CN102242066B

CN102242066B - 一种顶孢霉菌株及顶孢霉菌可湿性粉剂

Info

Publication number: CN102242066B
Application number: CN201010169890.0A
Authority: CN
Inventors: 沈慧敏; 张新虎; 张海英; 宋丽雯; 李莉; 张莉; 田大伟; 杨顺义
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2010-05-12
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2030-05-12
Also published as: CN102242066A

Abstract

本发明公开了一种顶孢霉菌株Acremonium hansfordii Ahy1及顶孢霉菌可湿性粉剂。其中顶孢霉菌可湿性粉剂包括如下重量百分比的组分：顶孢霉菌分生孢子粉10％、润湿剂2％、分散剂5％、紫外保护剂0.8％、稳定剂1％，余量为载体。本发明在干旱环境下筛选分离获得顶孢霉菌株Ahy1，该菌株所处的地理环境决定了此菌株不同于其它地区来源的菌株，具备抗逆性强的良好特性；同时，经室内和田间药效证明，本发明的顶孢霉可湿性粉剂对蚜虫具有极强的感染力。

Description

一种顶孢霉菌株及顶孢霉菌可湿性粉剂

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种真菌顶孢霉菌株及顶孢霉菌可湿性粉剂。

背景技术

由于化学农药的大量使用对环境生态造成了严重的影响，生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是重要的生防手段之一。在昆虫病原微生物中，昆虫的真菌病占据着一个重要地位，在害虫的生物防治中起着非常重要的作用。如我国用布氏白僵菌处理土壤，使花生地的暗黑鳃金龟幼虫虫口下降50％以上，最高达86.6％。昆虫病原真菌作为一类宝贵的生物资源，引起了生物学家的高度重视。现在各国研究应用最多的是白僵菌，其次是绿僵菌，赤霉菌、虫生藻菌等。许多昆虫病原真菌已被广泛开发应用于防治农林害虫、卫生害虫、农田杂草等有害生物。

虫霉目虫霉科真菌大约有150多种，可寄生32个科的120多种昆虫，寄主幼虫、蛹、成虫等虫态均可感染，是蝗虫、蝇类、蛾类、蚜虫、蚧类及螨类的主要寄生菌。虫霉科中有10多种虫霉如逸孢霉属、虫霉属、疫霉属、新接合霉属和虫疫霉属真菌等都可引起蚜虫30％～100％的死亡率。这些真菌对害虫的侵染和流行潜力极强，常引发许多害虫的流行病，在蚜虫等刺吸式口器害虫的自然控制中起着极其重要的作用。因此，开发和利用虫霉目真菌资源用于生物防治具有十分广阔前景。

而甘肃省由于大陆性季节气候的影响，造就了干旱少雨、光热丰富、昼夜温差大，兼具温带季风和大陆气候特征，对引用外来微生物资源带来了一定的限制因素，因此，筛选适合于此种干旱气候的虫霉目真菌资源更显格外重要。

另外，虫霉目真菌制剂的研制也是近年来虫霉研究的热点，近年来报道的新方法虽然在工艺设计上考虑了虫霉的生物学特性，但工艺难度大，成本高，而且后续干燥和保存的难度较大，如海藻盐作为包埋基质虽有许多优点，但存在保水性差、助剂易渗漏、易失水干燥、不利于菌株孢子再复水萌发、机械强度差以及胶球粘连等缺陷。因此，进一步研究寻找优良的虫霉目真菌添加成分或其它材料用于虫霉目真菌菌株加工，提高菌株产孢或感染能力是研发应用的关键。

发明内容

本发明的目的是针对现有真菌微生物在防治技术中的上述缺陷，提出一种适应干旱环境的顶孢霉菌株，该菌株对蚜虫有较强感染力。

本发明的另一个目的是提出一种利用上述菌株经发酵生产产生的孢子粉辅以相应助剂制成的顶孢霉菌可湿性粉剂，该制剂该制剂主要施用在蔬菜和果树上防治甘蓝蚜和桃蚜。

实现上述目的的技术方案如下：

一种顶孢霉菌株，该菌株分类命名为Acremonium hansfordii Ahy1，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，登记入册的编号为(CGMCCNo.2278)，保藏日期是：2007年12月03日。

经鉴定，该菌株具有下述性质：

1、形态特征：

菌落绒毛状，白色后变成桃红色，潮湿，有刺激性气味；菌落生长较快，25℃下10d直径5.5～6.8cm；背面黄色、土黄色至棕色。分生孢子梗稀缺，产孢细胞直立，单生，直接着生于菌丝细胞上，产孢细胞透明，无色，光滑，多数长9.0～30.2μm，基部膨大渐尖呈长瓶形，宽2.1～5.4μm，基部有隔膜。分生孢子纺锤形，光滑透明，6.5～9.8×2.0～3.2μm，L/B 2.7～4.3。多形成粘孢团，少数形成干燥的短链，大量孢子聚集产生微弱的红棕色。

2、培养特征

顶孢霉菌Ahy1生长和产孢的最佳碳源为木糖，菌丝生物量和产孢量分别为1.806mg/mL和7.061×10^6个孢子/mL；最佳氮源为尿素，其菌丝体含量和产孢量分别为0.242mg/mL和54.07×10^6个孢子/mL；最适于顶孢霉菌菌丝生长和产孢的C/N为10∶1。液体培养至6～7d时，菌丝生物量和产孢量均达到高峰，因此液体发酵终止时间应选择在接种后6～7d。

顶孢霉菌株Ahy1加工工艺：一级固体培养最适培养基为麦麸培养基，最佳培养时间为6d；二级液体振荡培养的最适接种液为马铃薯～糖培养液，以120r/min振荡培养(25±1)℃，3d；三级产孢培养介质为低值陈米，初步获得孢子粉，孢子含量为5.8×1010孢子/g，含水量6％，活孢率93.5％。

3、生理生化特性：

上述的顶孢霉菌Ahy1来源为：对甘肃省虫生真菌资源调查，从自然感病的桃蚜幼虫上筛选出的对蚜虫感染力较强一种菌株。该菌株产生纺锤形分生孢子，形成粘孢团或干燥的短链，分生孢子梗稀缺，长瓶状的产孢细胞生于菌丝上，无分枝。孢子脱落后顶部形成明显增厚的瘢疤等特征。菌株分生孢子萌发的最适温湿度组合为温度20℃、湿度90％以上，最适生长和产孢的温度为20℃，最适pH值范围是7.0～10.0，紫外线对孢子有很强的杀伤作用，明暗交替有利于其生长和产孢。葡萄糖、蔗糖、蛋白胨有利于Ahy1菌落的生长和产孢；适宜培养基为萨氏培养基(SDAY)和萨氏蛋黄培养基(SEA)培养基是Ahy1菌株生长最有利的培养基。

顶孢霉Ahy1菌株加工中一级固体最适培养基为玉米粉麦麸培养基，培养时间为6天；马铃薯-糖培养液振荡培养三天为二级液体培养，最适培养条件为25±1℃，120r/min；三级产孢培养介质为低殖陈米，获得的孢子粉，孢子含量为5.8×1010个/g，含水量6％，活孢率93.5％。

另外，本发明通过筛选与顶孢霉菌株孢子生物学相容的助剂，初步选定适合该菌制剂生产的载体为碳酸钙和膨润土；润湿剂为十二烷基苯磺酸钠和十二烷基硫酸钠；分散剂为木质素磺酸钙和木质素磺酸钠；紫外保护剂为荧光素钠和抗坏血酸，稳定剂为黄原胶等。

即本发明的顶孢霉可湿性粉剂，包括如下重量百分比的组分：包括如下重量份数的组分：顶孢霉菌分生孢子粉10％、十二烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠2％、木质素磺酸钙或木质素磺酸钠5％、荧光素钠或抗坏血酸0.8％、黄原胶1％，余量为碳酸钙或膨润土。加工的10％顶孢霉孢子可湿性粉剂的含孢量达5.8×108个孢子/g、含水量1.729％、悬浮率达82.24％、细度93.62％过220目筛、湿润时间136.01s。该制剂主要施用在蔬菜和果树上防治甘蓝蚜和桃蚜。

进一步地，优选如下重量百分比的组分：顶孢霉菌分生孢子粉10％、十二烷基苯磺酸钠2％、木质素磺酸钙或木质素磺酸钠5％、抗坏血酸0.8％、黄原胶1％，余量为碳酸钙。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、关于顶孢霉菌株的杀虫活性在国内少有报道，且仅见于线虫上，对其它害虫的防治效果的研究在国内尚属空白。本发明在干旱环境下筛选分离获得顶孢霉菌株Ahy1，该菌株所处的地理环境决定了此菌株可能不同于其它地区来源的菌株，具备抗逆性强的良好特性；同时其对蚜虫感染力强，对人畜安全，对天敌昆虫无害，选择性高，对生态系统影响小，不易产生抗药性，对于丰富我国真菌杀虫微生物资源，开发适宜于干旱条件下生产和应用的虫生真菌微生物杀虫剂，保护生态环境具有十分重要的意义。

2、本发明通过对顶孢霉菌助剂的筛选，获得了性能稳定的真菌微生物杀虫制剂。10％顶孢霉可湿性粉剂使用剂量为100-200倍时对桃蚜具有较好的防效和持久性。试验期间，对其它非靶标生物无不良影响，各处理区果树和蔬菜生长正常，制剂中所选助剂均是生物或低毒助剂。

10％顶孢霉孢子粉可湿粉剂对蚜虫具有良好的控制能力，并对菜青虫、小菜蛾有兼治作用。且残效期长，是一种理想的防治果树和蔬菜蚜虫的无公害农药。该制剂顺应了当前生物农药研究的潮流，开发的顶孢霉真菌制剂对果树和蔬菜蚜具有很好的防治作用，并具有高效、低毒、低残留，与环境相溶性好，是替代高残毒农药的新型虫生真菌制剂，对于我国开发无公害食品，保证粮食安全，维护生态环境，可持续农业具有重要的意义。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(一)菌株：

本发明顶孢霉菌株，该菌株分类命名为(Acremonium hansfordii Ahy1)，目前该菌株保藏于(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC))，登记入册的编号为(CGMCCNo.2278)，保藏日期是：2007年12月3日。

(二)顶孢霉Ahy1菌株孢子粉的生产：

采用低值陈米培养，获取高纯度孢子粉。将Ahy1菌株，转接到SDAY培养基上培养7天，接种到蚜虫体上进行菌株复壮，分离纯化后液体培养72h，将培养液接到灭菌好的低值陈米料上，并加入KNO₃作为氮源，增加其产孢量，拌匀后保湿培养8天，凉干收取孢子粉。

(三)顶孢霉可湿性粉剂的制备：

该顶孢霉可湿性粉剂包括如下重量百分比的组分：顶孢霉菌分生孢子粉10％、十二烷基苯磺酸钠2％、木质素磺酸钙5％、抗坏血酸0.8％、黄原胶1％，余量为碳酸钙。

(四)顶孢霉可湿性粉剂的药效评价

1.1供试材料

供试农药：顶孢霉可湿性粉剂(浓度为10％)；1.8％阿维菌素乳油(新沂中凯农用化工有限公司生产)；10％吡虫啉WP(江苏省农药研究所和江苏省农科院植保所生产)。

防治对象：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)；桃蚜(Myzus persicae)。

供试作物：结球甘蓝(Brassica oleraceavar Capitata)，品种为晚丰和中甘十一号；甘蓝，品种为中甘15号；桃树。

1.2试验方法

1.2.1顶孢霉可湿性粉剂对甘蓝蚜的室内毒力测定

1.2.1.1顶孢霉菌孢子悬浮液配制

将保存的斜面顶孢霉菌菌株转至SDAY培养基上平板上，置于光照培养(20℃、12L：12D、RH55％)中培养7d后，用0.01％Tween-80无菌水洗下孢子，再用纱布滤去菌丝，制成孢子悬浮液，并用血球计数板测定孢子浓度，配制不同浓度的孢子悬浮液(1.12×10⁵～1.12×10⁸个孢子/mL)。

1.2.1.2顶孢霉菌对甘蓝蚜的室内毒力测定方法

采用浸叶法：把带蚜虫的甘蓝叶片放入不同浓度孢子悬浮液内浸渍10s作为处理，把带蚜虫的甘蓝叶片浸入10％吡虫啉可湿性粉剂3000倍液作为对照(CK₁)，并以0.05％Tween-80处理作空白对照(CK₂)。自然风干后，移入直径90mm培养皿中饲养，培养皿内用两层滤纸保湿，每日观察试虫的行为，记录幼虫死亡数目及感病症状。每浓度处理试虫100头，重复3次，观察24h死亡百分率和以后每天的累积死亡率，统计触杀毒力。

挑取出现身体干瘪僵硬死亡的幼虫，并且身体上长出白色菌丝的，置于0.1％升汞溶液中浸泡1～2min，无菌水冲洗3次后，转接在SDAY培养基平板上，20℃培养3d后，培养基平板上的虫体长出菌丝，最后制片观察分离菌与顶孢霉菌是否形态一致。

所有数据的分析均采用DPS软件完成。

1.2.2 10％顶孢霉可湿性粉剂对甘蓝蚜的盆栽药效试验

1.2.2.1顶孢霉菌孢子悬浮液配制：同1.2.1.1。

1.2.2.2顶孢霉菌对甘蓝蚜的室内盆栽毒力测定方法

用小型营养钵种植结球甘蓝36盆，每盆两株，生长25天后，大约为3～4片真叶期时，挑取室内饲养的甘蓝蚜若蚜每盆100头，用喷雾法将不同浓度孢子悬浮液用小型喷雾器均匀喷洒在甘蓝苗上，喷雾10％吡虫啉可湿性粉剂3000倍液作为对照(CK₁)，并以0.05％Tween-80处理作空白对照(CK₂)，每处理6盆。喷雾后分别饲养于养虫罩内，每日观察试虫的行为，蚜虫用毛笔接触不动即为死亡，记录幼虫死亡数目及感病症状，观察24h死亡百分率和以后每天的累积死亡率，统计触杀毒力效果。

挑取幼虫出现身体干瘪僵硬死亡，并且身体上长出白色菌丝的，置于0.1％升汞溶液中浸泡1～2min，无菌水冲洗3次后，转接在SDAY培养基平板上，20℃培养3d后，培养基平板上的虫体长出菌丝，最后制片观察分离菌与原虫体菌是否形态一致。

所有数据的分析均采用DPS软件完成。

1.2.3顶孢霉可湿性粉剂防桃蚜田间药效试验

每小区3棵树，33m²，小区随机区组排列；重复4次，共20个小区；10％顶孢霉可湿性粉剂100倍、200倍、400倍三个浓度；1.8％阿维菌素乳油2000倍为药剂对照；以清水处理为空白对照。用新加坡生产的利农HD-400背负式手动喷雾器分小区对果树叶片正反面均匀喷雾。

每公顷用药液量900kg，每小区用水量3.96kg。2006年7月3日(果实彭大期)喷雾施药一次。试验期间除喷施供试药剂外再未用任何农药。每小区固定调查2株，每株按东、西南、北、中固定5个被害梢，每梢调查10片叶的活蚜虫数。施药前调查虫口基数，药后5天、9天分别调查活蚜数，共调查4次。

对调查数据进行统计，用下式计算病指和防效，并用邓肯式新复极差(DMRT)法对防效进行统计分析，以确定其显著性。

式中：CK——空白对照区虫口减退率

PT——药剂处理区虫口减退率

1.2.4顶孢霉可湿性粉剂防治甘蓝蚜田间药效试验

小区面积16m²，随机区组排列；重复4次，共20个小区。10％顶孢霉可湿性粉剂100倍、200倍、400倍三个浓度；1.8％阿维菌素乳油2000倍为药剂对照；以清水处理为空白对照。用新加坡生产的利农HD-400背负式手动喷雾器分小区均匀喷雾。每公顷用药液量900kg，每小区用水量1.43kg。2006年7月2日(结球期)喷雾施药一次。

每小区固定调查10株甘蓝上的蚜虫数。药前调查基数，在药后5、9天调查残存蚜虫数，统计防效。施药前调查虫口基数，药后5天、9天分别调查活蚜数，共调查4次。对调查数据进行统计，用下式计算病指和防效，并用邓肯式新复极差(DMRT)法对防效进行统计分析，以确定其显著性。

式中：CK——空白对照区虫口减退率

PT——药剂处理区虫口减退率

2.顶孢霉可湿性粉剂药效评价结果

2.1顶孢霉可湿性粉剂对甘蓝蚜的室内毒力测定结果

顶孢霉菌(Acremonium hansfordii)对甘蓝蚜有很强的致死作用(见表1)。在所测的浓度范围(1.12×10⁵～1.12×10⁸个孢子/mL)内，当菌液浓度为1.12×10⁷个孢子/mL时蚜虫的死亡率为59.3％，浓度增加到1.12×10⁸个孢子/mL时，蚜虫的死亡率提高到72.5％。在接菌后第二天就开始死亡，第四天出现死亡高峰。各剂量下第六天的死亡率分别为72.5％、59.3％、45.1％和38.5％，经测定该菌对甘蓝蚜的致死中浓度为1.650×10⁶个孢子/mL，与常用对照药剂10％吡虫啉WP相比，防效稍差，但作为一种微生物杀虫真菌，经过制剂加工，有很大开发利用前景。

接种3d后，挑取身体出现干瘪僵硬死亡的，并且身体上长出白色菌丝的幼虫，置于0.1％升汞溶液中浸泡1～2min，无菌水冲洗3次后，转接在SDAY培养基平板上，20℃培养3d后，培养基平板上的虫体长出菌丝，最后制片观察分离菌与顶孢霉菌的孢子形态一致。

表1顶孢霉菌对甘蓝蚜的毒力测定结果

2.2顶孢霉可湿性粉剂对甘蓝蚜的盆栽药效试验

顶孢霉菌(Acremonium hansfordii)对甘蓝蚜有很强的致死作用(见表2)。在所测的浓度范围(1.12×10⁵～1.12×10⁸个孢子/mL)内，当菌液浓度为1.12×10⁷个孢子/mL时蚜虫的死亡率为57％，浓度增加到1.12×10⁸个孢子/mL时，蚜虫的死亡率提高到66.7％。在接菌后第二天就开始死亡，第四天出现死亡高峰。各剂量下第六天的死亡率分别为66.7％、57％、43％和34.4％，经测定该菌对甘蓝蚜的致死中浓度为3.35×10⁶个孢子/mL，回归方程为y＝0.2852x+3.1394，药效低于对照药剂10％吡虫啉WP。

接种3d后，挑取身体出现干瘪僵硬死亡的，并且身体上长出白色菌丝的幼虫，置于0.1％升汞溶液中浸泡1～2min，无菌水冲洗3次后，转接在SDAY培养基平板上，20℃培养3d后，培养基平板上的虫体长出菌丝。最后制片观察分离菌与顶孢霉菌的孢子形态一致。

表2顶孢霉菌对甘蓝蚜的盆栽药效结果

2.3顶孢霉可湿性粉剂防桃蚜田间药效试验

顶孢霉可湿性粉剂对桃蚜的田间药效试验结果如表3所示，顶孢霉可湿性粉剂对桃蚜具有较好的防效，其用量为400倍时，药后5天、9天的防效分别为24.04％和45.47％；其剂量为200倍时，药后5天、9天的防效则为27.84％和54.11％；其剂量为100倍时，药后5天、7天的防效分别达到14.86％、32.46％和65.33％，均与对照药剂防效存在极显著差异。10％顶孢霉可湿性粉剂仍有极大的开发利用前景，在使用剂量为100～200倍时对桃蚜具有较好的防效和持久性。田间观察，各处理区果树生长正常据，未发现任何不良影响。试验期间据田间调查，对其它非靶标生物无不良影响。

表3顶孢霉可湿性粉剂防治桃蚜田间药效试验结果

^*注：A、B、C和a、b、c分别表示在0.01水平和0.05水平上

2.4顶孢霉可湿性粉剂防治甘蓝蚜田间药效试验

顶孢霉可湿性粉剂对甘蓝蚜的田间药效试验结果如表4所示，10％顶孢霉可湿性粉剂对甘蓝蚜具有较好的防效，其用量为400倍时，药后5天、9天的防效分别为17.83％和40.38％；其剂量为200倍时，药后5天、9天的防效则为22.89％和50.96％；其剂量为100倍时，药后5天、9天的防效分别达到13.01％、27.77％和62.4％，均与对照药剂防效存在极显著差异。但作为一种对环境安全的微生物农药，10％顶孢霉可湿性粉剂仍有极大的开发利用前景，在使用剂量为100-200倍时对十字花科蔬菜蚜虫具有较好的防效和持久性。

据试验期间田间观察，各处理区供试作物生长正常，未发现任何不良影响。试验期间据田间调查，各处理区有菜青虫、小菜蛾混合危害，施药后菜青虫及小菜蛾的数量下降。说明供试药剂对菜青虫及小菜蛾具有兼治作用。试验期间据田间调查，对其它非靶标生物无不良影响。

表4顶孢霉可湿性粉剂防治甘蓝蚜田间药效试验结果

注：A、B、C和a、b、c分别表示在0.01水平和0.05水平上显著

实施例2

防治蚜虫的顶孢霉菌株制剂，包括如下重量百分比的组分：顶孢霉菌分生孢子粉10％、十二烷基硫酸钠2％、木质素磺酸钠5％、荧光素钠0.8％、黄原胶1％，余量为膨润土。

同实施例1的药效检测，上述实施例2中的顶孢霉菌可湿性粉剂，对蚜虫也有很好的防治效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种顶孢霉菌可湿性粉剂，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：顶孢霉菌分生孢子粉10％、十二烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠2％、木质素磺酸钙或木质素磺酸钠5％、荧光素钠或抗坏血酸0.8％、黄原胶1％，余量为碳酸钙或膨润土；所述顶孢霉菌为顶孢霉菌（Acremonium hansfordii）Ahy1，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.2278。

2.根据权利要求1的顶孢霉菌可湿性粉剂，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：顶孢霉菌分生孢子粉10％、十二烷基苯磺酸钠2％、木质素磺酸钙或木质素磺酸钠5％、抗坏血酸0.8％、黄原胶1％，余量为碳酸钙。