CN1351652A - 用于控制植物疾病的短小芽孢杆菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的产抗生素芽孢杆菌菌种,其仅对特定植物病原体显示抗真菌活性而无抗细菌活性,本发明还提供了具有该菌株的所有鉴定特征的生物纯的菌株培养物。本发明还提供了一种通过施用有效量的这些菌株、这些菌株产生的上清、或从这些菌株中分离的代谢物,而治疗或保护植株、果实和根免受真菌感染的方法。本发明进一步包括联合使用NRRL保藏号B－30087和B－21661(AQ713)菌株的协同杀真菌效用。

Description

用于控制植物疾病的短小芽孢杆菌菌株
相关发明的交叉引用
本发明是1999年3月30日申请的美国专利申请系列号09/281,360的部分继续申请，以及1999年12月14日申请的美国专利申请系列号09/461,700的部分继续申请，这两个专利申请的内容并入本发明作为参考。
发明领域
本发明涉及生物杀虫剂领域。尤其是，本发明涉及一种NRRL保藏号为B-30087的新的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的发现，它能在体内抑制广泛的真菌植物疾病。本发明还涉及含有这种新的芽孢杆菌菌株的杀真菌组合物，和这种菌株产生的抗生素及该菌株的纯化和未纯化组分，所述组分可联合使用其它化学和生物学杀虫剂剂。本发明进一步还涉及联合使用NRRL保藏号B-30087和NRRL保藏号B21661(CCRC910106)的协同杀真菌效用。
背景
众所共知许多种微生物显示有利于控制植物疾病的生物活性。尽管在研究和发展控制各种具有农学和园艺学重要性的植物疾病领域取得了进步，但大部分使用的除害剂仍是合成的化合物。许多这些化学杀真菌制剂经环境保护协会(EPA)鉴定是致癌剂，对野生和其它非目的种有毒性。另外，病原体会对化学除害剂产生抗性。参见，例如Schwinn等《植物病理学进展》：Phytopathora infestans，马铃薯晚期枯萎的致病因，p244，学院出版，圣地亚哥，加利福尼亚(1991)。
相对于合成化学杀真菌制剂生物控制是一种诱人的选择。生物杀虫剂(有生命的生物体和这些生物体产生的化合物)更安全，更易于生物降解，并且它的发展没有合成昂贵。
一种常用的生物杀虫剂是革兰氏阳性苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。已知作为除害剂的苏云金芽孢杆菌菌株在芽孢形成时期可产生晶体蛋白，这种蛋白对特定序列和种类的昆虫和线虫有特异的毒性(参考，例如美国专利4,999,192和美国专利5,208,017)。苏云金芽孢杆菌产生的蛋白内毒素可发挥抗谷类食根虫和其它甲虫的杀虫剂作用(例如美国专利5,187,09和Johnson，T.J等(1993)，《经济昆虫学杂志》(J.Econ.Entomol.)86：330-333)。无论是纯化的晶体，洗过的细胞碎片和表达的蛋白，苏云金芽孢杆菌内毒素均显示是有效用的。Warren等WO96/10083，发现非内毒素蛋白产生于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和苏云金芽孢杆菌的无性繁殖期。这些无性繁殖蛋白，称作Vip11和Vip12具有潜在的抗谷类食根虫的活性(northern和western)。参考，Estruch等(1997)，《自然-生物技术》(Nature-Biotechnology)15：137-141。
一种苏云金芽孢杆菌的热稳定代谢物，β-外毒素也显示有杀虫剂的特性。Burgjeron和Biache(1979)，《食虫动物》(Entomophaga)11：279-284，报道了一种具有抗科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)活性的β-外毒素。另外，已知的苏云金芽孢杆菌β-内毒素显示有非特异的杀虫活性，不仅可杀死线虫，还可杀死苍蝇，黏虫，螨和谷类食根虫。Sigma外毒素与β-外毒素结构相似，并具有抗科罗拉多马铃薯甲虫的活性。参考，Argauer等(1991)，《昆虫协会杂志》(J.Entomol.Sci)：26：206-213。Alpha-外毒素对家蝇幼虫有毒性(Cluthy(1980)，FEMS微生物学通信(FEMSMicrobiol.Lett)8：1-7)。γ-外毒素是多种蛋白分解酶，壳多糖酶，和蛋白酶。γ-外毒素的毒性效应仅在与β-外毒素或δ-内毒素共同使用时才会表现出来。参考，Forsberg，C.，“苏云金芽孢杆菌：对环境质量的影响”加拿大国家研究委员会(National Research Council ofCanada)，出版号NRCC 15385，pp.91-109(1976)。Stonard等(1994)，ACS专题论丛系列(ACS Symposium Series)551：25，报道存在于蜡样芽孢杆菌菌株上清中的一种水溶性次生代谢物具有抗谷类食根虫的活性。
Zwittermicin A是一种水溶性的，酸稳定的线性多胺基分子(参考，He等，(1994)，Tetrahedron Lett 35：(16)：2499-2502)具有抗多种真菌类和细菌类植物病原体的广谱活性。已知Zwittermicin A能增强苏云金芽孢杆菌的活性。Manker等(WO96/39037)首次发现zwittermicin A增强苏云金芽孢杆菌的能力和特征。后来，Schnepf等也报道了zwittermicin A增强苏云金芽孢杆菌的作用(美国专利5,702,703)。
已知芽孢杆菌能够产生抗真菌和抗细菌的次生代谢物。参考，Korzybski等“从芽孢杆菌属(芽孢杆菌科)分离的抗生素)”发表于《抗生素-起源，自然和特性》，美国微生物协会，华盛顿，D.C.Vol.III(1978)，和Berdy，《抗生素化合物CRC手册》(CRC Handbook ofAntibiotic Compounds)，Vols.I-XIV，CRC出版，有限公司(Inc)，Boca Raton，FL(1980-87)。短小芽孢杆菌产生的化合物包括细小菌素P，短小菌素，和提坦菌素。
Kawaguchi等，美国专利4,250,170，从杆菌中分离了一种具有广谱抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌活性的新的水溶性抗生素。Stabb等(1990)《应用环境微生物学》(Applied Environ.Microbiol)60：4404-4412，已经鉴定了某些显示有抗真菌活性的芽孢杆菌菌种(芽孢杆菌菌种包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，蜡样芽孢杆菌(B.cereus)，蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)，苏云金芽孢杆菌)的菌株。这些菌株可以产生zwittermicin A和/或卡那霉素水解物。参考，Milner等，《应用环境微生物学》(Appl.Environ.Microb.)62：3061-3066(1996)。这些抗生素制剂是能够有效的抗苜蓿食植动物(Phytopathoramedicaginis)，烟草食植动物(P.nicotianae)，P.aphanidermatum或Sclerotinia minor导致的土生植物幼苗腐烂病症(参考，Stabb等，上述)。Zwittermicin-A是水溶性的，酸稳定性的多胺基分子。参考He等，(1994)Tetrahedron Lett.35(16)：2499-2502。它具有抗多种真菌和细菌植物病原体的广谱活性。卡那霉素水解物(Melner等，1996)也可抑制广泛范围的真菌植物病原体和一些细菌种属。
Handelsman等，美国专利5,049,379，说明了产生zwittermicin A的蜡样芽孢杆菌如何控制紫花苜蓿和大豆的幼苗腐烂病症。如果在种子外层包裹蜡样芽孢杆菌ATCC53522，可以抑制根腐烂真菌的致病活性。相同的，将特定蜡样芽孢杆菌菌株以芽孢的基本形式施用于大豆种子或施用于种子周围的土壤里可以改善试验田中大豆的产量。参考，Osburne等(1995)美国病理学协会(Am.Phytopathol.Soc.)79(6)：551-556。使用生物杀虫剂的方法是本领域所熟知的，包括，例如可湿的粉剂，可流动的干粉，微囊，和微生物的液体形式，全肉汤培养物或从适当的培养物中提取的抗生素组分。参考，例如，美国专利5,061,495 Rossall和美国专利5,049,379 Handelsman等。
Tsuno等(1986)抗生素杂志(J.Antibiotics)XXXIX(7)：1001-1003，报道一种得自短小芽孢杆菌具有体外抗广泛范围细菌的活性的新的氨基糖类抗生素。
SU1817875中Khmel，I.A等(1995)发现一种新的蜡样芽孢杆菌VKM CR-333D菌株，用于控制真菌植物病原体和细菌植物病原体。
Leifer等《应用细菌学杂志》78：97-108(1995)，报道两种杆菌菌株，枯草芽孢杆菌CL17和短小芽孢杆菌CL45，抗葡萄孢属(Botrytis)和抗链格孢属(Alternaria)的抗生素产量。所有肉汤培养基和无细胞过滤物在体外抗葡萄孢属和抗链格孢属的测试中具有活性，和在对Astilbe做的小型植物体内测试中具有抗葡萄孢属的活性。Leifert等(1997)在美国专利5,597,565中说明枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)对抑制收割后产生真菌，甘蓝格链孢菌(Alternaria brassicicola)，灰质葡萄孢菌(Botrytis cinerea)特别有效。他们还说明产生的抗生素存在于无细胞培养液过滤物中和它们在不同pH值下的活性，但是他们没有鉴定这些化合物。从枯草芽孢杆菌中得到的化合物在低pH下丧失活性，然而短小芽孢杆菌抽提物的活性只存在于pH低于5.6时。Leifert等(1998)美国专利5,780,080中说明可以使用枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌菌株处理卷心菜来抑制甘蓝格链孢菌，灰质葡萄孢菌。
Loeffier等(1986)《病理学杂志》115：204-213，说明枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，和凝结芽孢杆菌(B.coagulans)菌株能产生多种具有抗真菌和抗细菌活性的抗生素。短小芽孢杆菌产生杆菌溶素和伊枯草菌素。杆菌溶素是一种分子量为270的很小的化合物只具有抗酵母的活性。伊枯草菌素，可以溶解于极性溶液中，具有广谱抗真菌和抗细菌活性。
在美国专利5,344,647中，Rossall发现枯草芽孢杆菌菌株具有广谱抗真菌活性。另外，Rossall在美国专利5,061,495中涉及一种从枯草芽孢杆菌得到的新的抗生素，它分子量是63,500道尔顿，在pH低于5时发生沉淀，具有抗革兰氏阳性细菌和真菌(葡萄孢属和白粉菌属(Erysiphe))的活性。Sholberg等(1995)《加拿大微生物学杂志》(Can.J.Microbiol)41：247-252，Swinburne等(1975)Trans.Brit.Mycol.Soc，83：487-490，Ferreira等(1991)《病理学》81：283-287和Baker等(1983)《病理学》73：1148-1152。所有发现说明杆菌种属和枯草芽孢杆菌作为针对真菌植物疾病的生物控制剂是有效的。Pusey等(1988)《植物疾病》(Plant Dis)72：622-626，Pusey等美国专利5,047,239，和McKeen等(1986)《病理学》76：136-139说明用枯草芽孢杆菌可以控制收割后果实腐烂。McKeen等，上文，说明与低分子量伊枯草菌素环状多肽相似的抗生素也是枯草芽孢杆菌杀真菌活性的部分原因。
Liu等，美国专利5,403,583发现一种杆菌，(ATCC55000)和一种控制真菌植物病原体的方法，Rhizoctonia solani。Islam和Nandi(1985)《植物疾病防治杂志》92(3)：233-246，说明一种杆菌具有对Drechslera oryzae，稻米褐斑的病因，的拮抗作用。仍是这两位作者，Islam和Nandi(1985)《植物疾病防治杂志》92(#)：233-240，也说明这种杆菌体外拮抗Drechslera oryzae，链格孢(Alternariaalternata)，粉红镰刀菌(Fusarium roseum)的作用。他们讨论了培养物过滤后的三种组分。活性最高的抗生素在水中和甲醇中高度可溶具有在255nm的紫外吸收峰和260nm的鼓包，这一点证明是多氧菌素类脂蛋白。Cook等(1987)“Beltwide棉花产量研究会议”，达拉斯，得克萨斯州，pp43-45，说明使用杆菌悬浮液可以降低由Phymatotrichum omnivorum引发的棉花根腐烂而导致棉花植株死亡的数量。
B’Chir和Namouchi(1988)Revue Nematologiquell(2)：263-266，报道了一种可以刺激线虫捕获真菌从而增强自身捕获线虫能力的短小芽孢杆菌。B’Chir和Belkadhi(1986)Med.Fac.Landbouww.Rijksuniv.Gent 51/3b：1295-1310，讨论了导致柑桔感染的线虫和真菌(镰刀菌属)在细胞内的相互作用。真菌与短小芽孢杆菌相关(它们一起发生)并且当线虫也存在时，真菌更为严重。短小芽孢杆菌似乎为线虫提供了食物。Gokte和Swarup(1988)《印度线虫学杂志》18(2)：3131-318，报道短小芽孢杆菌可杀死线虫，但他们没有报道抗真菌活性。Slabospitskaya等(1992)MikrobiolZh(Kiev)54(6)：16-22，比较了包括短小芽孢杆菌在内的许多不同杆菌产生壳多糖酶的能力，但是它们没有报道抗植物病原体的活性。短小芽孢杆菌的壳多糖酶水平最低。McInroy等(1995)《植物和土壤》173(2)：337-342，研究了多种细菌，包括寄生于植物茎和根中的杆菌和短小芽孢杆菌。然而，他们没有证明这些植物内寄生菌株有抗真菌作用。Chernin等(1995)《分子遗传学》发现一种短小芽孢杆菌有抗导致植物疾病的细菌(例如，黄单胞菌(Xanthomonas)，假单胞菌(Pseudomonas)，欧文菌属(Erwinia))和真菌的广谱作用。Fey等(1991)Akad Landwirts Kart，报道短小芽孢杆菌菌株可以在一定程度上防治种子马铃薯的Rhizoctonia solani感染。
发明内容
本发明提供了一种新的产抗生素的芽孢杆菌菌种，其仅对某些特定的植物病原体表现有抗真菌活性而不表现抗细菌活性。本发明还涉及一种治疗或保护植物，果实和根免受真菌感染的方法，包括的步骤是使用有效量的产抗生素芽孢杆菌。产抗生素芽孢杆菌可以是存在于全肉汤培养物中的悬浮形式或是从产抗生素芽孢杆菌的全肉汤培养物中获得的部分纯化的含抗生素上清。本发明还提供了一种新的显示特异抗真菌活性而无抗细菌活性的水溶性抗生素。
本发明还涉及一种增强苏云金芽孢杆菌杀昆虫活性的新的化合物。此化合物从短小芽孢杆菌的全肉汤培养物或上清中分离出来，当其与苏云金芽孢杆菌结合使用时可以增强杀虫活性。本发明还包括用芽孢杆菌悬浮液或含代谢物的芽孢杆菌培养物上清或纯化的代谢物处理植株以控制植物上或植物体内昆虫侵袭的方法。
本发明进一步涉及联合使用菌株B-30087和菌株B-21661(AQ713)作为杀真菌剂，两种菌株的同时使用比单独使用任何一种都更显示出强大的效用。
附图的简要说明
图1是NRRL保藏号为B-30087的芽孢杆菌的部分纯化的杀真菌组分在D2O中于400MHz记录的核磁共振光谱。
图2显示zwittermicin A在D2O中于400MHz记录的1H核磁共振光谱。
图3A至3C是如实施例9中描述的从芽孢杆菌分离的上清的毛细管电泳图。电泳的条件：40C，30kV使用未包裹的56cm毛细管，正极，pH5.8的磷酸钠缓冲液，100μA，200nm紫外检测。图3A是短小芽孢杆菌B-30087的全肉汤培养物毛细管电泳图。图3B是以zwittermicin A为标准峰值的短小芽孢杆菌全肉汤培养基的毛细管电泳图谱。Zwittermicin A的峰出现在电泳大约3.25分钟时；在全肉汤培养基中没有同时洗脱的任何峰。图3C显示电泳大约3.28分钟的zwittermicin A标准。
图4比较了NRRL保藏号B-30087的部分纯化组分(图4A)，含zwittermicin A的NRRL保藏号B-30087的部分纯化组分(图4B)，和zwittermicinA(图4C)的三种毛细管电泳(CE)分析的电泳图。
图5显示了从B-30087中分离出的具有B+增强物活性的部分纯化活性组分在D2O中于400MHz的1H核磁共振光谱记录。
实施发明的方式
本发明涉及一种具有新的芽孢杆菌菌株和其突变体或变异体的所有鉴别特性的菌株的生物纯培养物，它具有仅抗特定植物病原体如锈霉，粉霉，和霜霉的抗真菌活性。根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，这种新的短小芽孢杆菌菌株于1999年1月14日保藏于农业研究机构保藏中心(NRRL)，1815North University Street，Peoria，III.61604，USA，相应的保藏号是NRRLB-30087。保藏号为NRRL B-21661的菌株于1997年3月7日保藏于该保藏中心，其后来经美国典型培养物保藏中心(ATCC)鉴定是枯草芽孢杆菌。
本发明还包括用这种细菌菌株或含抗生素的上清或从这种细菌菌株中提取的纯抗生素来防止和治疗植物包括植物根部的真菌病变的方法。本发明还包括一种水溶性的分子量小于10,000道尔顿的抗真菌抗生素，其略有热不稳定性，带正电荷，HPLC的紫外吸收峰最大为280nm并在230nm具有肩峰。这种抗生素不是zwittermicinA。
本发明的其他方面包括当与苏云金芽孢杆菌联合使用时增强苏云芽孢杆菌的杀虫活性的短小芽孢杆菌的全肉汤培养物或上清。本发明还包括用芽孢杆菌的细菌悬浮液或含代谢物的芽孢杆菌培养物上清或纯化的代谢物处理植物以控制昆虫侵染植物的方法。
本发明的另一个方面是联合使用短小芽孢杆菌(NRRL B-30087)和枯草芽孢杆菌(NRRL B-21661)菌株作为杀真菌剂时产生的出人意料的协同作用。本发明包括用它们作为杀真菌剂的组合物和方法。
定义
当在说明书和权利要求中使用时，除非上下文清楚地另有规定，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数所指。例如，术语“a cell”包括多数细胞，包括其混合物。
本文所用术语“包含(comprising)”意思是指组合物和方法包括列举的要素，但不排除其它的要素。“基本上由...组成”当用于定义组合物和方法时，应该是指排除其它任何对组合有重要意义的要素。这样，基本上由本文定义的要素组成的组合物不排除分离和纯化方法中的痕量杂质及药用可接受的载体，例如磷酸盐缓冲生理盐水，防腐剂，等。“由...组成”应该是指排除超出其它成分的痕量要素和本发明中施用组合物的基本方法步骤之外的任何事物。用每一个这样的转换术语定义的实施方案属于本发明范围内。
术语“分离”可以与“生物纯”互换使用，意思是指从菌株或代谢物天然相结合的细胞或其它组分中分离。
本文中所使用的“生物控制”定义为使用第二种生物体控制病原体或昆虫。已知的生物控制机制包括肠细菌，其通过与真菌竞争根部表面空间以控制根腐烂。细菌毒素，例如抗生素，已被用于控制病原体。可以分离毒素并直接应用于植物或可使用细菌菌种就地产生毒素。
术语“真菌”包括各种各样成核的产生孢子而无叶绿素II的生物体。真菌的实例包括酵母，霉菌，霉，锈菌，和蕈。
术语“细菌”包括任何没有明显细胞核的原核生物体。
“杀真菌”是指某种物质增加真菌死亡率或抑制其生长率的能力。
“抗生素”包括可以杀死或抑制微生物的任何物质。微生物可以产生抗生素或通过合成或半合成的方法产生抗生素。此术语，因此包括抑制或杀死真菌的物质，例如zwittermicin A或卡那霉素水解物。
“抗真菌剂”包括任何可以杀死或抑制真菌生长的物质。
术语“培养”是指在各种培养基上或培养基中生物体的增殖。
“全肉汤培养物”是指含细胞和培养基的液体培养物。
“上清”是指当生长于肉汤培养基的细胞通过离心，过滤，沉淀，或其它为本领域熟知的方法去除后剩下的液体肉汤培养基。
如本文中所使用的，术语“昆虫”包括“昆虫”纲的所有生物体。“成年期前”昆虫是指生物体在进入成体期前的任何形式，包括，例如卵，幼虫，和若虫。“杀昆虫性”是指物质的提高昆虫死亡率和抑制其生长率的能力。“杀线虫性”是指物质的提高线虫死亡率或抑制其生长率的能力。“杀虫性”是指物质的提高昆虫，线虫和螨的死亡率或抑制它们的生长率的能力。
“阳性对照”是指已知具有杀虫活性的化合物。“阳性对照”包括，但并不局限于，可购买的化学杀虫剂。术语“阴性对照”是指已知的无杀虫活性的化合物。阴性对照的实例有水和醋酸乙酯。
术语“溶剂”包括任何可以溶液形式容纳另一种物质的液体。“可溶剂抽提的”是指任何一种溶解于溶剂中又可以从溶剂中分离出来的化合物。溶剂的实例包括，但不局限于，有机溶剂如醋酸乙酯的。
术语“代谢物”是指任何具有杀虫活性的化合物，物质或微生物发酵的副产品。如上所定义的抗生素是具有抗微生物特异活性的代谢物。
“组合物”的意思是活性剂和另一种惰性(例如，一种可检测试剂或标记)或活性化合物或组合物如佐剂的联合。
“组分”意思是用于通过大小，极性或电荷分离上清分子的分级分离分析收集的一个等分。
“部分纯化的组分”是从分离分析中收集的一个等分，它可以在生物分析中抑制萌发或增强抗lepioloplaus的B+活性。
“有效量”是足以达到有益的或希望的结果的量。有效量可以一次或多次使用。在提到治疗和防治时，“有效量”是足以减轻，稳定，逆转，减慢或延迟昆虫侵袭进程的量。
我们描述了一种菌株的生物纯培养物，其具有NRRL保藏号为B-30087的新的产抗生素芽孢杆菌菌株及其仅对特定植物病原体具有抗真菌活性而无抗细菌活性的突变体的所有鉴定活性。在一方面，这种菌株是NRRL保藏号为B-30087的短小芽孢杆菌和其突变体。
另一方面，这种菌株是具有NRRL保藏号B-30087菌株经鉴定的所有特性(如下文所述)的NRRL保藏号B-30087的突变体或变体。突变体或变体在本说明书可互换使用而且，可被鉴别为具有在高度严格的条件下可与与NRRL保藏号B-30087的基因组杂交的基因组。“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应形成由核苷酸碱基间的氢键稳定的化合物的反应。氢键是以Watson-Crick碱基配对，Hoogstein结合，或其它任何序列特异方式发生的。化合物可含有形成双链结构的两条链，或形成多链化合物的三条或多条链，自身杂交的单链，或这些形式的任意组合。杂交反应可以在不同的“严格”条件下进行。一般的，低严格型的杂交反应在约40℃ 10×SSC或等离子强度/温度的溶液中进行。典型的中等严格型杂交在约50℃ 6×SSC中进行，高严格型杂交通常在60℃ 1×SSC中进行。
NRRL保藏号B-30087突变体或变体也可定义为基因组序列与NRRL保藏号B-30087的基因组相同性大于85％，优选大于90％或更为优选大于95％的菌株。多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与其它序列具有一定百分比(例如80％，85％，90％，或95％)的“序列相同性”是指，当进行排列分析，受比较的两条序列百分数内的碱基(或氨基酸)相同。这种排列和同源性百分数或序列相同性可以用本领域熟知的软件程序确定，例如，现代分子生物学方法(F.M.Ausubel等，eds，1987)增刊30，7.7.18部分，表7.7.1中所说明的。优选的，使用排列的默认参数。优选的排列程序是BLAST，使用默认参数。特别是，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用下列默认参数：遗传编码＝标准；渗透＝无；链＝两条；截断值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；说明＝50个序列；归类＝高分；数据库＝非冗余的GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+Spupdate+PIR。可以在因特网的下列网址中找到这些程序的详细说明：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
本发明进一步涉及从上述培养物中提取的上清。为本领域熟知的提取上清的方法有：离心；过滤；沉降等。
另一方面，本发明包括呈一种水溶性抗真菌抗生素的分离的代谢物。这种代谢物从本发明和上述说明的菌株中分离。它具有的化学特性如下：小于10,000道尔顿，UV280nm有吸收峰和230nm有肩峰，酸碱稳定，高于80℃时轻微热不稳定，带正电，并且对特异的植物病原体有活性，而不具有抗细菌活性。本发明进一步涉及生产这一代谢物的方法，步骤包括培养本发明菌株和用下述方法分离该活性代谢物。
本发明还包括具有抗真菌活性的NRRL保藏号B-30087的部分纯化组分。该活性组分与zwittermicin A不相同。
本发明进一步涉及含有上述任何一种菌株(包括突变体或变体)，上清，组分和代谢物的单一组合物，或相互联合，和载体联合的组合物。这些组合物可进一步补充至少一种化学的或生物的杀虫剂。这些组合物可采用各种制剂形式，它包括，但不局限于，可湿润的粉剂，粒状，水和悬浮液，可乳化的浓缩物，或微囊。
在本发明中为了使组合物更好的分散和粘附，在将全肉汤培养物，上清，组分和/或代谢物/抗生素形成配方时加入帮助分散和粘附的组分是优选的。相应的，适当的配方是本领域熟练技术人员所熟知的(可湿粉剂，颗粒，等，或可以在适当的介质或类似物中形成微囊的，液体例如水性流动液和水性悬浮液，和乳化原液)。其它适当的配方也是本领域熟练技术人员所熟知的。
任何上述注明的菌株，代谢物，组分，上清，和含有这些活性成分的组合物，都可用于提供治疗和保护植物，根或果实的真菌感染的方法。这种方法包括将有效量的菌株，代谢物，组分，上清或含有这些活性成分的组合物单独或相互联合和/或与其它生物或化学杀虫剂组合应用于感染的植物，根或果实。也可将有效量的这些组合物施加于植物、根或果实以预防这种侵袭。
进一步，本发明包含治疗或防治植物，根或果实真菌病变的方法，包括使用有效量的菌株或其变体产生的抗生素，所述菌株或其变体具有新的芽孢杆菌菌株NRRL保藏号B-30087的经鉴定的所有特性。在一个实施方案中，菌株是NRRL保藏号B-30087的芽孢杆菌。
本发明进一步涉及增强苏云金芽孢杆菌杀虫活性的水溶性化合物，其中化合物的分子量小于10,000道尔顿且化合物不是zwittermicinA。化合物不是β-外毒素或其它苏云金芽孢杆菌产生的外毒素。
用阴离子交换树脂，乙腈沉淀和排阻层析(SEC)分离化合物。本发明还涉及部分纯化的含新的化合物的芽孢杆菌上清。这种新的化合物和活性组分可从选自芽孢杆菌属的芽孢杆菌中分离出来，包括但不局限于枯草芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌，蕈状芽孢杆菌，和短小芽孢杆菌。
部分纯化的活性组分可通过其1HNMR(或质子NMR)光谱鉴定，本领域熟练化学家可据此确定一种化合物是否完全纯化。如果是纯化合物，代表一个质子一个峰积分为任意值1。代表两个质子的峰，例如一个亚甲基基团，其积分为2。代表三个质子的峰，例如一个甲基基团，其积分为3。纯zwitterimicin A标准是这种情况，如图3所示。然而，有活性的部分纯化的苏云金芽孢杆菌增强物的1HNMR光谱有一组峰积分值小于1，因此属于光谱中不同于较大峰的一个化合物。
分离中，化合物并不显示杀虫活性。与苏云金芽孢杆菌联合应用于植物和植物根部时增强苏云金芽孢杆菌的杀虫剂效用。苏云金芽孢杆菌可以是微生物菌株，商业产品，工程植株，杀虫活性代谢物，杀虫活性上清或δ内毒素的形式。
苏云金芽孢杆菌是形成孢子的革兰氏阳性细菌，其特征在于伴胞晶体蛋白包含体。这种蛋白对昆虫有很高的毒性并且具有毒性特异性。正如下文权利要求中使用的，术语“苏云金芽孢杆菌”包括微生物菌株，含这种菌株的商业产品，或含活性代谢物的分离物或从菌株中分离的组分，表达编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白或基因产物或δ内毒素的经遗传改造的或基因工程植物。毒素基因已分离测序，基于苏云金芽孢杆菌的重组DNA已产生并获准使用。转染苏云金芽孢杆菌内毒素到农业环境中的遗传工程技术和新方法正在发展和商业生产中。这包括使用经遗传工程改造的含抗害虫内毒素基因的植物和实用稳定的完整微生物细胞如苏云金芽孢杆菌内毒素转运系统(Gaertner等(1988)TIBTECH6：S4-S7)。通过将靶害虫暴露于天然表达内毒素基因的野生型苏云金芽孢杆菌中而用苏云金芽孢杆菌靶向性杀死害虫是可行的。或者，用编码毒素的基因转化适当的重组宿主并在其中表达。也可使用保留杀虫活性的苏云金芽孢杆菌毒素片段。
下列美国专利公开了杀虫活性的苏云金芽孢杆菌或表达苏云金芽孢杆菌毒素的重组微生物：美国专利5,006,335；5,106,620；5,045,469；5,135,867；4,990,332；5,164,180；5,126,133；5,093,119；5,208,017；5,186,934；5,185,148；5,211,946；4,948,734；4,849,217；4,996,155；4,999,192；4,966,765；5,073,632；5,196,342；5,063,055；5,080,897；5,024,837；5,147,640；5,173,409；和5,186,934。
多年来苏云金芽孢杆菌亚种kurstaki的孢子和晶体蛋白制品已用作防治鳞翅目昆虫的商业产品。例如，苏云金芽孢杆菌变体kurstakiHD-1产生一种叫做-δ内毒素的晶体蛋白对多种鳞翅目昆虫有毒性。苏云金芽孢杆菌的其它种即israelensis和tenebrionis已为商用控制昆虫。
Schnepf，H.等(1981)《美国科学院研究进展》78：2893-2897说明了苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达。美国专利4,448,885和美国专利4,467,036都说明了晶体蛋白在大肠杆菌中的表达。构建的杂交苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因对靶向害虫显示增强的毒性和更大的宿主范围。参考，美国专利5,128,130和5,055,294。美国专利4,797,276和4,853,331发现苏云金芽孢杆菌菌株圣地亚哥(a.k.a.B.t.tenebrionis，a.k.a.M-7)可在各种环境中用于控制甲虫类昆虫。美国专利4,948,734发现苏云金芽孢杆菌具有抗双翅目活性。美国专利4,849,217发现苏云金芽孢杆菌分离物具有抗alfalfa象鼻虫的活性。美国专利5,151,363和美国专利4,948,734发现苏云金芽孢杆菌的特定分离物具有抗线虫的活性。
从得克萨斯州Brownsville的美国农业部(USDA)可以获得苏云金芽孢杆菌培养物。申请应寄往USDA，ARS，棉花昆虫研究单位，P.O.Box 1033，Brownsville，Tex.78520 USA；或北方研究实验室，美国农业部，1815北方大学路，Peoria，III.，美国。
因此，化合物和活性组分增强苏云金芽孢杆菌抗昆虫的杀虫活性，包括但不局限于线虫，苍蝇，黏虫，螨，克罗拉多马铃薯甲壳虫和谷类食根虫。
正如本领域熟练技术人员所熟知的，活性化合物也可以组合物的形式使用。相应的，本发明涉及包含新的化合物和载体例如溶剂或农业适当的载体的组合物。另一个实施方案中，组合物进一步包括如上文所述的有效量的苏云金芽孢杆菌。在另一个实施方案中组合物包括至少一种本领域方便使用的化学或生物杀虫剂。本发明中，为了使组合物更好的分散和粘附，在全肉汤培养物，上清和/或代谢物形成配方时加入帮助分散和粘附的组分是有利的。为了便于应用于植物或植物根部，配方可加工成选自可湿润的粉剂，水性悬浮液，乳化原液和微囊配方中的一种。
新的化合物，活性组分或含有它们的组合物可以增强苏云金芽孢杆菌的杀虫活性。这样，本发明还涉及将有效量的新的化合物，活性成分或含有它们的组合物和苏云金芽孢杆菌联合使用增强苏云金芽孢杆菌的杀虫活性。更进一步的方面是，至少一种有效量的生物杀虫剂或化学杀虫剂加入配方中。
本发明进一步包含用新的化合物，NRRL保藏号B-30087与NRRL保藏号B-21661联合以全肉汤培养物的形式作为杀真菌剂联合应用于植物，根或果实，所说的杀真菌剂通过化合物联合使用的意外的协同效应而具有更强的效应。更为优选的，以1∶2(B-21661∶B-30087)的比率联合应用于抗灰质葡萄孢菌(Botrytis cinerea)或Peronospora parasifica。更为优选的是，以1∶4的比率联合应用于抗灰质葡萄孢菌或Peronospora parasitica。在另一个实施方案中，组合物包括至少一种为本领域方便使用的化学或生物学杀虫剂。在本发明中，为了使组合物获得很好的分散和粘附性，在全肉汤培养物，上清和/或代谢物配制时，加入帮助分散和粘附的组分是有利的。为了便于应用于植物或植物根部，配方可以加工成选自可湿润的粉剂，水性悬浮液，乳化原液和微囊配方中的一种。
在通篇说明中，各种参考出版物，专利和公布的专利说明书具体指出出处。这些出版物，专利和公布的专利说明书的全文引入本文作为参考，以对本发明所属的领域有更充分地说明。
实施例
下述实施例仅用于说明而不限制本发明。
实施例1
鉴定NRRL保藏号B-30087菌株
NRRL保藏号B-30087鉴定的基础是全细胞的细胞脂肪酸，其衍生成甲酯-FAMEs(Mill，L.T.(1982)“细菌整个细胞壁脂肪酸甲酯，包括羟酸的常规分析方法的一种衍生方法”临床微生物学杂志16：584-586)并用MIDI系统(微生物检定系统，有限公司，Newark，DE)进行气相色谱分析。MIDI描述了用于细菌培养物生长的方法和程序及仪器说明书(通过细胞脂肪酸的气相色谱鉴定细菌。技术说明#101，MIDI公司，115 Barksdale Professional Center，Newark，DE)。分离物于28℃在TSA(BBL)平板上生长24小时后收获细胞。加入1毫升甲醇化的NaOH(50％[vol/vol]甲醇中有15％[wt/vol]NaOH)使细胞在100℃皂化30分钟。用2ml的混合于46％(vol/vol)甲醇中的3.25N HCl在80℃进行酯化脂肪酸10分钟。将FAMEs抽提到1.25ml 1∶1(vol/vol)甲基叔丁醚-己烷中，用3ml 1.2％(wt/vol)NaOH洗有机抽提物再进行气相色谱分析。气相色谱仪(Hewlett-Packard5890A)装备有火焰离子化检测器和毛细柱(Hewlett-Packard19091B-102，交联的5％苯基甲基硅氧烷；25m×0.22mm ID；膜厚，0.3311m；相比150)，用氢作为载体气体。Hewlett Packard 3392积分仪自动积分FAME峰并用MIDI微生物鉴定软件(Sherlock TSBA文库版本3.80)命名细菌分离物。以嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonasmaltophila)ATCC13637的FAME图形为参考检测MIDI的鉴定结果。
三轮独立的MIDI图形结果鉴定NRRL保藏号B-30087作为短小芽孢杆菌具有0.875分的相似性检索分数。
实施例2
NRRL保藏号B-30087在体外培养中抗植物病原体的活性(区带(zone)分析)
为了确定NRRL保藏号B-30087是否可以有效地抗广泛范围的植物致病性真菌，使用以下这些植物病原体进行下述试验：灰质葡萄孢菌，甘蓝格链孢菌(Alternaria brassicicola)，Colletotrichumacutatum，Cladosporium carophylum，Monilinia fructicola，Venturiainaequalis，Rhizoctonia solani，Sclerotinia sclerotiorum，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，Taphrina deformans，和Verticillium dahliae。
为了确定在琼脂扩散(区带)分析中的NRRL保藏号B-30087活性，将植物病原体孢子(从培养皿上将孢子刮起并稀释到大约1×105个孢子/ml(视病原体而定))涂布于10cm平皿中的马铃薯葡萄糖琼脂表面。将Rhizoctonia solani和Sclerotinia sclerotiorum的菌丝片段而不是孢子涂布于平皿上。从琼脂中移出约7.0mm的圆孔并将在装有大豆酵母抽提物培养基的250ml摇瓶中生长72小时的NRRL保藏号B-30087的125μl上清样品移入孔中。
12,000rpm离心10分钟制备上清。典型的结果组成是孔周围有一个无病原体生长和/或生长减缓的区带或根本无区带。如果有区带则检测毫米范围内的区带大小并记录。结果如表1所示，见下。
                       表1
    NRRL登录号B-30087抗真菌植物病原菌的体外测试
    甘蓝格链孢菌     无区带
    灰质葡萄孢菌     无区带
    Cladosporium carophylum     无区带
    Colletotrichum acutatum     无区带
    尖孢镰刀菌     无区带
    Monilinia fructicola     无区带
    Rhizoctonia solani     无区带
    Sclerotinia sclerotiorum     无区带
    Taphrina deformans     无区带
    Venturia inaequalis     无区带
    Verticillium dahliae     无区带
    腐霉     无区带
    Phytophthora infestans 活性较弱(区带小，模糊)
    Phytophthora capsici     无区带
    Didimella bryonia     无区带
NRRL保藏号B-30087上清在区带测试中未显示抗多数真菌植物病原体活性。
实施例3
NRRL保藏号B-30087抗细菌植物病原体的活性
如实施例2建立标准琼脂扩散分析。将每种细菌病原体的菌苔涂布于马铃薯葡萄糖琼脂表面。如前文所述将125μl NRRL保藏号B30087上清样品移入每个小孔中。在毫米范围内检测是否有区带和区带的大小。
                        表2
        体外抑制细菌性植物病原体(区带测试)NRRL保藏号B-30087上清：                抑制区带Pseudomonas syringae pv.Tomato         无区带Xanthomonacampestris pv.campestris     无区带Erwinia carotovora亚种Carotovora       无区带
NRRL保藏号B-30087在体外测试中没有抗任何细菌性植物病原体的活性。
实施例4
在植物体内测试NRRL保藏号B-30087抗植物病原体活性
检测NRRL保藏号B-30087抗豆类锈菌，食荚菜豆上的Uromycesphaseoli，和灰霉菌，胡椒上的灰质葡萄孢菌，西红柿植株上的Alternaria solani和莴苣上的霜霉，Bremia lactucae；芸苔属霜霉，Peronospora parasitica，西红柿的晚期枯萎，Phytophthora infestans，和葡萄霜霉，Uncinula necator的活性。
Alternaria solani
病原体Alternaria solani生长于PDA的标准平皿上。从平皿上截取真菌菌落并培养在产孢子培养基上(20g蔗糖，30g碳酸钙，和每升无菌水20g琼脂)。在平皿中加入无菌水使菌丝段的部分被没过并将平皿放于22-26℃以14小时为光周期孵育两天。刮菌丝段收获孢子放入装有无菌水的烧杯中。调整孢子悬浮液至2×104个孢子/ml。
向植入2英寸罐并放置在苗床上的处于3-4叶期的番茄幼苗(UC82-B)上，用艺术家使用的气刷喷洒一定量的在装有大豆粉酵母膏培养基的250ml摇瓶中生长72小时的NRRL保藏号B-30087的全肉汤培养物。喷洒后，使幼苗最少干燥二小时。将接种的幼苗放于Percival露水室中22℃无照明培养40小时。每一个苗床中的植株覆盖一层塑料圆顶并放于Percival保温箱中以14小时光周期20-22℃孵育48小时。用不含NRRL保藏号B-30087的有和无病原体孢子的水作阴性对照。还用一种100到250ppm比例的化学杀真菌剂(例如，Azoxystrobin，Abound)作比较。植株的评分等级分0到5等级，其中5是100％感染而0是无症候出现。在含A.solani的水的对照中，所有的叶上有同样的损伤并且子叶离脱且感染严重(第5等级＝完全感染，无控制)。NRRL保藏号B-30087处理的植株看起来与水对照没有差别。NRRL保藏号B-30087对病原体无控制作用(也是第5等级)。阴性对照没有感染。化学处理的植株评分在0和1之间。
灰质葡萄孢菌
灰质葡萄孢菌病原体生长于含PDA的标准平皿(10cm)上并用补充了麦芽(0.5g/L)和酵母抽提物(0.5g/L)的马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)收集孢子并调整到1×106个孢子/ml。所用的植株是在2英寸罐中生长到3-5片实叶期的胡椒(Yolo Wonder)。使用的NRRL保藏号B-30087和病原体如上所述。装有罐的苗床于20℃无照明恒温孵育。用塑料圆顶覆盖放置2.5天(60到65个小时)再评分。
用一种20到100ppm比例的化学杀真菌剂(例如，Iprodione，Roval)作比较。植株评分分0到5的等级，其中5是100％感染而0没有症候出现。在含灰质葡萄孢菌的水对照中，所有的叶子有同样的损伤(第5等级＝完全感染，未控制)。NRRL保藏号B-30087处理的植株与水对照看起来没有区别。NRRL保藏号B-30087对病原体无控制(也是第5等级)。阴性对照没有感染。化学处理的植株评分在0和1之间。
Bremia lactucae
Bremia的测试中，在一个小而透亮的高度为8分米的正方形塑料种植箱中将莴苣种子种植于一层混合了泥炭，珍珠岩和金精石的无菌陶土中。种植一星期后，向莴苣幼苗喷洒NRRL保藏号B-30087肉汤培养物或上清样品。使植株干燥然后将从感染的莴苣幼苗上收集的霜霉孢子悬浮液(2×104个孢子/ml)喷洒到幼苗上。还施加了由Aliette(fosetyl-al)和Ridomil(metalaxyl)组成的化学标准物。然而，预先已证实这些测试中使用的Bremia lactucae分离物对这两种商用的化学标准不敏感。用密封的盖子盖上塑料箱并在Percival孵箱中于15-16℃无光照孵育16小时。然后将塑料箱置于室温(20-26℃)光照培养六天。打开幼苗的包装盖，喷水，再盖上，放回15-16℃的孵箱中使其过夜形成孢子。NRRL保藏号B-30087对化学抗性莴苣霜霉菌株的对抗效应列于表3中。
                  表3
                                   评分
                          Rep1    Rep2    Rep3NRRL保藏号B-30087样品1        0.0     1.0     1.0NRRL保藏号B-30087样品2        1.0     1.0     0.0Aliette 240ppm                5.0     3.0     --Ridomil 125ppm                3.0     3.0     --水对照                        5.0     5.0     5.0
NRRL保藏号B-30087具有优良的抗莴苣霜霉的活性使幼苗上几乎没有或没有病原体的孢子形成，而对照(水对照)植株完全形成了霜霉孢子。化学标准物不能有效地控制病原体。
Peronospora parasitica
芽孢杆菌菌株NRRL保藏号B-30087培养于上述250ml摇瓶中。将1X浓度的全肉汤培养物喷洒于一周龄的花椰菜上或用艺术家的气刷通过空气压缩向完全处于子叶期的球芽植物喷洒。每一次处理取15-25个幼苗/罐重复三组喷洒。以1-5×104个孢子/ml的浓度将霜霉Peronospora parasitica孢子悬浮液喷洒到先施用过NRRL保藏号B-30087的芸苔属植株上。还使用了Aliette(fosetyl-al)和Ridomil(metalaxyl)组成的化学标准物。然而，预先证实用于这些测试的Peronospora parasitica的分离物对于这两种商用化学标准物不敏感。
15-17℃孵育16小时后感染植株，然后将幼苗放于20-24℃孵育六天。将罐放回15-17℃过夜以形成病原体的孢子。在0到5的等级基础上通过估测病变控制的百分数检测每一植株。零等级是没有孢子形成的损伤的植株。表4显示重复罐的平均结果。
                        表4
                                  评分
                          Rep1    Rep2    Rep3NRRL保藏号B-30087样品1        0.5     1.0     0.5NRRL保藏号B-30087样品2        0.5     0.5     1.0Alitte 240ppm                 5.0     3.0     --Ridomil 125ppm                4.0     4.0     4.0水对照                        5.0     3.0     5.0
对比未处理的检测结果和化学标准物NRRL保藏号B-30087能更有效的控制芸苔属霜霉。
Uncinula necator
将葡萄幼苗(Chardonnay)培养于两英寸的罐中直到6-9片实叶期。以14小时为光周期于22-26℃在葡萄幼苗上培养霜霉培养物。摘除其它叶子只保留2-4片最幼嫩的叶子。根据上文使用一定量的NRRL保藏号B-30087，化学杀真菌剂(Rally，25ppm myclobutanil)和水对照确定对其它待测病原体的抗性。每一次处理重复四到五次。要接种霜霉时，保留幼苗用剪刀切除上面有霜霉的叶子并且使每个植株单独接种。用画笔轻刷保留幼苗表面使孢子沉积于待测植物的上表面。用3X放大镜进行这一步确保所有的植株接种量相当。将装有罐的苗床放置黑暗中于20-24℃放16-24小时。在测试结束前将苗床再保温于22-26℃以14小时为光周期放置9-11天。如上文，植株的评分分0到5等级。使用NRRL保藏号B-30087的结果显示于表5。
                      表5
                                  评分
                          Rep1  Rep2  Rep3  Rep4NRRL保藏号B-30087             0.5   0.0   1.0   1.0Rally 25ppm                   0.0   0.0   0.0   0.0水对照                        5.0   5.0   3.0   4.0
NRRL保藏号B-30087对比未处理的对照可以有效地控制Uncinula粉霉而且几乎和化学标准物Rally一样有效。
Phytophthora infestans
西红柿晚期枯萎的检测，用生长于二英寸正方形塑料罐中处于4-6片实叶期的幼苗(UC82-B)感染P.infestans。将如前所述的NRRL保藏号B-30087培养物喷洒于西红柿幼苗上。刮下黑麦种子琼脂上的孢子形成菌落并调整接种浓度在0.7到1.0×104个孢子/ml接种P.infestans。将接种的幼苗放于苗床中并准确的按A.solani测试孵育。分0到5等级检测幼苗。用比例为62.5到125ppm的Quadris(azoxystrobin)作比较。使用NRRL保藏号B-30087的结果显示于表6。
                        表6
                               评分
                   Rep1  Rep2  Rep3  Rep4  Rep5NRRL保藏号B-30087      2.0   1.5   1.5   0.5   2.0Quadris 125ppm         0.0   0.0   0.0   0.0   0.0Quadris 62.5ppm        0.0   0.5   0.0   0.5   0.0水对照                 5.0   5.0   4.0   4.0   5.0
孵育四天后NRRL保藏号B-30087对晚期枯萎的控制几乎具有与化学标准物，Quadris一样的效用。
Uromyces phaseoli
豆锈菌的检测，将食荚菜豆幼苗(Provider品种)感染U.phaseoli直到第一片初生叶已经有3/4舒展后。按前文所述使用NRRL保藏号B-30087检测其它宿主/病原体组合。接种的锈菌病原体以干锈菌孢子的状态放于瓶中-20℃储存。向含0.01％Tween20的水中加入干锈菌孢子并用磁力搅拌器剧烈搅动至少一个小时准备接种。接种浓度调至2-4×105个孢子/ml。初生叶接种后将幼苗放于苗床中并在Percival露水室中于20℃孵育过夜。然后室温(20-26℃)再孵育幼苗8-10天。根据形成锈菌孢子时小疣突存在的几率和严重程度将幼苗分0到5的等级。
用比例为40ppm的化学杀真菌剂Break(propiconazole)作比较。使用NRRL保藏号B-30087全肉汤培养物的结果显示于表7。
                    表7
                        评分
                 Rep1    Rep2    Rep3NRRL保藏号B-30087    0.5     0.5     0.0Break40ppm         0.0     0.0     0.5水对照               5.0     5.0     5.0
NRRL保藏号B-30087对大豆锈菌的控制几乎与化学标准物Break一样有效。
实施例5
NRRL保藏号B-30087产生的抗真菌代谢物
NRRL保藏号B-30087的全肉汤培养物划分为醋酸乙酯，丁醇和水相组分。用孢子发芽分析测试每一个组分抗金鱼草锈菌的活性。在含40个样品中的每1个和20个病原体孢子中的每1个的显微镜凹玻片上在每一个样品存在下做金鱼草锈菌孢子发芽的测试。约16小时后在显微镜下观察孢子是否发芽。与水对照(100％发芽和生长＝5分)比较没有发芽(0分)的说明被测样品的活性。NRRL保藏号B-30087不同组分的锈菌发芽分析结果示于表8(如上文分0到5的等级评分)。
                   表8
                         评分
                Rep1     Rep2     Rep3
醋酸乙酯        5.0      2.0      3.0
n-丁醇          3.0      5.0      3.0
水相            0.0      0.0      0.0
全肉汤          0.0      0.0      0.0
水对照          4.0      5.0      5.0
代谢物明显存在于水溶液组分中且完全不能通过抽提进入丁醇或醋酸乙酯。
代谢物的其它特性也经过了鉴定。此分子可以通过截留分子量10,000的滤膜说明代谢物小于10,000道尔顿。无论用蛋白酶处理还是用酸或碱处理都不会丧失活性。当加热到80℃一小时活性会有轻微丧失(抗金鱼草锈菌的评分从0升至1.5)。活性可以被阳离子树脂吸附，但不能被阴离子树脂吸附(代谢物带正电)。
实施例6
NRRL保藏号B-30087抗真菌组分的部分纯化
4200rpm离心NRRL保藏号B-30087的全肉汤培养物15分钟收集上清。在上清中加入活性炭(30g)，很好的震荡后11,500rpm离心20分钟。在旋转蒸发器中干燥上清然后再溶解于15ml水中。再通过根据分子量分离组分的排阻层析(SEC)进一步纯化样品。
用milliQ制备的去离子水泡胀R-2树脂(130g，BioRad)组装一个2.5cm×80cm的柱子。将15ml浓缩物打入P-2柱子中，通过重力用水洗脱柱子并收集10ml组分。P-2柱的参数是：范围＝2，nm＝226nm，16mv。
用实施例5中说明的金鱼草锈菌发芽试验分析洗脱组分。发现组分18-24可以完全抑制发芽。混合这些组分并放于旋转蒸发器干燥，然后重溶于8ml水中再用0.2μm滤膜过滤。再将样品打入第二个P-2柱中如上文所述过柱，区别是只收集7ml组分。
通过生物分析发现组分29-38可以抑制发芽。干燥这些组分并重新溶解于水中。通过阴离子柱(4.6mm×15cm，5m，100埃)HPLC进一步分离出小部分水相(5mg)。用0.01MKH2PO4平衡柱子并在30分钟内在一个从4％到44％的乙腈/0.01MKH2PO4梯度中电泳，1ml/min用UV200nm监测。
收集三个峰并用排阻HPLC柱(Toso Haas，G1000PW，7.5mm×30cm，10m)给峰1脱盐，流速1ml/min用UV200nm监测。收集排阻层析柱的一个峰通过发芽分析发现其活性。这种半纯活性物质在D2O中400MHz的1H-NMR谱的记录如图1所示。
实施例7
杀真菌组分的化学特性不同于zwittermicin A
本发明的杀真菌剂活性组分毛细电泳与zwittermicin A不同。NRRL保藏号B-30087全肉汤培养物生长于含豆粉，葡萄糖，酵母抽提物，KH2PO4，NaCl和MgSO4×7H2O的芽孢杆菌培养基。用划线培养物接种250ml摇瓶。摇瓶在30℃210rpm振荡4天。
NRRL保藏号B-30087全肉汤培养物与纯化的zwittermicin A脉冲并进行毛细管电泳(CE)。30μl的NRRL保藏号B-30087全肉汤培养物和10μl zwittermicinA进行脉冲。NRRL保藏号B-30087全肉汤，NRRL保藏号B-30087全肉汤和zwittermicin A和单独的zwittermicin A中的每一个作为一个样品在pH5.8的磷酸钠缓冲液进行CE。每一个样品产生的电泳图示于图3。
然后用毛细管电泳(CE)比较部分纯化的组分和zwittermicin A。图4显示了部分纯化的B-30087杀真菌组分，部分纯化的B-30087杀真菌组分和25μl zwittermicin A脉冲和单独zwittermicinA的电泳图，
图2显示了在D2O中记录400MHz的zwittermicin A1H-NMR光谱，部分纯化的B-30087杀真菌代谢物1H-NMR谱示于图1。示于图1和2的图谱说明NRRL保藏号B-30087的杀真菌代谢物不同于zwittermicin A。
NRRL保藏号B-30087的杀真菌代谢物也不同于-外毒素的1H-NMR。《苏云金芽孢杆菌分析化学》，L.A.Hickle和W.L.Fitch，eds，ACS专题论丛系列432，p.131(1990)说明外毒素的1H-NMR光谱大于5ppm时有七个共振。相反的，图1显示NRRL保藏号B-30087样品的1H-NMR谱，在大于5时没有质子共振。
实施例8
纯化增强物(enhancer)
如下文部分纯化B-30087全肉汤的增强物。通过阴离子树脂，乙腈沉淀和排阻层析部分纯化435ml全肉汤培养物。离心全肉汤去除细胞，在上清中加入14.5g阴离子树脂(AG1-X8，100-200网眼，乙酸形式)并振荡混合物1分钟。离心混合物5000rpm，20分钟并倾倒出上清以备下一步使用。在上清中加入乙腈使浓度达到50％，振荡一分钟并5000rpm离心20分钟。靠下的深棕色层含苏云金芽孢杆菌增强物。
通过两步排阻层析进一步纯化上文中的棕色层。首先，用milliQ去离子化水泡胀130gP-2树脂(BioRad)组装一个2.5cm×80cm的柱子。用旋转蒸发器浓缩棕色层约4倍再将15ml的浓缩物打入P2柱中。在重力作用下，用MQ水洗脱柱子12小时收集十分钟组分(UV280nm检测，吸收范围2.0，10mV)。进一步纯化组分26-28通过使用旋转蒸发器三倍浓缩该组分并打入原先的P2柱中。用MQ水洗脱柱子。收集前80分钟的十分钟组分，然后收集下两个小时的2分钟组分。苏云金芽孢杆菌增强物活性在16-20组分中洗脱下来。(220nmUV检测，吸收范围2.0，10mV)。
实施例9
增强物的化学特性和zwittermicin A不同
本发明的增强物毛细电泳不同于zwittermicin A。B-30087全肉汤培养物生长于含豆粉，葡萄糖，酵母抽提物，KH2PO4，K2HPO4，NaCl和MgSO4×7H2O的杆菌培养基中。用划线培养物接种250ml摇瓶。摇瓶在30℃ 210rpm振荡4天。苏云金芽孢杆菌B-30087全肉汤培养物与纯化的zwittermicin A进行脉冲并进行毛细管电泳(CE)。30μl的B-30087全肉汤与10μl的zwittermicin A进行脉冲。B-30087全肉汤(图3A)，B-30087全肉汤和zwittermicin A(图3B)和单独的zwittermicin A在pH5.8的磷酸钠缓冲液中进行CE。CE的电泳图显示于图4。
在D2O中400MHz记录zwittermicin A和B-30087半纯化增强物的1H-NMR谱。图谱显示增强物不同于zwittermicin A。
实施例10
确定苏云金芽孢杆菌的杀虫增强效用
用全短小芽孢杆菌肉汤培养物说明苏云金芽孢杆菌的增强作用，用甜菜黏虫(Spodoptera exigua)进行协同分析测试NRRL保藏号B-30087。分析在96孔板中进行。每孔中含有固体的琼脂底物。用生物分析测试20μlB-30087全肉汤培养物和商业制备的苏云金芽孢杆菌，Javelin(0.25-1.50μg/孔)。同时使用系列稀释浓度的Javelin浓缩物。
根据Marrone等(1985)《昆虫经济学杂志》78：290-293制备小板各孔的琼脂底物进行杀虫活性分析。用去离子水作对照。测试的样品或对照重复两次进行。植株放入烟雾通风橱干燥约2-3小时。
将一到三个Spodoptera exigua第一时期幼虫加入每个孔中。用密闭物质如Mylar封闭小板，每个小孔通过大头针扎孔通气。平板放于27℃孵育7天。
孵育后，通过记录新生虫死亡或幼虫生长程度给每孔评分。记录死亡的幼虫数。分1-4级给生长受阻的幼虫评分。生长受阻得分如下：4＝对照大小；3＝75％的对照大小；2＝50％对照大小；1＝25％对照大小。结果归纳于表9，如下。
                         表9
样品                    死亡数/总数     生长受阻得分
0.25μg Javelin             1/8              4
0.50μg Javelin             0/8              4
0.75μg Javelin             1/8              2
1.0μg Javelin              1/8              2
1.50μg Javelin             1/8              2
B-30087+0.25μg Javelin     3/8              2
B-30087+0.50μg Javelin     0/8              3
B-30087+1.0μg Javelin      7/8              2
B-30087+1.50μg Javelin     8/8              1
B-30087                     0/8              4
水对照                      0/8              4
运用上述程序进行第二次测试。结果归纳于表10。
                             表10样品                        死亡数/总数      生长受阻得分0.0625μgJavelin                0/8               40.125μgJavelin                 0/8               40.187μgJavelin                 0/8               40.250μgJavelin                 0/8               30.375μgJavelin                 1/8               2B-30087+0.0625μgJavelin        1/8               3B-30087+0.125μgJavelin         2/8               3B-30087+0.187μgJavelin         5/8               2B-30087+0.250μgJavelin         8/8               1B-30087+0.375μgJavelin         8/8               1B-30087                         0/8               4水对照                          0/8               4
用0.1μg/孔Javelin和40μl/孔的待测组分按上述方法检测样品以确定半纯化组分的杀虫增强特性。结果归纳于表11，如下。
                       表11样品                   死亡数/总数            生长受阻得分组分10                      0/9                    2组分16                     16/16                   1组分18                     17/17                   1组分20                     14/14                   1组分25                      1/10                   2组分30                      3/11                   2组分35                      1/12                   3Javelin，0.1μg/孔          0/8                    3水对照                      0/14                   4
实施例11
短小芽孢杆菌(B-30087)和枯草芽孢杆菌(B-21661)共同用作杀真菌剂
测试短小芽孢杆菌菌株，NRRLB-30087和枯草芽孢杆菌，NRRLB-21661，确定两种同时使用是否比单独使用任意一种菌株杀真菌效用更强。每种菌株生长于10升或5,000升发酵罐中50小时，培养基的基本成分是豆粉。每种菌株以肉汤培养物的形式检测它们的抗灰质葡萄孢菌在胡椒上形成的灰霉，和芸苔属上的Peronosporaparasitica霜霉。检测1X，1/2X，和1/8X的全肉汤培养物。检测两种菌株1/2X，1/4X和1/8X相互间的各种联合形式。用水对照(对照)和化学杀真菌剂(20ppm的BREAK)检测作比较。分0到5的等级给植株评分(其中5＝100％病变，无对照；和0＝100％对照，无病变)。结果显示于表12中，如下。
                         表12
                          灰质葡萄孢菌  Peronospora parasitica
                            平均病变率        平均病变率
                               (4株)             (4株)B-20661  1X                         0.3               未测
     1/2X                       0.3               0.5
     1/4X                       1.2               1.0
     1/8X                       1.7               2.0B-30087  1X                         1.7               未测
     1/2X                       2.3               1.3
     1/4X                       未测              3.7
     1/8X                       未测              4.3B-21661 1/4X和B-30087 1/2X          0.7               1.0B-21661 1/8X和B-30087 1/2X          1.4               0.3B-21661 1/4X和B-30087 1/4X          N/A               0.5B-21661 1/2X和B-30087 1/2X          N/A               0.3B-21661 1/2X和B-30087 1/4X          N/A               0.3B-21661 1/2X和B-30087 1/8X          N/A               0.520ppm的BREAK                      0.2              未测水对照                              4.6               5.0
灰质葡萄孢属测试结果显示两个菌株联合使用与单独使用相比具有统计学差异。例如，B-21661 1/4X和B-30087 1/2X的评分和B-21661 1/4X单独使用的评分1.2有显著差异。而且，B-21661 1/8X和B-30087 1/2X联合的评分比单独使用B-21661 1/8X的评分1.7或B-30087 1/2X单独使用的评分2.3有统计学差异，联合评分比每一个菌株单独使用的预期平均值低。这显示联合使用菌株有增强杀真菌剂效率的协同效用。
Peronospora parasitica检测结果显示联合使用B-21661 1/8X和B-30087 1/2X的评分远比期待的附加效应好。如果只是联合菌株的附加效应预期评分是2.05。然而，实际评分是0.3，显示联合使用菌株具有明显的协同效应。其它结果显示也比预期结果好，例如，B-21661 1/4X和B-30087 1/4X联合评分是0.5，这大大地好于预期的独立使用菌株时的简单附加效用(估测评分2.35)。同样的协同效用也显示于B-21661 1/2X和B-30087 1/2X(评分0.3)，B-21661 1/2X和B-30087 1/4X(评分0.3)，B-21661 1/2X和B-30087 1/8X(评分0.5)的联合使用。这些测试证明联合使用菌株具有协同效用，这是一个出乎意料的结果。
应理解的是尽管联系上述实施方案说明了本发明，但是前面的说明和实施例是用来解释说明而并不是限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面，优点和修改对本发明所属的领域中的熟练技术人员是显而易见的。

Claims (85)

1.一种生物纯的菌株培养物，其具有保藏号为NRRL No.B-30087的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株或其具有杀真菌活性的突变体的所有鉴定特征。
2.一种保藏号为NRRL No.B-30087的短小芽孢杆菌菌株的生物纯的培养物。
3.一种含有如权利要求1所述的生物纯的培养物和载体的组合物。
4.如权利要求1所述的组合物，其中该组合物由下列一组配制：可湿性粉剂、颗粒、水性悬浮液、和乳化原液及微胶囊化配方。
5.一种从生物纯的菌株培养物中分离出的分离的代谢物，其中所说的菌株培养物具有保藏号为NRRL No.B-30087的短小芽孢杆菌菌株或其具有杀真菌活性的突变体的所有鉴定特征。
6.一种从生物纯的菌株培养物中分离出的上清液，其中所说的菌株培养物具有保藏号为NRRL No.B-30087的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株或其具有杀真菌活性的突变体的所有鉴定特征。
7.一种从权利要求6所述的上清液中分离的部分纯化的组分。
8.一种含有如权利要求5所述的代谢物和载体的组合物。
9.一种含有如权利要求6所述的上清液和载体的组合物。
10.一种含有权利要求7所述的部分纯化的组分和载体的组合物。
11.如权利要求8所述的组合物，其中该组合物由下列一组配制：可湿性粉剂、颗粒、水性悬浮液、和乳化原液以及微胶囊化配方。
12.如权利要求9所述的组合物，其中该组合物由下列一组配制：可湿性粉剂、颗粒、水性悬浮液、和乳化原液以及微胶囊化配方。
13.如权利要求10所述的组合物，其中该组合物由下列一组配制：可湿性粉剂、颗粒、水性悬浮液、和乳化原液以及微胶囊化配方。
14.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求1所述的代谢物。
15.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求6所述的上清液。
16.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求7所述的部分纯化的组分。
17.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求8所述的组合物。
18.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求9所述的组合物。
19.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求10所述的组合物。
20.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求11所述的组合物。
21.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求12所述的组合物。
22.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括应用有效量的如权利要求13所述的组合物。
23.如权利要求17所述的方法，其中所说的真菌感染是由于至少一种选自下列一组微生物之一所导致的，该组微生物包括Bremialactucae；Peronospora parasitica；Phytophthora infestans；Uncinulanecator，和Uromyces phaseoli。
24.如权利要求18所述的方法，其中所说的真菌感染是由于至少一种选自下列一组微生物之一所导致的，该组微生物包括Bremialactucae；Peronospora parasitica；Phytophthora infestans；Uncinulanecator，和Uromyces phaseoli。
25.如权利要求19所述的方法，其中所说的真菌感染是由于至少一种选自下列一组微生物之一所导致的，该组微生物包括Bremialactucae；Peronospora parasitica；Phytophthora infestans；Uncinulanecator，和Uromyces phaseoli。
26.如权利要求20所述的方法，其中所说的真菌感染是由于至少一种选自下列一组微生物之一所导致的，该组微生物包括Bremialactucae；Peronospora parasitica；Phytophthora infestans；Uncinulanecator，和Uromyces phaseoli。
27.如权利要求21或22所述的方法，其中所说的真菌感染是由于至少一种选自下列一组微生物之一所导致的，该组微生物包括Bremia lactucae；Peronospora parasitica；Phytophthora infestans；Uncinula necator，和Uromyces phaseoli。
28.如权利要求1所述的组合物，进一步含有至少一种化学或生物学杀虫剂。
29.如权利要求7所述的组合物，进一步含有至少一种化学或生物学杀虫剂。
30.如权利要求8所述的组合物，进一步含有至少一种化学或生物学杀虫剂。
31.如权利要求14所述的方法，进一步包括应用有效量的至少一种化学或生物学杀虫剂。
32.如权利要求15所述的方法，进一步包括应用有效量的至少一种化学或生物学杀虫剂。
33.如权利要求17所述的方法，进一步包括应用有效量的至少一种化学或生物学杀虫剂。
34.一种生产抗真菌上清液的方法，包括培养NRRL No.B-30087的生物纯培养物，并从上清液中分离抗真菌的代谢物。
35.如权利要求34所述的部分纯化上清液的方法，包括分级分离该上清液并对各组分进行生物测试以鉴定抗真菌组分。
36.通过如权利要求34所述的方法生产的上清液。
37.如权利要求7所述的部分纯化的组分，其中该组分显示出抗植物致病真菌的活性，存在于水相组分中，略具有热不稳定性，具有酸/碱和蛋白酶下的稳定性，带有正电荷，且分子量小于10,000道尔顿。
38.如权利要求5所述的分离的代谢物，其中该代谢物显示出抗植物致病真菌的活性，存在于水相组分中，略具有热不稳定性，具有酸/碱和蛋白酶下的稳定性，带有正电荷，且分子量小于10,000道尔顿。
39.一种增强苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫活性的水溶性的化合物，并且其中该化合物的分子量小于10,000道尔顿且该化合物不是zwittermicin A。
40.如权利要求39所述的化合物，进一步包含苏云金芽孢杆菌。
41.一种含有如权利要求39所述的化合物和载体的组合物。
42.一种含有如权利要求40所述的组合物和载体的组合物。
43.如权利要求40所述的组合物，其中所说的苏云金芽孢杆菌的形式为微生物菌株、市售产品、工程植株或者δ-内毒素。
44.如权利要求40-43任一项所述的组合物，进一步含有至少一种化学或生物学杀虫剂。
45.如权利要求44所述的组合物，其中该组合物是选自下列一组的配方：可湿性粉剂、水性悬浮液、乳化原液及微胶囊化配方。
46.芽孢杆菌全肉汤培养物的部分纯化的组分，其可增强苏云金芽孢杆菌的杀虫活性并且不是zwittermicin A或β-外毒素。
47.如权利要求46所述的部分纯化的组分，其中该芽孢杆菌是短小芽孢杆菌。
48.如权利要求47所述的部分纯化的组分，其中所说的短小芽孢杆菌是NRRL保藏号为NRRL B-30087的短小芽孢杆菌。
49.一种含有如权利要求46-48任一项所述的组分和载体的组合物。
50.如权利要求46-49任一项所述的组分，进一步含有苏云金芽孢杆菌。
51.如权利要求50所述的组分，其中所说的苏云金芽孢杆菌的形式为微生物菌株、商业产品、工程植株或者δ-内毒素。
52.一种含有如权利要求49所述的组合物和苏云金芽孢杆菌的组合物。
53.如权利要求46-48任一项所述的组分，进一步含有至少一种化学或生物学杀虫剂。
54.如权利要求49所述的组合物，其中该组合物是选自于下列一组的配方：可湿性粉剂、水性悬浮液、乳化原液和微胶囊化配方。
55.如权利要求52所述的组合物，其中该组合物是选自于下列一组的配方：可湿性粉剂、水性悬浮液、乳化原液和微胶囊化配方。
56.如权利要求53所述的组合物，其中该组合物是选自于下列一组的配方：可湿性粉剂、水性悬浮液、乳化原液和微胶囊化配方。
57.一种增强苏云金芽孢杆菌的杀虫活性的方法，包括对植株和根施用有效量的如权利要求39所述的化合物并对植株和根施用有效量的苏云金芽孢杆菌。
58.一种增强苏云金芽孢杆菌的杀虫活性的方法，包含对植株和根施用有效量的如权利要求46所述的组分并对植株和根施用有效量的苏云金芽孢杆菌。
59.一种保护或治疗植株或根免受昆虫侵袭的方法，包括向植株或根施用有效量的如权利要求40所述的化合物。
60.一种保护或治疗植株或根免受昆虫侵袭的方法，包括向植株或根施用有效量的如权利要求44所述的组合物。
61.一种保护或治疗植株或根免受昆虫侵袭的方法，包括向植株或根施用有效量的如权利要求50所述的组分。
62.一种保护或治疗植株或根免受昆虫侵袭的方法，包括向植株或根施用有效量的如权利要求52所述的组合物。
63.一种保护或治疗植株或根免受昆虫侵袭的方法，包括向植株或根施用有效量的如权利要求53所述的组分。
64.如权利要求51所述的方法，进一步包括至少一种化学或生物学杀虫剂。
65.如权利要求49或50所述的方法，进一步包括至少一种化学或生物学杀虫剂。
66.一种组合物，其含有：
a)具有保藏号为NRRL No.B-30087的短小芽孢杆菌菌株或其突变体的所有鉴定特征的菌株的全肉汤培养物；和，
b)具有保藏号为NRRL No.B-21661的枯草芽孢杆菌菌株或其突变体的所有鉴定特征的菌株的全肉汤培养物，
所说的菌株具有协同杀真菌活性。
67.如权利要求66所述的组合物，其中的抗真菌活性是针对Botrutis cinerea和Peronospora parasitica。
68.如权利要求66所述的组合物，其中NRRL Nos.B-21661和B-30087的菌株以1∶2的比例组合。
69.如权利要求66所述的组合物，其中NRRL Nos.B-21661和B-30087的菌株以1∶4的比例组合。
70.如权利要求66所述的组合物，其中NRRL Nos.B-21661和B-30087的菌株以1∶2的比例组合以抗Botrutis cinerea和Peronospora parasitica。
71.如权利要求66所述的组合物，其中NRRL Nos.B-21661和B-30087的菌株针以1∶4的比例组合以抗Botrutis cinerea和Peronospora parasitica。
72.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括施用有效量的如权利要求66所述的组合物。
73.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括施用有效量的如权利要求67所述的组合物。
74.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括施用有效量的如权利要求68所述的组合物。
75.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括施用有效量的如权利要求69所述的组合物。
76.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括施用有效量的如权利要求70所述的组合物。
77.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括施用有效量的如权利要求71所述的组合物。
78.一种从权利要求66所述的培养物中分离出的上清液。
79.一种含有如权利要求78所述的上清液和载体的组合物。
80.如权利要求79所述的组合物，其中该组合物从下列一组配制：可湿性粉剂、颗粒、水性悬浮液、乳化原液和微胶囊化配方。
81.如权利要求66所述的组合物，进一步含有至少一种化学或生物学杀虫剂。
82.如权利要求79所述的组合物，进一步含有至少一种化学或生物学杀虫剂。
83.如权利要求81所述的组合物，其中该组合物从下列一组配制：可湿性粉剂、颗粒、水性悬浮液、乳化原液和微胶囊化配方。
84.如权利要求82所述的组合物，其中该组合物从下列一组配制：可湿性粉剂、颗粒、水性悬浮液、乳化原液和微胶囊化配方。
85.一种预防或治疗植株、根或果实的真菌感染的方法，包括施用有效量的如权利要求69所述的组合物。
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