CN114874931A

CN114874931A - 一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114874931A
Application number: CN202111580356.3A
Authority: CN
Inventors: 贾振华; 孙劲冲; 赵芊; 宋聪; 李冉; 张翔; 宋水山
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114874931B

Abstract

本发明公开了一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用，涉及生防菌剂技术领域。本发明提供了一种具有广谱抑菌效果的复合微生物制剂，有利于克服目前生防制剂防效单一的缺陷。另外，该复合微生物制剂能够提高农作物果实品质，提高作物中营养物质。

Description

一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生防菌剂技术领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，绿色生防菌剂在作物病害防治上的应用在不断地深入和扩大。其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是国际公认的、最早由美国FDA公布用于人类安全的42种益生菌之一。枯草芽孢杆菌是在环境中广泛存在的一类革兰氏阳性细菌，这类细菌的特点在于它可以产生内生芽孢、抗逆性强、抗菌谱广、易在植物表面定殖，其芽孢可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型或与化学农药混用而不失活，非常有利于生防菌剂的制备和应用。在设施蔬菜生产中使用拮抗微生物进行防治，既可以减少化学农药的使用，解决农药残留问题，又可以补充土壤中有益微生物的种类，维持土壤微生物的平衡，降低后续生产病害的影响，而且枯草芽孢杆菌可以广泛地抑制多种真菌和细菌的活性，且可促进作物生长、改善果实品质、生产过程简便。基于枯草芽孢杆菌的上述效果，有望作为一种良好的微生态制剂肥料进行应用。微生态制剂能够很好地解决农药化肥带来的土壤污染及病虫害抗性等问题，相比化学试剂而言，微生态制剂对土壤的危害程度更低。针对该问题。目前市面上生物防控微生态制剂产品种类繁多，但仍存在一定的使用缺陷，许多生防制剂的效果不稳定，预防的病害较为单一、抑菌谱窄。另外，将多种菌株进行配合制成复合微生物制剂也是本领域内的常见操作，提供更多效果优良的复合微生物制剂有利于促进微生物制剂的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种具有广谱抑菌效果的复合微生物制剂，有利于克服目前生防制剂防效单一的缺陷。另外，该复合微生物制剂能够提高农作物果实品质，提高作物中营养物质。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

枯草芽孢杆菌J-5的培养基为可溶性淀粉2～3％，蛋白胨1～2.5％，K₂HPO₄·3H₂O0.6～1.2％，KH₂PO₄ 0.3～0.8％，(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.3％， CaCO₃ 0.03～0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.08～0.12％，余量为水，pH6～7。

枯草芽孢杆菌J-5菌株能够抑制多种植物真菌病原菌，其中植物真菌病原菌包括但不限于对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黄瓜镰刀霉、棉花黄萎病、小麦赤霉病、玉米小斑病。该菌株的抑菌谱广，针对引发作物疾病的多种病原菌都有抑制效果，可以有效防止多种病害，减少化学农药的使用。

本发明的第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括枯草芽孢杆菌J-5和/ 或菌的培养物。

优选的，所述菌的培养物通过如下方法制备：将所述枯草芽孢杆菌J-5 接种于上述培养基中26～34℃下培养24～48h，搅拌速率100～260rpm。

本发明的第三方面，提供一种复合菌剂，所述复合菌剂包括枯草芽孢杆菌J-5、多粘类芽孢杆菌SWGC4112及草木樨中华根瘤菌32-2和/或各菌株的培养物。

经本公开实验验证，该复合菌剂应用于茄果类作物的种植，能够显著增加生长重量、高度及果实重量，并能够有效提高果实中营养成分的含量。该复合菌剂应用于番茄的生产，可有效提高果实中可溶性糖含量、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸、番茄红素等主要营养物质的含量。

优选的，所述复合菌剂中，所述枯草芽孢杆菌J-5：多粘类芽孢杆菌 SWGC4112；草木樨中华根瘤菌32-2的比例为1-3:1-3:1-4。

进一步优选的，所述复合菌剂中，三种菌的比例为1:1:1。

进一步优选的，所述复合菌剂中，有效活菌数为≥10亿/mL。

由于菌株对培养基的营养需求不同，菌株胞外分泌物的种类不同等，不同菌种处于混合状态时有可能表现出抑制、促进的效果，菌株的比例不同，其共同表现出的效果也不相同，经本发明验证，上述比例的三种菌株混合时，制备成为微生物制剂的作用效果较好。

本发明的第四方面，提供上述第一方面所述菌株、第二方面所述菌剂和 /或第三方面所述复合菌剂在下列任一方面的应用：

(1)抑制植物真菌病原菌；

(2)提高果实产量和果实品质；

优选的，所述植物真菌病原菌包括但不限于梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黄瓜镰刀霉、棉花黄萎病、小麦赤霉病、玉米小斑病；

优选的，所述促进果实生长和提高果实品质；进一步的，提高番茄果实产量提高番茄果实中包括但不限于亩产量、可溶性糖、可溶性蛋白、维生素 C、可滴定酸及番茄红素的含量；所述植物包括但不限于番茄、草莓、青椒。

有益效果：经本公开实验验证，该复合菌剂应用于茄果类作物的种植，能够有效提高果实中营养成分的含量。现有技术中针对枯草芽孢杆菌的促生作用往往体现在对植物生长重量、高度及果实重量的增产效果，而本公开中筛选得到的复合菌剂应用于茄果类植株的生产，实现的是果实中营养成分的提升。该复合菌剂应用于番茄的生产，可有效提高果实中可溶性糖含量、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸、番茄红素等主要营养物质的含量。

1、本发明中的菌株具有良好广谱抑菌效果，针对引发农作疾病的多种植物真菌病原菌具有良好的抑制效果。采用该菌株及包含该菌株培养物的菌剂制备微生物复合制剂可有效克服现有产品的防效单一的缺陷。

2、本发明针对上述菌株进一步提供了一种复合菌株产品，当三种菌株以一定比例混合后，能够获得较高的活菌数量，并且经本公开实验验证该复合菌剂具有良好的抑菌、防病及提高果实品质的功效。相比现有技术中采用枯草芽孢杆菌应用于番茄产量的提升，本发明的复合菌剂不仅具有提升产量的效果，还能够实现提高果实中营养成分含量的效果。应用于实际生产，一方面可以降低农药及肥料的使用剂量，一方面可以提高果实产量和品质，提高经济收益。

生物保藏信息

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)J-5于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为： CGMCC No.11750。

本发明所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SWGC4112于 2016年11月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No.13356。

本发明所述的草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)32-2于2013 年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No.8343。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，采用微生物制剂提高作物的产量及防治病虫害问题，可有效的减少传统化学试剂对土壤的危害作用。本公开提供了一种枯草芽孢杆菌J-5及其复合制剂，该菌株对多种植物真菌病原菌有拮抗作用，尤其对番茄灰霉病的防治效果显著；同时复合制剂应用于大棚番茄实验，可促进果实增产17.09％；有效防治番茄生长过程中出现的病害，其防治效果高达78％以上；番茄果实各项指标均有提升，其中番茄红素含量有显著提高。在提高作物品质的同时，减少对土壤的危害作用，具有良好的推广意义。

实验过程中涉及的普通培养基及其成分如下：

NB培养基：蛋白胨-1％，牛肉粉-0.3％，氯化钠-0.5％；琼脂-2％为 NA培养基。

PDA培养基：土豆-20％，葡萄糖-2％，琼脂-2％。

枯草芽孢杆菌J-5的菌液：将枯草芽孢杆菌J-5接种于上述培养基中26～ 34℃下培养24～48h，搅拌速率100～260rpm，培养基为可溶性淀粉2～3％，蛋白胨1～2.5％，K₂HPO₄·3H₂O 0.6～1.2％，KH₂PO₄ 0.3～0.8％， (NH₄)₂SO₄ 0.1～0.3％，CaCO₃ 0.03～0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.08～0.12％，余量为水，pH6～7；

将多粘类芽孢杆菌SWGC4112接种与培养基中37℃下培养48h，搅拌速率150rpm，得多粘类芽孢杆菌菌液；所述培养基包括以下质量百分含量的原料：可溶性淀粉2～3％，蛋白胨1～2.5％，K₂HPO₄·3H₂O 0.6～1.2％， KH₂PO₄ 0.3～0.8％，(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.3％，CaCO₃0.03～0.05％， MgSO₄·7H₂O 0.08～0.12％，余量为水，pH 6.8；

将草木樨中华根瘤菌32-2接种于培养基中，于30℃培养28h，搅拌速率200rpm，得草木樨中华根瘤菌菌液；所述培养基包括以下质量百分含量的原料：甘露醇1％，酵母膏0.3％，KH₂PO₄ 0.025％，K₂HPO₄ 0.025％，CaCO₃ 0.35％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，NaCl0.01％，余量为水，pH7.0。

实施例1：枯草芽孢杆菌J-5，多粘类芽孢杆菌SWGC4112与草木樨中华根瘤菌32-2的发酵液体积比＝1:1:1。

实施例2：枯草芽孢杆菌J-5，多粘类芽孢杆菌SWGC4112与草木樨中华根瘤菌32-2的发酵液体积比＝3:3:4；

实施例3：枯草芽孢杆菌J-5，多粘类芽孢杆菌SWGC4112与草木樨中华根瘤菌32-2的发酵液体积比＝2:4:4。

1.复合制剂为液态深褐色，pH值7.5-8.0，活菌数为≥10亿cfu/ml。复合制剂对植物病原真菌有拮抗作用，本实施例中以番茄灰霉病作为真菌病原菌代表，对其抑菌作用进行考察，抑菌圈为27-31mm(表1)。

表1复合制剂对植物病原菌的拮抗作用

	实施例1	实施例2	实施例3
				番茄灰霉病	31mm	29mm	27mm

2.复合制剂的植物保护作用

将三株菌的发酵液按照三个配方中的比例分别混合后，稀释50倍，得到三个2％浓度的复合制剂。

每个花盆播种一株番茄、草莓、青椒幼苗，番茄幼苗长至四叶一心时开始喷施2％浓度的复合制剂，每株用量10mL，2h后接种灰霉病原菌孢子液(浓度为10⁴个孢子/ml)。常规对照使用常规剂量的化学农药多菌灵作为防治药物，空白对照不施用防治药物但施加与实施例组相同重量的水；7d后统计复合制剂对番茄、草莓、青椒灰霉病的防治效果。各品种处理调查3株幼苗的全株叶片，统计发病情况，分级方法如下。

0级:无病斑；

1级：病斑占整个叶面积的5％以下；

3级：病斑占整个叶面积的5％～15％；

5级：病斑占整个叶面积的15％～25％；

7级：病斑占整个叶面积的25％～50％；

9级：病斑占整个叶面积的50％以上。

按以下公式计算病情指数：

表2在室内盆栽实验中复合制剂对灰霉病的防治效果

表3病情指数和防治效果

统计结果显示经2％浓度的复合制剂处理后可以使灰霉病的发病率降低 43-65％。综合复合制剂拮抗实验与植物保护实验效果，三种发酵液比例为 1:1:1时复合制剂的植物保护作用与抑菌效果最好。

3、复合制剂的田间实验

在河北省石家庄市鹿泉区的番茄连作田对番茄灰霉病进行复合制剂的田间试验。实验用地5亩，共分为5组，每组占地面积1亩，栽番茄苗1800 棵，每组使用有机肥与无机肥量相同，除以下变量外，实行统一管理。每周取样一次，定期测定植株的产量及病害发展。

实施例4：枯草芽孢杆菌J-5，多粘类芽孢杆菌SWGC4112与草木樨中华根瘤菌32-2发酵液体积比＝1:1:1，微生物制剂的使用量为20L/亩，随水冲施，不使用农药；

实施例5：枯草芽孢杆菌J-5，多粘类芽孢杆菌SWGC4112与草木樨中华根瘤菌32-2发酵液体积比＝3:3:4，微生物制剂的使用量为20L/亩，随水冲施，不使用农药；

实施例6：枯草芽孢杆菌J-5，多粘类芽孢杆菌SWGC4112与草木樨中华根瘤菌32-2发酵液体积比＝2:4:4，微生物制剂的使用量为20L/亩，随水冲施，不使用农药；

对照组1：正常使用农药。

对照组2：不使用农药。

使用复合制剂可有效提高果实产量(表4，其中实验组一中果实收获产量比对照组高15.82％，且实验组一较另两个实验组效果稍好。

表4不同实验组中番茄不同时间收获产量(kg)

果实产量	实施例4	实施例5	实施例6	正常农药	不使用农药
						总重量kg	5823	5694	5299	4973	3204
总增重％	17.09％	14.50％	6.55％

在成熟期采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查株发病率与病情指数，记录总调查株数、总发病株数。

番茄灰霉病病情指数分级标准：

0级：全株无害病斑；1级：少数叶片发病至全株下部1/4以下的叶片有病斑；2级：全株中下部1/2以下的叶片有病斑或者茎秆分枝上有病斑；3 级：全株3/4以下部位的叶片有病斑或者单个分支茎秆枯死和单株有1～2个果实发病腐烂；4级：全株3/4以上的叶片发病枯黄或者茎秆枯死，单株有2 个以上的果实发病腐烂。

防效计算方法：

番茄株发病率＝总发病株数/总调查株数×100

病情指数＝∑(发病株数×该发病株级值)/(总调查株数×最高级值)× 100

防治效果(％)＝(对照区病情指数—处理区病情指数)/对照区病情指数×100

防治效果如表5所示，实施例4对番茄灰霉病具有良好的防效，在施用复合制剂的情况下番茄灰霉病发病率和病情指数均降低，不同实施例的防病效果均在78％以上。实施例4、5、6对番茄病害的防治效果均好于正常使用农药的对照组，该结果说明该复合制剂一定程度上可以替代农药达到防治病害的目的。

表5复合制剂对番茄病害的防效

	实施例4	实施例5	实施例6	正常农药	不使用农药
						病情指数	4.50	5.56	8.68	10.25	39.67
防治效果％	88.66	85.98	78.12	74.16

4、番茄果实品质鉴定

番茄生长90-100天进行果实采摘，每组选择果实30个，测定可溶性糖含量、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸、番茄红素等指标(表6)。结果显示，使用复合制剂产品的实施例各指标均有所提高。其中，实施例4中维生素C、番茄红素与可溶性蛋白较正常使用农药组提升明显。

表6复合制剂对番茄果实品质的影响

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂的有效成分包括枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和草木樨中华根瘤菌；

所述复合微生物菌剂中的总活菌数量≥10亿/mL或≥10亿/g。

2.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和草木樨中华根瘤菌的菌液体积比为(1～3)：(1～3)：(1～4)。

3.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)J-5，保藏编号为CGMCC No.11750；

所述多粘类芽孢杆菌包括多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SWGC4112，保藏编号为CGMCC No.13356；

所述草木樨中华根瘤菌包括草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)32-2，保藏编号为CGMCC No.8343。

4.权利要求1～3任一项所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述枯草芽孢杆菌接种于培养基1中26～34℃下培养24～48h，搅拌速率100～260rpm，得枯草芽孢杆菌菌液；所述培养基1包括以下质量百分含量的原料：可溶性淀粉2～3％，蛋白胨1～2.5％，K₂HPO₄·3H₂O 0.6～1.2％，KH₂PO₄ 0.3～0.8％，(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.3％，CaCO₃ 0.03～0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.08～0.12％，余量为水，pH6～7；

将所述多粘类芽孢杆菌接种与培养基2中37℃下培养48h，搅拌速率150rpm，得多粘类芽孢杆菌菌液；所述培养基2包括以下质量百分含量的原料：可溶性淀粉2～3％，蛋白胨1～2.5％，K₂HPO₄·3H₂O 0.6～1.2％，KH₂PO₄ 0.3～0.8％，(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.3％，CaCO₃ 0.03～0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.08～0.12％，余量为水，pH 6.8；

将所述草木樨中华根瘤菌接种于培养基3中，于30℃培养28h，搅拌速率200rpm，得草木樨中华根瘤菌菌液；所述培养基3包括以下质量百分含量的原料：甘露醇1％，酵母膏0.3％，KH₂PO₄ 0.025％，K₂HPO₄ 0.025％，CaCO₃ 0.35％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，NaCl 0.01％，余量为水，pH7.0；

将所述枯草芽孢杆菌菌液、多粘类芽孢杆菌菌液和草木樨中华根瘤菌菌液按比例混合，得所述复合微生物菌剂。

5.权利要求1～3任一项所述复合微生物菌剂在经济作物种植中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述经济作物包括茄果类植物。

7.权利要求1～3任一项所述复合微生物菌剂在提高茄果类植物果实营养成分中的应用。

8.一种提高茄果类植物果实营养成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：在茄果类植物的苗期，喷施权利要求1～3所述复合微生物菌剂。

9.权利要求1～3任一项所述复合微生物菌剂在抑制植物真菌病原菌中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病原菌包括梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黄瓜镰刀霉、棉花黄萎病、小麦赤霉病和玉米小斑。