CN102321561A - 防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株cyw72及其应用 - Google Patents
防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株cyw72及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物保护技术领域，涉及防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CYW72及其应用。菌株CYW72，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4737。一种生防菌剂，以所述的保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分，其中CYW72活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。将该菌剂稀释100-1000倍后在日光温室大棚黄瓜移栽20d用菌剂CYW72喷雾处理，8d时对黄瓜霜霉病的防效达到60.50％；而喷雾/灌根同时处理防效达到65.20％。肠杆菌CYW72可在制备防治温室大棚黄瓜霜霉病的药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CYW72及其应用。
背景技术
黄瓜霜霉病在我国各地普遍发生其病原菌为专性寄生菌，其孢子囊可随风雨、黄瓜甲虫、农器具等进行传播，是一种主要的气传病害。
随着我国温室大棚面积急剧增加，反季节黄瓜大棚栽培种植大批量出现，使得其病菌一年四季可以侵染黄瓜；发病严重时，全叶呈黄褐色干枯，最后导致植株干枯早死，缩短收瓜期，严重影响黄瓜产量，损失可达20％到60％，此病害是温室大棚影响黄瓜产量的主要制约因素之一。
此病害农民主要是依照经验来喷施化学药剂，一周喷施一次化学药剂，交替选择不同种类药剂。这样依然极易使得病原菌对多种化学药剂产生交互抗性。故不少目光转移到绿色、生态产品生物农药上，如克菌康、武夷菌素等，活体的生防菌剂主要有芽孢杆菌和假单胞类，但大多处于实验室研究开发阶段，登记注册的微乎其微。且因霜霉病是活体寄生菌，大多完成简单的室内测定试验，在我国主要黄瓜栽培区进行日光温室或者露天试验药效广谱性测试的生防研究微乎其微。综上所述，开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂控制黄瓜霜霉病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全可持续发展的需要，符号社会发展需求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中没有对黄瓜霜霉病有较高防效的生防制剂的现状，提供一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CYW72。
本发明的另一目的是提供该菌株的应用。
本发明的又一目的是提供含有该菌株的菌剂及其制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CYW72，为肠杆菌(Enterobacter sp.)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO 4737。
所述的保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72在制备防治温室大棚黄瓜霜霉病的药物中的应用。
一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂，以所述的保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分，其中肠杆菌CYW72的活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
所述的防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂的制备方法，包含如下步骤：1)CYW72种子菌液的培养：将权利要求1所述的菌株CYW72接种到LB培养液中30℃200rpm振荡培养18-24h，12～16小时后定期取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值均在0.5～0.8之间时结束培养，获得种子菌液；2)CYW72菌剂的制备：将CYW72种子菌液以1∶100体积比加入装有发酵培养液的发酵罐中(此处的1∶100体积比指种子菌液与发酵培养液的体积比为1∶100)，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5～7m3/小时，罐压0.05～0.1KPa。然后6000rpm离心10min，每1000ml培养液获得10～15g湿菌，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成以菌株CYW72为有效成分的生防菌剂，活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
其中，所述的CYW72发酵培养液：麦芽糖1.0g/L，玉米粉2.4g/L，黄豆粉2.4g/L，胰蛋白胨2.0g/L，二水氯化钙0.12g/L，一水硫酸锰0.12g/L，磷酸氢二钾0.18g/L，调节pH值为7.2～7.4。
所述的菌体保藏液制备方法为：pH7.0，0.15mol/L的Tris缓冲液，向其中加入聚氧乙基脂肪酸酯至聚氧乙基脂肪酸酯在缓冲液中的终浓度为0.01mol/L即得菌体保藏液。
本发明的有益效果：
本发明是专门针对黄瓜霜霉病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于温室大棚蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于蔬菜的出口。温室实验表明：该菌制剂能显著降低黄瓜霜霉病的发生。所述的以保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分的生物菌剂稀释100-1000倍后在黄瓜移栽后4叶期开始进行喷雾处理或者喷雾/灌根处理，在天气因子适合黄瓜霜霉病流行前期，10d/7d一个间隔周期使用一次，对黄瓜霜霉病的防效可分别达到为64.75％和69.70％。
生物样品保藏信息
防治温室大棚黄瓜霜霉病的菌株CYW72，分类命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4737，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。
具体实施方式
实施例1
菌株来源：CYW72由广东省东莞市麻涌的香蕉根围土中分离得到。
菌株分离方法：平板稀释法(中国科学院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京：科学出版杜，1985.)
菌株筛选依据：检测菌株水解五种酶活性(蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、嗜铁素、IAA测定Yang J.-H.，Liu H.～X.，Zhu G.-M.，Xu L.-P.，Pan Y.-L.，and Guo J.-H.*.2008.Diversityanalysis of antagonists from rice associated bacteria and their application in biocontrol of ricediseases.Journal of Applied Microbiology.104(1)：91～104.)和对疫霉菌颉颃作用(对峙培养法，林福呈，李德堡.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003，33(2)：174～177.)，通过细菌的赋值评估(Faltin等，2004)，最终选择赋值评估分值靠前的CYW72作为有效细菌成分，并送交CGMCC保藏，保藏号为CGMCC NO.4737。
菌株鉴定方法：鉴定方法为16S r DNA基因片段序列测序。
鉴定结果见表1：
表1：测序比对结果
实施例2生防菌剂制备
(1)种子菌液的培养：将CYW72(CGMCC NO.4737)接种到发酵培养液中，在30℃200rpm振荡培养18-24h培养，16h后每隔3h取样在超净工作台中测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值均在0.5～0.8之间时结束培养，获得种子菌液；
(2)湿菌制备：将种子菌液以1∶100体积比加入装有200L发酵培养液的发酵罐中，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5～7m3/小时，罐压0.05～0.1KPa。然后6000rpm离心10min，每1000ml培养液获得10～15g湿菌，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成菌株CYW72菌剂，活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
其中，CYW72发酵培养基配方：麦芽糖1.0g/L，玉米粉2.4g/L，黄豆粉2.4g/L，胰蛋白胨2.0g/L，二水氯化钙0.12g/L，一水硫酸锰0.12g/L，磷酸氢二钾0.18g/L，调节pH值为7.2～7.4；CYW72菌体保藏液的制备方法为：pH7.0，0.15mol/L的Tris缓冲液，向其中加入聚氧乙基脂肪酸酯至聚氧乙基脂肪酸酯在缓冲液中的终浓度为0.01mol/L即得肠杆菌CYW72的菌体保藏液。
实施例3室内孢子囊萌发试验
方法：玻片培养法(参考文献：NY/T 1156.1-2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第1部分：抑制病原真菌孢子萌发试验凹玻片法)：将实施例2制备的以保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分的生防菌剂配制成相应浓度，分别滴加在灭菌的载玻片上，然后往菌液中滴加10μl配制好的霜霉病菌孢子囊悬浮液，浓度为105个孢子囊/ml，每个处理4个重复，以灭菌的清水作为对照，置于25℃光照培养箱培养48h后观察孢子囊萌发率，镜检以视野中30个孢子囊为准，观察标准为芽管长度大于霜霉病菌孢子囊宽度的1/2，计算公式为抑制率％＝(清水处理孢子囊萌发率-生防菌处理组孢子囊萌发率)×100/清水处理孢子囊萌发率。
霜霉病病原菌Pseudoperonospora cubensis(Berkely et Curtis)Rosto wzew，公知公用，见参照文献“汤钿.葡萄霜霉病离体接种方法的研究[J]微生物学通报，1994，(06).”。
病菌孢子囊悬浮液制备方法(参考文献：杜兴兰.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北农业大学，2008)：傍晚采集发病严重的新鲜黄瓜霜霉病病叶(近几天未施过农药)，用冰壶带回实验室，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，用浸水的脱脂棉包住叶柄，置于18℃培养箱中黑暗保湿培养，24h后待长出新鲜孢子囊。用无菌水刷取新长出的孢子囊，双层纱布过滤，12000rpm 15min离心，弃去上清液，用灭菌水稀释至105个孢子囊/ml，在18℃培养箱中黑暗培养2-3h，待有大量游动孢子囊出现时使用。
结果显示，以保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分的生防菌剂对霜霉病菌孢子囊的萌发有明显的抑制作用，如表2所示。
表2：CYW72菌剂对黄瓜霜霉病菌孢子囊抑制效果
实施例4实验室温室试验
本实验黄瓜品种采用“晚秋”，待长出8片真叶时开始处理喷雾处理。设3个处理组，分别为：A：用清水40倍稀释的实施例2制备的以保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分的生防菌剂(简称CYW72菌剂)；B：20％霜霉威水剂；C：清水对照。每处理设4个重复，每个重复24棵苗。喷施处理药剂后5d接种霜霉病菌孢子囊，浓度为105个孢子囊/ml，接种后8d时对照组发病。
调查病害严重度并计算防效，数据显示，以保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分的生防菌剂生防效果为60.65％，如表3。
表3：CYW72防治黄瓜霜霉病生防效果(8d)
实施例5温室日光大棚试验
实验地点一：淮安市丁集镇黄瓜日光温室大棚
黄瓜品种为“津优35”。设2个处理组，分别为：A：用清水100倍稀释的实施例2制备的以保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分的生防菌剂(简称CYW72菌剂)；B：清水对照。每处理设4个重复小区，每个重复60棵苗，各小区采用随机区组排列，小区之间以保护行隔离。施药方法采用小喷壶精细喷雾至每片黄瓜叶子上，主要喷施叶子背面；以及喷雾和灌根处理同时进行两种方法。移栽后20d(长出5-6片真叶)喷施处理药剂，采用一定农用措施，控制好大棚温湿度，大棚出现霜霉病情开始调查。
根据GB/T17980.26-2000《杀菌剂防治黄瓜霜霉病田间药效试验准则(一)》的黄瓜霜霉病分级标准：0级：无病斑，1级，病斑面积占整个叶面积的5％以下；3级，病斑面积占整个叶面积的6％～10％；5级，病斑面积占整个叶面积的11％～25％，7级，病斑面积占整个叶面积的26％～50％；9级，病斑面积占整个叶面积的50％以上。
调查方法：每株的每片叶子都调查，新叶也调查。
病害严重度％＝[∑(病级叶片数×代表级数)/总叶片数数×最高代表级值]×100；
生物防治效果％＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100
数据显示，以保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分的生防菌剂喷雾处理对黄瓜霜霉病防效为60.50％，而喷雾和灌根处理防效提高到了65.20％。
表4：CYW72菌剂喷雾处理对黄瓜霜霉病生防效果(8d)
表5：CYW72菌剂灌根/喷雾处理对黄瓜霜霉病生防效果(8d)
实验地点二：淮安市柴米河公司黄瓜日光温室大棚
黄瓜品种为“津春5号”。共设3个处理组，处理药剂分别为：A：用清水100倍稀释的实施例2制备的以保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分的生防菌剂(简称CYW72菌剂)；B：20％霜霉威水剂；C：清水对照。每处理设4个重复小区，每个重复60棵苗，各小区采用随机区组排列，小区之间以保护行隔离。施药方法采用小喷壶精细喷雾至每片黄瓜叶子上，主要喷施叶子背面；以及喷雾和灌根处理同时进行两种方法。
移栽后20d(长出5-6片真叶)喷施处理药剂，采用一定农用措施，控制好大棚温湿度，大棚出现霜霉病情开始调查。
数据显示，喷雾处理此菌剂对黄瓜霜霉病防效为58.79％，而喷雾和灌根处理防效为60.82％，如表6。
表6：CYW72对黄瓜霜霉病防治效果(处理7d)
注：sp表示采用喷雾处理；ss表示采用喷雾和灌根处理同时进行，CYW72菌剂稀释100倍，灌根处理时每株黄瓜苗100ml。
Claims (6)
1.一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CYW72，为肠杆菌(Enterobacter sp.)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4737。
2.权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72在制备防治温室大棚黄瓜霜霉病的药物中的应用。
3.一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂，其特征在于以权利要求1所述的保藏号为保藏号为CGMCC NO.4737的肠杆菌CYW72为有效成分，其中肠杆菌CYW72的活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
4.权利要求3所述的防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
1)CYW72种子菌液的培养：将权利要求1所述的菌株CYW72接种到LB培养液中30℃200rpm振荡培养18-24h，12～16小时后定期取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值均在0.5～0.8之间时结束培养，获得种子菌液；
2)CYW72菌剂的制备：将CYW72种子菌液以1∶100体积比加入装有发酵培养液的发酵罐中，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5～7m3/小时，罐压0.05～0.1KPa。然后6000rpm离心10min，每1000ml培养液获得10～15g湿菌，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成以菌株CYW72为有效成分的生防菌剂，活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的CYW72发酵培养液：麦芽糖1.0g/L，玉米粉2.4g/L，黄豆粉2.4g/L，胰蛋白胨2.0g/L，二水氯化钙0.12g/L，一水硫酸锰0.12g/L，磷酸氢二钾0.18g/L，调节pH值为7.2～7.4。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的菌体保藏液制备方法为：pH7.0，0.15mol/L的Tris缓冲液，向其中加入聚氧乙基脂肪酸酯至聚氧乙基脂肪酸酯在缓冲液中的终浓度为0.01mol/L即得菌体保藏液。
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Effective date of registration: 20171115 Address after: Magi Road, Changshou City high tech Industrial Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province, No. 88 215501 Patentee after: Changshu Zijin Intellectual Property Service Co., Ltd. Address before: 223300 Huaian Changjiang Road, Huaiyin District, Jiangsu, No. 111 Patentee before: Huaiyin Normal College |
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