10代的继代培养，并每一代以豇豆枯萎病菌JWS-1(该菌株分离单位为武汉市蔬菜科学研究所，于2014年7月3日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014314，该菌株已获中国发明专利授权，专利号为ZL 2014103340109，授权公告日为2016.02.17)为指示菌，利用平板对峙法测定脐孢木霉Tb 12拮抗活性的稳定性。
结果表明，本发明分离的脐孢木霉Tb 12连续10代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制率稳定在72％以上，具体数据见表1。
表1脐孢木霉Tb12的拮抗活性稳定性
B、脐孢木霉Tb12菌株孢子悬浮液活性的测定
取培养好的脐孢木霉Tb 12斜面菌种，加入5mL无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，在该平板中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接种豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径。
结果表明，脐孢木霉Tb 12孢子悬液对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制作用随稀释倍数的增加而降低，即，抑制率由85.03％降至65.26％，在最低浓度时其抑制率均超过60％，具体数据见表2。
表2脐孢木霉Tb12孢子悬浮液活性
C、脐孢木霉Tb12菌株发酵滤液活性的测定
用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的脐孢木霉Tb 12菌丝，接种于50mL的PD培养基中，在180rpm/min、28℃恒温振荡培养5d。用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径。
结果表明，脐孢木霉Tb12发酵滤液对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制率为71.63％，具体见表3。
表3脐孢木霉Tb12发酵滤液对豇豆枯萎病菌的抑制作用
D、活体盆栽
将市购豇豆种子(品种不限)用55℃温水浸泡30min，再用清水清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗，得到干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子2.05×107cfu/mL指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，在接种JWS-1菌液7d后做如下处理：用脐孢木霉Tb12发酵滤液(8.55×107cfu/mL)灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株做为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查(在第1次调查结束后及时应进行第2次灌根处理)。
每处理3次重复，每重复10株。按时统计幼苗发病情况，按病情分级(参照张衍荣等，2005年报道)，计算病情指数和防治效果；
豇豆枯萎病病情分级标准参照张衍荣等，2005年报道的方法。
0级：无症状；
1级：胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常；
3级：胚轴或子叶出现明显坏死，或1片子叶黄化，影响生长；
5级：2片子叶黄化，或1片子叶枯死；
7级：2片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长；
9级：整株萎蔫、倒伏或枯死；
采用浸根接种法测定脐孢木霉Tb12发酵滤液(8.55×107cfu/mL)对豇豆枯萎病菌进行生物防效试验，结果表明，脐孢木霉Tb12发酵滤液7d时对豇豆枯萎病的防治效果为100％，14d时为77.13％，具体数据见表4。
表4脐孢木霉Tb12发酵滤液对豇豆枯萎病的防效
实施例验证表明，本发明分离的脐孢木霉Tb12具有较强的稳定性，较高的孢子悬浮液活性和发酵滤液活性，具有良好的防治设施蔬菜土传病害-豇豆枯萎病的效果。
序列表
<110> 武汉友芹种苗技术有限公司
<120> 一种脐孢木霉菌株及其应用
<141> 2018-09-28
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 633
<212> DNA
<213> 脐孢木霉(Trichoderma brevicompactum)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(633)
<400> 1
aaatttcccc cgtagggggg actgcggagg gatcattacc gagtttacaa ctccccaaac 60
cccaatgtga acgttaccaa actgttgcct cggcgggatt tctgccccgg gcgcgtcgca 120
gccccggacc aaggcgcccg ccggaggacc aatttacaaa ctcttttgta tatcccatcg 180
cggattcttt acattctgag ctttctcggc gctcctagcg agcgtttcga aaatgaatca 240
aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 300
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ccagtattct ggcgggcatg cctgtccgag cgtcatttca accctcgaac ccctccgggg 420
ggtcggcgtt ggggatcggc acttacctgc cggccccgaa atacagtggc ggtctcgccg 480
cagcctctcc tgcgcagtag tttgcacact cgcaccggga gcgcggcgcg tccacggccg 540
taaaacaacc caaacttctg aaatgttgac ctcggatcag gtaggaatac ccgctgaact 600
tagcatatca ataaagcggg aggaaaactc ccc 633

Claims (3)

1.一种分离的脐孢木霉(Trichoderma brevicompactum)Tb12，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018649。
2.权利要求1所述脐孢木霉(Trichoderma brevicompactum)Tb12在防治蔬菜土传病害豇豆枯萎病中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征包括以下步骤：
A、以豇豆枯萎病菌作为指示菌
用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.)JWS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014314；
B、脐孢木霉Tb12的稳定性测定
在PDA培养基平板上对保藏编号为CCTCC NO：M 2018649的脐孢木霉Tb12进行连续10代的继代培养，以豇豆枯萎病菌JWS-1为指示菌，采用平板对峙法测定脐孢木霉Tb12拮抗活性的稳定性；
C、脐孢木霉Tb12孢子悬浮液活性测定
取培养好的脐孢木霉Tb12斜面菌种，加入适量的无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，采用血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，在该平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，并以仅接种指示菌的为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d后测量菌落直径；
D、脐孢木霉Tb12发酵滤液活性测定
用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的脐孢木霉Tb12菌丝，接种于50mL的PD培养基中，在180rpm/min，28℃恒温振荡培养5d，用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，并以仅接种指示菌的为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d后测量菌落直径；
E、活体盆栽
将豇豆种子用55℃温水浸泡30min，清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗得到干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子数为2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，接种豇豆枯萎病菌JWS-1，7d后用8.55×107cfu/mL的脐孢木霉Tb12发酵滤液灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查，在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理；每处理3次重复，每重复10株，按时统计幼苗发病情况，计算病情指数和防治效果。
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