CN101519639A - 防治植物真菌病害的多粘类芽孢杆菌及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株防治植物真菌病害的多粘类芽孢杆菌及其生产方法，属于生物农药技术领域。本发明采用的菌株是多粘类芽孢杆菌EBL－06菌株，分离自小麦叶面，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2377。该菌株可以防治植物多种真菌病害，提高作物产量。本发明利用味精废水来发酵多粘类芽孢杆菌，制备生防菌剂，该工艺生产的多粘类芽孢杆菌生防剂能有效防治多种植物真菌病害，并且生产成本低廉，操作简单，还可以有效利用味精废水，减少环境污染。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域。
技术背景
根据味精生产过程中废水所含污染物情况可分成三类：一是高浓度高酸度有机废水即离交尾液；二是其它中高浓度有机废水；三是不需处理直接外排的冷却降温水。离交尾液是通过离子交换法提取谷氨酸后剩余的“废液”，它既含有丰富的有机质，还含有N、P、K等少量无机盐及其它微量元素，这些物质都可为微生物生长提供营养。其它中高浓度有机废水包括：淀粉废水、制糖废水、发酵洗灌废水、精制废水等。淀粉废水和制糖废水除了含有一定的有机污染物质外，还有一些悬浮物质；发酵洗灌废水与离交尾液所含成分基本相同，只是含量较低；精制废水有时呈酸性，有时呈碱性，有机物污染物质含量较高，这些有机废水也是微生物资源开发比较理想的营养来源之一。但是，这些废水如果得不到合理利用，不仅会对环境造成严重污染，而且使资源白白浪费掉。
文献报导味精废水造成较大环境污染，如中国环境生态网上指出2005年全国味精生产厂家230余家，年排放废水17万吨，绝大多数未经治理直接排放(http://www.eedu.org.cn/ Article/es/envir/ptheory/water/200511/6456.html)。中国专利(公开号：N1916155A)中公开了一种利用味精废水制备发酵培养基及生产生物农药灰色链霉菌的方法，目前，众多味精废水处理技术大致分为两步，一是提取废水中的谷氨酸菌体单细胞蛋白，通过此步分离菌体，约可除去30％左右的COD，常用物化方法进行处理(如絮凝、离心等方法)；二是提取菌体后废液的处理，使其达到排放标准或处理后用于工厂回用，这也是众多味精废水处理技术所面临的关键问题，常采用生物处理方法(如厌氧发酵、生物膜法，SBR法等)。
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)在自然界中分布广泛，是一种重要的生防菌，对多种植物真菌、细菌病害均有较好的防治作用。王智文等报道了一株多粘类芽孢杆菌Cp-S316菌株对动植物真菌、细菌病原物具有广谱抗性，利用大孔吸附树脂对多粘类孢杆菌Cp-S316产生的抗真菌活性物质的吸附、解吸性能，筛选出其最佳解吸剂，该活性物质对热、紫外线稳定，对胰蛋白酶、蛋白酶K有一定的耐受性，对氯仿部分敏感，对酸稳定，对碱敏感(王智文，袁士涛，何亮等，多粘类芽孢杆菌Cp-S316抗真菌活性物质的提取及其部分性质研究，农业环境科学学报，2007，26(4)：1464—1468)。中国专利(授权公告号：CN 1169942C)中报导培养的Paenibacillus polymyxa HY96-2及其发酵上清液可以用来防止植物细菌性青枯病，而且还可用来防治植物苗期立枯病，猝倒病，以及黄瓜枯萎病，番茄枯萎病，茄子枯萎病，大豆根腐病，并且对植物具有十分明显的促进生长作用。中国专利(授权公告号：CN 1186441C)中公开了Paenibacillus polymyxa可以作为微生物肥料菌剂中的一种成分分解秸秆，有效解决农业生产中一方面农业垃圾过多，污染水体和环境，处理困难，另一方面化肥，农药使用过多，土壤恶化的矛盾。中国专利(授权公告号：CN 1325635C)中公开了Paenibacillus polymyxa Jaas cd可以在较低的浓度下进入植物体内，并能在植物体内定植，繁殖和传导；对植物同时具有促进生长，提高产量，防病抗病的作用，特别是对土传维管束病害具有良好的防治效果。
多粘类芽孢杆菌生防剂的生产方法有多种，如：中国专利(公开号：CN 1844360A)中公开了一种多粘类芽孢杆菌的生产方法，其培养基为豆渣。中国专利(授权公告号：CN1186441C)中使用庖肉培养基作为多粘类芽孢杆菌发酵培养基。以味精废水为培养基生产多粘类芽孢杆菌生防剂的方法未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够在植物叶际与根际定植，并且对多种病原菌具有拮抗作用的生防菌——多粘类芽孢杆菌EBL-06菌株，同时提供一种利用味精废水生产该生防菌剂的方法。
本发明所提供的生防菌株是由我们实验室从小麦的叶面上分离筛选出来的。将其编号为EBL-06，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为二零零八年二月二十六日，分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。保藏编号为：CGMCC No.2377。该菌株具有下列性质：
1 菌落形态特征
该菌株在PDA培养基上生长良好，单个菌落呈半玻璃珠状，边缘整齐，表面粘稠，与培养基结合紧密，菌落中心乳黄色。
2 菌体形态特征
菌体杆状，革兰氏染色显阳性，芽孢端生，包囊膨大。
3 碳源利用能力
可以利用碳源：α-环式糊精；肝糖；D-葡糖胺酸；衣康酸；D-半乳糖酸γ-内酯；
D-半乳糖醛酸；2-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；L-精氨酸；L-天门冬酰胺；L-丝氨酸；甘氨酰-L-谷氨酸；D-木糖；D-甘露醇；苯乙胺。
不可利用碳源：丙酮酸甲酯；D-纤维二糖；β-甲基-D-葡萄糖苷；i-赤藓糖醇；N-乙酰-D葡萄糖氨；D，L-α-磷酸甘油；α-丁酮酸；γ-羟丁酸；L-苯丙氨酸；L-苏氨酸；腐胺。
4 对真菌拮抗能力
菌株在PDA固体培养基上表现出对灰葡萄孢霉、黄瓜黑星病的病原菌原菌、木霉菌等的高效拮抗效果。
5 16S rDNA基因序列
用27f与1492r为引物进行扩增出的该菌株的16S rDNA基因的部分序列，测序结果递交到GenBank，登录号为EF545556。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登陆细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与多粘类芽孢杆菌的相似性最高，达到99％以上。
本发明所述的多粘类芽孢杆菌生防剂的生产方法如下：
1、味精废水预处理：味精废水pH较低约3.0，先用水稀释5—15倍，用碳酸钙或氢氧化钠将pH调至5—7，高压灭菌。
2、液体种子制备：向高压灭菌的土豆液体培养基中，接种多粘类芽孢杆菌，于25—35℃，200r/min培养，得到液体种子。
4、液态发酵：向经过预处理的废水中接种5％(体积)的液体种子，于25—35℃，通无菌空气培养24—72小时。
5、后处理：培养好的发酵液经细菌计数后，调节至108—1010cell/ml，包装使用。
由本发明技术方案生产的多粘类芽孢杆菌生防剂能够高效防治多种真菌类植物病害，而且无公害，生产成本低，并且有效地利用了味精废水。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1：多粘类芽孢杆菌生物农药制备
种子培养基制备：称取200g土豆，切碎，于1L自来水中煮沸30分钟，过滤除去残渣，加入20g葡萄糖，定容至1L，即得土豆培养基。分装入5个1L的三角瓶中，121℃灭菌20min。
发酵培养基制备：经过絮凝除去细菌蛋白的味精废水1L加入9L自来水稀释，并用氢氧化钠调节pH至6.0。
液体种子制备：向土豆液体培养基中接种多粘类芽孢杆菌，于30℃，摇瓶200r/min，恒温摇床振荡培养24小时，得到液体种子。
发酵产品：将上述发酵培养基装罐到10L的发酵罐中，121℃灭菌15min，按照5％的接种量接种液体种子，在30℃恒温，通无菌空气的条件下，发酵2至3天，取样计数后，无菌条件下分装。
实施例2：对多种病原真菌的拮抗作用
菌株在PDA固体培养基平板中心处接种直径为1cm的病原真菌，在距离病原真菌菌落边缘2cm处接种(点接)活化好的多粘类芽孢杆菌，第6天观察抑菌圈大小，发现对病原真菌灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、黄瓜黑星病的病原菌(Cladosporium sp.)和木霉(Trichoderma sp.)等都具有显著的拮抗作用。
实施例3：对黄瓜黑星病防治效果
温室盆钵中的黄瓜苗长至四片真叶时，用107/ml多粘类芽孢杆菌菌液喷雾处理叶片一次，间隔1天后接种黑星病原菌，再间隔1天后喷施107/ml多粘类芽孢杆菌菌液一次，以清水代替多粘类芽孢杆菌菌液喷雾的黄瓜苗为对照，连续调查黄瓜苗的病情，发现多粘类芽孢杆菌处理对黄瓜黑星病有明显的防治效果。
Claims (4)
1.一株具有防治植物病害的细菌，其特征在于：该细菌是一株多粘类芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2377。
2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌，其特征在于：该菌株在PDA培养基上生长良好，单个菌落呈半玻璃珠状，边缘整齐，表面粘稠，与培养基结合紧密，菌落中心乳黄色。菌体杆状，革兰氏染色显阳性，芽孢端生，包囊膨大。该菌株的16S rDNA基因的部分序列已递交到GenBank数据库，登录号为EF545556。
3.用权利要求1所述多粘类芽孢杆菌来制备抗植物病害生防剂的生产方法，其特征在于：培养基的主要成分是味精废水。
4.权利要求3所述生防剂的生产方法，其特征在于：将味精废水用水稀释5—15倍，调节pH为5—7，高压灭菌，接种多粘类芽孢杆菌，于25—35℃，通无菌空气培养24—72小时。
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