BG105982A

BG105982A - Щам bacillus pumilus за контролирaне на болести по растенията

Info

Publication number: BG105982A
Application number: BG105982A
Authority: BG
Inventors: Lori LEHMAN; Randy MCCOY; Belinda MESSENGER; Denise Manker; Jimmy ORJALA; Dorte Lindhard; Pamela MARRONE; Desmond JIMENEZ
Original assignee: Agraquest, Inc.
Priority date: 1999-03-30
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2003-04-30
Also published as: BR0017570B1; AU3765700A; YU69401A; TR200201743T2; DE60038958D1; KR20010112933A; EP1165751A1; BR0009430B1; SK13062001A3; US6635245B1; PL351956A1; KR100736253B1; AP2001002275A0; TR200201745T2; CR6455A; AU775016B2; BR0009430A; IL145291A0; TR200201746T2; JP2010200765A

Abstract

Изобретението се отнася до продуциращ антибиотик Bacillus sp., който проявява противогъбична активност само върху определени растителни патогени и който не притежава антибактериална активност, а такасъщо до биологически чиста култура от щам с всичкиидентифициращи характеристики на този щам. Изобретението се отнася до метод за третиране или защитана растения, плодове и корени от гъбни инфекции чрез прилагане на ефективно количество от щамовете,супернатанти, продуцирани от тези щамове, или метаболит, изолиран от тях. Изобретението се отнася идо синергистичния фунгициден ефект от приложението на щам на NRRL Nos. B-30087 заедно с В-21661 (AQ713).

Description

Област на изобретението

Настоящето изобретение е от областта на биопестицидите. По- специално, това изобретение се отнася до установяването на факта, че нов щам Bacillus pumilus, NNRL В-30087, може да инхибира широк кръг гъбни болести по растенията in vivo. Изобретението се отнася също и до фунгицидни състави, съдържащи този нов щам Bacillus, и антибиотиците и пречистени и непречистени фракции на този щам както самостоятелно, така и в комбинация с други химикали и биологични пестициди. Изобретението по- нататък се отнася до синергистичния фунгициден ефект на използване на щам NRRL No. В-30087 заедно с NRRL No. В-21661, (CCRC 910106).

Ниво на техниката

Общоизвестно е, че различни микроорганизми проявяват биологична активност, която е приложима за контролиране на болестите по растенията. Макар да е направен прогрес в областта на идентифициране и развиване на биологичните пестициди за контролиране на различни болести по растенията от значение за агрономията и градинарството, повечето от използваните пестициди са все още синтетични вещества. Много от тези химични пестициди са отнесени към карциногените от Агенцията за защита на околната среда (ЕРА), токсични са за живите организми и други видове, които не представляват цел на обработката. В допълнение, патогените могат да развият резистентност спрямо химични пестициди. Виж, например, Schwinn et al., in: Advances In Plant Pathology: Phytopathora infestans, The Cause of Late Blight of Potato, p. 244, Academic Press, San Diego, Calif. (1991).

Биологичният контрол предлага една атрактивна алтернатива спрямо синтетичните химични фунгициди. Биопестицидите (живи организми и природно продуцираните от тези организми вещества) могат да бъдат по- безопасни, полесно биологично разградими и не толкова скъпи за произвеждане.

Един широко използван биопестицид е грам положителната бактерия Bacillus thuringiensis. Известно е, че пестицидните щамове на В. thuringiensis продуцират кристални протеини по време на спорулация, които са специфично токсични спрямо определени родове и видове инсекти и нематоди (виж, напр. US patent No. 5,208,017). Протеиновите ендотоксини, продуцирани от В. thuringiensis също действат като инсектицидни средства срещу бълхи и други бръмбари (напр. US patent 5,187,09 Johnson, Т. J. et al. (1993), J. Econ. Entomol., 86:330-333). Показано е, че ендотоксини на B. thuringiensis са ефективни като пречистени кристали, промити клетъчни утайки и експресирани протеини.

Warren et al. WO 96/10083, описват не- ендотоксинови протеини по време на вегетативния стадий на Bacillus cereus и В. thuringiensis . Тези вегетативни протеини, наречени Vip1 и Vip2 имат потенциална активност спрямо бълхата- Diabrotica longicornis (северна и западна). Виж, Estruch et al. (1997), NatureBiotechnology 15:137-141.

Един термостабилен метаболит на В. thuringiensis, наречен бета-ендотоксин, също е показано че има пестицидни свойства. Burgjeron and Biache (1979), Entomophaga 11:279-284, докладват за бета- ендотоксин, който е активен спрямо колорадския бръмбар по картофите (Leptinotarsa decemlineata). В допълнение, известните бета- ендотоксини проявяват неспецифична пестицидна активност, не само убиваща нематоди, но също и мухи, кръгли червеи, молци и бълхи. Сигма екзотоксина има сходна структура с бета- екзотоксина, и е активен спрямо колорадския бръмбар по картофите. Виж, Argauer et al. (1991), J. Entomol. Sci. 26: 206- 213. Алфа- екзотоксинът е токсичен за ларви на Musca domestica (Cluthy (1980), FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7). Гама- екзотоксини са различни протеолитични ензими, хитинази и протеази. Токсиновите ефекти на гама- екзотоксине са изразени само в комбинация с бета- екзотоксини или делта- екзотоксин. Виж, Fosberg, С., “Bacillus thuringiensis: Its effects on Enviromental Quality “National Research Council of Canada, Publication No. NRCC, pp. 91-109 (1976). Stonard et al. (1994), ACS Symposium Series 551:25, докладва за водно- разтворим метаболит, активен спрямо бълхи в супернатантата на щам Bacillus cereus.

Цвитермицин А е водно разтворима, киселинно стабилна линеарна аминополиолна молекула (виж He et al. (1994), Tetrahedron Lett. 35(16): 2499-2502) c широкоспектърна активност спрямо много гъбни и бактериални растителни патогени.

Цвитермицин А е известен също да усилва активността на В. thuringiensis. Manker et al. (WO 96/39037) са първите, които са определили възможността на В. thuringiensis да подсилят свойствата на цвитермицин А. По- късно, Schnepf et al. също докладват, че цвитермицин А се подсилва от В. thuringiensis. (US patent 5,702,703).

Известно е, че бацилите продуцират противогъбни и антибактериални вторични метаболити. Виж, Korzybski et al. “Antibiotics isolated from the genus Bacillus (Bacillaceae)” in: Antibiotics- Origin, Nature and Properties, American Society for Microbiology, Washington, D.C. Vol. Ill (1978), and Berdy, CRC Handbook of Antibiotic Compaunds, Vols. I-XIV, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1980-87). Съединенията, продуцирани от В. pumilus включват микрококцин Р, пумилин и тетаин.

Kawaguchi et al., in US patent No. 4,250,170, изолират нов водно- разтворим антибиотик от Bacillus с активност спрямо широк кръг грам позитивни и грам негативни бактерии. Stabb et al. (1990) Applied Environ. Microbiol. 60:4404-44012, са идентифицирали определени щамове Bacillus spp. (Bacillus spp. включват B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis) които проявяват противогъбна активност. Тези щамове е показано, че продуцират цвитермицин А и/или каносамин. Виж, Milner et al., Appl. Environ. Microb. 62:3061-3066 (1996). Те са антибиотични средства, които са ефективни спрямо заболяване по почвите, причинено от Phytopathora medicaginis, Р. nicotianae, Р. aphanidermatum Sclerotinia minor (See, Stabb et al., по- горе). Цвитермицин A e водно разтворима, киселинно стабилна линеарна аминополиолна молекула. Виж, He et al., (1994) Tetrahedron Lett. 35(16): 24992502. Той притежава широкоспектърна активност спрямо много гъбични и бактериални растителни патогени. Каносамина (Milner et al., 1996) също инхибира широк кръг гъбни растителни патогени и някои бактериални видове.

Handelsman et al., in US patent No. 5,049,379, описват как цвитермицин-А- продуциращ В. cereus контролира подтискане на почвите с люцерна и соя. Когато семената се контролират с В. cereus АТСС 53522, патогенната активност на гъбичката на гниене по корените се инхибира. Аналогично, прилагането на основани на спори форми на определени щамове В. cereus към соеви семена или почвата, заобикаляща семената, е показано че подобрява добива на соя в тези места от полето. Виж, Osburne et al. (1995) Am. Phytopatol. Soc. 97(6): 551-556. Методи за приложение на биопестициди са добре известни в областта и включват, например, хигроскопични прахове, микрокапсулиране и течни форми на микроба, пълен бульон или антибиотични фракции от подходящи култури. Виж, напр. US patent No. 5,061,495 to Rossal and US Patent No. 5,049379 to Handelsman et al.

Tsuno et al. (1986) J. Antibiotics XXIX(7): 1001-1003, доклад върху нов амино захарен антибиотик от В. pumilus с активност спрямо широк кръг бактерии in vitro.

Khmel, I.A. et al., (1995) в SU 1817875 описва нов щам Bacillus pumilus VKM CR-333D, който се използва за контрол на гъбни фитопатогени и бактерии.

Leifert et al., J. Appl. Bacteriol. 78:97-108 (1995), докладва продуцирането на анти- Botrytis и анти- Alternaria антибиотици от два щама Bacillus, В. subtilis CL27 и В. pumilus CL 45. Пълният бульон и свободни на клетки филтрати са активни спрямо Botrytis Altemaria и in vitro тестове и са активни спрямо Botrytis и in vivo растителни тестове върху Astilbe. Leifert et al. (1997) US Patent 5,597,565 описват B. subtilis, B. pumilus и B. polymyxa, които са специално ефективни при инхибиране на заболяване, причинено от гъбички след събирането на продукцията, Altemaria brassicicola и Botrytis cinerea. Те описват също наличието на антибиотици, продуцирани в свободния на клетки културален филтрат и тяхната активност при различни стойности на pH, но те не идентифицират тези съединения. Съединенията от В. subtilis губят активност при ниско pH, докато активността на екстрактите от В. pumilus се проявява само при pH стойности под 5.6. Leifert et al. 91998) US Patent No. 5,780,080 описват зеле, което може да бъде третирано с щамове на В. subtilis, В. pumilus В. polymyxa за инхибиране на Altemaria brassicicola and Botrytis cinerea.

Loeffler et al. (1986) J. Phytopatology 115:204-213, описват щамове B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis and B. coagulans, които продуцират различни антибиотици с противогъбична и антибактериална активност. В. pumilus продуцира бацилизин и итурин А. Бацилизина е много малко съединение с молекулно тегло от 270, което инхибира само дрожди. Итурина, който е разтворим в полярни разтворители, има широка противогъбна и антибактериална активност.

В US patent No. 5,344,647, Rossall описва щамове Bacillus subtilis с широка противогъбна активност. Допълнително, US patent No. 5,061,495 to Rossall, предлага нов антибиотик от В. subtilis, който е 63,500 далтона, преципитира при pH под 5 и има активност спрямо грам позитивни бактерии и гъби (Botrytis and Erysiphe). Sholberg et al. (1995) Can. J. Microbiol. 41:247-252, Swinburne etal. (1975) Trans. Brit. Mycol. Soc. 65:211-217, Singh and

Deverall, (1984) Trans. Br. Mycol. Soc. 83:487-490, Ferreira et al. (1991) Phytopatology 81:283-287 and Baker et al. (1983) Phytopathology 73: 1148-1152. Всички те описват използването на Bacillus spp. and Bacillus subtilis като средства за биологичен контрол на гъбни растителни патогени. Pusey et al., US Patent No. 5,047,239 and McKeen et al. (1986) Phytopathology 76:136-139 описват контрол на заболяване след събиране на продукцията с използване на В. subtilis. McKeen et al., по- горе, са показали че антибиотици, сходни на итуриновите цикло полипептиди с ниско молекулно тегло определят фунгицидната активност на В. subtilis.

Liu et al., US patent No. 5,403,583 описва Bacillus sp., (ATCC 55000) и метод за контрол на гъбичния растителен патоген, Rhizoctonia solani. Islam and Nandi (1985) J. Plant Dis. Protect. 92(3):241-246, описват Bacillus sp. c антагонизъм спрямо Dreslera oryzae, причинител на оризовата кафява петнистост. Същите автори, Islam and Nandi (1985) J. Plant Dis. Protect. 92(3):233-240, също описват in vitro антагонизъм на Bacillus sp. спрямо Drechslera oryzae, Alternaria altemata and Fusarium roseum. Te обсъждат три компонента в културалния филтрат. Най- активния антибиотик е силно разтворим във вода и метанол с UV пик при 255 nm и рамо при 260 nm, с което се доказва че е полиоксиноподобен липопептид. Cook et al. (1987) Beltwide Cotton Production Research Conferences, Dallas, TX, pp. 43-45, описват приложението на суспенсия на Bacillus sp. за редуциране броя на памукови растения, умъртвени от Phymatotrichum omnivorum, причинител на гниене по корените на памука.

B’Chir and Namouchi (1988) Revue Nematologique 11(2):263266, доклад върху Bacillus pumilus, който стимулира нематод улавящи гъбички за повишаване тяхната способност да улавят нематоди. B’Chir and Belkadhi (1986) Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. Gent 51/3b: 1295-1310, обсъждат клетъчните взаимодействия на гъби (Fusarium) и нематоди, които причиняват инфектиране на цитрусовите растения. Гъбата се асоциира с В. pumilus (те се срещат заедно) и когато нематода е също там, гъбата е с по- силно действие. В случая В. pumilus се явява като снабдител на храна за нематодите. Gokte and Swarup (1988) Indian J. Nematol. 18(2): 313-318, доклад върху B. pumilus които са нематоцидни, но не докладват за каквато и да е антифунгална активност. Slabospitskaya et al. (1992) Mikrobial Zh (Kiev) 54(6): 1622, сравняват много различни бацилуси, включително В. pumilus за тяхната способност да продуцират хитинази, но те не докладват за активност върху растителни патогени. В. pumilus продуцират най- ниските хитиназни нива. Mclnroy et al. (1995) Plant and Soil 173(2):337-342, са направили преглед на много типове бактерии, включително много Bacillus и В. pumilus, които са ендофити с растителните стебла и корени. Обаче, те не показват доказателство че тези ендофитни щамове са противогъбични. Chernin et al. (1995) Molecular Genetics, намират Bacillus pumilus, които имат широкоспектърна активност спрямо бактерии (напр. Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia) и гъби, които причиняват болести по растенията. Fey et al. (1991) Akad Landwiris Kart, доклад върху щам B. pumilus, който предоставя известна защита на картофените семена от Rhizoctonia solani.

Описание на изобретението

Предложен е нов продуциращ антибиотик Bacillus sp., който проявява противогъбна активност само върху определени специфични растителни патогени и не проявява антибактериална активност. Освен това, предложен е метод за третиране или защита на растения, плодове и корени от гъбни инфекции, включващ етапа на приложение на ефективно количество продуциращ антибиотик Bacillus sp. Продуциращите антибиотик Bacillus sp. могат да бъдат предложени като суспенсия в пълна бульонна култура или като частично пречистена съдържаща антибиотик супернатанта, получена от пълната бульонна култура на продуциращия антибиотик Bacillus sp . Предложен е също нов водно разтворим антибиотик, който проявява специфична противогъбна активност и не проявява антибактериална активност.

Настоящето изобретение предлага също ново съединение, което подсилва инсектицидната активност на В. thuringiensis. Съединението е изолирано от пълна бульонна култура или супернатанта на В. pumilus, който при комбиниране с В. thuringiensis, повишава неговата инсектицидна активност. Изобретението включва също методи за третиране на растения за контрол на заразяване с насекоми върху или във растения с бактериална суспенсия на Bacillus или съдържаща метаболит супернатанта на култура от Bacillus или пречистени метаболити.

Настоящето изобретение предлага комбиниране на щам В30087 с щам В-21661 (AQ713) за използване като фунгициди, където приложението на щамовете заедно предоставя по- висока ефективност в сравнение с това, ако всеки бъде използван самостоятелно.

Кратко описание на чертежите

Фигура 1 е NMR спектър, записан при 400 MHz в D₂O, от частично пречистена фунгицидна фракция на Bacillus sp., депозиран в NRRL No. В-30087.

Фигура 2 показва ¹Н NMR спектър на цвитермицин А, записан при 400 MHz D₂O.

Фигура ЗА до ЗС са капилярни електрофореграми на супернатанта, изолирана от Bacillus както е описано в Пример 9. Условия на електрофорезата: Използвана е 56 см капиляра при 40С, 30kV, позитивна полярност, 100 μΑ с pH 5.8 натриево фосфатен буфер, UV детекция при 200 nm. Фигура ЗА е капилярна електрофореграма на пълна бульонна култура на Bacillus pumilus В- 30087. Фигура ЗВ е капилярна електрофореграма на пълен бульон на Bacillus pumilus В- 30087, запълнена с цвитермицин А стандарт. Пика на цвитермицин А показва възход приблизително към началното време на пропускане от 3.25 минути; няма съпътстващо елуиране с който и да е пик в пълния бульон. Фигура ЗС показва цвитермицин А стандарта в начално време на пропускане от около 3. 28 минути.

Фигура 4 сравнява три електрофореграми от анализа на капилярната електрофореза (СЕ) на частично пречистена фракция на NRRL No. В-30087 самостоятелно (Фигура 4А), частично пречистена фракция на NRRL No. В-30087 с цвитермицин самостоятелно (Фигура 4А), частично пречистена фракция на NRRL No. В-30087 с цвитермицин А (Фигура 4В), и цвитермицин А самостоятелно (Фигура 4С).

Фигура 5 показва ¹HNMR спектър на частично пречистена активна фракция с активност като В+ енхансер, изолиран от В30087, записан при 400 MHz в D₂O.

Начини за осъществяване на изобретението

Настоящето изобретение предлага биологично чиста култура на щам, притежаващ всички идентифициращи характеристики на нов щам Bacillus sp. и негови мутанти или варианти, с противогъбна активност само върху специфични патогени като причинителите на ръжда по растенията, причинителя на брашнеста роса (Erysiphales) и на лъжлива брашнеста роса (Peronosporales). Този нов щам на В. pumilus е депозиран на 14.01.1999 в Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, III. 61604, USA, c номер No. NRRL B-30087, съгласно разпоредбите на Будапещенския договор за Международно признаване депозирането на микроорганизмите за целите на патентната процедура. Щама означен NRRL В-21661 е депозиран в същата институция на 7. март, 1997. Той е съответно идентифициран като Bacillus subtilis от Американската типова колекция за култури (АТСС).

Изобретението включва също методи за предотвратяване и третиране на гъбни заболявани по растенията, включително корени на растенията, с помощта на такива бактериални щамове или съдържащи антибиотик супернатанти или чисти антибиотици, получени от такива бактериални щамове. Изобретението включва също водно- разтворим противогъбен антибиотик с молекулно тегло от по- малко от 10000 далтона, слабо температурно лабилен, позитивно натоварен и HPLC пик с UV абсобрбция при максимум от 280 nm и рамо при 230 nm. Антибиотика не е цвитермицин А.

Други следващи аспекти на изобретението включват пълна бульонна култура или супернатанта на В. pumilus, който при комбиниране с В. thuringiensis подсилва инсектицидната активност на В. thuringiensis. Изобретението включва също методи за третиране на растения за контролиране на заразяване с насекоми върху или в растения с бактериална суспенсия от Bacillus или съдържаща метаболит супернатанта на култура от Bacillus или пречистени метаболити.

Друг аспект на изобретението е неочакван синергистичен ефект от използване на комбинация от щам В. pumilus (NRRL В30087) В. subtilis (NRRL В-21661) като фунгицид. Изобретението включва съставите и методите на използването им като фунгициди.

Определения

Както е използвано в описанието и претенциите, формата за единствено число включва множество референции доколкото контекста ясно не диктува нещо друго. Например, терминът “клетка” включва множество от клетки, включително смеси от тях.

Както е изпозвано тук, терминът “включващ” се предполага че означава че съставите и методите включват цитираните елементи, но не изключват други. “Състоящ се по същество от” когато се използва за определяне състави и методи, ще означава изключване на други елементи от каквато и да е съществена значимост за комбинацията. Така, състав състоящ се по същество от елементите, както са определени тук не биха изключвали следи от замърсители от метода на изолиране и пречистване и фармацевтично приемливи носители, като фосфатно буфериран разтвор на соли, консерванти и др. подобни. “Състоящ се от” ще означава повече от следи от елементи за други инградиенти и съществени за метода етапи на въвеждане на съставите от това изобретение. Вариантите на изпълнение, дефинирани с всеки от тези термини са в рамките на обхвата на това изобретение.

Термина “изолиран” се използва взаимообменно с биологично чист” и означава отделен от компоненти, клетъчни или други, в които обикновено щама или метаболита е асоцииран в природата.

Както е използван тук, термина “биологичен контрол” се дефинира като контрола от патоген или насекомо чрез използване на втори организъм. Известни механизми на биологичен контрол включват ентеробактерии, които контролират гниенето по корените чрез гъбички, конкурентни за пространство на повърхността наа корена. Бактериални токсини, като антибиотици, са използвани за контрол на патогени. Токсина може да бъде изолиран и приложен директно на растението или бактериалният вид може да бъде въведен така, че да продуцира токсина in situ.

Термина “гъба” или “гъби” включва широко разнообразие от ядрени спороносещи организми, които са лишени от хлорофил. Примери за такива гъби включват дрожди, плесени, причинителите на брашнеста роса и ръжда по растенията, както и едливи гъби.

Термина “бактерия” включва който и да е прокариотен организъм, който не притежава отчетливо ядро.

“Фунгициден” означава способността на вещество да повишава свъртността или да инхибира скоростта на растеж на гъбите.

“Антибиотик” включва което и да е вещество, което е способно да убие или да инхибира даден микроорганизъм. Антибиотици могат да бъдат продуцирани чрез микроорганизъм или чрез изкуствен процес или полу- синтетичен процес. Термина, поради това, включва вещество, което инхибира или убива гъби например, цвитермицин А или каносамин.

“Противогьбен включва което и да е вещество, което е способно да убие или инхибира растежа на гъбите.

Термина “култивиране” се отнася до размножаването на организми върху или в среда от различен вид.

“Пълна бульонна култура” се отнася до течна култура, съдържаща както клетки, така и среда.

“Супернатанта” се отнася до течен бульон, оставащ когато клетките, развили се в бульона бъдат отстранени чрез центрофугиране, филтруване, седиментация или с други средства, добре известни в областта.

Както се използва тук, термина “инсекти” (насекоми) включва всички организми от класа “Insecta”. “Съзряващо” насекомо се отнася до която и да е форма на организма преди стадия на възрастно насекомо, включително например, яйца, ларва и нимфи. “Инсектициден” се отнася до способността на вещество да повиши смъртността или да инхибира скоростта на растеж на насекомите. “Нематоциден” се отнася до способността на дадено вещество да повиши смъртността или да инхибира скоростта на растеж на нематодите. “Пестициден” се отнася до способността на вещество да повиши смъртността или да инхибира скоростта на растежа на насекоми, нематоди и плесени.

“Позитивна контрола” означава съединение, известно че има пестицидна активност. “Позитивни контроли” включват, но не се ограничават до, търговско достъпни химични пестициди. Термина “негативна контрола” означава съединение, известно като не притежаващо пестицидна активност. Примери на негативни контроли са вода или етил ацетат.

Термина “разтворител” включва която и да е течност, която носи друго вещество в разтвор. “Екстрактируемо в разтвор” се отнася до което и да е съединение, което се разтваря в разтворител и което след това може да бъде изолирано от разтворителя. Примери на разтворители включват, но не се ограничават до, органични разтворители като етил ацетат.

Терминът “метаболит” се отнася до което и да е съединение, вещество или съпътстващ продукт на ферментация на микроорганизъм, който има пестицидна активност. Антибиотик, както е определен по- горе, е метаболит, специфично активен спрямо микроорганизъм.

“Състав” се предполага, че означава комбинация от активно средство, инертно (например, средство за откриване или маркер) или активно, като аджувант.

“Фракция” се предполага, че означава определена част от фракционирана проба, използвана за разделяне на молекулите от супернатантата по размер, полярност или натоварване.

“Частично пречистена фракция” е една от частите, взета от фракционираната проба, която е в състояние да инхибира развитието в биологичната проба или да засили В+ активност спрямо лепиолоплаус.

“Ефективно количество” е количеството, достатъчно да повлияе благоприятни или желани резултати. В границите на третирането и защитата, “ефективно количество” е количеството, достатъчно да подобри, стабилизира, забави или отложи прогресирането на заразяване с насекоми.

Ние описваме биологично чиста култура от щам, притежаващ всички идентификациони характеристики на нов продуциращ антибиотик щам Bacillus sp., депозиран в NRRL No. В-30087, и негови мутанти, които имат противогъбична активност само върху специфични растителни патогени и не притежават антибактериална активност. В един аспект, щама е Bacillus pumilus, депозиран в NRRL No. В-30087, и мутанти на щама.

В други аспекти, щама е мутант или вариант на NRRL No. В30087, който има всички идентификационни характеристики (както е предложено по- долу) на щама, депозиран в NRRL под No. В30087. Мутанти или варианти са използвани взаимосвързани в цялото описание и по- нататък, могат да бъдат идентифицирани като притежаващи геном, който хибридизира в строго ограничените условия на генома на NRRL No. В-30087. “Хибридизация” се отнася до реакция в които един или повече полинуклеотиди реагират за формиране на комплекс, който е стабилизиран чрез водородно свързване между базите на нуклеотидните остатъци. Водородното свързване може да стане чрез удвояване на базите по Watson- Crick, свързване по Hoogstein, или в който и да е друг секвенционно- специфичен начин. Комплекса може да включва две вериги, формиращи дуплексна структура, три или повече вериги, формиращи многоверижен комплекс, самостоятелна самохибридизираща се верига или която и да е комбинация от тях. Хибридизационните реакции могат да бъдат осъществени в условия с различна “строгост”. Най- общо, хибридизационна реакция с неособено строгост на условията се провежда при около 40°С в 10XSSC или разтвор с еквивалентна йонна сила/температура. Средно строга хибридизация обикновено се провежда при около 50°С в 6XSSC и строга хибридизационна реакция обикновено се провежда при около 60°С в 1XSSC.

Мутант или вариант на NRRL No. В-30087 може също да бъде определен като щам, притежаващ геномна последователност, която е по- голяма от 85%, за предпочитане по- голяма от 90% или още повече за предпочитане от 95% секвенционна идентичност спрямо генома на NRRL No. В-30087. Полинуклеотида или полинуклеотидния участък (или полипептид или полипептиден участък) да има определен процент (например, 80%, 85%, 90% или 95%) “секвенционна идентичност” спрямо друга последователност означава, че при деспирализация, този процент от бази (или амино киселини) са същите при сравняване на двете последователности. Тази деспирализация и процента на хомоложност или секвенционна идентичност могат да бъдат определени с помощта на софтуерни програми, известни в областта, например, онези описани в Current Protocols in Molecular

Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. За предпочитане, за деспирализация се използвани специални параметри. Предпочитана програма за деспирализация е BLAST. В частност, предпочитани програми са BLASTN и BLASTP, с помощта на следните параметри: Генетичен код=стандарт; филтър=не; верига=двете; срязване=60; очакване=10; MaTpnKC=BLOSUM62; Описание=50 последователности; подбор чрез= HIGH SCORE; Бази данни= без излишък, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + Spupdate + PIR. Подробности на тези програми може да бъдат намерени на следния Интернет адрес: http://www.ncbi.nlm.nih.qov/cqi-bin/BLAST.

Изобретението по- нататък осигурява супернатанти, получени от посочените по- горе култури. Супернатантата може да бъде получена по методи, добре известни в областта, включващи: центрофугиране; филтрация; седиментация и др. подобни.

В друг аспект, изобретението обхваща изолиран метаболит, който е водно разтворим противогъбен антибиотик. Метаболита е изолиран от щамовете на това изобретение и е описан по- горе. Той притежава химични характеристики, според които е по- малко от 10,000 далтона, UV абсорбционен пик при 280 nm и рамо при 230 nm, устойчив на киселина и основа, слабо лабилен на нагряване над 80°С, и позитивно натоварен с активност върху специфични растителни патогени, но без активност върху бактерии. Това изобретение по- нататък предлага метод за продуциране на този метаболит, метода включващ култивиране на щам от това изобретение и изолиране на активния метаболит с помощта на методите, описани по- долу.

Друг аспект на изобретението е частично- пречистена активна фракция на NRRL No. В- 30087, който притежава фунгицидна активност. Активната фракция не е идентична на цвитермицин А.

По- нататък това изобретение предлага състави, включващи който и да е от посочените по- горе щамове (включително негови мутанти или варианти), супернатанти, фракции и метаболити, самостоятелно или в комбинация с всеки друг и носител. Тези състави могат да бъдат по- нататък заместени с добавянето на най- малко един химически или биологически пестицид. Тези състави може да бъдат включени в различни форми, като например хигроскопични прахове, гранули и водни суспенсии, емулсионен концентрат или микрокапсулиране.

С оглед постигане добра дисперсия и адхезия на съставите в рамките на настоящето изобретение, преимуществено може да бъде формирана пълната бульонна култура, супернатанта, фракция и/или метаболит/антибиотик с компоненти, които целят дисперсия и адхезия. Съответно, подходящи форми са добре известни на специалистите в областта (хигроскопични прахове, гранули и др. подобни, или могат да бъдат микрокапсулирани в подходяща среда и други подобни, течности като водни потоци и водни суспенсии и емулсионни концентрати). Други подходящи форми ще бъдат известни на специалистите в областта.

Всеки от посочените по- горе щамове, метаболити, фракции, супернатанти и състави, съдържащи тези активни инградиенти, може да бъде използван за осигуряване на метод за третиране или защита на растения, корени или плодове от гъбни инфекции. Метода включва прилагане на ефективно количество от щам, метаболит, фракция, супернатанта или състав, съдържащ тези активни инградиенти, самостоятелно или в комбинация с всеки друг и/или друг биологичен или химичен пестицид, на инфектираните корени, растение или плодове. Ефективни количества от тези състави могат да бъдат приложени също на растението, корена или плодовете за предотвратяване на това заразяване.

В друг аспект, изобретението обхваща метод за третиране или защита на растения, корени иплодове от гъбни заболявания, включващ прилагане на ефективно количество от антибиотика, продуциран със щама, или негови варианти, притежаващ всички идентификационни характеристики на новия щам Bacillus sp. NRRL No. В-30087. В един вариант на изпълнение, щама е Bacillus sp. NRRL No. В-30087.

Изобретението по- нататък предлага водно разтворимо съединение, което засилва инсектицидната активност на Bacillus thuringiensis, където съединението има молекулно тегло от помалко от 10,000 далтона и съединението не е цвитермицин А. Съединението не е бета екзотоксин или друг продуциран от Bacillus thuringiensis екзотоксин.

Съединението е изолирано с анийонообменна смола, ацетонитрилна преципитация и ситова хроматография (SEC). Това изобретение предлага също частично пречистена фракция на супернатантата на Bacillus който съдържа новото съединение. Новото съединение и активната фракция може да бъде изолирана от Bacillus , избран от групата на Bacillus spp., включваща, но без да се ограничава до В. subtilis, В. cereus, В. mycoides и В. pumilus.

Частично пречистената активна фракция може да бъде идентифицирана с нейния ¹Н NMR (или протонна NMNR) спектър, което позволява на химика- специалист в областта да определи дали съединението е било напълно пречистено. Когато съединението е чисто, пика представляващ един протон след това ще се интегрира за стойността на два. Пиковете, представляващи три протона, например метилна група, ще се интегрира за три. Това е случая за Фигура 3, стандарт за чист цвитермицин А. Обаче, ¹Н NMR спектъра на активния частично пречистен Bacillus thuringiensis енхансер има група от пикове, които интегрират за по- малко от един и поради това принадлежи на различно съединение от по- големите пикове в спектрума.

При изолиране, съединението не проявява инсектицидна активност. Комбинация с Bacillus thuringiensis засилва инсектицидния ефект на Bacillus thuringiensis, когато се прилага на растения и растителни корени. Bacillus thuringiensis може да бъде във формата на микробиален щам, търговски продукт, модифицирано по генен път растение, инсектицидно активен метаболит, инсектицидно активна супернатанта или делта ендотоксин.

Bacillus thuringiensis е Грам- позитивна, спорообразуваща бактерия, характеризираща се с параспорални кристалинни протеинови инклузии. Протеините могат да бъдат силно токсични спрямо вредителите и специфични в тяхната токсична активност. Както е използван в претенциите по- долу, термина Bacillus thuringiensis” включва микробиални щамове, търговски продукти съдържащи такива щамове или изолати, съдържащи активните метаболити или фракции, изолирани от щамовете, генетично модифицирани или конструирани растения, които експресират ген, кодиращ Bacillus thuringiensis инсектициден протеин или генен продукт или делта ендотоксин. Гени на токсина са изолирани и съгласувани, и са получени продукти, основан на рекомбинантна ДНК Bacillus thuringiensis, като са доказани и техните приложения. По настоящем се развиват генно инженерни техники и се произвеждат в търговската мрежа нови подходи за доставяне на тези Bacillus thuringiensis ендотоксини до земеделските площи. Това включва използването на растения, генетично конструирани с ендотоксинови гени за устойчивост на вредители и използването на стабилизирани интактни микробиални клетки като доставящи ендотоксина на Bacillus thuringiensis вехикулуми (Gaertner, et al. (1988) TIBECH 6:S4-S7). Bacillus thuringiensis може да достигнат до целените вредители чрез излагането им на див тип Bacillus thuringiensis, който естествено експресира токсина. Обратно, гена кодиращ желания токсин може да бъде трансформиран в и експресиран в подходяща гостоприемникова клетка. Фрагменти на токсините на Bacillus thuringiensis, които съхраняват инсектицидната активност също могат да бъдат използвани.

Изброените по- долу US патенти описват пестицидни Bacillus thuringiensis изолати или рекомбинантни микроби, които експресират Bacillus thuringiensis токсин: US pat. Nos.: 5,006,335; 5,106,620; 5,045,469; 5,135,867; 4,990,332; 5,164,180; 5,126,133; 5,093,119; 5,208,017; 5,186,934; 5,185,148; 5,211,946; 4,948,734; 4,849,217; 4,996,155; 4,999,192; 4,966,765; 5,073,632; 5,196,342; 5,063,055; 5,080,897; 5,024,837; 5,147,640; 5,173,409; и 5,186,934.

Препарати от спорите и кристалите на Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki са използвани от много години като търговски инсектициди за вредители от разред Lepidoptera (пеперуди).

Например, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 продуцира кристал, наречен -делта ендотоксин, който е токсин ссрещу ларвите на много насекоми от посочения разред. В допълнителни видове от Bacillus thuringiensis, наречени израелензис и тенебриони, са използвани в търговията за контрол на насекомите.

Клонирането и експресията на кристален протеинов ген на Bacillus thuringiensis в Eshehchia coli е описано в Schnepf, Н. et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2893-2897. US Patent No. 4,448,885and US Pat. No. 4,467,036 едновременно описват експресията на кристален протеин в Е. coli. Конструирани са хибридни гени за кристален протеин на Bacillus thuringiensis, които проявяват повишена токсичност и разширен обхват на гостоприемници за целените вредители. Виж, US Pat. Nos. 5,128,130 и 5,055,294. US Pat. Nos. 4,797,276 и 4,853,331 описват щам на Bacillus thuringiensis San Diego (a.k.a.B.t. tenebrionis, a.k.a. M-7), който може да бъде използван за контрол на вредители от разред Coleoptera (твърдокрили) в различни местообитания. US Pat. No. 4,918,006 описват Bacillus thuringiensis притежаващ активност спрямо Diptera (двукрили). US Pat. No. 4,849,217 описва изолати на Bacillus thuringiensis, който притежава активност спрямо вредителя по люцерната дългоноско (Curculionidae). US Pat. No. 5,151,363 и US Pat. No. 4,948,734 описват определени изолати на Bacillus thuringiensis, който притежава активност срещу нематоди.

Култури на Bacillus thuringiensis също са достъпни от United States Department of Agriculture (USDA) in Brownsville, Tex. Искания могат да бъдат отправяни до USDA, ARS, Cotton Insects Research Unit, P.O. ВохЮЗЗ, Brownsville, Tex. 78520 USA; или до Northern

Research Laboratory, US Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, III., USA.

Поради това, съединението и активната фракция засилват инсектицидната активност на Bacillus thuringiensis срещу насекоми, които включват, без да се ограничават до нематоди, мухи, кръгли червеи, молци, колорадски бръмбар по картофите и бълхи.

Както е добре известно на специалистите в областта, активната компонента може да бъде приложена под форма на състав. Съответно, това изобретение също предлага състав, съдържащ новото съединение и носител, като разтворител или подходящ за селското стопанство носител. В друг вариант на изпълнение, състава по- нататък включва ефективно количество от Bacillus thuringiensis, както е описано по- горе. В още един вариант на изпълнение, състава включва най- малко един химически или биологически пестицид, който е обичайно използван в областта. С оглед достигане на добра дисперсия и адхезия на сътавите в рамките на настоящето изобретение, преимущество може да бъде формиране на пълна бульонна култура, супернатанта и/или метаболит с компоненти, които целят дисперсия и адхезия. За по- лесно прилагане на растенията или корените на растенията, формите могат да бъдат преработени в такива, подбрани от групата състояща се от хигроскопичен прах, адхезионна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.

Новото съединение, негова активна фракция или състави, които го съдържат, могат да бъдат използвани за повишаване инсектицидната активност на Bacillus thuringiensis. Така, това изобретение също предлага метод за повишаване инсектицидната активност на Bacillus thuringiensis чрез комбиниране на ефективно подсилващо количество от новото съединение, негова активна фракция или състав, който го съдържа с Bacillus thuringiensis. В следващ аспект, ефективно количество от най- малко един биопестицид или химически пестицид се добавя към формата.

Изобретението по- нататък включва използването на ново съединение, NRRL No. В-30087 в комбинация с NRRL No. В-21661, приложен като пълна бульонна култура върху растението, корена или плодовете, за приложение като фунгицид, като посочения фунгицид притежава по- голям потенциален ефект като резултат от неочаквания синергистичен ефект на комбинацията от съединения. За предпочитане, комбинацията се прилага в съотношение от 1:2 (В-21661 :В-30087) на Botrytis cinerea или Peronospora parasitica. Дори повече се предпочитаприлагането на комбинацията върху Botrytis cinerea или Peronospora parasitica в съотношение 1:4. В следващ вариант на изпълнение, състава включва най- малко един химически или биологически пестицид, който е обичайно използван в областта. С оглед достигане на добра дисперсия и адхезия на сътавите от настоящето изобретение, преимущество е формирането на пълна бульонна култура, супернатанта и/или метаболит с компоненти, които достигат дисперсия или адхезия. За лесно прилагане върху растения или корени на растения, формите могат да бъдат преработени в такива, избрани от групата, състояща се от хигроскопичен прах, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.

В настоящето описание са включени различни публикации, патенти и публикувани патентни описания посредством идентифициращо цитиране. Разкриването на тези публикации, патенти и публикувани патентни описания са включени в настоящето описание с оглед по- пълно описване нивото на техниката, към което принадлежи това изобретение.

ПРИМЕРИ

Следните примери илюстрират, без да ограничават настоящето изобретение.

Пример 1

Охарактеризиране на щам NRRL No. В-30087.

Щам NRRL No. В-30087 е идентифициран на основата на клетъчните мастни киселини, превърнати в метил естери- FAMEs (Miller, L. Τ. (1982) “Single derivatization method for routine analysis of bacteria whole cell wall fatty acyd methyl esters, including hydroxy acids” J. Clin. Microbiol. 16:584-586) и анализиран чрез газова хроматография с помощта на MIDI система (Microbial Identification System, Inc., Newark. DE). Процедурата и протоколите, използвани за култивиране на бактериалните култури и използваните спецификации са описани от MIDI (Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. Technical Note#101. MIDI, Inc., 115 Barksdale Professional Center, Newark, DE). Изолатите се култивират върху TSA (BBL) панички при 28°С за 24 часа и клетките се събират. Добавя се един ml от метанолова NaOH (15% [wt/vol] NaOH в 50% [vol/vol] метанол) и клетките се подлагат на сапониране при 100°С за 30 минути. Провежда се естерификация на мастните киселини с 2 ml от 3.25 N HCI в 46% (vol/vol) метанол при 80°С за 10 минути. Екстрахират се FAMES в 1.25 ml от 1:1 (vol/vol) метил-терц-бутил етер- хексан, и органичния екстракт се промива с 3 ml 1.2% (wt/vol) NaOH преди анализиране с газова хроматография. Газ хроматографа (HewlettPackard 5890А) е снабден с пламъков йонизационен детектор и капилярна колона (Hewlett- Packard 19091В-102, кръстосаносвързан 5% фенил метил силикон; 25 m ID; дебелина на филма 0.33 Ilm; съотношение на фазите от 150)с водород като носещ газ. Hewlett- Packard 3392 интегратор автоматично интегрира FAME пикове и бактериални изолати, означени с помощта на MIDI Microbial Identification Software (Sherlock TSBA Library version 3.80). FAME профила на Xanthomonas maltophila ATCC 13637 ce използва като референтна проверка за MIDI определянията.

Резултатите от трите отделни MIDI профила идентифицират NRRL No. В-30087 като Bacillus pumilus с аналогичен индекс от 0.875.

Пример 2

Активност на NRRL No. В-30087 срещу растителни патогени в in vitro култура (зонално изпитване).

За определяне дали NRRL No. В-30087 е ефективен срещу широк кръг растителни патогенни гъби, се провежда следния експеримент с помощта на тези растителни патогени: Botritis cinerea, Alternaria brassicicola, Colletorichum acutatum, Cladosporium carophylum, Monilinia fructicola, Venturia inaequalis, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Taphina deformans u Verticillium dahliae.

За определяне активността на NRRL No. В-30087 в агарна (зонална) дифузионна проба, растителни патогенни спори (спорите се настъргват от повърхността на петриеви панички и се разреждат до приблизително 1 χ 10⁵ спори/ml (в зависимост от патогена) се разпръскват на повърхността на картофено декстрозен агар в 10 cm петриеви панички. За Rhizoctonia solani и Sclerotinia sclerotiorum, върху паничките се разпръскват мицелни фрагменти вместо спори. Кръгли ямки, приблизително 7.0 mm се отстраняват от агара и 125 I проба от супернатантата на NRRL No. В-30087 се култивира в соя, в кладенчето се поставя среда от дрождев екстракт от 250 ml шейкерни колби, 72 часа.

Супернатантата се приготвя чрез центрофугиране при 12,000 rpm за 10 минути. Типичните резултатите могат да се състоят от зона без растеж и/или редуциран растеж на патогена около кладенчето или няма зона изобщо. Измерва се размера на зоната в милиметри и се записва, ако има такава. Резултатите са показани на Таблица 1, по- долу.

Таблица 1

In vitro тест на NRRL No. В-30087 срещу гъбни растителни патогени

Altemaria brassicicola	Няма зона
Botrytis cinerea	Няма зона
Cladosporium carpohylum	Няма зона
Colletotrichum acutatum	Няма зона
Fusarium oxysporum	Няма зона
Monilinia fructicola	Няма зона
Rhyzoctonia solani	Няма зона
Sclerotinia sclerotiorum	Няма зона
Taphrina deformans	Няма зона
Venturia inaequalis	Няма зона
Ventricillium dahliae	Няма зона
Pythium sp.	Няма зона
Phytophthora infestans	Слаба активност (малка, мътна зона)
Phytophthora capsici	Няма зона
Didimella bryonia	Няма зона

NRRL No. В-30087 супернатанта не показва активност срещу повечето гъбни растителни патогени в зоналните тестове.

Пример 3

Активност на NRRL No. В-30087 срещу бактериални растителни патогени.

Стандартна агарова дифузионна проба се изготвя както в Пример 2. Посявка от всеки бактериален патоген се разпръсква на повърхността на картофено декстрозен агар. 125 I проба от NRRL No. В-30087 супернатанта се поставя във всяко кладенче, както е описано по- рано. Наличието на зона или размер от зоната се измерва в милиметри.

Таблица 2

In vitro инхибиране на бактериални растителни патогени (зонален тест)

NRRL No. В-30087 супеонатанта	Зона на инхибиране (mm)
Pseudomonas syringae pv. Tomato	Няма зона
Xanthomonas campestris pv. campestris	Няма зона
Erwinia carotovora subsp. Carotovora	Няма зона

NRRL No. В-30087 не е активен спрямо който и да е вид от бактериалните растителни патогени, тествани in vitro.

Пример 4

Активност на NRRL No. В-30087 спрямо растителни патогени в тестове с растения.

Активността на NRRL No. В-30087 се изпитва спрямо ръжда по бобови растения, Uromyces phaseoli и сивата плесен, Botrytis cinerea по пипера, Alternaria solani по доматите, и лъжлива брашнеста роса по цветното зеле, Peronospors parasitica, късно гниене по доматите, Phytophthora infestans, и лъжлива брашнеста роса по гроздето, Uncinula necator.

Alternaria solani

Патогена, Alternaria solani, се култивира върху стандартни петриеви панички (10 см) с PDA. Гъбните колонии се изрязват от паничката и се поместват върху спорулационна среда (20 g захароза, 30 g калцев карбонат и 20 g arap за литър стерилна

26°С с 14 часа фотопериод за два дни. Спорите се събират чрез остъргване на мицелните блокове в мензурка със стерилна вода. Споровата суспенсия се довежда до 2 х 10⁴ спори /ml.

Доматени покълнеци (UC82-B) в стадий 3-4 листа засадени в двуинчови саксии и поставени върху плоски повърхности, се напръскват с обикновена четка за рисуване с NRRL No. В-30087 пълен бульон, култивиран в соево брашно, дрождева екстракционна среда за 72 часа в 250 ml шейкерни колби. След напръскването, покълнеците се оставят да изсъхнат минимум два часа. Инокулираните покълнеци се поставят в камера на Percival при 22°С без осветление за първите 40 часа. Растенията от всяка от плоските повърхности се покриват с пластмасово покривало и се оставят при 20- 22°С за 48 часа в инкубатор на Percival при 14 часов фотопериод. Вода без NRRL No. В-30087, с и без спори от патогена се използва като негативна контрола и позитивна патогенна контрола. Също така, химичен фунгицид (напр. Azoxystrobin, Abound®) се използва за сравняване при степени от 100 до 250 ppm. Растенията се записват на скала от 0 до 5, където 5 е 100% инфектирани и 0 означава, че няма симптоми на заразяване. На водна A. solani контрола, има еднородни лезии по всички листа и котиледоните са отделени и инфектирани по особен начин (степен от 5= пълно инфектиране, няма контрола). Третирани с NRRL No. В-30087 растения не изглеждат различни от водната контрола. Няма контрола на патогена с NRRL No. В30087 (също степен 5). Негативната контрола не е инфектирана. Химично третираните растения имат степен между 0 и 1.

Botrytis cinerea

Патогена, Botrytis cinerea, е култивиран върху стандартна петриева паничка (10 см) с PDA и спорите са събрани с помощта на картофено декстрозен бульон (PDB) заместена с малц (0.5 g/L) и дрождев екстракт (0.5 g/L) и доведен до 1 X 106 спори/ml. Използваните растения са пипер (Yolo Wonder) култивиран в двуинчови саксии до стадий 3- 5 листа. Прилагането на NRRL No. В-30087 и патогена са същите както по- горе. Плоските повърхности, на които са подредени саксиите се инкубират при постоянни 20°С без осветяване. Те се покриват с пластмасови покривала и се оставят за 2.5 дни (60 до 65 часа) до записване на резултатите.

За сравнение се използва химичен фунгицид (напр. Ипродион, Роврал®) при стойности от 20 до 100 ppm. Растенията се записват на скала от 0 до 5, където 5 означава 100% инфектиране и 0 не показва наличие на симптоми. Във водната контрола с В. cinerea има еднородни лезии по всички листа (степен от 5 = пълна инфекция, няма контрола). Обработени с NRRL No. В-30087 не изглеждат различни от водната контрола. Няма контрола от патогена с NRRL No. В-30087 (също степен от 5). Негативната контрола не е инфектирана. Химично обработените растения имат степен от 0 до 1.

Bremia lactucae

За теста с Bremia , семена за салата се засаждат в слой от стерилизирана смес, съдържаща торф, перлит и вермикулит в малки светли пластмасови кутии за растения с размери от около 8 сантиметра височина и квадрат. Една седмица след засаждането, салатните покълнеци се напръскват с проба от бульон или супернатанта от NRRL No. В-30087. Растенията се оставят да изсъхнат и след това от инфектираните салатни покълнеци се събира суспенсия от спори на лъжлива брашнеста роса (2 х 10⁴спори/ml) и се разпръсква върху покълнеците. Химичнит стандарти, състоящи се от Aliette (fosetyl-al) и Ridomil (metalaxyl) също се прилагат. Обаче, изолата от Brimia lactucae използван в тези тестове по- рано е демонстрирано че е нечувствителен спрямо тези два химични стандарта, които са използвани по търговски път. Пластмасовите кутии се покриват с плътно прилепнали капаци и се инкубират при 15-16°С в инкубатор Percival за 16 часа без осветяване. Пластмасовите кутии след това се поставят на стайна температура (20-26°С) при осветяване за 6 дни. Покълнеците се отварят, напръскват се с вода, възстановяват се и след това се връщат в инкубатора при 1516°С за спорулация за една нощ. Ефекта на NRRL No. В-30087 върху химично- резистентния щам за лъжлива брашнеста роса по салатата е показан по- долу на Таблица 3.

Таблица 3

	степен
	Rep 1	Rep 2	Rep 3
NRRL No. В-30087 Проба 1	0.0	1.0	1.0
NRRL No. В-30087 Проба 2	1.0	1.0	0.0
Aliette 240 ppm	5.0	3.0	-
Ridomil 125 ppm	3.0	3.0	-
Водна проверка	5.0	5.0	5.0

NRRL No. В-30087 притежава отлична активност спрямо причинителя на лъжливата брашнестата роса по салатата с малка до липса на спорулация на патогена върху покълнеците, където контролните (водна проверка) растения са напълно спорулирали с лъжлива брашнеста роса. Химичните стандарти не контролират ефективно патогена.

Peronospora parasitica

Щам Bacillus NRRL No. В-30087 се култвират както по- горе в 250 ml шейкерни колби. Пълна бульонна култура със сила 1Х се наплъсква върху цветно зеле на възраст една седмица или покълнеци от Брюкселско зеле в стадий пълен котиледон с обикновена четка за рисуване. Три репликата от 15- 25 покълнеци/ саксия се напръскват за едно третиране. Спорова суспенсия от лъжлива брашнеста роса, Peronospora parasitica при

1-5 X 10⁴ спори/ml се напръскват върху растения Brassica след първото прилагане на NRRL No. В-30087 . Химичните стандарти, състоящи се от Aliette (fosetyl- al) и Ridomil (metaxyl) също се прилагат. Обаче, изолата от Peronospora parasitica, използвани в тези тестове е показано по- рано че са нечувствителни на тези два химически стандарти, които са изоплзвани в търговията.

Растенията се държат при 15-17°С за 16 часа за инфектиране, след това покълнеците се инкубират при 20- 24°С за шест дни. Саксиите след това се връщат на 15- 17°С за една нощ за спорулация на патогена. Всяко растение се оценява чрез изпитване процента на заболялата контрола на базата на скала от 0 до 5. Рейтинг нула е растение без спорулационни лезии. Резултатите през репликативните саксии са показани по- долу на Таблица 4.

Таблица 4

		степен
	Rep 1	Rep 2	Rep 3
NRRL No. В-30087 Проба 1	0.5	1.0	0.5
NRRL No. В-30087 Проба 2	0.5	0.5	1.0
Aliette 240 ppm	5.0	3.0	-
Ridomil 125 ppm	4.0	4.0	4.0
Водна проверка	5.0	3.0	5.0

NRRL No. B-30087 контролира лъжливата брашнеста роса по цветното зеле по- ефективно в сравнение с нетретираната проверка и химичните стандарти.

Uncinula necator

Лозови насаждения (Chardonnay) се култивират в двуинчови саксии до стадий 6- 9 листа. Културата от истинска брашнеста роса се наблюдава върху лозови насаждения при 2226°С в 14 часов фотопериод. Всички най- млади 2-4 листа се отстраняват. NRRL No. В-30087, химичният фунгицид (Rally®, миклобутанил при 25 ppm) и са прави водна проба както по- горе за другите тествани патогени. За инокулиране с истинска брашнеста роса, листата с вредителя от поддържаните насаждения се отстраняват и всяко растение се инокулира индивидуално. Повърхността на поддържаните насаждения внимателно се изчетква с четка за рисуване така че спорите да паднат върху горната повърхност от тестваните растения. Процедурата се осъществява с помощта на ЗХ светлинно увеличителни лещи, за да е сигурно, че всички растения са приели еквивалентен инокулум. Поставките със саксии се поставят на тъмно за 16- 24 часа при 20- 24°С с 14 часов фотопериод за допълнителни 9-11 дни докато теста е готов. Както по- горе, растенията получават степен от 0 до 5. Резултатите използващи NRRL No. В-30087 са показани по- долу на Таблица 5.

Таблица 5

		степен
	Rep 1	Rep 2	Rep 3	Rep 4
NRRL No. В-30087	0.5	0.0	1.0	1.0
Rally 25 ppm	0.0	0.0	0.0	0.0
Водна проверка	5.0	3.0	-	-

NRRL No. В-30087 контролира лъжливата брашнеста роса Uncinula ефективно, сравнено с нетретираната проба и почти така добре, както химичния стандарт Rally.

Phytophthora infastans

Теста за късното гниене по доматите, Р. infestans, се провежда с използване на доматени разсад (UC82-B) при стадия

2- 4 листа, порастнали в двуинчови квадратни пластмасови саксии. Правят се приложения на NRRL No. В-30087 култивирани както е описано по- рано върху доматен разсад. Инокулум от Р. infestans се продуцира чрез изстъргване на спорулираща колония върху агар и довеждане на концентрацията на инокулума до от 0.7 до 1.0 X 10⁴ спорангии/ml. Инокулираните покълнеци се поставят върху плоскости и се инкубират точно както е описано в теста за A. solani. Разсада се оценява на скала 0-5. Използван е Quadris ® (azoxysrobin) за сравняване при степен от 62.5 до 125 ppm. Резултата с използване на NRRL No. В-30087 е показан подолу на Таблица 6.

Таблица 6

			степен
	Rep 1	Rep 2	Rep 3	Rep 4	Rep 4
NRRL No. В-30087	0.5	0.0	1.0	1.0	1.0
Rally 25 ppm	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
Водна проверка	5.0	3.0	-	-	-

NRRL No. В-30087 контролира късното гниене по доматите както и химичния стандарт, Quadris, след четири дни инкубация.

Uromyces phaseoli

Теста за ръжда по боба, U. phaseoli, се провежда с помощта на бобови покълнеци (Provider variety) до порастване на първите листи до %. Прилагането на щам NRRL No. В-30087 се прави както е описано по- рано за други комбинации от гостоприемник и патоген. Инокулум от патогена за ръждата се съхранява като изсушени спори в епруветки при -20°С. Инокулума се изготвя чрез добавяне на изсушени спори за ръжда към вода с 0.01% Tween 20 и се разбърква енергично с магнитна бъркалка за най- малко един час. Инокулума се довежда до 2-4 X 10⁵ спори/ml. Първичните листа се инокулират и покълнеците се поставят върху плоскости и инкубират за една нощ при 20°С в камера на Percival. Покълнеците след това се инкубират на стайна температура (2026°С) за допълнителни 8- 10 дни. Покълнеците се определят на скала от 0 до 5 на базата на идентичността и силата на спорулация на наличните мехурчета от вредителя.

Химичният фунгицид, Break® (пропиконазол) се използва за сравнение при степен от 40 ppm. Резултата с използването на пълен бульон от NRRL No. В-30087 е показан по- долу на Таблица

7.

Таблица 7

		Степен
	Rep 1	Rep 2	Rep 3
NRRL No. В-30087	0.5	0.5	0.0
Break® 40 ppm	0.0	0.0	0.5
Водна проверка	5.0	5.0	5.0

NRRL No. В-30087 контролира ръждата по бобови приблизително така, както химичния стандарт, Break®.

Пример 5

Противогьбен метаболит, продуциран от NRRL No. В-30087.

Пълният бульон от NRRL No. В-30087 се разпределя на части в етил ацетат, бутанол и водни фракции. Всяка фракция се тества срещу ръждата лъвско око в проба за прорастване на спорите. Спорите на лъвското око се развиват в присъствието на всяка проба в микроскопски слайдове, съдържащи 40 I от пробата и 20 I от патогенните спори. Приблизително 16 часа по- късно спорите са наблюдавани под микроскоп за да се види дали има прорастване. Липса на прорастване (степен 0) в сравнение с водната контрола (100% прорастване и растеж= степен от 5) показва активност на тестваната проба. Резултатите от пробата за прорастване на ръждата с различни фракции на NRRL No. В39

30087 са показани по- долу (степен от 0 до 5 както по- горе) на

Таблица 8.

Таблица 8

		степен
	Rep 1	Rep 2	Rep 3
Етил ацетат	5.0	2.0	3.0
п-бутанол	3.0	5.0	3.5
Воден	0.0	0.0	0.0
Пълен бульон	0.0	0.0	0.0
Водна проверка	4.0	5.0	5.0

Метаболита е светъл във водно разтворимата фракция и не може лесно да се екстрахира в бутанол или етил ацетат.

Определени са и други характеристики на метаболита. Показано е, че молекулата преминава през филтър с мол. тегло 10,000, което показва че метаболита епо- малък от 10,000 далтона. Активността се губи малко при нагряване до 80°С за 1 час (степента за ръждата лъвско око нараства от 0 до 1.5). Активността се абсорбира върху катионообменна смола, но не и върху анионообменна смола (метаболита е позитивно натоварен).

Пример 6

Частично пречистване на фунгицидна фракция от NRRL No. В-30087.

Пълната бульонна култура от NRRL No. В-30087 (850 ml) се центрофугира при 4200 rpm за 15 минути и супернатантата се събира. Добавя се активен въглен (30 д) към супернатантата и се разклаща добре преди центрофугиране за 20 минути при 11,500 rpm. Супернатантата се изсушава върху кръгов изпарител и след това отново се разтваря в 15 ml вода. Пробата след това се пречиства чрез ситова хроматография (SEC), за разделяне на компонентите по молекулно тегло.

Смола Р-2 (130 g, BioRad) се пропива с milliQ дейонизирана вода за напълване на колона 2.5 cm х 80 cm. 15 ml- ия концентрат се натоварва върху колоната Р-2, тя се елуира с вода по гравитет и 10 ml фракции се събират. Параметри за Р-2 колоната: интервал= 2, nm= 226 nm, 16 mv.

Елуираната фракция се изпитва с помощта на проба за прорастване на спорите на ръждата лъвско око, описана в Пример 5. Установено е, че фракции 18- 24 напълно инхибират прорастването. Тези фракции се комбинират и изсушават на кръгов изпарител, след това отново се разтварят в 8 ml вода и се филтрират през 0.2 m филтър. Той се натоварва върху втора Р-2 колона и се пропуска както е показано по- горе, с изключение на това, че се събират 7 ml фракции.

Установено е, че фракциите 29-38 инхибират прорастването в биологичната проба. Тези фракции се изсушават и отново се разтварят във вода. Малка част (5 mg) се отделя с HPLC с помощта на амино колона (4.6 mm х 15 cm, 5 m, 100 ангстрьома). Колоната се еквилибрира в 0.01 М КН₂РО₄ и градиента се пропуска от 4% до 44% ацетонитрил/0.01 М КН₂РО₄ за 30 минути, 1 ml/min установено с UV при 200 nm.

Три пика се събират и пик 1 се обезсоляват на чрез ситова HPLC колона (Toso Haas, G1000 PW, 7.5 mm χ 30 cm, 10_rml), елуира се c вода при 1 ml/min, определено с UV при 200 nm. Един пик се събира от ситовата колона и е установено, че е активен в пробата за прорастване (герминационна проба). ¹Н- NMR спектър се записва при 400 MHz в D₂O от този полу- чист активен материал както е показано на Фигура 1.

\

Пример 7

Химични характеристики на фунгицидните компоненти са различни от цвитермицин А

На капилярна електрофореза е показано, че фунгицидно

активната фракция от това изобретение е различна от цвитермицин А. Пълен бульон от щам NRRL No. В-30087 се култивира в културална среда за Bacillus, съдържаща соево брашно, декстроза, дрождев екстракт, КН₂РО₄, К₂НРО₄, NaCL MgSO₄ х 7Н₂О. Използват се набраздени култури за инокулиране на 250 ml шейкерни колби. Колбите се разклащат при 210 rpm при 30°С за 4 дни.

Пълен бульон на NRRL No. В-30087 се запълва с цвитермицин А и се пропуска за капилярна електрофореза (СЕ). 30 μΙ пълен бульон на щам NRRL No. В-30087 се запълват с 10 μΙ цвитермицин А. Една проба, всяка от пълен бульон на NRRL No. В-30087, NRRL No. В-30087 с цвитермицин А и цвитермицин А самостоятелно, се пропускат на СЕ с помощта на натриево фосфатен буфер при pH 5.8. Генерираните електрофореграми за всяка проба са показани на Фигура 3.

Частично пречистените фракции след това се сравняват с цвитермицин А с помощта на капилярна електрофореза (СЕ). Фигура 4 показва електрофореграми на частично- пречистената фунгицидна компонента от В- 30087, частично пречистената фунгицидна компонента от В- 30087, запълнена с 25 μΙ цвитермицин А и цвитермицин А самостоятелно.

¹Н- NMR спектър на цвитермицин А е показан на Фигура 2 и заедно с частично пречистения фунгициден метаболит на В30087, показан на Фигура 1, са записани в D₂O при 400 MHz. Спектъра, както е показан на Фигури 1 и 2, показват че фунгицидния метаболит от NRRL No. В-30087 е различен от цвитермицин А.

Фунгицидния метаболит от NRRL No. В-30087 може също да бъде отличен от -екзотоксин чрез ¹Н- NMR. ¹Н- NMR спектъра на - екзотоксина има седем резонанса над 5 ppm, както е показано в Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, L.A. Hickle and W.L. Fitch, eds., ACS Symposium Series 432, p. 131 (1990). B противоположност на това, фигура 1 показва че за проба от NRRL No. В-30087 не се установява протонов резонанс над 5 ppm.

Пример 8

Пречистване на енхансера

Енхансера се подлага на полупречистване от пълен бульон на В-30087 както следва. Той се подлага на полупречистване чрез обработка на 435 mL пълен бульон с анионообменна смола, преципитиране с ацетонитрил и ситова хроматография. Пълният бульон се центрофугира за тостраняване на клетките и към супернатантата се добавят 14.5 g анионна смола (AG 1X8, 100200 сито, ацетатна форма) и сместа се разклаща една минута. Тя се центрофугира при 500 rpm, 20 минути и супернатантата се отдекантира и използва в следващия етап. Ацетонитрила се добавя към супернатантата за получаване на 50% разтвор и се разклаща една минута и центрофугира 5000 rpm за 20 минути. Най- долния тъмно кафяв слой съдържа енхансер на Bacillus thuringiensis.

Кафявия слой по- нататък се пречиства чрез ситова хроматография в два етапа. Най- напред, 130 g от Р-2 смолата (BioRad) се пропива с milliQ дейонизирана вода за запълване на колона 2.5 cm х 80 cm. Кафявия слой се концентрира с помощта на кръгов изпарител приблизително 4х и 15 ml от концентрата се поставя на колоната Р2. Колоната се елуира с MQ вода под гравитация и десет минутни фракции се събират за 12 часа (UV детекция 280 nm, абсорбционен интервал 2.0, 10 mV). Следващо пречистване на фракции 26- 28 се провежда чрез концентриране на фракциите до Зх с помощта на кръгов изпарител и чрез прилагането им на оригиналната Р2 колона. Колоната се елуира с MQ вода. Десет минутни фракции се събират за първите 80 минути, след това 2 минутни фракции се събират за следващите два часа. Енхансерната активност на Bacillus thuringiensis се ф елуира във фракции 16-20. (UV детекция при 220 nm, абсорбционен интервал 2.0,10 mV).

Пример 9

Химичните характеристики на енхансера са различни от цвитермицин А

Чрез капилярна електрофореза е показано, че енхансера от настоящето изобретение е различен от цвитермицин А. В-30087 пълен бульон се култивира в културална среда на Bacillus, Ф съдържаща соево брашно, декстроза, дрождев екстракт, КН₂РО₄,

К₂НРО₄, NaCl и MgSO₄ х 7Н₂О. Набраздени култури са използвани за инокулиране на 250 ml шейкерни колби. Колбите се разклащат при 210 rpm при 30°С за 4 дни. Пълен бульон на Bacillus thuringiensis В-30087 се запълва с пречистен цвитермицин А и се пуска на капилярна електрофореза (СЕ). 30 μΙ В-30087 пълен бульон се запълва с 10 μΙ цвитермицин А. В-30087 пълен бульон (Фигура ЗА), В-30087 пълен бульон плюс цвитермицин А (Фигура ЗВ) и цвитермицин А самостоятелно (Фигура ЗС) се пуска на СЕ с помощта на натриево фосфатен буфер при pH 5.8. Електрофореграми на СЕ са показани на Фигура 4.

¹H-NMR спектър на цвитермицин А и В-30087 полупречистен енхансер се записва в D₂O при 400 MHz. Спектъра показва, че енхансера е различен от цвитермицин А.

Пример 10

Определяне на инсектицидно подсилване с Bacillus thuringiensis

Подсилването с В. thuringiensis се демонстрира с помощта на пълен бульон от В. pumilus, NRRL No В-30087 с тест за синергистично изпитване върху ратни червеи по цвеклото (Spodoptera exigua). Проведени са анализи в 96- кладенчови микрапластини. Всяко кладенче съдържа твърд агаров субстрат. 20 μΙ от В-30087 пълен бульон се изпитва с търговски препарат на В. thuringiensis, Javelin (0.25- 1.50 μς/κπβΑβΗΗβ) в биологичната проба. Пропускат се също и серийни разреждания на Javelin концентрациите самостоятелно.

За изпитване на инсектицидната активност, за кпаденчетата се изготвя агарен субстрат от микропаничките съгласно Marrone et al. (1985), J. Econ. Entomol. 78: 290-293. като негативна контрола се използва дейонизирана вода. Два репликата от тест пробата или контрола се използват за всяко изпитване. Паничките след това се поставят в изпарител за приблизително 2-3 часа за изсушаване.

Към всяко кладенче се добавят една до три от първите възрастни ларви на Spodoptera exigua . Микропаничките се зясяват например с Mylar® , и всяко кладенче се вентилира с иглена преса. Паничките се инкубират при 27°С до 7 дни.

След инкубацията, кпаденчетата се отчитат по неонатална смъртност или по степен на развитие на ларвите. Броят на мъртвите ларви се записва. Ларвите със забавен растеж се записват със степен от 1 до 4. Степента на забавяне е както следва: 4= контролен размер; 3= 75% от контролния размер; 2= 50% от контролния размер. Резултатите са обобщени на Таблица 9, по- долу.

Таблица 9

Проба	No. мъртви/общо	Степен на забавяне
0.25 μρ Javelin	1/8	4
0.50 μρ Javelin	0/8	4
0.75 μρ Javelin	1/8	2
1.0 μρ Javelin	1/8	2
1.50 μρ Javelin	1/8	2

В-30087 + 0.25 μρ Javelin	3/8	2
В-30087 + 0.50 μρ Javelin	0/8	3
В-30087 +1.0 μρ Javelin	7/8	2
В-30087 + 1.50 μρ Javelin	8/8	1
В-30087 само	0/8	4
Водна проверка	0/8	4

Проведен е втори тест с помощта на горните процедури. Резултатите са обобщени по- долу на Таблица 10.

Таблица 10

Проба	No. мъртви/общо	Степен на забавяне
0.0625 pg Javelin	0/8	4
0.125 pg Javelin	0/8	4
0.187 pg Javelin	0/8	4
0.250 pg Javelin	0/8	3
0.375 pg Javelin	1/8	2
В-30087 + 0.0625 pg Javelin	1/8	3
В-30087 + 0.125 pg Javelin	2/8	3
В-30087 +0.187 pg Javelin	5/8	2
В-30087 + 0.250 pg Javelin	8/8	1
В-30087 + 0.375 pg Javelin	8/8	1

В-30087 само	0/8	4
Водна проверка	0/8	4

За определяне инсектицидно подсилващите свойства на полупречистената фракция, пробата се тества както по- горе с помощта на 0.1 цд/кладенче Javelin и 40 μΙ/ кладенче от тестваните фракции. Резултатите са показани на Таблица 11, подолу.

Проба	No. мъртви/общо	Степен на забавяне
Фракция 10	0/9	2
Фракция 16	16/16	1
Фракция 18	17/17	1
Фракция 20	14/14	1
Фракция 25	1/10	2
Фракция 30	3/11	2
Фракция 35	1/12	3
Javelin, 0.1 рд/кладенче	0/8	3
Водна проверка	0/14	4

Пример 11

В. pumilus (В-30087) и В. subtilis (В-21661), използвани заедно като фунгицид

Щам В. pumilus, NRRL В-30087 се изпитва с В. subtilis, NRRL В-21661, за определяне дали фунгицидния ефект е по- голям, ако бъдат използвани заедно, в сравнение с това ако всеки щам бъде използван самостоятелно. Всеки щам се култивира в 10 литров или 5000 ферментор, в среда основана на соево брашно за приблизително 50 часа. Всеки щам е изпитван като пълна бульонна култура спрямо сивата плесен Botrytis cinerea по пипера и лъжливата брашнеста роса Peronospora parasitica по цветното зеле. Пълните бульони се тестват при IX, 1/2Х и 1/8Х. Двата щама след това се тестват в различни комбинации с всеки друг при 1/2Х, 1/4Х и 1/8Х. Водна проверка (контрола) и химичен фунгицид (BREAK® при 20 ppm) също се тестват за сравнение. Растенията се отчитат на базата на скала от 0 до 5 (където 5=100% заболяване, без контрола; и 0= 100% контрола, няма заболяване). Резултатите са показани на Таблица 12, по- долу.

	Botrytis cinerea	Peronospora parasitica
	Средна степен на заболяване (4 растения)	Средна степен на заболяване(4растения)
В-21661 1X	0.3	Не е тестван
1/2X	0.3	0.5
1/4X	1.2	1.0
1/8Х	1.7	2.0

В-30087 1X	1.7	Не е тестван
1/2Х	2.3	1.3
1/4Х	Не е тестван	3.7
1/8Х	Не е тестван	4.3

В-21661 1/4Х и В-30087 1/2X	0.7	1.0
В-21661 1/8Х и В-30087 1/2Х	1.4	0.3

В-21661 1/4X и В-30087 1/4X	N/A	0.5

В-21661 1/2Х и В-30087 1/2Х	N/A	0.3
В-21661 1/4Х и В-30087 1/4Х	N/A	0.3
В-21661 1/4Х и В-30087 1/8Х	N/A	0.5

BREAK® при 20 ppm	0.2	Не е тестван

Водна проверка	4.6	5.0

Резултатите от теста за Botritis cinerea показват статистически разлики когато щамовете се използват в комбинация, в сравнение с това когато те се използват самостоятелно. Например, отчитане на 0.7 за В-21661 1/4Х и В30087 1/2Х е статистически различен в сравнение с отчитането на 1.2 за В-21661 1/4Х използвани самостоятелно. Също така, отчитане на 1.4 за В-21661 1/8Х и В-30087 1/2Х е статистически различен в сравнение с отчетеното 1.7 за В-21661 1/8Х самостоятелно или 2.3 за В-30087 1/2Х самостоятелно, и записа заедно е по- нисък от очакваните средни стойности за всеки щам използван самостоятелно. Това показва синергистичния ефект от използването на щамовете самостоятелно за повишена ефективност като фунгицид.

Резултатите от тестовете за Peronospora parasitica показват, че записа за комбинацията от В-21661 1/8Х и В-30087 1/2Х е много по- добър отколкото би се очаквало от един допълнителен ефект. Отчитане на 2.05 би се очаквало ако би имало само допълнителен ефект от комбинирането на щамовете. Обаче, актуалната стойност е 0.3, което показва че е налице определен синергистичен ефект при използване на щамовете в комбинация. Други стойности също показват по- добър от очакваните резултати, например, В-21661 1/4Х и В-30087 1/4Х имат стойност 0.5, което е много по- добро от очакваната от само един допълнителен ефект (изпитана стойност от 2.5) от отделните щамове. Същия този синергизъм е показан в комбинациите от В21661 и В-30087 1/2Х (стойност от 0.3), В-21661 1/2Х и В-30087 1/4Х (стойност от 0.3), и В-21661 1/2Х и В-30087 1/8Х (стойност от 0.5). Тези тестове доказват, че е налице синергистичен ефект при ф използване на щамовете в комбинация, и е един неочакван резултат.

Следва да се разбере, че изобретението е описано в съответствие с горните варианти на изпълнение, които следващите описания и примери се предполага да илюстрират и да не ограничават обхвата на изобретението. Други аспекти, преимущества и модификации в рамките на обхвата на изобретението биха били очевидни за специалиста в областта, към която изобретението принадлежи.

Claims

ПРЕТЕНЦИИ

1. Биологически чиста култура от щам, притежаващ всички идентификационни характеристики на щам Bacillus pumilus, обозначен NRRL No. В-30087, или негови мутанти, които имат фунгицидна активност.
2. Биологически чиста култура от щам Bacillus pumilus, обозначена NRRL No. В-30087.
3. Състав, включващ биологически чистата култура от претенция 1 и носител.
4. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това че е формиран от групата, състояща се от хигроскопичен прах, гранула, водна суспенсия и емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
5. Изолиран метаболит, отделен от биологически чистата култура от щам, притежаващ всички идентификационни характеристики на щам Bacillus pumilus, обозначен NRRL No. В-30087, или негови мутанти, които притежават фунгицидна активност.
6. Супернатанта, отделена от биологически чистата култура на щам, притежаващ всички идентификационни характеристики на Bacillus pumilus, обозначен NRRL No. В30087, и негови мутанти, които имат фунгицидна активност.
7. Частично пречистена фракция, отделена от супернатантата съгласно претенция 6.
8. Състав, характеризиращ се с това, че включва метаболита от претенция 5 и носител.
9. Съста, характеризиращ се с това, че включва супернатантата съгласно претенция 6 и носител.
10. Състав, характеризиращ се с това, че включва частично пречистената фракция от претенция 7 и носител.
11. Състав съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че е формиран от групата, състояща се от хигроскопичен прах, гранула, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
12. Състав съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че е формиран от групата, състояща се от хигроскопичен прах, гранула, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
13. Състав съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че е формиран от хигроскопичен прах, гранула, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
14. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от метаболита съгласно претенция 1.
15. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от супернатантата от претенция 6.
16. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от частично- пречистена фракция от претенция 7.
17. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава от претенция 8.
18. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 9.
19. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 10.
20. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 11.
21. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 12.
22. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 13.
23. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че гъбната инфекция е причинена от най- малко един от микроорганизмите, избрани от групата, състояща се от Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator u Uromyces phaseoli.
24. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че гъбната инфекция е причинена от най- малко един от микроорганизмите, избрани от групата, състояща се от Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator u Uromyces phaseoli.
25. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че гъбната инфекция е причинена от най- малко един от микроорганизмите, избрани от групата, състояща се от Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator u Uromyces phaseoli.
26. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че гъбната инфекция е причинена от най- малко един от микроорганизмите, избрани от групата, състояща се от

Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator u Uromyces phaseoli.
27. Метод съгласно претенция 21 или 22, характеризиращ се с това, че гъбната инфекция е причинена от най- малко един от микроорганизмите, избрани от групата, състояща се от Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator u Uromyces phaseoli.
28. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържа и най- малко един химически или биологически пестицид.
29. Състав съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че съдържа и най- малко един химически или биологически пестицид.
30. Състав съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че съдържа и най- малко един химически или биологически пестицид.
31. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че съдържа и най- малко един химически или биологически пестицид.
32. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че включва и прилагането на ефективно количество от наймалко един химически или биологически пестицид.
33. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че включва и прилагането на ефективно количество от наймалко един химически или биологически пестицид.
34. Метод за продуциране на противогъбна супернатанта, включваща култивиране на биологически чистата култура NRRL No. В-30087, и изолиране на противогъбен метаболит от супернатантата.
35. Метод за частично пречистване на супернатантата от претенция 34, включващ фракциониране на супернатантата и осъществяване на биологични изпитвания на фракциите за идентифициране на противогъбните фракции.
36. Супернатанта, получена съгласно метода от претенция 34.
37. Частично пречистена фракция съгласно претенция 7, характеризираща се с това, че фракцията проявява активност срещу растителни патогенни гъби е установена във водната фракция, че е слабо температурно лабилна и има молекулно тегло по- малко от 10,000 далтона.
38. Изолиран метаболит съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че метаболита проявява активност срещу растителни патогенни гъби, установен е във водната фракция, че е слабо температурно лабилен, че е киселинно/основно и протеазно стабилен, че е позитивно зареден и има молекулно тегло от по- малко от 10,000 далтона.
39. Водно- стабилно съединение, подсилващо инсектицидната активност на Bacillus thuringiensis, характеризиращо се с това че има молекулно тегло по- малко от 10,000 далтона и че съединението не е цвитермицин А.
40. Съединение съгласно претенция 39, характеризиращо се с това, че включва и Bacillus thuringiensis.
41. Състав, характеризиращ се с това, че включва съединението съгласно претенция 39 и носител.
42. Състав, характеризиращ се с това, че включва съединението съгласно претенция 40 и носител.
43. Състав съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че Bacillus thuringiensis е във формата на бактериален щам, търговски продукт, създадено растение или делта ендотоксин.
44. Състав съгласно която и да е от претенции 40 до 43, характеризиращ се с това, че включва и най- малко един химически или биологически пестицид.
45. Състав съгласно претенция 44, характеризиращ се с това, че състава е форма, подбрана от групата, състояща се от хигроскопичен прах, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
46. Частично пречистена фракция на пълна бульонна култура на Bacillus, която подсилва инсектицидната активност на

Bacillus thuringiensis и че не е цвитермицин А или βекзотоксин.
47. Частично пречистена фракция съгласно претенция 46, характеризираща се с това, че микроорганизма от род Bacillus е Bacillus pumilus.
48. Частично пречистена фракция съгласно претенция 47, характеризираща се с това, че Bacillus pumilus е щам Bacillus pumilus NRRL No. В-30087.
49. Състав, характеризиращ се с това, че включва фракцията от която и да е от претенции 46 до 48 и носител.
50. Фракция съгласно която и да е от претенции 46 до 49, характеризираща се с това, че включва и Bacillus thuringiensis.
51. Фракция съгласно претенция 50, характеризираща се с това, че Bacillus thuringiensis е под формата на микробиален щам, търговски продукт, създадено растение или делта ендотоксин.
52. Състав, характеризиращ се с това, че включва състава съгласно претенция 49 и Bacillus thuringiensis.
53. Фракция съгласно която и да е от претенции 46 до 48, характеризиращ се с това, че включва най- малко един химически или биологически пестицид.
54. Състав съгласно претенция 49, характеризиращ се с това, че е състава е форма, избрана от групата състояща се от хигроскопичен прах, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
55. Състав съгласно претенция 52, характеризиращ се с това, че съставът е форма, избрана от групата състояща се от хигроскопичен прах, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
56. Състав съгласно претенция 53, характеризиращ се с това, че съставът е форма, избрана от групата състояща се от хигроскопичен прах, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
57. Метод за подсилване на инсектицидната активност на Bacillus thuringiensis, характеризиращ се с това, че включва прилагане на растението или корена на ефективно количество от състава съгласно претенция 39 и ефективно количество от Bacillus thuringiensis върху растението или корена.
58. Метод за подсилване на инсектицидната активност на Bacillus thuringiensis, характеризиращ се с това, че включва прилагане на растението или корена на ефективно количество от фракцията съгласно претенция 46 и ефективно количество от Bacillus thuringiensis върху растението или корена.
59. Метод за предотвратяване или третиране на растения или корени за заразяване с насекоми, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от съединението съгласно претенция 40 на растението или корена.
60. Метод за предотвратяване или третиране на растения или корени за заразяване с насекоми, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от съединението съгласно претенция 44 на растението или корена.
61. Метод за предотвратяване или третиране на растения или корени от заразяване с насекоми, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от съединението съгласно претенция 50 на растението или корена.
62. Метод за предотвратяване или третиране на растения или корени за заразяване с насекоми, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от съединението съгласно претенция 52 на растението или корена.
63. Метод за предотвратяване или третиране на растения или корени за заразяване с насекоми, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от съединението съгласно претенция 53 на растението или корена.
64. Метод съгласно претенция 51, характеризиращ се с това че включва и най- малко един химически или биологически пестицид.

й
65. Метод съгласно претенция 49 или 50, характеризиращ се с това, че включва и най- малко един химически или биологически пестицид.
66. Състав, включващ

а) пълна бульонна култура от щам, притежаващ всички идентификационни характеристики на щам Bacillus pumilus, обозначен NRRL No. В-30087, или негови мутанти; и

в) пълна бульонна култура на щам, притежаващ всички идентификационни характеристики на щам Bacillus subtilis, обозначен NRRL No. В-21661, или негови мутанти;

които щамове имат синергистична фунгицидна активност.
67. Състав съгласно претенция 66, характеризиращ се с това, че фунгицидната активност е срещу Botrytis cinerea и Peronospora parasitica.
68. Състав съгласно претенция 66, характеризиращ се с това, че щамовете са комбинирани в съотношение от 1:2 за NRRL No. В-21661 и В- 30087.
69. Състав съгласно претенция 66, характеризиращ се с това, че щамовете са комбинирани в съотношение от 1:4 за NRRL Nos. В-21661 и В-30087.
70. Състав съгласно претенция 66, характеризиращ се с това че щамовете са комбинирани в съотношение от 1:2 за NRRL Nos В-21661 и В-30087 срещу Botrytis cinerea или Peronospora parasitica.
71. Състав съгласно претенция 66, характеризиращ се с това, че щамовете са комбинирани в съотношение 1:4 за NRRL Nos В-21661 и В-3087, срещу Botrytis cinerea или Peronospora parasitica.
72. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 66.
73. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 67.
74. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 68.
75. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 69.
76. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 70.
77. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 71.
78. Супернатанта, характеризираща се с това че е отделена от културата съгласно претенция 66.
79. Състав, характеризиращ се с това, че включва супернатантата съгласно претенция 78 и носител.
80. Състав съгласно претенция 79, характеризиращ се с това, че състава е формиран от групата, състояща се от хигроскопичен прах, гранула, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
81. Състав съгласно претенция 66, характеризиращ се с това, че включва и най- малко един биологически или химически пестицид.
82. Състав съгласно претенция 79, характеризиращ се с това, че включва и най- малко един биологически или химически пестицид.
83. Състав съгласно претенция 81, характеризиращ се с това, че състава е формиран от групата, състояща се от хигроскопичен прах, гранула, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
84. Състав съгласно претенция 82, характеризиращ се с това, че състава е формиран от групата, състояща се от хигроскопичен прах, гранула, водна суспенсия, емулсионен концентрат и микрокапсулирана форма.
85. Метод за предотвратяване или третиране на растения, корени или плодове за гъбна инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от състава съгласно претенция 69.