JPS61239885A - 新規な生物学的殺虫剤及びその運搬及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 多くの天然の微生物はポリペプチド殺虫剤を生成し、そ
のような殺虫剤は多くの農業有害生物の増殖を抑制する
ことができる。それらの生態学的なこのましさにもかか
わらず、多くの理由でこれらの天然につくられた殺虫剤
は広く商業的に実施をみなかった。多くの場合そのよう
な微生物は生育が困難であり、殺虫剤のコストが高く、
環境における殺虫剤の残留活性が比較的低く、個々の場
合においてそれ以外の欠点がある。

多くの生き物のように微生物は環境中で特別の生態的地
位にッチェ）を占有している。全般的に亘る検討、そし
てエコロジーアンドエビデミオロジーオブフェリアーバ
クテリアルプラントバソゲンズという題のものがアニュ
アルレビューオブフィトパソロジ−（１９８３年、ヒラ
メ　ニス、ニス、及びアッパー　シー、ディー、２１　
：２４３−６９）に見出される。微生物が外来のくエキ
ソティック）環境に導入された時に生き延びることは一
般に悪影響を受ける。これは殺虫剤を作り出す天然の微
生物の場合もそうである。殺虫剤として効果的であるた
めには天然の微生物及び又はそれらの製品は外来環境中
に導入されなければならず、従って不十分な残留活性し
か有しない。しかし、殺虫剤の効力及び生態学的な望ま
しさは、もしもそれらの使用に対する価値の減少が除か
れるか又は少なくとも改善されるならば、これらを商業
的に使用する魅力的な候補者とする。

従ってこれらの殺虫剤を製造し、これらを生物活性な形
でフィールドに分配し、環境におけるそれらの活性を強
めかつ長持ちさせる経済的な方法を見つけることに実質
的な興味が存在する。

ブラ（ＢｕｌｌａＸ１９８１）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、２５４：　３０００−３００４はバシルス　スリ
ンギエンシス変異株クルスタキ（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｋｕｒｓｔａｋｉ）からの蛋
白質性のパラ、胞子結晶毒素を記載している。ベルト等
　（１９８２）　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＬＪＳＡ　７９：６０６５−６０６９は
蛋白質性のパラ胞子結晶毒素に対する遺伝子を大腸菌及
び枯草菌にクローン化することを記載している。シュネ
ップ等（上記）　（１９８１）７８：　２８９−２９４
も参照。ウオング等（１９８３）Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５８：　１９６０−１９６７はＢ、スリ
ンギエンシス毒素遺伝子の転写制御シグナルを記載して
いる。

クリエール等（１９８２）　ＥＭＢｏ　１ニア９１−７
９９はＢｔ毒素遺伝子のクローニング及び表現を記載し
ている。米国特許４　、２６５　、８８０は生きた殺虫
病原菌をコアセルベートマイクロと一ド中に埋め込むこ
とを記載している。

［問題を解決する手段］ 植物のフィトスフェア中を占有し、そこで生き延びかつ
増殖することのできる微生物を修飾することによって新
規な微生物が提供された。微生物は殺虫剤、特に殺昆虫
剤の微生物中での表現が出来る１又はそれ以上の遺伝子
を導入することによって修飾された。好ましい微生物は
植物とともに生育し、連続的に殺虫剤を造り出し、環境
での分解から殺虫剤を保護する。これらの新規な微生物
（生物的パッケージ）は植物のフィトスフェア中に殺虫
剤を運搬し、その活性を保持する役割をす１　　　　る
・ ポリペプチド殺虫剤の表現の遺伝的可能性を含有してい
る修飾された微生物、そのような修飾された微生物を製
造する方法、及び微生物を使用する方法がここに記載さ
れる。微生物は問題とするｌ又はそれ以上の作物のフェ
トスフェア（フィロプレイン、フィロスフェア、リゾス
フェア及び又はりシブレイン〉を占有することが知られ
ているものが選ばれる。これらの微生物は、特定の環境
（作物及び他の昆虫生息）で野性形の微生物とうまく競
争することが出来るように選ばれ、ポリペプチド殺虫剤
を表現している遺伝子の安定な保持及び表現を提供し、
望ましくは環境による分解及び不活性化から殺虫剤を保
護することを改良する。

多くの微生物が多くの種々の重要な作物のフィロプレイ
ン（植物の葉の表面）及び又はリゾスフェア（植物の根
の周囲の土壌）で生息することが知られている。これら
の微生物は細菌、藻類、及び酵母・かび類（ｆｕｎｇｉ
）を含む。特に興味があるのは細菌、例えば次の属のも
の、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エル
ウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ
ｉａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ）、
リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドプソイドモナ
ス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ−ａ＋ｏｎａｓ）、アグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセト
バクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシルス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　Ｉ　１ｕｓ）、アルスロバクタ
−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ−ｔｅｒ）、アゾトバクタ−（
Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロイコノストック（Ｌｅｕ
ｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及びアルカリゲネス（Ａｌｃａｌ
　ｉｇｅｎｅｓ）、酵母かび類、特に酵母、例えばサツ
カロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプ
トコツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、　クルイベ
ロマイセス（に１ｕｙｖｅｒｏａ＋ｙｃｅｓ）、スポロ
ボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏ−１ｏｎ＋ｙｃｅｓ）、
ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）及びアウレオバ
シジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）等の微生物で
ある。

特に興味があるのは次のようなフィトスフェア細菌種の
ものである。プソイドモナス　シリンガニ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）、プソイドモナス　
フルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ）、セラチアマルセスセンス（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター　
クシリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ
）、アグロバクテリウム　ッメフエフ７シェンス（Ａｇ
ｒ−ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
、ロトブソイドモナススレロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅ
ｕｄｏｇ＋ｏｎａｓ　５ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、キサン
トモナスカンペステリス（Ｘａｎｔｈｏａ＋ｏｎａｓｃ
ａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、リゾビウム　メリオティ（Ｒｈ
ｉｚｏｂｉｕｍｎ＋ｅｒｉｏｔｉ）、　アルカリゲネス
エントロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｎｔｒｏ
ｐｈｕｓ）、及びアゾトバクタ−ビンランデイー　（Ａ
ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｌａｎｄｉｉ）、及びフ
ィトスフェア酵母種、例えばロドトルラルブラ（Ｒｈｏ
ｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）、ロドトルラグルティ
ニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、
ロドトルラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍａｒｉ
ｎａ）、ロドトルラ　アラランティアカ（Ｒｈｏｄｏｔ
ｏｒｕｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、クリプトコツカ
ス　アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｉ
ｄｕｓ）、クリプトコツカスディフルエンス（Ｃｒｙρ
ｔｏｃｏｃｃｕｓｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、クリプトコツ
カス　ラウレンティ−（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉ
ａｕｒｅｎｔｉｉ）、サツカロマイセスロセイ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｉ）、サツカロマイセ
ス　プレトリエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｐｒｅｔｏｒｉｅｎ−ｓｅｓ）、サツカロマイセス　セ
レビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏ−Ｂｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）−スポロボロマイセス　ロセウス（Ｓｐｏｒ
ｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｕｓ）、スボロボロマ
イセスオドラス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏ＊ｙｃｅｓ　ｏｄ
ｏｒｕｓ）、クルイベロマイセスベロナエ（にＩｕｙｖ
ｅｒｏｗ＋ｙｃｅｓ　ｖｅｒｏｎａｅ）及びオウレオバ
シジウムボルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉ−ｕｇ＋
　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）である、特に興味があるのは色
素を有する微生物である。上記の微生物は全て天然源か
ら容易に入手出来、又はＮＲＲＬ及びＡＴＣＣ等の確立
した培養基保有機間から容易に入手できる。

天然の毒素の・内、Ｂ、スリンギエンシス変異株クルス
タキ（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　
ｋｕｒｓｔａｋｉ）のポリペプチド結晶毒素は鱗細類（
レビドブテラ＝１ｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）に対し活性で
あり、Ｂ、スリンギエンシス変異株イスラエレンシス（
Ｂ、　ｔ、　Ｖａｒ、　１ｓｒ−ａｅｌｅｎｓｉｓ）は
蚊に対して活性であり、Ｂ、スリンギエンシスＭ−７（
Ｂ、　ｔ、　Ｍ−７）は甲虫類（ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ
）に対して活性であり、Ｂ、スファエリカス　（８゜５
ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）は蚊の幼虫に対して活性である。

他の毒素には昆虫病源かび１１ｉ（ｅｎｔｏｍｏｐａｔ
ｈｏｇｅｎｉｃｌ　　　　　ｆ・・ｇｌ）のものが含ま
れ、例えばペアウベリアバシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ
　ｂａｓｓｉａｎａ）のペアウベリン及びメタリジウム
ｓｐｐ、（Ｍｅｔａｒｒｈｉｚｉｕｍ　ｓｐｐ、）のデ
ストラフシンが含まれ、又は広いスペクトルの殺虫化合
物、例えばストレプトマイセス　アベルミティラス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｗｉｙｃｅｓ　ａｖｅｒ＋ｇｉｔｉｌｕｓ
）のアベルメクチンスなどが含まれる。上のものを例示
している培養基は次の通りである。

Ｂ、スリンギエンシス変異株クルスタキ（Ｂ、　ｔｈｕ
−ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｋｕｒｓｔａｋｉ
）ＨＤ−１−−ＮＲＲＬ　Ｂ−３７９２；米国特許４，
４４８，８８５に開示、Ｂ、スリンギエンシス変異株イ
スラエレンシス（Ｂ。

ｔ、　Ｖａｒ、　１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）　−−ＡＴ
ＣＣ３５６４６Ｂ、スリンギエンシスＭ−７−−ＮＲＲ
Ｌ　Ｂ−１５９３９次のＢ、スリンギエンシス培養基は
米国テキサス州ブラウンスピルの米国農務省（ｕｓＤＡ
）から人手できる。請求は米国７８５２０テキサス州ブ
ラウンスピルビーオーボツクス＋０３３コツトンインセ
クツリサーチユウニツトＡＲ５，ＵＳＯＡジョーガルシ
ア宛てにされるべきである。

Ｂ、スリン１ニジシス（Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ）ＨＤ２Ｂ、スリン４−ニジシス変異株フィニティマ
スＣｔｔ　　ｖａｒ、　　ｆｉｎｉｔｉｍｕｓ）ＨＤ３ Ｂ、スリンキーニジシス変異株１トスエ（（／／　　　
ｖａｒ、　　ａｌｅｓｔｉ）ＨＤ４Ｂ、スリシキーエン
シス変異株りルスタ４（／／　　ｖａｒ、　　ｋｕｒｓ
ｔａｋｉ）ＩＤ７３６、スリンキ゛エンシス変異株ソッ
ト　　（／／　　ｖａｒ、　　５ｏｔｔｏ））ｌＤ７７
０Ｂ、スリン１工ンシス変異株テーエシト　０リマス（
ｔｔ　　ｖａｒ、　　ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ）ＨＤ？ Ｂ、スリンｑ”Ｉンシス変異株ケニャフク（ｔｔ　　ｖ
ａｒ、　　ｋｅｎｙａｃ）ＨＤ５Ｂ、スリシキ゛エンシ
ス変異株カーレリ７（ｔｔ　　ｖａｒ、　　ｇａｌｌｅ
ｒｉａｅ）ＨＤ２Ｂ、スリンキ゛エンシス変異株カナテ
゛ンシス（ｓ　　　ｖａｒ、　　ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ
）Ｂ、スリンキ゛エンシス変異株エントモシタース　　
（／／　　ｖａｒ、　　ｅｎｔｏａ＋ｏｃｉｄｏｓ）Ｈ
Ｄ９ ８、スリンキーニジシス変異株サフ゛トクシカス　　（
／／　　　ｖａｒ、　　５ｕｂｔｏｘｉｃｕｓ）ＩＤ１
０９ Ｂ、スリシキ゛ニジシス変異株１イ雫゛ワイ（ｔｔ　　
ｖａｒ、　　ａｉｚａｗａｉ）ＨＤＩＩＢ、スリシキ゛
エンシス変異株モリイソニ（／／　　ｖａｒ、　　ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎｉ）ＨＤＩＢ、スリン４−Ｉシシス変異株
オストリニア（／／　　ｖａｒ、　　ｏｓｔｒｉｎｉａ
ｅ）ＨＤＢ、スリンキ゛１ンシス変異株トルウオルシ（
ｔｔ　　　ｖａｒ、　　ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ））ＩＤＢ
、スリンキ°ニジシス変異株タールムスタテーインシス
（Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ−ｓｉｓ　　ｖａｒ、　　
ｄａｒｍｓｔａｄｉｅｎｓｉｓ）ＨＤ１４６Ｂ、スリン
キーニジシス変異株トウマノフ＜（／／　　ｖａｒ、　
　ｔｏｕｌｌ＋ａｎｏｆｆｉ）ＩＤ２０１ Ｂ、スリンキ゛エンシス変異株キュシ１ニジシス（／／
　　ｖａｒ、　　ｋｙｕｓｈｕｅｎｓｉｓ）８０５４１ Ｂ、スリンキ゛エンシス変異株トンフ０ソニ（ｔｔ　　
ｖａｒ、　　ｔｈｏｍｐｓｏｎｉ）ＨＤＢ、スリシキ゛
ニジシス変異株へ〇キスタニ（ｔｐ　　　ｖａｒ、　　
ｐａｋｉｓｔａｎｉ）ＨＤＢ、スリンギエンシス変異株
イスラエレシス（ｓ　　ｖａｒ、　　１ｓｒａｅｌｅｎ
ｓｉｓ）ＨＤ５Ｂ？ Ｂ、スリンキーエンシス変異株インチ゛イ１す　（ｔｔ
　　ｖａｒ、　　１ｎｄｉａｎａ）ＨＤＢ、スリンキー
エンシス変異株夕゛］夕（ｔｔ　　ｙＢｒ、　　ｄａｋ
ｏｔａ）８、スリンキ゛ニジシス変異株トーホクエンシ
ス（ｔｔｖａｒ、　　ｔｏｈｏｋｕｅｎｓｉｓ）ＩＤ８
６６ Ｂ、スリン４−ニジシス変異株クマモトエシシス　（／
ｌ　　ｖａｒ、　　ｋｕ…ａｎｏｔｏ−ｅｎｓｉｓ）Ｈ
Ｄ８６７ Ｂ。スリン１゛ニジシス変異株トチキ゛エンシス（ｔｔ
　　　ｖａｒ、　　ｔｏｃｈｉｇｉｅｎ−ｓｉｓ）ＨＤ
８６８ Ｂ、スリン４−Ｉンシス変異株コルメリ（／／　　ｖａ
ｒ、　　ｃｏｌｍｅｒｉ）ＨＤ８４７Ｂ。スリンキ゛ニ
ジシス変異株ヒュハネンシス（ｔｔ　　　Ｖａｒ、　　
讐ＵｈａｎｅｎＳ　ｉ　５）Ｂ、ｔＬ、ウス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ）−−ＡＴＣＣ２１２１８１
Ｂ、モリタイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｍｏｒｉｔａｎｉ
）−−ＡＴＣＣ２１２８２Ｂ９本０ヒ０す１工（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）−−ＡＴＣＣ１４
７０６Ｂ、Ｌンティモルハ゛ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　
１ｅｎｔｉｏ＋ｏｒｂｕｓ）−−ＡＴＣＣ１４７０７Ｂ
、スフ７エリｈス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｐｈａｅｒ
ｉｃｕｓ）−−ＡＴＣＣ３３２０３へ゛１ウヘ゛す７ハ
゛ヴシ１す（８ｅａｕｖｅｒｉａ　　ｂａｓｓｉａｎａ
）−−＾ＴＣＣ９８３５メタリシーウム７ニソフ０９７
（Ｍｅｔａｒｒｈｉｚｉｕｍ　　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ
）　　　　−−ＡＴＣＣ２４３９８ メタリシーウムフラ本゛ヒーリテ−（Ｍｅｔａｒｒｈｉ
ｚｉｕ＋ｗ　　ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｅ）−−ＡＴＣＣ
３２９６９ ストレフ０ロマイセス７へ１ミテイラス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｕｓ）−ＡＴＣＣ
３１２６Ｂ １　　　　　毒素は天然の毒素と同じである必要はない
。ポリペプチド毒素は天然の毒素の断片でもよい、欠失
の表現生成物、トランスバージョン（ピリミジンがプリ
ンと置き換わる塩基対置換突然変異〉又はトランジショ
ン（プリンがプリンと又はピリミジンがピリミジンと置
き換わる塩基対突然変異）突然変異でもよい、２又はそ
れ以下の数の％のアミノ酸は変化してよい。また意図さ
れた有害生物宿主によフて保持することができる繰り返
し配列でもよい。更にＮ−末端においてｌ、５又はそれ
以上のアミノ酸が提供された融合製品を製造出来、例え
ば毒素の減少された蛋白分解物を与える。ある場合には
複数の同じ又は異なる毒素がコード化されそして表現さ
れ得、その場合には加工位置はポリトキシン中の各々の
毒素部分の間に導入することが出来る。

安定な遺伝子の保持及び表現を可能とする条件下で微生
物宿主中に毒素を表現している遺伝子を導入するのに広
範囲の方法が利用できる。毒素遺伝子の表現の為の転写
及び翻訳制御信号、それらの調整制御化の毒素遺伝子及
び宿主生物中の配列と相同のＤＮＡ配列を含むＤＮＡＩ
Ｉ築物を提供出来、それによって統合化（ｉｎｔｅｇｒ
ａｔｉｏｎ）が起こるか、及び／又は宿主中で機能する
複製系が生じ、それによって統合化又は安定な保持がお
きる。

転写開始信号はプロモーター及び転写開始出発位置を含
む、ある場合には毒素の表現が環境へ放出されたあとに
のみおきる毒素の制御表源を提供することが望ましい。

これはオペレータ又はアクティベーター又はエンヘンサ
ーに結合する領域で達成でき、これは微生物の物理的又
は化学的環境に於ける変化後、誘導を生じることが出来
る０例えば、温度に感受性の調整領域を使用でき、この
場合生物は毒素の表現なしに実験室中で生育できるが、
環境に放出すると表現が開始する。他の技術として、環
境における栄養培地は毒素の表現を可能とし、実験室中
では毒素の表現を阻害する特定の栄養培地を使用できる
。翻訳開始の為にはリポソーム結合位置及び開始コドン
が存在する。

メツセンジャーの表現を増強するために、特に活性プロ
モーターを使用すること、並びにメツセンジャーＲＮＡ
の安定性を増強する配列を使用することなどによって、
種々の操作が使用される。開始及び翻訳終了領域はスト
ップコドン、ターミネータ−領域及び任意付加的にポリ
アデニル化信号を含む。

転写の方向、即ちコード又は意味配列の５′から３′方
向において、構築物はもしあるとするならば転写調整領
域及びプロモーターを含み、ここで調整領域はプロモー
ターの５′又は３′、リポソーム結合位置、開始コドン
、開始コドンのフェーズ中の間放読み枠（オーブンリー
ディングフレーム）を有する構造遺伝子、ストップコド
ン、もしあるならばポリアデニル化信号配列、及びター
ミネータ領域である。この配列は二重鎖として微生物宿
主の形質転換にそれ自体使用できるが、通常はマーカー
を含むＤＮＡ配列が含められ、この場合に第二のＤＮＡ
配列は毒素表現構築物と結合されるか又は宿主へのＤＮ
Ａへの導入の間に毒素表現構築物と別個のＤＮＡ断片と
して組合わせることが出来る。

マーカーとは改質されるか、又は形質転換されている宿
主の選択を提供する構造遺伝子を意味することが意図さ
れている。マーカーは通常選択の利点例えば殺生物抵抗
性、例えば抗生物質又は重質金属に対する抵抗性、オー
トトゥロフィック（無機栄養）宿主に対するプロトトロ
フィーを提供するような相補正（コンプレメンテ−ジョ
ン）などを与える。好ましくはコンプレメンテ−ジョン
（相補性）が使用され、従って修飾された宿主は選択さ
れるだけでなく、場において競争的でもある。構築物の
開発並びに宿主の修飾においてｌ又はそれ以上のマーカ
ーを使用できる。フィールドにおける他の野性形の微生
物に対して競争的な利点を提供することによって微生物
を更に改変することが出来る。例えば、金属キレート剤
を表現する遺伝子、例えばジデロフォア（ｓｉｄｅｒｏ
ｐｈｏｒｅ）を毒素を表現する構造遺伝子とともに宿主
中に導入できる。このようにしてジデロフォアの増強さ
れた表現は、毒素製造宿主に対し競争的な利点を与え、
従ってこれは効果的に野性形の微生物と競主 ）　　　　争し、保護されるべき植生の環境における生
態的地位にッチェ）を安定に占有する。

機能的な複製形が存在しないときはその構築物は少なく
とも５０塩基対（ｂｐ）、好ましくは少なくとも約＋ｏ
ｏｂｐそして通常は１０００ｂｐｌ？：越えない宿主の
配列と相同（ホモロガス）な配列も含むであろう。

このようにして正当な組替えの確率が強められ、従って
遺伝子は宿主中に統合（ｉ　ｎｔｅｇｒａｔｅ）され宿
主によって安定に保持される。好ましくは毒素遺伝子は
コンプレメンテ−ジョンを与える遺伝子、並びに競争的
な利点を与える遺伝子の近くの場所にあることが望まし
い、従フて毒素遺伝子が失われると生じる生物はコンプ
レメンティング遺伝子も失いがちであるか又は競争的な
利点を与える遺伝子も失いがちで、従ってこれは無傷の
構築物を保持する遺伝子と環境において競争することが
出来ない。

多くの種々の微生物宿主９例えば細菌、バクテリオファ
ージ、シアノバクテリア、藻類、かび・酵母類（ｆｕｎ
ｇｉ）などから多くの転写制御領域が人手できる０種々
の転写制御領域には、宿主中で機能する場合の、ｔｒｐ
遺伝子、Ｉａｃ遺伝子、ｇａｌ遺伝子と関連した領域、
ラムダ左及び右プロモーター、Ｔａｃプロモーター、天
然の毒素遺伝子と関連したプロモーターが含まれる０例
えば、米国特許４．３３２，８９８．４，３４２，８３
２及び４，３５６，２７０を参照、二つの領域が適合性
で宿主中で機能し得るものであるかぎりにおいて、停止
領域は転写開始領域又は異なる転写開始領域と正常に関
連している停止領域でありうる。

安定なエピゾーム性の保持又は統合化が望まれるときに
は宿主中で機能しうる複製系を有するプラスミドが用い
られるであろう。１１製系はクロモソームから、宿主又
は異なる宿主中に通常存在するエピゾーム性要素から、
又は宿主中で安定なウィルスからの複製系に由来するも
のであり得る。

多くのプラスミドが人手可能である。例えば、ｐＢＲ３
２２、ｐＡｃＹｃ１８４、Ｒ５Ｆ１０１０、ｐＲＯＩ６
１４などである。

例えばオルソン等（１９８２）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、１５０：６０６９及び、バグダサリアン等（＋９
８１）　Ｇｅｎｅ　１８：　２３７、及び　米国特許第
４，３５６，２７０．４，３６２，８１７　　及び４．
３７１，６２５を参照。

毒素を表現している構造遺伝子は種々の方法でその宿主
から単離される。構造遺伝子が文献に記載され、配列及
び又は制限地図が記載され、プローブを製造するために
ある配列が入手可能な場合には種々の技術がライブラリ
を製造するために存在し、ライブラリのどのクローンが
プローブに対する相補（コンプレメンタリー）配列を含
有するかを決定し、そして所望の構造遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片を単離し、断片を適当に修飾する。ｍ飾はｌ
又はそれ以上の制限酵素で完全に又は部分的に消化する
こと、リセクション（ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）、ブライマ
ー修復（ｐｒｉｍｅｒ　ｒｅｐａｉｒ）、インビトロの
突然変異誘発、その他を含み、全体の構造遺伝子又は毒
素活性を有する断片が単離される。

構造遺伝子を次に転写及び翻訳開始領域及び転写及び翻
訳停止領域の間に導入し、開始領域の調整制御下にある
ようにする。この構築物をプラスミド中に含め、このプ
ラスミドは少なくとも一つの複製系を含んでいるが、プ
ラスミドの開発の間に一つの複製系がクローニングに対
し用いられる時は一つ以上含むことができ、第二の複製
系は究極の宿主中に於て機能するのに必要である。更に
一つ又はそれ以上のマーカーが存在し得、これは以前に
記載した。統合化（インテグレーション）が望まれる時
にはプラスミドを宿主ゲノムと相同（ホモロガス）の配
列を含むのが望ましい。

究極宿主と異種（ヘテロトガス）である幾つかのポリペ
プチド毒素が知られているが（ヘテロロガスとは究極の
宿主によって通常は造られない生成物を意図している）
好ましいポリペプチド毒素は野性系のＢ、スリンギエン
シス（Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ−ｓｉｓ）によって造
られる天然の蛋白質性パラ胞子結晶毒素と関連している
。異なるポリペプチド毒素に対しコードを有する一つ又
はそれ以上の構造遺伝子を、同−又は異なる適合性のプ
ラスミド上に、又は宿主ゲノム中に組み込む条件下とし
て、宿主中に導入できる。

異種（ヘテロロガス）宿主中で造られた毒素は、毒素が
同じポリペプチド配列を有している場合においてさえ、
もともとの宿主によって造られた毒素と同一である必要
はない。というのは毒素は個々の宿主に依存して異なる
程度グリコジル化され得るからである。

形質転換物は、通常は修飾されていない生物又はもし存
在するならば運搬生物から望まれる生物を選択すること
を可能とする選択技術を使用して慣用の方法に従って単
離できる。形質転換物を次に殺虫活性、特に殺昆虫活性
につき試験する。種々の昆虫害虫には双支ｎｇｌ　（蝿
及び蚊）　、ＭＩＮ類（蛾及び蝶の幼虫）、甲虫類（ゴ
キブリ幼虫及び成虫）などが含まれる。殺昆虫活性の検
定の為にはタバコホーンウオーム（ｔｏｂａｃｃｏ　ｈ
ｏｒｎｗｏｒｗ）、マンドカセクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ
　５ｅｘｔａ）・キャベツ尺とり虫（ｃａｂｂａｇｅ　
１ｏｏｐｅｒ）、トリチョブルシアニ（Ｔｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａ　ｎｉ）の幼虫を上記シュネフ等によって記
載された手順に従って用いる。

ブトスフェア中で特に好まれる宿主は宿主中の毒素の環
境における安定性を強めるある種の特性を有するであろ
う。保護する量には低水準の蛋白乳類への毒性がないこ
と、摂取される為に害虫に対し魅力があること、取扱及
び保存の容易さ、フィールドに於ける増殖の速度、競争
性などが含まれる。

フィールドにおける適用において形質転換株はその天然
の生息地に適用され、例えば害虫から保護されるべき植
物のりシスフェア又はフィロプレインに適用される。形
質転換株はその自然の生息に於て生育し、その閏毒素を
製造し、これが幼虫又は成虫の害虫によって吸収される
か又は摂取され、又は卵に対し毒性効果を及ぼす、微生
物が常牝 に存在すること（パーシステンス）は植軽疹侵の長い期
間にわたる保護を与えるが、繰り返しの投与が時々要求
されるかもしれない。生物は散布、浸み込ませ、土壌へ
の注入、種の被覆、苗の被覆又はスプレーなどにより適
用される。フィールドに於ける投与において一般に生物
の濃度は１０８〜１０１０細胞／１であり、ヘクタール
当りの適用容量は一般に約０．１オンス〜２ボンド又は
それ以上である。植物の部分への適用の場合、微生物の
濃度は一般に平方センナメーター当り１０３〜１０６細
胞である。

水中の環境においては害虫の抑制は形質転換微生物株の
脂質含量を変化させることによって表面下で達成できる
。脂質含有量の為に土着の海水の藻類が浮かんでいるこ
とが知られている。脂質含量の変化は形質転換株が水中
下で所望の深さに於て分配されることを可能とする。

市販の処方については微生物は選択性を保持し、低い増
殖速度を生じる栄養培地中で保持できる。

種々の培地、例えば酵母抽出物、し−ブロス等を使用で
きる。フィールドに於て一旦微生物が使用されることと
なったときは非増殖濃縮菌は適当な選択栄養培地中・に
導入され、高濃度、一般には約１０５〜１０（’細胞１
１に濃縮され、次にフィロプレイン又はリゾスフェアへ
の導入の為に使用されるか、植物の部分、例えば種、こ
ん茎等の処置、苗の処置などの為に使用される。

次の実施例は説明の為に使用され制限するものではない
。

実施例１−−へテロロガス遺伝子の構築及び適当な宿主
中への形質転換 構築はノーザンリージョナルリサーチラボラトリーズ（
ＮＲＲＬ　Ｂ−１２１２７）から得られる広い宿主範囲
のシャトルプラスミドｐＲＯＩ６１４を含有するプソイ
ドモナス　アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ
ｅｒｇｉｎｏｓａ）のクローンで始めた（　Ｊ、　Ｂａ
ｃｔ、　［１９８２］　１５０：６０；米国特許４，３
７４，２００）、プラスミドは独特の旧ｎｄ［［［、Ｂ
ａｗｌ　Ｉ及び５ａｌＩ及びＰｖｕｎの制限位置、モし
てＰｓｔｌ挿入物を有し、これはカルベニシリン抵抗遺
伝子、プソイドモナス　アエルギノサ複製系を含んでい
て、ここで旧ｎｄｍ、Ｂａｗｌ　Ｉ及び５ａｌｌ制限位
置はテトラサイクリン抵抗遺伝子中にある。残りのプラ
スミドはｐＢＲ３２２に由来する。第二のプラスミドｐ
ｓＭ１−１７は大腸菌のクローンとして寄託されている
（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９７６）、この寄託物はアメリカ
合衆国６１６０４イリノイ州ペオリア米国＊ａ省ノーｊ
　　　　ザンリージョナルリサーチラボラトリーの永久
保存とされている。プラスミドｐｓＭｌ−１７は大腸菌
に対するアンピシリン抵抗性を与え、Ｂ、スリンギエン
シス８０−７３の５０ｓ＋ｄ（メカ−ターＡ）ン）プラ
スミドからのδ−エンドトキシン遺伝子を含む８．８　
ｋ　ｂｐ（キロ塩基対）の旧ｎｄｍ　ＤＮＡ断片を含有
している。十分な毒素をこの遺伝子から大＆ｌＷＩ中で
表現し、無傷の細胞をキャベジルーパ（キャベツ尺とり
虫）に対し毒性とした。毒素表現を増強する為、及び別
の宿主（プソイドモナス　フルオレッセンス）中で毒素
の表現を達成するためＤＮＡ断片を更に修飾した。　６
．８　ｋ　ｂｐから望まれないＤＮＡを除去するために
ｐｓＭｌ−１７をＢａｗｌ　Ｉで消化し、環状のプラス
ミドを毒素遺伝子の５２−末端の最も近いところで開き
、エンドヌクレアーゼＢａ１−３１で処置して、８．８
　ｋ　ｂｐのＨｉｎｄＩＩ挿入物を約２．９　ｋ　ｂｐ
に減少させた。ＤＮＡの遊離末端をクレナウボリメラー
ゼ（Ｋｌｅｎｏｗ　ｐｏｌｙｗ＋ｅｒａｓｅ）で充填し
、Ｂａｗｌ　Ｉリンカ−を加え、線状のＤＮＡを連結さ
せて環状のプラスミドを回復させた。生じるベクター、
ｐＦＧ２７０をＸｈｏ　Ｉで消化し、環状のプラスミド
を毒素遺伝子の３′−末端の最も近くで問いた＊５ａｌ
ｌリンカーを加え、プラスミドを連結させてその環状の
形とし、生じるベクター、ｐＦＧｌｏ、６を大腸菌中で
増幅させた。　ｐＦＧｌｏ、６を５ａｌＩ及びＢａｗＨ
Ｉで完全に消化し、毒素遺伝子を含有している生じる２
、１　ｋ　ｂｐ断片をゲル電気泳動で精製し、プラスミ
ドｐＲＯ１６１４の８ａｍＨＩ及び５ａｌＩ位置に連結
させた。生じたプラスミドｐｃＨ２，１を大Ｉｌ！菌中
で増幅させ、プソイドモナスフルオレッセンスをカルベ
ニシリン抵抗性、モしてδ−エンドトキシンを合成する
能力の為に形質転換するのに使用した。プソイドモナス
　フルオレッセンス（ｐｃＨ２，１）をＮＲＲＬに寄託
し、寄託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９７７が与えられた。

次の例示的な実験でプソイドモナスフルオレッセンス（
ｐｃ８２．１）を形質転換菌の対照と関連付けて使用し
た。

培養基寄託大腸菌（ｐｓＭｌ−１７）　−−−ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５９７６及びプソイドモナス　フルオレッセン
ス（ｐＣ）１２．１）−−−ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９７７
は少なくとも３０年間保たれるべきＮＲＲＬ寄託機関の
永久保存とされた。これらの寄託菌はここにそれを開示
している特許の付与がなされると一般に人手可能となる
。寄託物は本出願及びその子孫の対応物が出願された国
において外国特許法によって要求されるにしたがい入手
可能となる。しかしながら寄託菌が人手されるからとい
って本発明に行政行為によって与えられた特許権を損な
って実施する権限を構成するものではないことを理解す
るべきである。

実施例２−ｍ−へテロロガス（外来又は異種）遺伝子を
宿す微生物の試験 例示的な実験において、プラスミドｐＣ）１２．１で形
質転換された、二つのプソイドモナス　フルオレッセン
ス株を、形質転換しないＭＩ菌の対照と関連づけて使用
した。

Ｂｔ毒素を有するか又は有しないプソイドモナスフルオ
レッセンスの二リットルブロス培養基からの細胞ペレッ
トを半分に分割した。細胞をｌｏｌの無菌脱イオン水中
で再ペレット化した。この懸濁液の９ｍ１（１０”〜１
０１２細胞／１）を３つの若いレタス植物上にふりかけ
た。３つのふりかけられた植物を単一の閉じられた部屋
中に置き、植物に５０〜７５匹のトリコブルシア　ニ（
Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）幼虫を適用した。植
物は観察期間中に葉の目にみえた損失が無いならば保護
されたものと考えた。

次の表１は結果を示す。

シス Ｐ、フル第１ツｔ　　　生　　　　　　　　３゜１ｘｌ
Ｏ目　　　７５　　　　保護ンス＋Ｂｔ毒素 Ｐ。フルオレッｔ　　　ＩＸＡコ゛−ルヨ　　　　　　
　　０　　　７５　　　　保護無シス　　　　　ウ素４
時間 Ｐ、フル第１ツセ　　Ｈル］゛−ルヨ　　　　　　　　
Ｏ７５保ｆｆｌシス＋Ｂｔ毒素　ウ素４時間 構成：１日目、２５匹の２日目幼虫を植物に適用３日目
、５０匹の５日目幼虫を植物に適用１００日目観測を報
告 次の研究において新たにふ化したキャベツ尺とり虫を生
物検定されるべき物質の液滴を含有しているペトリ皿中
に置いた。幼虫は液を吸込み次に幼虫を除いて幼虫の食
物を含有している小さなカップに入れた。幼虫を７日後
に検査し、死んだ動物の全ての数を記録した。次の表２
は結果を示す。

：　　　　　　　　　　　〜−０゛モナ　　　　第１　
セ　ン死亡幼虫　死亡　生菌 シス Ｐ、フル第１ツセ　　　生　　　　　　　　１．１／１
８　　　　　６２　　　２．５ｘｌＯ’２ンス＋Ｂｔ毒
素 Ｐ、フル第１ツセ　　ｌχルコ゛−ルヨ　　　Ｏ／１５
　　　　　　０　　　　　０シス　　　　ウ素４時間 Ｐ、フル第１ツセ　　ＩＸＡコー−ルヨ　　　８／１３
　　　　　６２　　　　　０ンス＋Ｂｔ毒素　ウ素４時
間 ｍ−６゛イトーモナ　　　１　し　セ　ン死亡幼虫　死
亡　生菌 シス Ｐ、フルオＬヴセ　　　生　　　　　　　　　３／２０
　　　　　１５　　　４．５ｘ１０１１ンス＋Ｂｔ毒素 Ｐ、フルオしツセ　　Ｈルコ”−ルヨ　　　　Ｏ／１５
　　　　　　０　　　　　０ンス　　　　　ウ素４時間 Ｐ、フルオしブセ　　１χルコ゛−ルヨ　　　８／１５
　　　　　５３　　　　　０ンス＋Ｂｔ毒素　ウ素４時
間 一−フ０′イトー【す　　　ｎ　ト　セイシス死亡幼虫
　死亡　生菌 シス Ｐ、フル第１ツセ　　　　２０／２０　　　　１００　
　　３　　ｘｌｏ目ンス＋Ｂｔ毒素 実施例３− この実施例は植物の葉をコロニー化する種々の微生物の
性質の評価を与える。微生物が葉をコロニー化する能力
が良ければ良いほど、本発明で有用である０次の結果は
驚くべきことにある種の酵母例えばロドトルラ　ルブラ
（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）が有利なこと
に非常に良好な植物の葉のコロナイザー（コロニー化を
するもの）であることが示される。従ってこれらの微生
物は本発明の実施に非常に有用である。

旦」Ｌ工」と坐」Ｌ肌 Ｃ−Ｉ　　Ｃ−２Ｃ−３Ｘ−Ｉ　　　Ｘ−２Ｘ−３Ｘ−
４レタス　　　２．８１０．８　１．８　６８　２゜８
　４．８　２゜９ト　マ　ト　　　　　　　　　　　４
゜９１．１５００會京胡瓜　　　　　　　　　　　９９ 西洋力木−チャ　　　　　　　　　　　　　　　　　３
４キヤベツ　　　　　　　　　９ 西洋トネリコ　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
００會カバ　　　　　　　　　　　５００會 西洋二ハトコ　　　　　　　　　　　　　　　　　５０
０會オーク　　　　　　　　　　５００會 プラム　　　　　　　　　　１２ ポプラ　　　　　　　　　　７ セコイヤ　　　　　　　　　５００會 雫イカモア（７メリ カスス゛カケツキ）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１５タ ヤナギ　　　　　　　　　　１７ 植ｌ Ｘ−５Ｘ−６Ｘ−７Ｘ−８Ｘ−９Ｘ−１０レタス　　　
２゜４　４．５　３．２　１．８　２．９　３．２トマ
ト２゜０８．７ 胡瓜 西洋力ネ゛チャ キャベツ 西洋トネリコ カバ 西洋二ハト〕 オーク プラム ポプラ セコイヤ 雫イカモア（７ｉリ カススーカタノ４） ヤナギ 植」１− Ｘ−１１Ｘ−１２Ｘ−１３Ｘ−１４ レタス　　０．６　０．８　１．０　３．９トマト 胡瓜 西洋力木−チャ キャベツ 西洋トネリ］ カバ 西洋二ハトコ オーク プラム ポプラ セコイヤ 夛イカモ？（７メリ カススーカタノＮ） ヤナギ ５００會−細胞を１０５〜１０８／ｃｍ２で４週間又は
それ以上保った。計算した半減期は５００日より大。

細胞を水中的１０１１／ｍｌでスプレーした。葉を標準
の条件下で洗浄し、試料を微生物の計数及び同定の為に
平板培養した。バックグラウンド計数は１０１〜１０”
／ｃｍ２であった。正規分布させた半減期（Ｎ）ＩＬ）
は葉の表面上の細胞の出発濃度が５０χに落ちる迄の日
数に於ける期待される時閉である。　（ＮＨＬ＝Ｌｏｇ
　０．５／−ｂここで−ｂは崩壊曲線の線状の後退（リ
グレッション）の勾配である（Ｌｏｇ細胞数／ｃｒａ２
対時間）。検定は１１月から７月までの９力月の期間に
わたって南カリフォルニア中で実施した。

とＫ Ｃ−Ｉ　　　　Ｂ、スリシ岑゛エンシスの胞子Ｃ−２７
０ソイトモナス　フルオトスセンスの葉の単離物Ｃ−３
９ツカロマイセス　セしヒータ７（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｘ−１０ト”）ル
ラ　ルフ゛う （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　　ｒｕｂｒａ）Ｘ−２オウ
トオへ゛シテーイウム　フ０ルランス（Ａｕｒｅｏｂａ
ｓｉｄｉｕｗ＋　　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）Ｘ−３赤葡萄
からのオウレオハ゛シテ”イウム様単離物Ｘ−４タリフ
０トコツカス　フルヒ゛りス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　　ａｌｂｉｄｕｓ）Ｘ−５タリフ６トコツカス　テ
゛イフルーエンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｄｉ
ｆｆｌｕｅｎｓ）Ｘ−６タリフ０トコツカス　ラウレン
ティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　Ｉａｕｒｅｎｔｉ
ｉ）Ｘ−７クリフ０ト］ブカス様のレタスからの単離物
Ｘ−８０）−）ルラ　アウラシティ７力（Ｒｈｏｄｏｔ
ｏｒｕｌａ　　ａｕｒａｎｔｉａｃａ）Ｘ−９ロトート
ルラ　り゛ルティニス （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　　ｇｌｕｔｉｎｉｓ）Ｘ−
１ｏ　　　ｎ）−トルラ　マリナ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　　ｍａｒｉｎａ）Ｘ−１１
？ッカロマイセス　フ０レトリエシセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　　ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｅｓ）Ｘ−１
２量フカ０マイセス　ロセイ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｒｏｓｅｉ）Ｘ−１
３ス参００本−〇マイセス　オドラス（Ｓｐｏｒｏｂｏ
ｌｏｍｙｃｅｓ　　ｏｄｏｒｕｓ）Ｘ−１４ス参″０本
゛ロマイセス　ロセ゛ウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｒｏｓｅｕｓ）上の結果はロドトルラルブラ（
Ｘ−１）が最もよいエビフィティック（植物体表面）コ
ロナイザーであることを示している。

ポリペプチド毒素はこの技術で良く知られた手順の使用
によって酵母中で表現される。例えば、Ｂ、スリンギエ
ンシス毒素はサツ力ロマイセスセレビシア中でこの生物
からの誘導可能なガラクトースプロモーターを含有する
プラスミドを用いて表現することが出来る（ブローチジ
ェー、アール１、シー　ワイ０、ウェル、シー、及びジ
ャヤラムエム１、エクスペリメンタルマニビュレーショ
ンオブジーンエクスブレッション［１９８３］、８３頁
、エム、イノウニ、アカデミツクプレス扁）、これらの
プラスミドはＹＥｐ５１及びＹＥｐ５２と呼ばれ（ブロ
ーチジェイ、アール、等［１９８３］）　、複製の大腸
菌オリジン、β−ラクタマーゼの遺伝子、酵母ＮＥＵ２
遺伝子、複製の２μｍオリジン及び２μ閾サークルＲＥ
Ｐ３場所を含んでいる。組替え遺伝子表現は酵母ＧＡＬ
ｌＯ遺伝子プロモーターによってドライブされる。

毒素遺伝子はＹＥｐ５１中に挿入できる。他の酵母プロ
モーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ベネッ
ツエンジエー、エル、及びホールビー。

ディー、［１９８２］　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、
　２５７：　３０１８；アンメラージー１、メソッドイ
ンエンザイモロジ−［＋９８３］　１０１巻１９２頁）
、ホスホグリセレート　キナーゼ（デルインク　アール
０、ヒッツエマンアール、ニー１、グレイ　ビー、ダブ
り二一、及びチェデルディー。ブイ９、エクスペリメン
タルマニビュレーションオブジーンエクスブレッション
［１９８３１２４７頁、エム、イノウニ編、アカデミツ
クブレス）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ア
ルパー　ティー、及びカワサキジー、［１９８２］　Ｊ
。

Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、
　１：　４１９）　、又はエノラーゼ（インネスエム、
ニー、等［１９８５］サイエンス２２６：　２１）を同
様の方法でロドトルラルブラ等の池の酵母宿主とともに
使用できる。

上の結果から、異種宿主が植物又は他の害虫生息地と関
連した生態的地位に生息するのに適合される場合には、
ポリペプチド毒素をコードしている構造遺伝子を異種宿
主に導入できることが明瞭である。異種の宿主はそこで
毒素を製造して昆虫害虫からの植物の保護を提供するこ
とが出来る。

これは異種宿主が昆虫害虫によって摂取されるので、害
虫に対して活性の形で殺生物量の殺虫剤を与え、従って
植物に対する保護を提供する。

本発明は毒素が異種宿主中に導入され、これが経済的に
生育でき、植物成長のに於て葉及び土壌の両方において
種部（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅ）され、そして長期の期
間にわたって毒素を提供するように増殖し、実質的に最
初に製造設備で造ったよりもより多くの量をフィールド
に与えるように増殖するという点において、ポリペプチ
ド毒素の利用における実質的な改良を提供する。宿主は
更に環境における悪化からの毒素に対する保護を更に提
供し、毒素の連続した供給を与え、有用な殺生物形に於
て毒素を提供する。

上記の発明は説明の為にある詳細において記載し、理解
を明確にする目的である実施例について述べたが、ある
種の変更、修正が特許請求の範囲内において実施できる
ことが明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植生のフィトスフェア（Ｐｈｙｔｏｓｐｈｅｒｅ）
   を占有することができるか又はその中で増殖することの
   できる生きた微生物であって、上記微生物は上記微生物
   中で表現されポリペプチド毒素に対しコードを有してい
   る外来の遺伝子を含有しており、上記毒素は真核有害生
   物に対し殺生物活性であり、上記毒素は通常の摂食にお
   いて上記微生物が上記有害生物に摂取された時に生育阻
   害水準が摂取されるようなある水準で上記微生物中に保
   たれていることを特徴とする生きた微生物。 ２、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾ
   トバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア
   （Ｅｒｗｉｎｉａ）、 セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、 クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、 リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、 ロドプソイドモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
   ｓ）、メチロフィリウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕ
   ｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
   ｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）又は
   アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）のなかの種
   である特許請求の範囲第１項に記載の微生物。 ３、上記微生物が色素を有し、フィロプレイン（Ｐｈｙ
   ｌｌｏｐｌａｎｅ）に付着性である特許請求の範囲第２
   項に記載の微生物。 ４、バシルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔ
   ｈｕｒｉｎ−ｇｉｅｎｓｉｓ）又はバシルススファエリ
   カス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の蛋
   白質性のパラ胞子結晶毒素である毒素を含有している特
   許請求の範囲第１項に記載の微生物。 ５、バシルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔ
   ｈｕｒｉｎ−ｇｉｅｎｓｉｓ）のパラ胞子結晶毒素であ
   る毒素を含有している特許請求の範囲第４項に記載の微
   生物。 ６、上記バシルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が変異株クルスタキ（ｖ
   ａｒ．ｋｕｒｓ−ｔａｋｉ）である特許請求の範囲第５
   項に記載の微生物。 ７、植生のフィトスフェア中で増殖することのできる生
   きたプソイドモナド（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ）微生物
   であって、上記微生物は上記微生物中で表現され、少な
   くともバシルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
   ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のパラ胞子結晶毒素の少
   なくとも毒素断片に対しコードを有している外来遺伝子
   を含有しており、上記毒素は上記有害生物が正常な摂取
   において上記微生物を摂取すると殺生物水準が摂取され
   るようなある殺生物水準で上記微生物中で保持される特
   許請求の範囲第１項に記載の微生物。 ８、上記プソイドモナド微生物がプソイドモナスフルオ
   レスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓ
   ｃｅｎｓ）である特許請求の範囲第７項に記載の微生物
   。 ９、上記微生物がバシスルスリンギエンシス変異株クル
   スタキからの毒素を含有している特許請求の範囲第８項
   に記載の微生物。 １０、植生のフィトスフェアを占有することのでき、酵
   母中で表現され、ポリペプチド毒素に対しコードを有す
   る外来の遺伝子を含有している生きた酵母であって、上
   記毒素は真核有害生物に対し殺生物活性であって、上記
   毒素は上記有害生物が通常の摂取において酵母を摂取す
   ると生育阻害水準が摂取されるような水準で上記酵母中
   で保持される特許請求の範囲第１項に記載の微生物。 １１、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）又はスポ
   ロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）の種
   の酵母である特許請求の範囲第１０項に記載の微生物。 １２、植生のフィトスフェア中で増殖することが出来る
   生きた酵母微生物であって、上記酵母は酵母中で表現さ
   れ、バシルススリンギエンシス（Ｂａｃｉ−ｌｌｕｓ　
   ｔｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のパラ胞子結晶毒素の少な
   くとも毒性断片に対しコードを有している外来遺伝子を
   含有しており、上記毒素は上記有害生物が通常の摂取に
   於いて上記酵母を摂取することによって殺生物水準が摂
   取されるような水準で上記酵母中で保持される特許請求
   の範囲第１項に記載の微生物。 １３、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）又はスポ
   ロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）の種
   の酵母である特許請求の範囲第１２項に記載の微生物。 １４、酵母がロドトルラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌ
   ａ　ｒｕｂｒａ）である特許請求の範囲第１３項に記載
   の微生物。 １５、酵母がロドトルラグルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏ
   ｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）である特許請求の範囲第１
   ３項に記載の微生物。 １６、植生のフィトスフェア（Ｐｈｙｔｏｓｐｈｅｒｅ
   ）を占有することができるか又はその中で増殖すること
   のできる生きた微生物であって、上記微生物は上記微生
   物中で表現されポリペプチド毒素に対しコードを有して
   いる外来の遺伝子を含有しており、上記毒素は真核有害
   生物に対し殺生物活性であり、上記毒素は通常の摂食に
   おいて上記微生物が上記有害生物に摂取された時に生育
   阻害水準が摂取されるようなある水準で上記微生物中に
   保たれていることを特徴とする生きた微生物を上記植生
   の環境に、又は植物の部分に投与することからなる真核
   有害生物から植生を保護する方法。 １７、上記投与がリゾスフェアに対してである特許請求
   の範囲第１６項に記載の方法。 １８、上記投与がフィロプレインに対してである特許請
   求の範囲第１６項に記載の方法。 １９、植生のフィトスフェア中で増殖することが出来る
   生きた酵母微生物であって、上記酵母は酵母中で表現さ
   れ、バシルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔ
   ｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のパラ胞子結晶毒素の少なく
   とも毒性断片に対しコードを有している外来遺伝子を含
   有しており、上記毒素は上記有害生物が通常の摂取に於
   いて上記酵母を摂取することによって殺生物水準が摂取
   されるような水準で上記酵母中で保持される酵母を上記
   植生の環境に投与することからなる植物に対する真核植
   物有害生物から植生を保護する特許請求の範囲第１６項
   に記載の方法。 ２０、上記酵母がロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ
   ）又はスポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃ
   ｅｓ）の種のものである特許請求の範囲第１９項に記載
   の方法。 ２１、上記ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）がロ
   ドトルラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ
   ）である特許請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２、上記ロドトルラがロドトルラグルティニス（Ｒｈ
   ｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｉｎｉｓ）である特許請
   求の範囲第２０項に記載の方法。 ２３、植生のフィトスフェア（Ｐｈｙｔｏｓｐｈｅｒｅ
   ）を占有することができるか又はその中で増殖すること
   のできる生きた微生物であって、上記微生物は上記微生
   物中で表現されポリペプチド毒素に対しコードを有して
   いる外来の遺伝子を含有しており、上記毒素は真核有害
   生物に対し殺生物活性であり、上記毒素は通常の摂食に
   おいて上記微生物が上記有害生物に摂取された時に生育
   阻害水準が摂取されるようなある水準で上記微生物中に
   保たれていることを特徴とする生きた微生物を植物部分
   に適用することからなる真核有害生物から成長を保護す
   る特許請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２４、上記植物部分が種である特許請求の範囲第２３項
   に記載の方法。 ２５、上記微生物がバシスルスリンギエンシスのパラ胞
   子結晶毒素の少なくとも殺生物活性断片である毒素を表
   現している遺伝子を含有する特許請求の範囲第２３項に
   記載の方法。 ２６、植物の部分に、植生のフィトスフェアを占有する
   ことのできる生きた酵母であって、上記酵母は、酵母中
   で表現されポリペプチド毒素に対しコードを有する外来
   の遺伝子を含有しており、上記毒素は真核有害生物に対
   し殺生物活性であって、上記毒素は上記有害生物が通常
   の摂取において酵母を摂取すると生育阻害水準が摂取さ
   れるような水準で上記酵母中で保持される酵母を適用す
   ることからなる真核有害生物から生育を保護する特許請
   求の範囲第２３項に記載の方法。 ２７、上記植物部分が種である特許請求の範囲第２６項
   に記載の方法。 ２８、上記酵母がバシルススリンギエンシスのパラ胞子
   結晶毒素の少なくとも生物断片である毒素を表現する遺
   伝子を含有している特許請求の範囲第２６項に記載の方
   法。