发明内容
本发明的目的是提供一株绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2。
本发明所提供的绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5433,该绿僵菌具有高效防治根结线虫的功能。
该绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No.5433具有以下特征:
在PDA和SMAY培养基上20-25℃下生长7天,菌落直径35mm,14天达50mm。在查氏培养基上菌落扩张较慢。菌落质地绒毛状至棉絮状,初为白色,产孢后变为深绿色至墨绿色,背面棕黄色,菌落表面常因分生孢子粘聚而呈厚苔样。分生孢子梗不形成分生孢子座,直径2.2-3.1μm。分生孢子单细胞,长椭圆形,表面光滑,脱落后聚集成孢子团5.6-8.4μm~2.5-3.2μm;最佳生长温度为25-30℃。
本发明的另一个目的是提供一种绿僵菌制剂,所述制剂的活性成分为绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No.5433,在所述制剂中的含量为107-109cfu/克。
所述制剂为微球型制剂,所述微球型制剂的单粒微球重为0.032-0.034克,粒径为4.2-4.8mm。
本发明所提供的绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2CGMCC No.5433或所述制剂可用于防治植物根结线虫。
本发明还提供一种防治植物根结线虫的方法,包括如下步骤:将绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No.5433或所述制剂施于植物的根下,防治植物根结线虫,所述防治植物根结线虫为降低所述植物根结线虫的病情指数。
所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No.5433或所述制剂按照如下用量施于所述植物的根下:每亩4×1011-8×1012cfu所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2,优选为每亩4×1011-8×1011cfu所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2,最优选为每亩4×1011所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2。
所述植物为黄瓜、青椒或西红柿。
所述根结线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和/或北方根结线虫(Meloidogyne hapla)。
本发明还提供一种所述制剂的制备方法,包括如下步骤:
1)将硅藻土、所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2和海藻酸钠水溶液按照20-24克硅藻土、4×1011cfu-7×1011cfu权利要求1所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae)HYN-1-2和2.6-4.0克海藻酸钠的配比混合均匀,得到悬浮液;
2)将步骤1)得到的悬浮液按2.6-4.0克海藻酸钠与1.11-2.22克氯化钙的配比加入氯化钙水溶液中,获得所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2的微球型制剂。
田间试验证明,本发明所提供的绿僵菌制剂在室温20-25℃条件、30-40%湿度条件下放置180天后,仍具有较好的防治线虫功效,防治效果可达50%-70%,说明该制剂较为稳定,且其活性成分即本发明的绿僵菌菌株在土壤中的定植效果好。另外,本发明的绿僵菌制剂还具有无毒无污染、性价比高、施用方便等优点。本发明的绿僵菌菌株及其制剂在植物根结线虫病害防治中可发挥重要作用,应用前景广阔。
下面结合具体实施例详细描述本发明,所述实施例用于理解而不是限制本发明。
保藏说明
菌种名称:绿僵菌
拉丁名:Metarhizium anisopliae var.anisopliae
菌株编号:HYN-1-2
保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称:CGMCC
地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期:2011年10月31日
保藏中心登记入册编号:CGMCC No.5433
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下实施例中所使用的材料来源和规格如下:
海藻酸钠:粘度500,烟台新旺海藻有限公司;
硅藻土:200-300目,堆密度0.38g/cm3,渗透率3.6达西,北京创清源过滤器材有限公司。
实施例1、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2 CGMCCNo.5433的分离鉴定与保藏
采集河北永年黄瓜根结线虫病根,用自来水冲洗病根3-5分钟除去土壤,然后将病根放在解剖镜下,用小镊子挑出卵囊,用1%次氯酸钠处理卵囊1分钟对卵囊表面消毒并使线虫卵释放,将次氯酸钠卵悬液分别过200μm和30μm的网筛,用灭菌蒸馏水冲洗3遍以除去次氯酸钠,大约每100个卵涂布在PDA平板上,每天观察菌落出现情况。最终自黄瓜根结线虫卵上分离得到一株杀线虫的真菌菌株,命名为HYN-1-2,并于2011年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.5433,经鉴定,该菌株为绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)。该绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)菌株HYN-1-2CGMCC No.5433具有以下特征:在PDA和SMAY培养基上20-25℃条件生长7天,菌落直径35mm,14天达50mm。在查氏培养基上菌落扩张较慢。菌落质地绒毛状至棉絮状,初为白色,产孢后变为深绿色至墨绿色,背面棕黄色,菌落表面常因分生孢子粘聚而呈厚苔样。分生孢子梗不形成分生孢子座,直径2.2-3.1μm。分生孢子单细胞,长椭圆形,表面光滑,脱落后聚集成孢子团5.6-8.4μm~2.5-3.2μm;最佳生长温度为25-30℃。
以下内容所述绿僵菌如无特别说明均为绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No.5433。
实施例2、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2的培养
1、试管种培养
将绿僵菌HYN-1-2的菌丝或孢子接种到试管PDA培养基斜面上,在25-27℃下培养,培养72-96小时,获得试管种。
2、菌种摇床扩大培养
将斜面种子接种到三角瓶液体YES-2培养基中,25-26℃、120-180rpm摇床振荡培养。
3、液体发酵生产
将逐级扩大的绿僵菌HYN-1-2菌液按照1∶10的体积比接种于发酵罐(发酵培养基为YES-2培养基)中,25-26℃搅拌并通气(通气量1∶1),培养48小时,得到绿僵菌HYN-1-2浓度为4×109-7×109cfu/mL的发酵液。
上述YES-2培养基的配方为葡萄糖30克,酵母6.12克,K2HPO4 1克,MgSO4 0.5克,KCl 0.5克,FeSO4 0.01克,ZnSO4·7H2O 10毫克,用水定容至1L,pH调至6.5。
实施例3、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2的微球型制剂的制备
1、微球海藻酸钠凝胶液的配制(100升):将2.6千克海藻酸钠缓缓加入到100升80℃的自来水中,不断搅拌使其溶化,得到海藻酸钠水溶液,冷却至约30℃,备用;
2、取实例2得到绿僵菌HYN-1-2的浓度为4×109cfu/mL的发酵液100升匀浆打碎,加入24千克硅藻土充分混匀后,加入到步骤1配制的100升海藻酸钠水溶液中,充分搅拌混匀,得到悬浮液;
3、配制CaCl2溶液:用自来水配制摩尔浓度为0.2M的氯化钙溶液100升,备用;
4、将步骤2得到的悬浮液通过0.2毫米孔径的筛孔,滴加到步骤3得到的100升0.2M的氯化钙溶液中,筛孔和氯化钙液面相距50厘米左右。海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后,生成海藻酸钙微球。
5、将步骤4得到的海藻酸钙微球淬水搅拌10分钟,然后将海藻酸钙微球滤出,用清水冲洗2次,滤出微球40℃吹干,得到微球剂型的绿僵菌HYN-1-2制剂(图1)。经检测,该制剂的单粒微球重0.032-0.034克,直径4.5±0.3mm,每克微球含5×108CFU/克绿僵菌(M.anisopliae)HYN-1-2。
实施例4、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2的微球型制剂的制备
1、微球海藻酸钠凝胶液的配制(100升):将2.6千克海藻酸钠缓缓加入到100升80℃的自来水中,不断搅拌使其溶化,得到海藻酸钠水溶液,冷却至约30℃,备用;
2、取实例2得到绿僵菌HYN-1-2的浓度为7×109cfu/mL的发酵液100升匀浆打碎,加入20千克硅藻土充分混匀后,加入到步骤1配制的100升海藻酸钠水溶液中,充分搅拌混匀,得到悬浮液;
3、配制CaCl2溶液:用自来水配制摩尔浓度为0.2M的氯化钙溶液100升,备用;
4、将步骤2得到的悬浮液通过0.2毫米孔径的筛孔,滴加到步骤3得到的100升0.2M的氯化钙溶液中,筛孔和氯化钙液面相距50厘米左右。海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后,生成海藻酸钙微球。
5、将步骤4得到的海藻酸钙微球淬水搅拌10分钟,然后将海藻酸钙微球滤出,用清水冲洗2次,滤出微球40℃吹干,得到微球剂型的绿僵菌HYN-1-2制剂(图1)。经检测,该制剂的单粒微球重0.032-0.034克,直径4.5±0.3mm,每克微球含5.5×108CFU/克绿僵菌HYN-1-2。
实施例5、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2的微球型制剂的制备
1、微球海藻酸钠凝胶液的配制(100升):将4.0千克海藻酸钠缓缓加入到100升80℃的自来水中,不断搅拌使其溶化,得到海藻酸钠水溶液,冷却至约30℃,备用;
2、取实例2得到绿僵菌HYN-1-2的浓度为4×109cfu/mL的发酵液100升匀浆打碎,加入20千克硅藻充分混匀后,加入到步骤1配制的100升海藻酸钠水溶液中,充分搅拌混匀,得到悬浮液;
3、配制CaCl2溶液:用自来水配制摩尔浓度为0.1M的氯化钙溶液100升,备用;
4、将步骤2得到的悬浮液通过0.2毫米孔径的筛孔,滴加到步骤3得到的100升0.2M的氯化钙溶液中,筛孔和氯化钙液面相距50厘米左右。海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后,生成海藻酸钙微球。
5、将步骤4得到的海藻酸钙微球淬水搅拌10分钟,然后将海藻酸钙微球滤出,用清水冲洗2次,滤出微球40℃吹干,得到微球剂型的绿僵菌HYN-1-2制剂(图1。经检测,该制剂的单粒微球重0.032-0.034克,直径4.5±0.3mm,每克微球含5×108CFU/克绿僵菌HYN-1-2。
实施例6、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2的微球型制剂的制备
1、微球海藻酸钠凝胶液的配制(100升):将4.0千克海藻酸钠缓缓加入到100升80℃的自来水中,不断搅拌使其溶化,得到海藻酸钠水溶液,冷却至约30℃,备用;
2、取实例2得到绿僵菌HYN-1-2的浓度为4×109cfu/mL的发酵液100升匀浆打碎,加入24千克硅藻土充分混匀后,加入到步骤1配制的100升海藻酸钠水溶液中,充分搅拌混匀,得到悬浮液;
3、配制CaCl2溶液:用自来水配制摩尔浓度为0.2M的氯化钙溶液100升,备用;
4、将步骤2得到的悬浮液通过0.2毫米孔径的筛孔,滴加到步骤3得到的100升0.2M的氯化钙溶液中,筛孔和氯化钙液面相距50厘米左右。海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后,生成海藻酸钙微球。
5、将步骤4得到的海藻酸钙微球淬水搅拌10分钟,然后将海藻酸钙微球滤出,用清水冲洗2次,滤出微球40℃吹干,得到微球剂型的绿僵菌HYN-1-2制剂(图1)。经检测,该制剂的单粒微球重0.032-0.034克,直径4.5±0.3mm,每克微球含3×108CFU/克绿僵菌HYN-1-2。
将上述实例3得到的绿僵菌HYN-1-2微球制剂于室温20-25℃,湿度20-30%条件下放置6个月,每克微球中含绿僵菌HYN-1-2变为1×108CFU,防治效果如实施例7-9。
实施例7、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2制剂对黄瓜根结线虫的生防效果检测
选择根结线虫病发病严重的北京市门头沟碧琨种植中心蔬菜温室大棚,种植品种为迷你型小黄瓜(北京金土地农业技术研究所)。实验采用随机区组试验,共设三个区组(重复),每个区组设6个小区(处理),每个小区的面积为20平方米。在黄瓜苗移栽时,将供试药剂采用穴施的方法,施于作物根下,实验期间按常规方法管理,黄瓜移栽的株距和行距分别是30cm和50cm。
作物收获后,挖出黄瓜根,统计每个处理各重复中各级(0-10级)病株的数目,计算病情指数及防治效果,结果见表1,同时采集空白对照中黄瓜根上的根结线虫,用立式显微镜通过形态方法鉴定根结线虫的种类。
各处理及药剂如下:
处理1:不施任何药剂(空白对照);
处理2:1千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理3:4千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理4:8千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理5:1升/亩穴施1.8%阿维菌素乳油(北京中农大生物技术有限公司奇克农药厂生产)(对照1);
处理6:30-40克/亩98%大扫灭粉剂(有效成分为二硫代氨基甲酸钾和二甲基噻二嗪,上海金山实验化工厂)熏蒸(对照2)。
根结线虫分级调查指标:0级代表没有根结,1级代表1-10%的根上有根结,2级代表11-20%的根上有根结,3级代表21-30%的根上有根结,4级代表31-40%的根上有根结,5级代表41-50%的根上有根结,6级代表51-60%的根上有根结,7级代表61-70%的根上有根结,8级代表71-80%的根上有根结,9级代表81-90%的根上有根结,10级代表91-100%的根上有根结;
病情指数=100×∑(各级病株数×各级代表值)/调查总株数×最高代表值;
防治效果=100%×(空白对照的病情指数-处理后的病情指数)/空白对照的病情指数。
结果:空白对照中黄瓜根上的根结线虫主要是南方根结线虫(Meloidogyneincognita)和北方根结线虫(Meloidogyne hapla)。
表1本发明的绿僵菌制剂对黄瓜根结线虫的防治效果检测结果
处理 |
病情指数 |
防治效果(%) |
处理1(空白对照) |
90.38±4.2 |
- |
处理2(绿僵菌制剂1千克/亩) |
55.14±6.0 |
38.98 |
处理3(绿僵菌制剂4千克/亩) |
29.31±6.7 |
67.57 |
处理4(绿僵菌制剂8千克/亩) |
27.82±4.1 |
69.22 |
处理5(阿维菌素) |
26.30±3.8 |
70.89 |
处理6(大扫灭) |
40.16±1.9 |
55.56 |
注:表中数值为各重复的平均值。
表1结果表明,使用本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂后对黄瓜上的南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和北方根结线虫(Meloidogyne hapla)有一定程度的防效,与空白对照相比能够显著降低根结线虫危害。
实施例8、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2制剂对青椒根结线虫的生防效果检测
选择根结线虫病发病严重的山东寿光稻田镇蔬菜温室大棚,种植作物为青椒F1(中国农科院中良公司)。实验采用随机区组试验,共设三个区组(重复),每个区组设5个小区(处理),每个小区的面积为20平方米。在青椒苗移栽时,将供试药剂采用穴施的方法,施于作物根下,实验期间按常规方法管理,青椒的移栽的株距和行距分别是30cm和50cm。
作物收获后,挖出青椒根,统计每个处理各重复中各级(0-10级)病株的数目,计算病情指数及防治效果,结果见表2,同时采集空白对照中青椒根上的根结线虫,用立式显微镜通过形态方法鉴定根结线虫的种类。
各处理及药剂如下:
处理1:不施任何药剂(空白对照);
处理2:1千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理3:4千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理4:8千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理5:2公斤/亩穴施10%福气多颗粒剂(有效成分为噻唑磷)(日本石原产业株式会社生产)(对照)。
根结线虫分级调查指标:0级代表没有根结,1级代表1-10%的根上有根结,2级代表11-20%的根上有根结,3级代表21-30%的根上有根结,4级代表31-40%的根上有根结,5级代表41-50%的根上有根结,6级代表51-60%的根上有根结,7级代表61-70%的根上有根结,8级代表71-80%的根上有根结,9级代表81-90%的根上有根结,10级代表91-100%的根上有根结;
病情指数=100×∑(各级病株数×各级代表值)/调查总株数×最高代表值;
防治效果=100%×(空白对照的病情指数-处理后的病情指数)/空白对照的病情指数。
结果:空白对照中青椒根上的根结线虫主要是南方根结线虫(Meloidogyneincognita)。
表2本发明的绿僵菌制剂对青椒根结线虫的防治效果检测结果
处理 |
病情指数 |
防治效果(%) |
处理1(空白对照) |
86.67±5.9 |
- |
处理2(绿僵菌制剂1千克/亩) |
56.72±5.8 |
34.55 |
处理3(绿僵菌制剂4千克/亩) |
34.11±3.8 |
59.47 |
处理4(绿僵菌制剂8千克/亩) |
33.60±2.4 |
61.23 |
处理5(福气多) |
13.56±2.9 |
87.62 |
注:表中数值为各重复的平均值。
表2结果表明,使用本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂后对青椒上的南方根结线虫(Meloidogyne incognita)有一定程度的防效,与空白对照相比能够显著降低根结线虫危害。
实施例9、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2制剂对西红柿根结线虫的生防效果检测
选择根结线虫病发病严重的山东寿光稻田镇蔬菜温室大棚,种植作物为西红柿中蔬5号(中国农科院中良公司)。实验采用随机区组试验,共设三个区组(重复),每个区组设5个小区(处理),每个小区的面积为20平方米。在西红柿苗移栽时,将供试药剂采用穴施的方法,施于作物根下,实验期间按常规方法管理,西红柿移栽的株距和行距分别是30cm和50cm。
作物收获后,挖出西红柿根,统计每个处理各重复中各级(0-10级)病株的数目,计算病情指数及防治效果,结果见表3,同时采集空白对照中西红柿根上的根结线虫,用用立式显微镜通过形态方法鉴定根结线虫的种类。
各处理及药剂如下:
处理1:不施任何药剂(空白对照);
处理2:1千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理3:4千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理4:8千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂;
处理5:1升/亩穴施1.8%阿维菌素乳油(北京中农大生物技术有限公司奇克农药厂生产)(对照)。
根结线虫分级调查指标:0级代表没有根结,1级代表1-10%的根上有根结,2级代表11-20%的根上有根结,3级代表21-30%的根上有根结,4级代表31-40%的根上有根结,5级代表41-50%的根上有根结,6级代表51-60%的根上有根结,7级代表61-70%的根上有根结,8级代表71-80%的根上有根结,9级代表81-90%的根上有根结,10级代表91-100%的根上有根结;
病情指数=100×∑(各级病株数×各级代表值)/调查总株数×最高代表值;
防治效果=100%×(空白对照的病情指数-处理后的病情指数)/空白对照的病情指数。
结果:空白对照中西红柿根上的根结线虫主要是南方根结线虫(Meloidogyneincognita)和北方根结线虫(Meloidogyne hapla)。
表3本发明的绿僵菌制剂对西红柿根结线虫的防治效果检测结果
处理 |
病情指数 |
防治效果(%) |
处理1(空白对照) |
78.6±5.6 |
- |
处理2(绿僵菌制剂1千克/亩) |
54.92±5.7 |
30.12 |
处理3(绿僵菌制剂4千克/亩) |
36.8±7.9 |
53.2 |
处理4(绿僵菌制剂8千克/亩) |
36.22±3.2 |
53.91 |
处理5(阿维菌素) |
22.4±3.2 |
71.5 |
注:表中数值为各重复的平均值±标准差。
表3结果表明,使用本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂后对西红柿上的南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和北方根结线虫(Meloidogyne hapla)有一定程度的防效,与空白对照相比能够显著降低根结线虫危害。
实施例4-6得到的绿僵菌HYN-1-2制剂于室温20-25℃、湿度20-30%条件下,放置6个月后的防治效果与实施例3得到的绿僵菌HYN-1-2制剂在实施例7-9中的防治效果无显著差异。