CN117511753B - 一株海洋木霉属菌株及其在防治烟草花叶病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株海洋木霉属菌株及其在防治烟草花叶病毒中的应用，所述的菌株为木霉属菌株，其保藏编号为CGMCC NO.40807。本发明获得对烟草普通花叶病毒有生物活性的木霉属菌株，可应用于烟草普通花叶病毒病的防治，利用局部枯斑法测定其发酵上清液对烟草花叶病毒和烟蚜也都有防治效果，在生产上具有实际应用价值。

Description

一株海洋木霉属菌株及其在防治烟草花叶病毒中的应用

技术领域

本发明属于功能性微生物筛选技术领域，具体涉及一株海洋木霉属菌株及其在防治烟草花叶病毒中的应用。

背景技术

烟草花叶病毒病是由烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)引起的植物病毒病，在世界各烟区普遍发生，造成严重损失，是危害烟草的最严重病害之一。TMV主要通过汁液摩擦传播，能侵染包括烟草、番茄、马铃薯、茄子、辣椒、龙葵等茄科作物在内的350多种寄主植物。自苗床至大田整个生育期均可发生，烘烤后的病叶颜色不均匀，品质下降，产量降低。

目前对于烟草花叶病毒病的治疗多采用化学农药，但化学农药泛滥使用导致环境中农药残留的增加，病虫抗药性的增强和病虫的再度猖獗等问题最为突出。随着世界各国对化学农药所带来的种种社会问题、环境问题、以及人类健康问题的进一步认识，越来越多的化学农药被限制使用或禁止使用。而生物农药作为一种低毒、低残留，并且病虫害不易产生抗药性的新型农药，自然就成为现代农药产业关注并试图开发的热点，其研发和产业化也成为国家的战略需求。

微生物农药是生物农药的重要一类，包括农用抗生素和活体微生物农药。微生物农药是从天然产物中分离纯化出来的，可以直接作用于病虫害防治，也可以作为先导化合物合成新的农药。这些农药既可以保留原有生物活性物质的低毒、低残留等优点，同时克服了某些天然产物的稳定性差、活性不高等不足，使得生物活性物质的潜力得到充分挖掘。

真菌是开发微生物农药的重要资源，世界各国投入了大量的科研力量予以研究。目前已经注册的以陆生真菌或其代谢产物为有效成分的生物农药达70余种，这些微生物农药被广泛应用于防治植物病害、虫害和田间杂草。我国在应用和基础研究方面也取得了十分突出的成绩。尽管我国当前生物农药的产量仅占农药总产量的9％，但从人类长远利益角度考虑和农药发展趋势来看，生物农药的发展潜力十分巨大。

海洋真菌的生存环境比较苛刻(高盐、高压、缺氧、低营养、无光照等)，为求得生存空间，它们在长期的进化过程中产生了一些结构独特的次生代谢物质，特别是海洋动植物共附生真菌，为争取自身的最大生存，通过分泌具有各种生物活性的代谢物来积极地参与动植物的代谢活动，在动植物的抗感染、抗吞噬的生态防卫中发挥了重要的作用。关于海洋真菌次生代谢物的功能与用途，研究者较多的关注于治疗人类疾病的医用药物的开发，海洋真菌代谢物农用抗病毒功能的研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一株海洋木霉属菌株及其在防治烟草花叶病毒中的应用，是从海底沉积物中筛选获得的一株木霉属(Trichoderma sp.)菌株，该菌株具有防治烟草普通花叶病毒的功效，并且筛选的菌株可产生对烟草普通花叶病毒有抑制活性的次级代谢产物。

本发明所提供的来自于海底沉积物的木霉(Trichoderma sp.)菌株MFC2306，已于2023年8月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC NO.40807。

本发明筛选的MFC2306菌株可用于防治烟草普通花叶病毒，也可用来制备用来防治烟草普通花叶病毒的制品；

所述的制品，为微生物菌剂。

本发明还提供MFC2306菌株的代谢产物，其一种制备方法如下：

将MFC2306菌株进行发酵，发酵后的上清液加入乙酸乙酯进行萃取，获得的有机相在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发获得代谢粗提物。

所述的发酵，是将MFC2306菌株接种于PDB液体培养基，28℃进行发酵。

本发明所获得的MFC2306菌株的代谢产物可用于防治烟草普通花叶病毒病。

本发明获得对烟草普通花叶病毒有生物活性的MFC2306菌株，可应用于烟草普通花叶病毒病的防治，利用局部枯斑法测定其发酵上清液对烟草花叶病毒和烟蚜也都有防治效果，在生产上具有实际应用价值。

附图说明

图1：菌株MFC2306的菌落培养形态图，其中左侧图为培养基的正面图，右侧图为培养基的背面图，

图2：菌株MFC2306发酵上清液对TMV的抑制作用图，

图3：菌株MFC2306次级代谢产物粗提物对TMV的抑制作用图，

图4：菌株MFC2306 PDB液体发酵培养14d的照片图，

图5：菌株MFC2306大米培养基固体发酵培养7d的照片图，

图6：菌株MFC2306次级代谢粗提物HPLC谱图(上为液体发酵培养，下为固体发酵培养)。

具体实施方式

本发明从海底沉积物中筛选获得对烟草普通花叶病毒具有拮抗效果的海洋真菌菌株，并对其产生的活性物质进行分离提取，应用于烟草花叶病毒病的防治之中。

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何并更或改进，均属于本发明的保护范围。

实施例1：木霉属(Trichoderma sp.)MFC2306菌株的分离纯化与鉴定将2020年12月从山东青岛大沽河口采集的海底沉积物样品置于PDA培养基上(培养基配制方法：马铃薯去皮，200g切成小块，加海水1L煮沸30min，4-6层纱布过滤，加20g葡萄糖，溶解，用蒸馏水补充失去的水分。固体培养基则加入1.5-2％的琼脂，121℃，高压灭菌20min。)在28℃下进行培养，单斑分离纯化获得了MFC2306菌株。

所筛选的菌株经18s rDNA ITS基因序列分析鉴定为木霉属(Trichoderma sp.)菌株，其ITS基因序列如下：

ATAGGGATATTCGGGTCTCGCGGCCAACCTCCCACCCTTGTCTCTATACAC

CTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACCTGGTCGCCGGGGGACGCACGT

CCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCGCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCT

GTCTGAGTACTATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCG

GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC

CGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGG

CATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGT

GGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTC

GAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCA

CCACCACATTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAA

CTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA(SEQ ID NO:1)。

实施例2：木霉属(Trichoderma sp.)MFC2306菌株的培养形态、理化参数1、

1、MFC2306菌株的显微形态特征

显微镜下观察，MFC2306菌株分生孢子梗生长于匍匐菌丝上，菌丝直径2-4μm；分生孢子梗直立，分成两个相对的侧枝，最后形成梗，小梗顶端有成簇的分生孢子。孢子呈球形或卵圆形，淡黄色，孢子表面有细小的芒刺。

2、MFC2306菌株培养条件

菌落在PDA培养基上培养7d，直径9cm，平展，气生菌丝茂密、黄白色、略带粉色，菌落边缘黄白色；背面中部黄亮色，边缘白色。产孢梗黄绿色，中度产生(图1)。MFC2306菌株的最适生长温度28℃，最适PH值为10，最佳培养时间8d，最适培养基为海水PDA培养基。

实施例3MFC2306菌株对烟草花叶病毒TMV的抑制效果

利用局部枯斑法测定所得菌株对TMV的抑制效果，具体步骤如下：

称取1g新鲜TMV病叶加10mL灭菌磷酸缓冲液研磨成匀浆，用灭菌纱布过滤后取上清液作为接种液：将菌株接种于PDB液体培养基中，进行大规模发酵培养，取发酵上清液，即作抗TMV菌液备用。将该菌液与TMV接种液等量混合，PDB液体培养基与TMV接种液等量混合，室温下分别静止10min后摩擦接种三生-NN烟，接种前叶片表面喷洒适量金刚砂。左半叶接种菌液与TMV接种液的混合液，右半叶接种PDB培养基与TMV接种液的混合液作为对照，每半片叶接种200uL。接种后用清水进行叶面冲洗，3次重复。接种3d后观察结果，并统计枯斑数计算抑制率。结果显示，菌株发酵液对TMV的抑制效果较好，枯斑抑制率达到63％(表1，图2)，菌株次级代谢粗提物对TMV的枯斑抑制率达到87.06％(表2，图3)，生防菌株在生长代谢过程中产生了抑制TMV活性的抗性物质。

抑制率(％)＝[1-(处理平均枯斑数/对照平均枯斑数)]×100。

表1：MFC2306菌株发酵上清液对TMV的抑制作用表

表2：MFC2306菌株次级代谢粗提物对TMV的抑制作用表

实施例4海洋真菌MFC2306菌株次级代谢丰富度分析

将供试海洋真菌MFC2306菌株分别接种于液体PDB培养基(图4)和固体大米培养基(图5)中进行培养，28℃，静置发酵培养40d左右。发酵完毕后，取液体PDB培养基上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，固体发酵大米培养菌体中直接加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得有机相分别在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发至干获得MFC2306菌株液体发酵和固体发酵次级代谢粗提物。

将两种培养方式获得的MFC2306菌株发酵粗提物用适量甲醇溶解，进行高效液相色谱(HPLC)分析，根据色谱峰的数量及紫外吸收曲线进行比较分析，分析液体和固体两种不同培养方式下菌株MFC2306次级代谢产物种类丰富度及含量情况(图6)。从结果来看，两种培养方式下，菌株MFC2306次生代谢产物种类丰富度差异较大。

表3：HPLC标准程序表

时间(min)	流速(mL/min)	甲醇	水
				0-5	0.8	10％	90％
5-35	0.8	10％-100％	90％-0
				35-45	0.8	100％	0
45-50	0.8	100％-10％	0-90％
				50-60	0.8	10％	90％

实施例5海洋真菌MFC2306菌株次级代谢活性物质对烟蚜的生物测定

将海洋真菌MFC2306菌株接种于液体PDB培养基，28℃，静置发酵培养40d左右。发酵完毕后，取液体PDB培养基上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得有机相分别在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发至干获得MFC2306菌株液体发酵次级代谢粗提物。

采用浸虫浸叶法测试真菌粗提物对烟蚜的毒力作用。培养皿(直径9cm)中铺上滤纸，加1mL蒸馏水保持适宜湿度，将大小适中的烟叶浸入溶液中10s后晾干，然后放入培养皿中，烟叶柄部用脱脂棉加水保湿。将带有蚜虫的烟叶浸入稀释的粗提物溶液中10S，挑取30头蚜虫(大小一致、健康的无翅蚜)于培养皿中。

用丙酮将粗提物配置成10000mg/L母液，以清水梯度稀释，分别配制5000mg/L、2500mg/L、1250mg/L、625mg/L和312.5mg/L的溶液，CK(丙酮)。各设3个重复，于24h检查统计各浓度粗提物下的烟蚜死亡情况，用SPSS软件处理数据，计算LC50、回归方程及相关系数；确定毒力回归方程为：y＝-13.023+5.006x，R＝0.86，95％置信限为322.37-470.89。

表4：MFC2306菌株次级代谢产物粗提物对烟蚜的LC50分析表

回归方程	LC50(mg/L)	置信区间	相关系数
				y＝-13.023+5.006x	399.44	322.37-470.89	0.86

结果表明，海洋真菌MFC2306菌株次级代谢粗提物的活性成分对烟蚜有较高活性，在处理浓度为5000mg/L时杀虫率可达100％。通过SPSS软件进行统计分析得到菌株MFC2306发酵液提取物对烟蚜的LC50为399.44mg/L。

Claims (10)

1.一种木霉属菌株，其特征在于，所述的木霉属（Trichoderma sp.）菌株的保藏编号为CGMCC NO.40807。

2.权利要求1所述的木霉属菌株在防治烟草花叶病毒中的应用。

3.权利要求1所述的木霉属菌株在制备用来防治烟草花叶病毒的制品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为微生物菌剂。

5.一种防治烟草花叶病毒的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的木霉属菌株。

6.如权利要求5所述的制品，其特征在于，所述的制品中还包含有权利要求1所述的木霉属菌株的代谢产物。

7.如权利要求6所述的制品，其特征在于，所述的代谢产物，是权利要求1所述的木霉属菌株的发酵上清液进行萃取，萃取获得的有机相在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发获得的。

8.如权利要求7所述的制品，其特征在于，所述的萃取，是使用乙酸乙酯进行萃取。

9.一种木霉菌代谢产物，其特征在于，所述的代谢产物是对权利要求1所述的木霉属菌株进行发酵，发酵后的上清液加入乙酸乙酯进行萃取，获得的有机相在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发获得的。

10.权利要求9所述木霉菌代谢产物在制备用于防治烟蚜的制品中的应用。