CN101948782B - 红假单胞菌菌株及其液体菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具体公开了一种红假单胞菌菌株及其液体菌剂及其制备方法和应用，该红假单胞菌菌株的保藏名称为红假单胞菌S 8-1，保藏号为CCTCC M2010144。本发明的液体菌剂中红假单胞菌S 8-1的菌体浓度达到10亿个/ml以上。本发明液体菌剂的制备方法包括以下步骤：先将红假单胞菌S 8-1接种于双层夹心固体培养基平板中进行活化，然后接种于种子液体培养基中进行种子培养和发酵培养，活化、培养过程中的温度控制在30℃～35℃，光照强度控制在4500～7500lux，发酵培养至对数生长期后得到液体菌剂。本发明的菌株及液体菌剂可有效降解土壤中的除草剂吡嘧磺隆残留物，以解决土壤中的化学除草剂残留物对后茬作物的安全性问题。
Description
技术领域
本发明属于利用生物降解化学农药残留物技术领域，具体涉及一种红假单胞菌及其菌剂及相应的制备方法和应用。
背景技术
化学农药中化学除草剂的使用，在农业生产中挽回了大量因草害引起的损失，同时极大地提高了农业生产的劳动效率和机械化程度，在农业生产的现代化进程中起了不可估量的作用。但是，农业生产中广泛使用的化学除草剂，其在环境中的残留不仅严重污染了环境，而且造成了农产品中化学除草剂残留物的超标，严重影响了农产品的质量和品质；而且，化学除草剂选择性强，对不同作物的敏感性差异很大，土壤中少量的残留量即可对后茬敏感作物产生药害，因此该类除草剂在土壤中的残留物对后茬作物的安全性等问题引起了人们的普遍关注。许多国家和地区目前不得不暂时禁用某些残留期长的除草剂。
目前，由于我国从事农业生产的劳动力的减少，我国农业发展的趋势是大规模机械化生产，不使用化学除草剂，无法解决因草害引起的经济损失以及由此引起的农作物(特别是粮食作物)品级的降低。因此，在现有植保水平下除草剂还将继续在农业生产中发挥巨大作用。然而，随着人们生活水平的提高和环境保护意识的增强，人们越来越关注农产品中的农药残留物所带来的危害问题。如何协调解决农业生产中的这个两难问题就成为各个学科的研究热点。实验室和实际应用研究均表明利用微生物来消除化学农药的残留物，具有环保、实用、操作简便等特点，目前已成为去除农药残留物污染的一种重要方法，但该方法成本相对较高，去除效果还有待进一步加强。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本小、使用方便、农药降解效果好的红假单胞菌菌株及利用该菌株制得的液体菌剂，同时还相应提供一种前述液体菌剂的制备方法，以及前述菌株及液体菌剂在降解除草剂吡嘧磺隆残留物中的应用，以解决土壤中的化学除草剂残留物对后茬作物的安全性问题，也可应用于含高浓度农药的农业废水的处理。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种红假单胞菌菌株，所述红假单胞菌菌株的保藏名称为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)S8-1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010144。
上述本发明的红假单胞菌菌株属革兰氏阴性菌，经鉴定为红假单胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)，其主要生物学特征为：双层固体平板培养基上，培养5d～7d，形成红色的圆形菌落，边缘整齐光滑，菌落直径0.45mm～1.05mm。液体培养基中培养6d呈深红色。菌体G-，光学显微镜观察呈球形或卵状，能在厌氧或微好氧条件下生长；该菌体超薄切片电镜观察菌体切片形态多变，从球形、卵球到短杆形不等。以二分裂增殖，极生鞭毛，菌体大小(0.7～1.2)μm×(0.8～2.5)μm，光合内膜结构为片层状，位于质膜之下并与质膜平行。生理生化特性：V-P反应、甲基红反应、吲哚试验、脲酶试验均阴性；H2S反应、明胶液化、接触酶试验均阳性，3％ NaCl中能生长，能利用淀粉，最适生长温度30℃～35℃，pH 7.0～7.2，能以吡嘧磺隆为唯一的碳源和氮源生长。菌体细胞的特征吸收峰为310nm、585nm、809nm、865nm。菌体16S rDNA序列长度为1430bp，在GenBank中的登录号为EU004438。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种含上述红假单胞菌菌株的液体菌剂，在该液体菌剂中，所述红假单胞菌S8-1的菌体浓度达到10亿个/ml以上。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的红假单胞菌菌株的液体菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)活化：将所述红假单胞菌S8-1接种于双层夹心固体培养基平板中进行活化，所述活化过程中，控制固体培养基的pH值为7.0～7.2，活化温度控制在30℃～35℃，活化时的光照强度控制在4500lux～7500lux，活化培养至红色菌落出现；
(2)种子培养：将上述活化后的红假单胞菌S8-1菌种接种于种子液体培养基中，种子培养时的温度控制在30℃～35℃，光照强度控制在4500lux～7500lux，种子培养至对数期；
(3)发酵培养：将上述种子培养后的红假单胞菌S8-1菌种按发酵培养基1％～5％的接种量接种种子菌体，于透明的发酵生产瓶中进行发酵培养，所述发酵培养基的配方与所述种子液体培养基相同，发酵培养时的温度控制在30℃～35℃，发酵培养时的光照强度控制在4500lux～7500lux，发酵培养至对数生长期后将所得培养液进行封装，得到液体菌剂。
上述本发明的制备方法中，全流程培养时间大约在25天，培养结束后，红假单胞菌S8-1菌体浓度可达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出生产瓶，并在自动包装机上用塑料袋或塑料瓶分装成液体菌剂剂型。
上述红假单胞菌菌株的液体菌剂的制备方法中，所述固体培养基优选包含以下浓度的组分：(NH4)2SO4 0.1g/mL～0.2g/mL、MgSO4 0.02g/mL～0.05g/mL、NaHCO3 0.5g/mL～0.6g/mL、K2HPO4 0.05g/mL～0.1g/mL、NaCl 0.02g/mL～0.05g/mL、酵母膏0.15g/mL～0.17g/mL和琼脂1.3g/mL～1.8g/mL(余量物质为蒸馏水，这是公知的)。所述固体培养基主要是由前述组分配制而成，其配制时的pH值为7.0～7.2，配制后在121℃温度下灭菌30min。
上述红假单胞菌菌株的液体菌剂的制备方法中，每升所述的种子液体培养基中含有以下质量的组分：(NH4)2SO4 1g～2g、MgSO4·7H2O 0.2g～0.5g、NaHCO3 5g～6g、K2HPO4 0.5g～1g、蛋白胨2g～2.5g、乙酸钠2g～3g、NaCl 0.2g～0.5g和酵母膏1.5g～1.7g(余量物质为蒸馏水)。所述种子液体培养基主要是由前述组分配制而成，其配制时的pH值为7.0～7.2，配制后在121℃温度下灭菌30min。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的红假单胞菌菌株或者上述的红假单胞菌菌株的液体菌剂在降解除草剂吡嘧磺隆残留物中的应用。
作为对上述应用的进一步改进，所述应用的一种具体方法为：将所述液体菌剂稀释50～100倍后喷施在含有除草剂吡嘧磺隆残留物的土壤中，间隔5～10天后再次喷施一次。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明成功解决了农业生产中吡嘧磺隆除草剂残留量超标的问题，既充分发挥了吡嘧磺隆除草剂在杂草防治中的高效快速的作用，又可以生产出无公害的绿色农产品。通过使用本发明的红假单胞菌菌株S8-1能使土壤和水体中除草剂吡嘧磺隆残留量降低45％以上，大大降低了该种除草剂在土壤和水体中的残留危害，也降低了农业生产中因这种除草剂残留去除过程中的工作量和操作成本。通过使用本发明的降解菌红假单胞菌菌株S8-1可以在农作物的生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治和杂草的防除，同时还能保证农产品中农药残留含量符合绿色食品生产的要求。本发明的降解菌红假单胞菌菌株S8-1还可用于农药厂高浓度农药废水的处理，降低废水中农药残留量。
总体来说，本发明的红假单胞菌菌株S8-1及液体菌剂具有生产成本小、使用方便、农药降解效果好等优点，适合在全国粮油生产基地或绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要意义。
本发明的红假单胞菌菌株已于2010年6月13日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 2010144；保藏地址位于中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
实施例1
本实施例考察液体培养基中本发明的红假单胞菌菌株CCTCC M 2010144对高浓度吡嘧磺隆的降解。
首先将吡嘧磺隆原药用丙酮溶解，溶解后的吡嘧磺隆丙酮溶液经0.22μm滤膜过滤除菌，并将其添加到本发明的灭菌的种子液体培养基中至吡嘧磺隆终浓度为200mg/L。所用的种子液体培养基由以下组分配制而成：(NH4)2SO4 1g～2g、MgSO4·7H2O 0.2g～0.5g、NaHCO3 5g～6g、K2HPO4 0.5g～1g、蛋白胨2g～2.5g、乙酸钠2g～3g、NaCl 0.2g～0.5g和酵母膏1.5g～1.7g，然后用蒸馏水定容至1000mL，控制pH值为7.0～7.2，经121℃灭菌30min后得到。在含有吡嘧磺隆(200mg/L)的上述种子液体培养基中，按2％的接种量接入已活化后的红假单胞菌菌株CCTCC M 2010144种子菌液，温度控制在30℃～35℃，光照强度为4500lux～7500lux，该条件下培养7天，以同等培养条件下不加本发明降解菌株而含有吡嘧磺隆(200mg/L)的种子液体培养基作为空白对照，每个处理重复三次。
上述含有吡嘧磺隆的液体培养基样品经过乙腈及超声波萃取处理20min，凝胶渗透色谱净化、C18固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱分离，外标法定量，上机前用0.45μm有机相滤膜过滤。吡嘧磺隆检测残留量在Agilent 1200 Series高效液相色谱仪上进行，其配置为：配备四元泵、可变波长紫外(VWD)检测器、自动进样器、化学工作站；色谱柱为AgilentZORBAX Eclipse，XDB-C18(4.6mm×250mm i.d.不锈钢柱，5-Micron，内装ODS填充物)(美国Agilent公司)。高效液相色谱分离的检测条件：经过优化后流动相的配比为乙腈/水(用磷酸调节pH值3.0)＝70∶30(V/V)、流速1mL/min、柱温30℃、进样量10μL、检测波长为241nm。试验测定结果见下表1。由下表1可见，种子液体培养基中吡嘧磺隆的降解率高达52.07％
表1：降解菌剂S8-1在液体培养基中对吡嘧磺隆的降解
注：降解率(％)＝(1-C1/C0)×100％，其中C1表示处理后吡嘧磺隆的残留浓度，C0表示处理前样本中吡嘧磺隆的残留浓度。
实施例2
本实施例考察土壤中本发明的红假单胞菌菌株CCTCC M 2010144的液体菌剂对吡嘧磺隆的降解。
称取100g灭菌的水稻田土壤，加入吡嘧磺隆，使土壤中含药浓度为20mg/kg。
采用以下方法制备一种本发明的红假单胞菌菌株的液体菌剂：
(1)活化：将筛选得到的并保存于-80℃下的红假单胞菌菌株CCTCC M 2010144(含20％甘油)接种于双层夹心固体培养基平板进行活化，所用固体培养基包含以下浓度的组分：(NH4)2SO4 0.1g/mL、MgSO4 0.02g/mL、NaHCO3 0.5g/mL、K2HPO4 0.05g/mL、NaCl 0.02g/mL、酵母膏0.15g/mL、琼脂1.8g/mL；控制固体培养基的pH值为7.0～7.2，活化温度控制在30℃～35℃，活化时的光照强度控制在4500lux～7500lux，活化培养至红色单菌落出现(约为5～7天)，挑选菌落直径最大的单菌落进行后续的扩大培养；
(2)种子培养：将上述活化后的红假单胞菌菌株CCTCC M 2010144接种于120ml种子液体培养基中，种子培养时的温度控制在30℃～35℃，光照强度控制在4500lux～7500lux，种子培养至对数期，每天摇匀3～5次；所用的种子液体培养基是由以下质量的组分配制而成：
(NH4)2SO4 1g、MgSO4·7H2O 0.2g，NaHCO3 5g、K2HPO4 0.5g、蛋白胨2g、乙酸钠3g、NaCl 0.2g、酵母膏1.5g，用蒸馏水定容至1000mL、pH值为7.0～7.2；
(3)发酵培养：将上述种子培养后的红假单胞菌菌株CCTCC M 2010144按发酵培养基5％(1％～5％均可)的接种量接种入5L的生产瓶(该瓶为透明玻璃瓶)进行发酵培养，发酵培养基的配方与种子液体培养基相同，发酵培养时的温度控制在30℃～35℃，发酵培养时的光照强度控制在4500lux～7500lux，发酵培养至对数生长期。
全流程培养时间为25天，培养结束后，菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出生产瓶并在自动包装机上用塑料袋或塑料瓶分装成液体菌剂剂型。
将上述制得的液体菌剂稀释80倍后喷施在含有除草剂吡嘧磺隆残留物的土壤中，使每克土壤中的红假单胞菌菌株CCTCC M 2010144的细胞数量达到108个，混匀后置于30℃、光照强度为7500lux条件下培养7天(可以在培养7天后再次喷施一次)，取样测定吡嘧磺隆在土壤中的残留量。以加农药而不加本发明的降解菌株CCTCC M 2010144液体菌剂的灭菌土壤为对照，结果见下表2，由下表2可见，灭菌土壤中吡嘧磺隆的降解率达高到45.78％。
表2：降解菌剂S8-1在种子液体培养基及灭菌土壤中对吡嘧磺隆的降解
以上实施例仅为了对本发明作进一步的说明，本发明的保护范围不受所举实施例的局限。
Claims (7)
1.一种红假单胞菌菌株，其特征在于：所述红假单胞菌菌株的保藏名称为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)S8-1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2010144。
2.一种含权利要求1所述红假单胞菌菌株的液体菌剂，其特征在于：所述液体菌剂中，所述红假单胞菌S8-1的菌体浓度达到10亿个/ml以上。
3.一种如权利要求2所述的红假单胞菌菌株的液体菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)活化：将所述红假单胞菌S8-1接种于双层夹心固体培养基平板中进行活化，所述活化过程中，控制固体培养基的pH值为7.0～7.2，活化温度控制在30℃～35℃，活化时的光照强度控制在4500lux～7500lux，活化培养至红色单菌落出现；
(2)种子培养：将上述活化后的红假单胞菌S8-1菌种接种于种子液体培养基中，种子培养时的温度控制在30℃～35℃，光照强度控制在4500lux～7500lux，种子培养至对数期；
(3)发酵培养：将上述种子培养后的红假单胞菌S8-1菌种按发酵培养基1％～5％的接种量接种入生产瓶中进行发酵培养，所述发酵培养基的配方与所述种子液体培养基相同，发酵培养时的温度控制在30℃～35℃，发酵培养时的光照强度控制在4500lux～7500lux，发酵培养至对数生长期后将所得培养液进行封装，得到液体菌剂。
4.根据权利要求3所述的红假单胞菌菌株的液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述固体培养基中包含以下浓度的组分：(NH4)2SO4 0.1g/mL～0.2g/mL、MgSO4 0.02g/mL～0.05g/mL、NaHCO3 0.5g/mL～0.6g/mL、K2HPO4 0.05g/mL～0.1g/mL、NaCl 0.02g/mL～0.05g/mL、酵母膏0.15g/mL～0.17g/mL和琼脂1.3g/mL～1.8g/mL。
5.根据权利要求3或4所述的红假单胞菌菌株的液体菌剂的制备方法，其特征在于，每升所述的种子液体培养基中含有以下质量的组分：(NH4)2SO4 1g～2g、MgSO4·7H2O 0.2g～0.5g、NaHCO3 5g～6g、K2HPO4 0.5g～1g、蛋白胨2g～2.5g、乙酸钠2g～3g、NaCl 0.2g～0.5g和酵母膏1.5g～1.7g。
6.一种如权利要求1所述的红假单胞菌菌株或者如权利要求2所述的红假单胞菌菌株的液体菌剂在降解除草剂吡嘧磺隆残留物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：将所述液体菌剂稀释50～100倍后喷施在含有除草剂吡嘧磺隆残留物的土壤中，间隔5～10天后再次喷施一次。
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