CN112625919B - 一株棘孢曲霉及其在抗根结线虫中的应用 - Google Patents

一株棘孢曲霉及其在抗根结线虫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株棘孢曲霉及其在抗根结线虫中的应用。本发明提供了棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)HH5‑7，保藏登记号为CGMCC No.21033。本发明还保护一种制备棘孢曲霉HH5‑7的提取物的方法，包括如下步骤：取棘孢曲霉HH5‑7的发酵物，采用有机试剂进行提取，收集提取液；将提取液进行减压蒸馏以去除有机溶剂和水，得到提取物。本发明还保护棘孢曲霉HH5‑7或所述提取物的应用，为如下(a)或(b)：(a)在制备线虫抑制剂中的应用；(b)在抑制线虫中的应用。本发明还保护棘孢曲霉HH5‑7或所述提取物在制备式(Ⅰ)所示化合物中的应用。

Description

一株棘孢曲霉及其在抗根结线虫中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株棘孢曲霉及其在抗根结线虫中的应用。
背景技术
根结线虫是农业上一种非常严重的寄生虫，是农作物种植中的重要病害之一。每年给农业造成了非常严重的经济损失。
根结线虫寄主很广，可危害39科130多种作物。线虫体型很小，肉眼很难看到。多分布在0-20厘米土壤内，特别是3-9厘米土壤中线虫数量最多。雌雄异体，雌成虫圆梨形，雄成虫线状，常以卵或二龄幼虫随植株残体遗留在土壤中或粪肥中越冬或翌年环境适宜时以二龄幼虫从嫩根侵入，繁殖危害。线虫可通过带虫土或苗及灌溉水传播。土温25℃-30℃，土壤湿度为40％-70％条件下线虫繁殖很快，10℃以下停止活动，55℃时10分钟死亡。在无寄主条件下可存活1年。
由于药物的广泛使用，根结线虫随之发生了耐药现象，因此需要筛选新的药物，用于农业线虫防治。
发明内容
本发明的目的是提供一株棘孢曲霉及其在抗根结线虫中的应用。
本发明提供了棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)HH5-7，已于2020年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21033。
本发明还提供了一种制备棘孢曲霉HH5-7的发酵物的方法，包括如下步骤：将棘孢曲霉HH5-7进行发酵，得到发酵物。所述发酵采用的培养基为发酵培养基。
发酵培养基的原料组成如下：1-2质量份大米和1-2质量份水。发酵培养基的制备方法如下：1-2质量份大米和1-2质量份水混合，浸泡。发酵培养基的制备方法具体如下：200g大米和200g水混合，室温浸泡12小时。
制备棘孢曲霉HH5-7的发酵物的方法具体如下：
(1)取棘孢曲霉HH5-7，接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养3-5天；
(2)完成步骤(1)后，用无菌水冲洗所述平板，收集孢子，每个平板约得到50-60ml孢子液；
(3)将步骤(2)得到的孢子液接种至装有发酵培养基的三角瓶中(每个三角瓶接种10ml孢子液)，20-35℃静置培养14-35天(具体可为：28℃静置培养28天)。
完成步骤(3)后，三角瓶中的内容物即发酵物。
三角瓶规格为1000mL。
每个三角瓶中的发酵培养基如下：将200g大米和200g水混合，室温浸泡12小时。
所述PDA培养基平板的直径为9cm。
所述方法制备得到的发酵物也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种制备棘孢曲霉HH5-7的提取物的方法，包括如下步骤：
取所述发酵物，采用有机试剂进行提取，收集提取液；
将所述提取液进行减压蒸馏以去除有机溶剂和水，得到提取物。
制备棘孢曲霉HH5-7的提取物的方法具体如下：
(1)取棘孢曲霉HH5-7，接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养3-5天；
(2)完成步骤(1)后，用无菌水冲洗所述平板，收集孢子，每个平板约得到50-60ml孢子液；
(3)将步骤(2)得到的孢子液接种至装有发酵培养基的三角瓶中(每个三角瓶接种10ml孢子液)，20-35℃静置培养14-35天(具体可为：28℃静置培养28天)；
(4)完成步骤(3)后，在所述三角瓶中加入2.0L有机试剂，室温浸提24h，收集上清液；
(5)完成步骤(4)后，在所述三角瓶中加入2.0L有机试剂，室温浸提24h，收集上清液；
(6)完成步骤(5)后，在所述三角瓶中加入2.0L有机试剂，室温浸提24h，收集上清液；
(7)将步骤(4)得到的上清液、步骤(5)得到的上清液和步骤(6)得到的上清液合并，然后减压蒸馏以去除有机溶剂和水，得到的产物即为提取物。
所述有机试剂由3-5体积份乙酸乙酯和1体积份甲醇组成。
具体来说，有机试剂由4体积份乙酸乙酯和1体积份甲醇组成。
所述减压蒸馏的温度为40℃。
发酵培养基的原料组成如下：1-2质量份大米和1-2质量份水。发酵培养基的制备方法如下：1-2质量份大米和1-2质量份水混合，浸泡。发酵培养基的制备方法具体如下：200g大米和200g水混合，室温浸泡12小时。
三角瓶规格为1000mL。
每个三角瓶中的发酵培养基如下：将200g大米和200g水混合，室温浸泡12小时。
所述PDA培养基平板的直径为9cm。
所述方法制备得到的提取物也属于本发明的保护范围。
本发明还保护棘孢曲霉HH5-7、所述发酵物或所述提取物的应用，为如下(a)或(b)：
(a)在制备线虫抑制剂中的应用；
(b)在抑制线虫中的应用。
本发明还保护棘孢曲霉HH5-7、所述发酵物或所述提取物在制备式(Ⅰ)所示化合物中的应用。
本发明还保护式(Ⅰ)所示化合物的应用，为如下(a)或(b)：
(a)在制备线虫抑制剂中的应用；
(b)在抑制线虫中的应用。
以上任一所述线虫具体可为南方根结线虫。
Figure BDA0002854599310000031
本发明提供的菌株的发酵提取物具有很高的抗根结线虫的活性。本发明对菌株的发酵提取物进行化合物分离，得到了式(Ⅰ)所示化合物，该化合物对根结线虫具有较高的致死率。
附图说明
图1为反相色谱层析的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，采用的培养基均为灭菌后的培养基。DMSO全称为二甲基亚砜。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
实施例1、菌株的分离、鉴定和保藏
一、菌株HH5-7的采集
2019年9月从厦门沿海红树林根际土壤中分离到一株菌，命名为菌株HH5-7。
二、菌株HH5-7的鉴定
形态特征：菌丝体为棕色，在培养基表面向上生长旺盛，是气生菌丝中的繁殖菌丝，菌落较大，孢子体为圆形，褐色。
ITS部分序列见序列表的序列1，与GENBANK ACCESSION NO.EU833205.1的序列相似性最高，相似性为99.83％。
根据鉴定结果，菌株HH5-7属于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)。
三、菌株HH5-7的保藏
棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)HH5-7，已于2020年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21033。
实施例2、制备棘孢曲霉HH5-7的粗提物并检测其对根结线虫的抑制作用
一、制备棘孢曲霉HH5-7的粗提物
1、取在-80℃甘油管中保藏的棘孢曲霉HH5-7，用接种环接种于PDA培养基平板(平板直径为9cm)，28℃静置培养3-5天。
2、完成步骤1后，用无菌水冲洗所述平板，收集孢子，每个平板约得到50-60ml孢子液。
3、将步骤2得到的孢子液接种至装有发酵培养基的三角瓶中(每个三角瓶接种10ml孢子液)，28℃静置培养28天。完成本步骤后，三角瓶中的内容物即发酵产物。
三角瓶规格为1000mL；每个三角瓶中的发酵培养基如下：将200g大米和200g水混合，室温浸泡12小时。
4、完成步骤3后，在所述三角瓶中加入2.0L有机试剂(有机试剂由4体积份乙酸乙酯和1体积份甲醇组成)，室温浸提24h，收集上清液。
5、完成步骤4后，在所述三角瓶中加入2.0L所述有机试剂，室温浸提24h，收集上清液。
6、完成步骤5后，在所述三角瓶中加入2.0L所述有机试剂，室温浸提24h，收集上清液。
7、将步骤4得到的上清液、步骤5得到的上清液和步骤6得到的上清液合并，然后利用旋转蒸发仪40℃减压蒸馏以去除有机溶剂和水，得到的产物即为粗提物。
平均每个三角瓶得到1.5-3g粗提物。
二、检测粗提物对根结线虫的抑制作用
取步骤一制备的粗提物，用DMSO溶解，使粗提物浓度为1000μg/μL，即为粗提物溶液。
取南方根结线虫卵囊，洗净，放置到0.5％次氯酸钠水溶液中消毒3min，再用无菌水反复冲洗3次以洗去次氯酸钠，然后进行孵化，每隔两天观察并收集二龄幼虫。取二龄幼虫，用无菌水悬浮，得到线虫悬液，每50μL线虫悬液中含100条二龄幼虫。
取24孔板，每孔加入50μL线虫悬液、200μL粗提物溶液和150μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，然后28℃静置12h，然后统计线虫死亡率。
用等体积DMSO代替代替粗提物溶液作为阴性对照。
进行三次重复试验，每次重复试验至少设置3个重复处理，结果取平均值。
阴性对照组的线虫死亡率为6.5％。粗提物处理组的线虫死亡率为79.3％。
实施例3、制备化合物并检测其对根结线虫的抑制作用
一、制备化合物
1、取1质量份实施例2的步骤一制备的粗提物，利用混合溶剂(混合溶剂由二氯甲烷和甲醇等体积混合得到)溶解并与2质量份200-300目层析硅胶(青岛海洋化工有限公司)混合，然后自然挥发以去除混合溶剂，得到拌样硅胶。
2、取层析柱(长度为30cm，内径为6.5cm)，先填充薄层层析硅胶(青岛海洋化工有限公司薄层硅胶H)，然后填充拌样硅胶。完成填充后，薄层层析硅胶位于底部(长度为8cm)，拌样硅胶位于薄层层析硅胶上部(长度为0.8cm)。
3、完成步骤2后，先用二氯甲烷洗脱两次，然后用洗脱液1(由99体积份二氯甲烷和1体积份甲醇组成)洗脱一次，然后用洗脱液2(由98体积份二氯甲烷和2体积份甲醇组成)洗脱一次，然后用洗脱液3(由97体积份二氯甲烷和3体积份甲醇组成)洗脱一次，然后用洗脱液4(由96体积份二氯甲烷和4体积份甲醇组成)洗脱一次。每次洗脱均为500ml，每次洗脱得到一个馏分，共得到6个馏分。
4、取步骤3得到的第4个馏分(即洗脱液2进行洗脱的馏分)，进行凝胶层析。
层析柱：长度为50cm，内径为2.5cm。
填充介质：凝胶Sephadex LH-20。
洗脱液：由二氯甲烷和甲醇等体积混合得到。
上样后，用洗脱液洗脱，收集馏分，每50ml收集1份，连续收集4份。
将各个馏分分别利用旋转蒸发仪40℃减压蒸馏以去除有机溶剂。
5、取步骤4得到的第3个馏分的减压蒸馏产物用甲醇溶解，然后进行反相色谱层析。
色谱柱：型号为RP-18的Agilent反相色谱柱(柱长为250mm，内径为9.4mm)。
检测波长：254nm。
流动相：60％(体积百分含量)乙腈水溶液。
流动相流速：3ml/min。
收集目标峰的过柱后溶液(目标峰为第6个洗脱峰，峰值对应的保留时间为12.77min)。色谱图见图1，箭头标注目标峰。
6、取步骤5得到的过柱后溶液，利用旋转蒸发仪40℃减压蒸馏以去除有机溶剂和水，得到产物。
每g粗提物约得到0.6mg产物。
7、取步骤6得到的产物，进行化合物结构鉴定。
结果见表1。HRESIMS显示其准分子离子峰m/z 288.1233[M+H]+。结合1H NMR和13CNMR推测其为结构式如式(Ⅰ)所示的化合物。
表1
Figure BDA0002854599310000061
Figure BDA0002854599310000062
二、检测化合物对根结线虫的抑制作用
取步骤一制备的式(Ⅰ)所示化合物，用DMSO溶解，使化合物浓度为1000μg/μL，即为化合物溶液。
取南方根结线虫卵囊，洗净，放置到0.5％次氯酸钠水溶液中消毒3min，再用无菌水反复冲洗3次以洗去次氯酸钠，然后进行孵化，每隔两天观察并收集二龄幼虫。取二龄幼虫，用无菌水悬浮，得到线虫悬液，每50μL线虫悬液中含100条二龄幼虫。
取24孔板，每孔加入50μL线虫悬液、200μL化合物溶液和150μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，然后28℃静置12h，然后统计线虫死亡率。
用等体积DMSO代替代替化合物溶液作为阴性对照。
进行三次重复试验，每次重复试验至少设置3个重复处理，结果取平均值。
阴性对照组的线虫死亡率为6.5％。化合物处理组的线虫死亡率为83.5％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一株棘孢曲霉及其在抗根结线虫中的应用
<130> GNCYX203179
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 590
<212> DNA
<213> Aspergillus aculeatus
<400> 1
tggaagtaaa aatcgtaaca aggtttccgt aggtgaacct gcggaaggat cattaccgag 60
tgctgggtcc ttcggggccc aacctcccac ccgtgcttac cgtaccctgt tgcttcggcg 120
ggcccgcctt cgggcggccc ggggcctgcc cccgggaccg cgcccgccgg agaccccaat 180
ggaacactgt ctgaaagcgt gcagtctgag tcgattgata ccaatcagtc aaaactttca 240
acaatggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taactaatgt 300
gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc 360
cggggggcat gcctgtccga gcgtcatttc tcccctccag ccccgctggt tgttgggccg 420
cgcccccccg ggggcgggcc tcgagagaaa cggcggcacc gtccggtcct cgagcgtatg 480
gggctctgtc acccgctcta tgggcccggc cggggcttgc ctcgaccccc aatcttctca 540
gattgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcata 590

Claims (10)

1.棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)HH5-7，其保藏登记号为CGMCC No.21033。
2.一种制备权利要求1所述棘孢曲霉的发酵物的方法，包括如下步骤：
将权利要求1所述棘孢曲霉进行发酵，得到发酵物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵采用发酵培养基；所述发酵培养基的原料组成如下：1-2质量份大米和1-2质量份水。
4.权利要求2所述方法制备得到的发酵物。
5.一种制备权利要求1所述棘孢曲霉的提取物的方法，包括如下步骤：
取权利要求4所述发酵物，采用有机试剂进行提取，收集提取液；
将所述提取液进行减压蒸馏以去除有机试剂和水，得到提取物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述有机试剂由3-5体积份乙酸乙酯和1体积份甲醇组成。
7.权利要求5所述方法制备得到的提取物。
8.权利要求1所述棘孢曲霉、权利要求4所述发酵物或权利要求7所述提取物的应用，为如下（a）或（b）：
（a）在制备根结线虫抑制剂中的应用；
（b）在抑制根结线虫中的应用。
9.权利要求1所述棘孢曲霉、权利要求4所述发酵物或权利要求7所述提取物在制备式（Ⅰ）所示化合物中的应用；
Figure 664177DEST_PATH_IMAGE001
式（Ⅰ）。
10.式（Ⅰ）所示化合物的应用，为如下（a）或（b）：
（a）在制备根结线虫抑制剂中的应用；
（b）在抑制根结线虫中的应用；
Figure 975072DEST_PATH_IMAGE002
式（Ⅰ）。
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