CN102428964A - 一种防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂cb28合剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物保护技术领域,涉及一种防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂。CB28合剂主要由保藏号为CGMCC NO.4734的巨大芽孢杆菌BS13和保藏号为CGMCC NO.4733的肠杆菌BJN15组成。每个菌在LB培养液32℃200rpm振荡培养18~20h,然后4000rpm离心15min,取湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌悬液。按照菌的活菌数量比1∶1配成混合制剂,合剂中活菌总浓度为1×109~1010cfu/ml。CB28合剂对黄瓜霜霉病防效为70%以上。该复合菌剂通过喷雾使用防治病害,也可以通过喷雾和根部处理同时使用。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域,涉及一种防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂。
技术背景
黄瓜是全球十大蔬菜栽培作物之一,在我国“菜篮子”工程中占有重要地位。其叶部病害很多,其中以霜霉病危害最重。因此,研究和防治日光大棚黄瓜病害刻不容缓。在黄瓜叶部病害中,霜霉病是极易发生的,一旦发生,面积大、流行性强,危害严重,防治上难度较大,是黄瓜日光大棚生产中最主要的一大病害。
黄瓜霜霉病是古巴假霜霉菌(Psedoperonspora cubensis(Berkis Curt)Rostov)引起的一种真菌病害,在各地普遍发生。病菌的孢子囊可随风雨、黄瓜甲虫、农器具等进行传播,是一种主要的气传病害;且为专性寄生菌,对寄主植物的专化选择性很强。
随着我国日光大棚面积急剧增加,反季节黄瓜大棚栽培种植大量突现,合适的温湿度等条件,给霜霉病病菌的越冬、传播带来有利条件,一年四季侵染黄瓜,发病严重时,全叶呈黄褐色干枯,最后导致植株干枯早死,缩短收瓜期,严重影响黄瓜产量,损失可达20%到60%,是影响产量的主要制约因素之一。
目前,对日光大棚黄瓜种植而言,控制此病害主要依靠化学药剂,但是其发生期的预测预报精确度不高,很难在防治时间点上适期用药,通常做法是不管发病与否,用药次数急剧增加至每周一次,用药量也急剧增加,药剂种类选择也无法游刃有余,大多是一些保护类化学药剂如霜脲·锰锌wp、唖酮·霜脲氰水分散粒剂、代森锰锌·霜脲氰wp、氟菌·霜霉威悬浮剂等。另外化学药剂的成倍使用,使得农田生态系统易遭到严重破坏,收获后的黄瓜农药残留严重,给人们健康带来不可忽视的严重威胁。同时,化学农药不易降解,高残留,对人、畜的安全性都严重限制了在将来的农业生产上的使用。因此,非化学性防治措施目前已成为防治黄瓜病害的核心方式,而生物防治则为其中最有前途的方法。
由此可见,开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂控制黄瓜霜霉病是提高社会生产总量的需要,同时更是农业安全及可持续发展的需要,符合社会发展需求。
发明内容
本发明的目的是针对利用生物防治解决农业生产中黄瓜霜霉病防治难度大,成本高,而化学农药抗性日益突出,农药残留高等问题提供一种防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂,该CB28合剂对黄瓜霜霉病防效为62.00%以上。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
一种防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂,含两种有效细菌成分:分别是巨大芽孢杆菌(Bacillus meqaterium)BS13,于2011年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为CGMCC NO.4734;肠杆菌(Enterobacter sp.)BJN15,于2011年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为CGMCC NO.4733;该合剂中所述的保藏号为CGMCC NO.4734的巨大芽孢杆菌BS13与保藏号为CGMCC NO.4733的肠杆菌BJN15的活菌数量比为1∶1,总活菌总浓度为1×109~1010cfu/ml。
所述的防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂的制备方法,包含如下步骤:
(1)种子菌液的培养:分别将保藏号为CGMCC NO.4734的巨大芽孢杆菌BS13和保藏号为CGMCC NO.4733的肠杆菌BJN15接种到LB培养液中,在30~32℃、180~220rpm条件下培养至600nm处的OD值为0.5~0.8之间时结束培养,获得种子菌液;
(2)湿菌制备:取步骤(1)中的种子菌液,以1∶250体积比分别加入LB培养液中,30~32℃、180~220rpm振荡培养45~48小时,然后4000rpm离心10~15min,弃上清得湿菌沉淀;
(3)合剂复配:分别取两种湿菌与相应的菌体保藏液按1g∶40ml配成两种细菌单剂,再将两种细菌单剂按照各菌活菌数量(CFU/ml)比1∶1配成合剂。
其中,步骤(3)所述的合剂中活菌总浓度为1×109~1010cfu/ml。
所述菌体保藏液配制方法为:
1)制备pH 6.8~10,每升含有0.01~0.2mol的无机盐缓冲液或有机盐缓冲液;
2)在上述缓冲液中加入非离子型或天然物表面活性剂,至表面活性剂浓度为0.001~5mol/L即得菌体保藏液。
所述的无机盐缓冲液选自磷酸盐缓冲液、焦磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液;所述的有机盐缓冲液选自甲酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷以及柠檬酸盐有机缓冲液。
所述的非离子型选自聚氧乙基脂肪酸酯、烷基聚氧乙基醚、Tween20等非离子型表面活性剂,天然物表面活性剂选自皂荚以及其它含有环戊烷菲基团的天然物表面活性剂。
本发明所述的CB28合剂在防治黄瓜霜霉病中的应用。
所述的CB28合剂可通过喷雾使用防治病害,也可以通过喷雾和灌根处理。
有益效果
本发明CB28合剂是针对黄瓜霜霉病的生防制剂。由于是生物制剂,完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题,因而能有效保护农田生态系统,实施农业的可持续发展。且生产的黄瓜无农药残留,为绿色黄瓜,食用也大可放心。同时,灌根处理的方式,也可有效控制一些土传病害的发生,减少化学肥料的大量使用。该生防菌剂防效较高,价格较化学农药低,这不仅可为农民节省开支。同时,该菌剂还有促进黄瓜生长、增加产量的功能,生产的黄瓜质量较好可为农民增加收入。
室内孢子囊萌发试验表明,CB28合剂对霜霉病菌的孢子囊萌发有明显的抑制作用;离体叶片试验显示,CB28合剂对霜霉病的控制有明显作用;日光大棚试验表明:CB28合剂能有效控制霜霉病菌对黄瓜的侵染,抑制孢子囊萌发,达到控制病情发生的效果。
该菌剂用湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂,可室温保存2~3年。
生物样品保藏信息
巨大芽孢杆菌(Bacillus meqaterium)BS13,于2011年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所,菌种保藏号为CGMCC NO.4734。
肠杆菌(Enterobacter sp.)BJN15,于2011年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所,菌种保藏号为CGMCC NO.4733。
具体实施方式
实施例1
菌株来源:BS13由广东省东莞麻涌的香蕉根围土壤中分离得到;BJN15由广东省东莞市麻涌的香蕉假茎中分离得到。
菌株分离方法:平板稀释法(中国科学院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京:科学出版杜,1985.)
菌株筛选依据:水解五种酶活性(蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、嗜铁素、IAA测定Yang J.-H.,Liu H.~X.,Zhu G.-M.,Xu L.-P.,Pan Y.-L.,and Guo J.-H.*.2008.Diversity analysis of antagonistsfrom rice associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases.Journal of AppliedMicrobiology.104(1):91~104.)和对疫霉病病菌拮抗活性的测定(对峙培养法,林福呈,李德堡.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报,2003,33(2):174~177.),通过细菌的赋值评估(Faltin等,2004),最终选择BS13和BJN15作为本合剂的有效细菌成分。
菌株鉴定方法:鉴定方法为16Sr DNA基因片段序列测序。
表1:测序比对结果
BS13(CGMCC NO.4734)在PDA平板上,菌株幼龄时期菌落圆形、突起、表面光滑和有光泽、湿润、半透明、粘稠、易挑取。随着培养时间的延长菌落粘性降低,表面光泽变暗,长时间培养变成浅褐色,易挑取。营养肉汤液体试管培养菌体聚集形成沉淀。在菌体形态上,采用碱性复红简单染色,显微镜下观察到菌株两端钝圆,多以成对出现:美兰染色观察,细胞内有多个不着色的颗粒,革兰氏染色阳性,部分两端着色较重,始时芽孢近端生、圆形,随着培养时间的延长,芽孢扩大呈椭圆形,芽孢囊不膨大,无伴孢晶体。
BJN15(CGMCC NO.4733)在LB培养基上10h产生单菌落,培养24h菌落乳白色,质地均一,圆形,湿润,中间隆起,表面光滑,菌体为短直杆状,G-。
实施例2
一种防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂,含两种细菌成分:分别是巨大芽孢杆菌BS13(CGMCC NO.4734)和肠杆菌BJN15(CGMCC NO.4733)。
该防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂的制备方法如下:
(1)种子菌液的培养:分别将保藏号为CGMCC NO.4734的巨大芽孢杆菌BS13和保藏号为CGMCC NO.4733的肠杆菌BJN15接种到LB培养液中,在30~32℃、180~220rpm条件下培养至600nm处的OD值为0.5~0.8之间时结束培养,获得种子菌液;
(2)湿菌制备:取步骤(1)中的种子菌液,以1∶250体积比分别加入LB培养液中,30~32℃、180~220rpm振荡培养45~48小时,然后4000rpm离心10~15min,弃上清得湿菌沉淀;
(3)菌体保藏液制备:
a.巨大芽孢杆菌BS13菌体保藏液的制备:pH6.8,0.03mol/L的磷酸盐缓冲液,向其中加入Tween20至Tween20在缓冲液中的终浓度为0.02mol/L即得巨大芽孢杆菌BS13的菌体保藏液。
b.肠杆菌BJN15菌体保藏液的制备:pH7.0,0.15mol/L的Tris缓冲液,向其中加入聚氧乙基脂肪酸酯至聚氧乙基脂肪酸酯在缓冲液中的终浓度为0.01mol/L即得肠杆菌BJN15的菌体保藏液。
(4)合剂复配:取(2)中制备的巨大芽孢杆菌BS13湿菌与(3)中制备的巨大芽孢杆菌BS13菌体保藏液按1g∶40ml配成巨大芽孢杆菌BS13细菌单剂。取(2)中制备的肠杆菌BJN15湿菌与(3)中制备的肠杆菌BJN15菌体保藏液按1g∶40ml配成肠杆菌BJN15细菌单剂。再将两种细菌单剂按照各菌活菌数量(CFU/ml)比1∶1配成合剂,合剂中活菌总浓度为1×109CFU/ml。
实施例3室内孢子囊萌发试验
方法:玻片培养法(参考文献:NY/T 1156.1-2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第1部分:抑制病原真菌孢子萌发试验凹玻片法):将按照实施例2方法制备的CB28合剂菌液配制成相应浓度,分别滴加在灭菌的载玻片上,然后往菌液中滴加10μl配制好的霜霉病菌孢子囊悬浮液,浓度为105个孢子囊/ml,每个处理4个重复,以灭菌的清水作为对照,置于25℃光照培养箱培养48h后观察孢子囊萌发率,镜检以视野中30个孢子囊为准,观察标准为芽管长度大于霜霉病菌孢子囊宽度的1/2,计算公式为抑制率%=(清水处理孢子囊萌发率-生防菌处理组孢子囊萌发率)*100/清水处理孢子囊萌发率
霜霉病病原菌Pseudoperonospora cubensis(Berkely et Curtis)Rosto wzew,公知公用,见参照文献“汤钿.葡萄霜霉病离体接种方法的研究[J]微生物学通报,1994,(06).”。
病菌孢子囊悬浮液制备方法(参考文献:杜兴兰.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北农业大学,2008):傍晚采集发病严重的新鲜黄瓜霜霉病病叶(近几天未施过农药),用冰壶带回实验室,冲去叶面上的杂物和原有的抱子囊,用浸水的脱脂棉包住叶柄,置于18℃培养箱中黑暗保湿培养,24h后待长出新鲜孢子囊。用无菌水刷取新长出的孢子囊,双层纱布过滤,12000rpm 15min离心,弃去上清液,用灭菌水稀释至105个孢子囊/ml,在18℃培养箱中黑暗培养2-3h,待有大量游动孢子囊出现时使用。
结果显示,CB28合剂对霜霉病菌孢子囊的萌发有明显的抑制作用,如表2所示。
表2:CB28合剂对黄瓜霜霉病菌孢子囊抑制效果
实施例4离体叶片试验
从育苗地直接采取黄瓜移栽5-20d新鲜叶片用自来水冲洗、晾干,尽量打成直径为1cm的叶圆盘,每叶圆盘背面朝上,放入灭菌的培养皿中,培养皿中放一张用2mL无菌水浸湿的滤纸保湿,每皿9个叶圆盘,每个处理重复3次,每个叶圆盘中央接一滴10μl配好的霜霉病菌孢子囊悬浮液(浓度为105个孢子囊/ml),置于25℃的生化培养箱中培养,对照发病时进行记录。
根据GB/T17980.26-2000《杀菌剂防治黄瓜霜霉病田间药效试验准则(一)》的黄瓜霜霉病分级标准:0级:无病斑,1级,病斑面积占整个叶面积的5%以下;3级,病斑面积占整个叶面积的6%~10%;5级,病斑面积占整个叶面积的11%~25%,7级,病斑面积占整个叶面积的26%~50%;9级,病斑面积占整个叶面积的50%以上。
调查方法:每株的每片叶子都调查,新叶也调查。
病害严重度%=[∑(病级叶片数×代表级数)/总叶片数×最高代表级值]×100;
生物防治效果%=(对照病害严重度-处理病害严重度)/对照病害严重度×100
以下实施例中的病害严重度和生物防治效果(简称防效)皆同此计算方法。
将叶圆盘在实施例2制备的CB28合剂菌悬液中浸泡5min取出后自然条件晾干,然后接种霜霉病菌孢子囊悬浮液,以无菌水为阴性对照,霜霉威为阳性对照,每个处理重复3次。置于25℃的生化培养箱中培养。接种病原菌后8日统计病害严重度及防效,结果显示:CB28合剂对黄瓜霜霉病预防效果为77.57%,如表3。
表3:CB28合剂对黄瓜霜霉病防治预防效果(8d)
实施例5实验室温室试验
本实验黄瓜品种采用“津优35”,待长出8片真叶时开始喷施处理药剂,设3个处理组,处理药剂分别为:A:用清水40倍稀释的实施例2制备的CB28合剂;B:20%霜霉威水剂;C:清水对照。每处理设4个重复,每个重复24棵苗。喷施处理药剂后5d接种霜霉病菌孢子囊,浓度为105个孢子囊/ml,接种后8d时对照组发病。
调查病害严重度并计算防效,生防效果为69.04%,如表4。
表4:CB28合剂对黄瓜霜霉病防治试验效果(8d)
实施例6日光大棚田间试验
实验地点一:淮安市丁集镇黄瓜日光大棚
黄瓜品种为“津优35”。大田试验选择在淮安市丁集镇黄瓜日光大棚,共设3个处理组,处理药剂分别为:A:用清水100被稀释的实施例2制备的CB28合剂;B:20%霜霉威水剂;C:清水对照。每处理设4个重复小区,每个重复60棵苗,各小区采用随机区组排列,小区之间以保护行隔离。施药方法采用小喷壶精细喷雾至每片黄瓜叶子上,主要喷施叶子背面;以及喷雾和灌根处理同时进行两种方法。
移栽后20d(长出5-6片真叶)喷施处理药剂,采用一定农用措施,控制好大棚温湿度,大棚出现霜霉病情开始调查。
数据显示,喷雾处理此合剂对黄瓜霜霉病防效为66.89%,而喷雾和灌根同时处理则相应提高了防效为70.26%,如表5。
表5:CB28合剂对黄瓜霜霉病防治效果(处理8d)
注:sp表示采用喷雾处理;ss表示采用喷雾和灌根处理同时进行,CB28合剂稀释100倍,灌根处理时每株黄瓜苗100ml。
实验地点二:淮安市柴米河公司黄瓜日光大棚
黄瓜品种为“津春5号”。共设3个处理组,处理药剂分别为:A:用清水100被稀释的实施例2制备的CB28合剂;B:20%霜霉威水剂;C:清水对照。每处理设4个重复小区,每个重复60棵苗,各小区采用随机区组排列,小区之间以保护行隔离。施药方法采用小喷壶精细喷雾至每片黄瓜叶子上,主要喷施叶子背面;以及喷雾和灌根处理同时进行两种方法。
移栽后20d(长出5-6片真叶)喷施处理药剂,采用一定农用措施,控制好大棚温湿度,大棚出现霜霉病情开始调查。
数据显示,喷雾处理此合剂对黄瓜霜霉病防效为62.81%,而喷雾和灌根同时处理则相应提高了防效为65.91%,如表6。
表6:CB28合剂对黄瓜霜霉病防治效果(处理7d)
注:sp表示采用喷雾处理;ss表示采用喷雾和灌根处理同时进行,CB28合剂稀释100倍,灌根处理时每株黄瓜苗100ml。
实施例7:温室促生试验
选用4-5叶期的黄瓜苗,生防菌处理组,每株苗用25ml浓度为108CFU/ml的按照实施例2方法制备的CB28合剂灌根和喷雾处理,对照组用清水处理,每个处理48棵苗,每处理重复4次。30d天后测量苗株高、茎围及鲜重等指标并计算生物量增加,计算各组生物量增加,结果见表7。
生物量增加=[(处理平均鲜重-对照平均鲜重)/对照平均鲜重]×100%
表7:CB28合剂对黄瓜的温室促生效果
注:*不同英文字母表示处理间在P=0.05水平上差异性显著(Duncan’test)
实施例8日光大棚促生效果统计
黄瓜品种为津优“35”,共设3个处理:A:用清水100被稀释的实施例2制备的CB28合剂,在黄瓜移栽当天灌根和喷雾处理;B:20%霜霉威水剂,在黄瓜移栽当天喷雾处理;C:清水对照,在黄瓜移栽当天喷雾处理。在黄瓜移栽后第30天、60天进行日光大棚田间促生效果的调查,每个处理4个重复小区。每小区按照5点取样法随机取5株进行最大叶面积cm2(从黄瓜茎顶端向下第4-5节黄瓜植株当时最大叶片面积),茎粗(黄瓜茎顶端自上向下第五节处茎粗),叶片数、挂果数,以及成果率的调查统计。同时从采收开始分别对不同处理组进行产量统计。从采收开始分别对小区产量进行登记,并统计小区总产量。
增产率(%)=(药剂处理后黄瓜产量-空白对照产量)/空白对照产量×100
从表8、表9可见,处理30天时,合剂CB28对黄瓜地上部分的促生作用明显。处理60天时挂果数较空白对照增加17.86%。从表10可见,处理60天时,合剂CB28对黄瓜的增产率达49.33%,显著高于对照药剂霜霉威。
表8:不同处理黄瓜30天时后促生效果
表9:不同处理黄瓜60天时促生效果
表10:黄瓜单果和产量测定
Claims (7)
1.一种防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂,其特征在于含两种有效细菌成分:分别是巨大芽孢杆菌(Bacillus meqaterium)BS13,于2011年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为CGMCC NO.4734;肠杆菌(Enterobacter sp.)BJN15,于2011年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为CGMCC NO.4733;该合剂中所述的保藏号为CGMCC NO.4734的巨大芽孢杆菌BS13与保藏号为CGMCC NO.4733的肠杆菌BJN15的活菌数量比为1∶1,总活菌总浓度为1×109~1010cfu/ml。
2.权利要求1所述的防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂的制备方法,其特征在于包含如下步骤:
(1)种子菌液的培养:分别将保藏号为CGMCC NO.4734的巨大芽孢杆菌BS13和保藏号为CGMCC NO.4733的肠杆菌BJN15接种到LB培养液中,在30~32℃、180~220rpm条件下培养至600nm处的OD值为0.5~0.8之间时结束培养,获得种子菌液;
(2)湿菌制备:取步骤(1)中的种子菌液,以1∶250体积比分别加入LB培养液中,30~32℃、180~220rpm振荡培养45~48小时,然后4000rpm离心10~15min,弃上清得湿菌沉淀;
(3)合剂复配:分别取两种湿菌与相应的菌体保藏液按1g∶40ml配成两种细菌单剂,再将两种细菌单剂按照各菌活菌数量(CFU/ml)比1∶1配成合剂。
3.根据权利要求2所述的防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂的制备方法,其特征在于步骤(3)所述的合剂中活菌总浓度为1×109~1010cfu/ml。
4.根据权利要求2所述的防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂的制备方法,其特征在于,所述的菌体保藏液通过如下方法制备:
1)制备pH 6.8~10,每升含有0.01~0.2mol的无机盐缓冲液或有机盐缓冲液;
2)在上述缓冲液中加入非离子型或天然物表面活性剂,至表面活性剂浓度为0.001~5mol/L即得菌体保藏液。
5.根据权利要求4所述的防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂的制备方法,其特征在于所述的无机盐缓冲液选自磷酸盐缓冲液、焦磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液;所述的有机盐缓冲液选自甲酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷以及柠檬酸盐有机缓冲液。
6.根据权利要求4所述的防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂CB28合剂的制备方法,其特征于所述的非离子型选自聚氧乙基脂肪酸酯、烷基聚氧乙基醚、Tween20,天然物表面活性剂选自皂荚以及其它含有环戊烷菲基团的天然物表面活性剂。
7.权利要求1所述的CB28合剂在防治黄瓜霜霉病中的应用。
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