CN109182145A - 一种棘孢曲霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，与蔬菜土传病害生物防治有关。从蔬菜土传病害发生严重的地块采集根际土壤，分离得到棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)Aa19，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018648。以保藏编号为CCTCC NO：M 2014314的豇豆枯萎病菌JWS‑1为指示菌测试棘孢曲霉菌株的稳定性、孢子悬浮液活性及发酵滤液的活性，通过生物功能验证，证明本发明的分离株对蔬菜土传病害具有良好的防效。棘孢曲霉Aa 19对蔬菜安全，稳定性好，抑菌活性较高，可用于土传病害‑豇豆枯萎病的生物防治。

Description

一种棘孢曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，本发明与蔬菜土传病害生物防治领域相关。
背景技术
我国设施蔬菜产业发展迅速，2014年全国设施蔬菜面积超过380万hm2(5700万亩)，蔬菜生产方式得到进一步丰富，对于保障蔬菜周年供应和调整蔬菜品种结构意义重大。与露地栽培相比，设施栽培棚室湿度高、轮作倒茬困难，为病虫害的发生流行提供了有利条件。设施地土壤的次生盐渍化、酸化，土壤养分失衡，土传病害严重，造成蔬菜产量下降、品质恶劣，严重制约了设施蔬菜生产的可持续发展。
对设施蔬菜基地调查结果表明，猝倒病、立枯病、枯萎病、根腐病、黄萎病、青枯病、根结线虫等土传病害呈加重趋势。目前，针对这些病害主要以化学防治为主，但化学农药的长期和过量使用会导致生态环境破坏、次要病害猖獗、蔬菜农药残留超标等问题，直接影响了设施蔬菜的产量和品质，生物防治是一种环境友好且能够有效防治植物病害的方法，已成为继农业防治、化学防治之后的又一重要防治方法，并且有修复土壤生物多样性的作用，极具开发潜力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，为了解决设施蔬菜土传病害化学防治中的环境安全问题，提供一种分离的棘孢曲霉菌株及其在土传病害防治中的应用。
本发明的技术方案如下所述：
申请人于2017年7月，在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖蔬菜基地土传病害发生严重的地块，从设施蔬菜作物根际土壤中分离筛选得到一种拮抗真菌，申请人将该菌株命名为棘孢曲霉Aa19，Aspergillus aculeatus Aa19，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2018648。
棘孢曲霉Aa19的菌学特征：
棘孢曲霉Aa19菌株在PDA培养基平板上生长迅速，28℃培养5d菌落直径达6cm，质地紧密，呈丝绒状，气生菌丝较多，中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状，背面中心呈黄色四周白色，菌落表面有黑色干粉，无渗出液，顶囊初生时呈球形或辐射状，后呈球形或椭圆形，直径50-65μm，孢梗茎无色或淡褐糙有刺突，直径约5μm，串生于小梗顶端，小梗单层，全部表面可育。
上述分离的棘孢曲霉Aa19菌株可在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用。
本发明还提供了棘孢曲霉Aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用的具体步骤，所述的步骤包括：
A.以豇豆枯萎病菌JWS-1作为指示菌
用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.)JWS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014314；
B、棘孢曲霉Aa19的拮抗活性稳定性的测定
在PDA培养基平板上对保藏编号为CCTCC NO：M 2018648的棘孢曲霉Aa19进行了连续10代的继代培养，以豇豆枯萎病菌JWS-1为指示菌，采用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性；
C、棘孢曲霉菌株Aa19孢子悬浮液活性的测定
取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种，加入5mL无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径，明确棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性；
D、棘孢曲霉Aa19发酵滤液活性的测定
用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉Aa19菌丝，接种于50mL的PD培养基，180rpm/min、28℃恒温振荡培养5d，用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径，明确棘孢曲霉Aa19发酵滤液活性；
E、活体盆栽
将种子用55℃温水浸泡30min，清水清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，在接种病原菌7d后做如下处理：用棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查(在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理)；
每处理3次重复，每重复10株，按时统计幼苗发病情况，按病情分级(参照张衍荣等，2005年报道)，计算病情指数和防治效果，计算公式如下；
PDA培养基及制备方法：去皮马铃薯200g，切成厚约2mm的片，加入1000mL蒸馏水煮沸30min，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g，加热溶解后再补足蒸馏水至1000mL，自然pH，在121℃湿热蒸汽下高压灭菌30min，之后在超净工作台上倒平板，得到PDA培养基；
PD培养基及制备方法：称取200g马铃薯，洗净去皮切片，加水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加蒸馏水补足至1000mL，再加12g葡萄糖，煮沸至固体充分溶解后分装到三角瓶中，于121℃湿热蒸汽下高压灭菌20min，得到PD培养基。
本发明具有以下有益效果：
1、棘孢曲霉Aa19从设施蔬菜根际土壤分离获得，对蔬菜作物安全，且对豇豆枯萎病具有防治作用，可用于设施蔬菜土传病害的防治。
2、棘孢曲霉Aa19稳定性好，防效较高，连续10代继代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1抑菌效果稳定在68％以上，田间盆栽防效达到69.43％，适合设施蔬菜土传病害防治要求。
3、棘孢曲霉Aa19防治设施蔬菜土传病害，使用方法简单，只需将菌株进行发酵培养，然后取发酵滤液对作物灌根即可，使用方便。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是棘孢曲霉Aa19的18S rDNA序列。
图1：棘孢曲霉Aa19菌落形态及分生孢子和分生孢子梗形态。
图2：棘孢曲霉Aa19的18S rDNA-ITS系统发育树。
图3：棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病的防治效果。附图标记说明：图3中的A为棘孢曲霉Aa19发酵滤液处理组；图3中的B为对照组(仅接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1)。
具体实施方式
实施例1候选菌株的分离与鉴定
A、土样的采集
2017年7月在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖基地土传病害发生严重的地块，采用5点取样法，取地下15-20cm处土样，采集设施蔬菜作物根际土壤，自然风干后保存备用；
B、候选菌株的分离纯化
称取5g土样倒入三角瓶中，加无菌水至50mL，28℃振荡30min后静置，即为10-1土壤悬液；再从上述溶液中取出1mL，加入9mL无菌水充分振荡制成10-2的土壤稀释液，吸取100μL稀释液涂于马丁氏培养基(配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，孟加拉红0.03g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1L，自然pH，分装后121℃湿热蒸汽下高压灭菌30min)，使用时每mL培养基中加入30μg链霉素以抑制放线菌生长，置于28℃培养箱中培养，生长5天后挑取单菌落于培养基上，进行分离纯化，4℃保存备用；
C、候选菌株形态学观察
将候选菌株接种到PDA培养基平板上，置于28℃恒温培养，观察菌落形态和颜色，5d后制作玻片在光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征。
菌学特征：
候选菌株在PDA培养基平板上，生长迅速，28℃培养5d菌落直径达6cm，质地紧密，呈丝绒状，气生菌丝较多，中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状，背面中心呈黄色四周白色，菌落表面有黑色干粉，无渗出液，顶囊初生时呈球形或辐射状，后呈球形或椭圆形，直径50-65μm，孢梗茎无色或淡褐糙有刺突，直径约5μm，串生于小梗顶端，小梗单层，全部表面可育。
D、菌丝收集
用接种针挑取少量候选菌株的菌丝，在无菌条件下接种至装有100mL PD培养基的三角瓶内，于28℃，180rpm/min下振荡培养4d，取10mL上述菌液至无菌离心管内，于13000rpm/min离心10min，弃上清收集菌丝备用。
E、基因组DNA的提取
采用OMEGA HP Fugal DNA Kit试剂盒提取候选菌株基因组DNA，利用通用引物ITS1/ITS4对候选菌株的18s rDNA的ITS片段进行扩增(PCR为常规方法)，引物序列为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(PCR方法为常用方法)。
F、测序
采用1.0％琼脂糖凝胶法对扩增产物进行检测，并用紫外凝胶成像系统进行拍照保存，将PCR扩增得到的产物直接送武汉擎科创新生物技术有限公司进行测序。
G、分子鉴定
将测序所得的序列在NCBI BlAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库中进行比对，确定待鉴定菌株(即候选菌株)的遗传来源，利用MEGA6.0.6软件与已知菌种ITS序列作序列同源性比较，并对检索获得的同源性较近的菌株采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树(Boot-strap＝1000，见图2)，分析亲缘关系和系统发育，结合微生物形态分类鉴定，将分离株(即候选株)命名为棘孢曲霉Aa19，Aspergillus aculeatus Aa19，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2018648。
实施例2棘孢曲霉Aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中的应用
实施步骤如下所述：
A、棘孢曲霉Aa19菌株的稳定性测定
在PDA培养基平板上对筛选得到的棘孢曲霉Aa19进行连续10代的继代培养，并每一代以豇豆枯萎病菌JWS-1(JWS-1于2014年7月3日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2014314，该菌株已获中国发明专利授权，专利号为ZL 2014103340109，授权公告日为2016.02.17)为指示菌，利用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性；
结果表明，棘孢曲霉Aa19连续10代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制率稳定在68％以上，结果见表1。
表1棘孢曲霉Aa19的拮抗活性稳定性
B、棘孢曲霉Aa19菌株孢子悬浮液活性测定
取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种，加入5mL无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，中央接豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径；
结果表明，棘孢曲霉Aa19孢子悬液对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制作用随稀释倍数的增加而降低，由84.32％降至64.33％，在最低浓度时其抑制率均超过60％，具体数据见表2。
表2棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性
C、棘孢曲霉Aa19菌株发酵滤液活性的测定
用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉Aa19菌丝，接种于50mL的PD培养基中，在180rpm/min，28℃恒温下振荡培养5d。用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径。
结果表明，棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制率为70.75％，结果见表3。
表3棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病菌的抑制作用
D、棘孢曲霉Aa19活体盆栽试验
将市购豇豆种子用55℃温水浸泡30min，清水清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗，得到干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子数为2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，在接种豇豆枯萎病菌JWS-1菌液7d后做如下处理：用棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株做为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查，在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理。
每处理3次重复，每重复10株。按时统计幼苗发病情况，按病情分级(参照张衍荣等，2005年报道)，计算病情指数和防治效果，公式如下；
豇豆枯萎病病情分级标准：(张衍荣等，2005年报道)
0级：无症状；
1级：胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常；
3级：胚轴或子叶出现明显坏死，或1片子叶黄化，影响生长；
5级：2片子叶黄化，或1片子叶枯死；
7级：2片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长；
9级：整株萎蔫、倒伏或枯死；
采用浸根接种法测定棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)对豇豆枯萎病防效，结果表明，7d时对豇豆枯萎病的防治效果为100％，14d时为69.43％，具体数据见表4。
表4棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病的防效
本实施例验证表明，本发明得到的棘孢曲霉Aa19具有较强的稳定性，较高的孢子悬浮液活性和发酵滤液的活性，防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病具有积极效果。
序列表
<110> 武汉友芹种苗技术有限公司
<120> 一种棘孢曲霉菌株及其应用
<141> 2018-09-28
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 630
<212> DNA
<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(630)
<400> 1
gagagccggg tcgggggggg gaccctgcgg agggatcatt acggagaact tccgttaggg 60
ggacctgcgg aaggatcatt accgagtgct gggtccttcg gggcccaacc tcccacccgt 120
gcttaccgta ccctgttgct tcggcgggcc cgccttcggg cggcccgggg cctgcccccg 180
ggaccgcgcc cgccggagac cccaatggaa cactgtctga aagcgtgcag tctgagtcga 240
ttgataccaa tcagtcaaaa ctttcaacaa tggatctctt ggttccggca tcgatgaaga 300
acgcagcgaa atgcgataac taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg 360
aacgcacatt gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt catttctccc 420
ctccagcccc gctggttgtt gggccgcgcc cccccggggg cgggcctcga gagaaacggc 480
ggcaccgtcc ggtcctcgag cgtatggggc tctgtcaccc gctctatggg cccggccggg 540
gcttgcctcg acccccaatc ttctcagatt gacctcggat caggtaggga tacccgctga 600
acttaagcat atcaataaac cgggaggaaa 630

Claims (3)

1.一种分离的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)Aa19，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018648。
2.如权利要求1所述的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)Aa19在防治蔬菜土传病害豇豆枯萎病中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征包括以下步骤：
A、以豇豆枯萎病菌作为指示菌
用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.)JWS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014314；
B、棘孢曲霉Aa19稳定性的测定
在PDA培养基平板上对棘孢曲霉Aa19进行连续10代的继代培养，以豇豆枯萎病菌JWS-1为指示菌，采用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性；
C、棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性的测定
取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种，加入适量的无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，采用血球计数法在显微镜下检查棘孢曲霉Aa19的孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接种指示菌为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落的直径；
D、棘孢曲霉Aa19发酵滤液活性的测定
用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉Aa19菌丝，接种于50mL的PD培养基中，在180rpm/min，28℃恒温振荡培养5d，用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接种的指示菌为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落的直径；
E、活体盆栽
将豇豆种子用55℃温水浸泡30min，清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗，得到干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子数为2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，接种病原菌7d后用7.20×107cfu/mL的棘孢曲霉Aa19发酵滤液灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查，在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理；每处理3次重复，每重复10株，按时统计幼苗发病情况，计算病情指数和防治效果。
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