CN102660627B - 一种木霉生防菌种质评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种木霉生防菌种质评价方法，包括：木霉生防菌生长特性评价，木霉生防菌拮抗作用评价，木霉生防菌固体发酵产孢量评价，木霉生防菌制剂耐贮性与孢子存活率评价，木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价，木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价；该方法有利于筛选生防效果良好、对自然环境友好的新的木霉菌株，并且可以加快菌种筛选速度，为快速寻找发现具有经济价值的新木霉菌株提供了有效的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种木霉生防菌种质评价方法，属于农业生物防治技术领域。
背景技术
生物防治是农作物病虫害综合防治的重要内容之一，生物农药是生物防治中应用最广泛、应用面积最大的措施，我国生物农药的应用具有良好的基础，20世纪80年代至90年代曾得到迅速发展，在水稻、小麦、棉花、玉米、果树、蔬菜等作物病虫害的综合防治中发挥了重要作用。虽有一段低谷，但目前，人们越来越重视保护环境、生态和谐和可持续发展，提出了“公共植保，绿色植保”的理念，生物农药面临着新的发展机遇。
木霉生防菌作为微生物活体杀菌剂，其创新利用过程复杂、杀菌机制较多、环境影响因素复杂，推广时涉及的附加条件较多，这就决定了木霉生防菌种质创新的评价应该是一个系统工程，涉及到平板生长特性比较、拮抗作用筛选、生产工艺的完善与产孢量、制剂贮存期与孢子存活率以及盆栽试验与大田应用条件下木霉生防菌定殖存活量及存活时间、生物防治效果等一系列指标，目前普遍采用与化学农药相同单一的药效评价标准是很难满足要求的，仅涉及其中的一个环节，不全面，同时只注重防效，缺少对农田生态系统安全性的评价指标，生物农药对生态环境的安全性、对农产品的安全性等优点难以突显出来。
哈茨木霉菌T-22株系是人工修饰的株系，是由T95株系和T12株系为父本通过细胞融合技术获得的人工杂交株系。T95株系对植物根系的缠绕能力和定植能力强，T12株系对病害的防治能力强，通过细胞融合技术将其两者的优点结合到一起，从而获得了根系缠绕、定殖、病害防控能力皆优的株系T22，同时获得了其父本对不同土壤类型的适应能力，可以在沙壤土和粘性土壤中良好的定殖繁殖，使T22的应用更具适应性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种木霉生防菌种质评价方法。
一种木霉生防菌种质评价方法，包括：木霉生防菌生长特性评价，木霉生防菌拮抗作用评价，木霉生防菌固体发酵产孢量评价，木霉生防菌制剂耐贮性与孢子存活率评价，木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价，木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价：
(1)木霉生防菌生长特性评价：
将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别接种于PDA平板培养基上平板培养；然后分别转接到PD液体培养基中液体培养；
测定平板培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌落直径，生长特性中菌落直径的种质评价标准为：待评价木霉菌株菌落直径比哈茨木霉菌T-22菌落直径提高5％-10％；
测定平板培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的产孢量，生长特性中产孢量的种质评价标准为：待评价木霉菌株产孢量比哈茨木霉菌T-22产孢量提高10％-20％；
测定液体培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌丝重量，生长特性中菌丝重量的种质评价标准为：待评价木霉菌株菌丝重量比哈茨木霉菌T-22菌丝重量提高10％-15％；
(2)木霉生防菌拮抗作用评价：
在PDA平板培养基上对峙培养病原真菌与待评价木霉菌株、病原真菌与哈茨木霉菌T-22，具体步骤参照中华人民共和国农业行业标准NY/T1156.2-2006；
对峙培养结束后测定病原真菌菌落半径和被覆盖情况，分为5级拮抗标准，拮抗作用中拮抗程度的种质评价标准为：待评价木霉菌株拮抗程度为1级或2级；
所述5级拮抗标准如下：
1级：木霉菌完全长过病菌，并覆盖整个培养皿；2级：木霉菌占整个培养皿面积的2/3以上；3级：木霉菌占整个培养皿面积的1/2至2/3；4级：病菌占整个培养皿面积的2/3以上；5级：病菌长过木霉菌，并覆盖整个培养皿；
(3)木霉生防菌固体发酵产孢量评价：
对待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22进行固体发酵，固体发酵培养基按65-75wt％的麦麸与25-35wt％的作物秸秆粉末混合，再加入1.1-1.3倍重量的水搅拌均匀，调pH为6-6.5制得；
测定产孢量，固体发酵中产孢量的种质评价标准为：待评价木霉固体培养物产孢量2.5-6.5×1010cfu/g，比哈茨木霉菌T-22产孢量提高10％-20％；
(4)木霉生防菌制剂耐贮性与孢子存活率评价：
参照农药热贮测定标准GB/T19136-2003和低温稳定性测定标准GB/T19137-2003，将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别0℃处理7d、55℃处理14d，室温放置180天、360天、540天、720天后，进行稀释平板培养；
通过测定稀释平板培养基上的萌发孢子数，计算孢子存活率，孢子存活率的种质评价标准为：待评价木霉孢子存活率达75％以上，或较哈茨木霉菌T-22孢子存活率提高10％-20％；
(5)木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价：
取当地耕作层土壤，晾干至含水率3wt％-5wt％，过孔径为4mm的筛，经灭菌后，得灭菌土壤；种植作物前10-15天，按每克灭菌土壤加入1-1.5×105cfu分生孢子的量，将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别与上述灭菌土壤混合，加灭菌土壤重量20％-30％的水定殖，然后按0.5-1.5kg的量装入盆中，同时向每盆中播种作物种子3-10粒，然后采用灌土法每盆注入10-15mL每毫升106-107cfu的病原真菌菌丝及孢悬液；
分别于种植后15-90天对盆栽土壤进行取样，采用平板计数法，测定木霉定殖存活的数量，盆栽试验条件下定殖存活量的种质评价标准为：待评价木霉在土壤中存活量达1.5-2.3×104cfu/g，或比哈茨木霉菌T-22在土壤中存活量提高10％-25％；
观察记录作物出苗率、长势、健康情况，盆栽试验条件下生物防治效果的种质评价标准为：施用待评价木霉的作物发病率比施用哈茨木霉菌T-22的作物发病率降低10％-15％；
(6)木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价：
作物种植前10-30天，按150-200kg/hm2用量将待评价木霉、哈茨木霉菌T-22施入大田15-20cm的耕层土壤，灌溉至耕层土壤相对含水量为55％-65％；
分别于作物种植后苗期、生长期、结果期对耕层土壤进行取样，采用平板计数法，测定待评价木霉和哈茨木霉菌T-22定殖存活的数量，田间应用条件下定殖存活量的种质评价标准为：待评价木霉在土壤中存活量为1-28×104cfu/g干土，或比哈茨木霉菌T-22提高10％-20％；
观察记录作物出苗率、长势、健康情况，参照中华人民共和国国家标准杀菌剂GB/T17980.88-2004、GB/T17980.92-2004、GB/T17980.108-2004标准，田间应用条件下生物防治效果的种质评价标准为：施用待评价木霉的作物防病效果比施用哈茨木霉菌T-22的提高10％-15％，或防病效果达70％以上；
测定耕层土壤水稳性团聚体数量、土壤有机质、土壤有益微生物群落数，田间应用条件下生态效应的种质评价标准为：施用待评价木霉的土壤与施用哈茨木霉菌T-22的土壤相比，土壤水稳性团聚体数量提高10％-30％、土壤有机质提高5％-10％、土壤有益微生物群落数提高10％-30％；
检测标准：水稳性团聚体数量的检测标准执行中华人民共和国农业行业标准NY/T1121.19-2008，有机质检测标准执行中华人民共和国农业行业标准NY/T 1121.6-2006；有益微生物群落数测定：用去离子无菌水稀释平板培养法，放线菌培养用高氏一号培养基，固氮菌培养用阿须贝氏培养基。上述培养基均按本领域惯用配方配制，菌体个数计算方法按惯用方式计算。
为了提高评价结果的准确性，上述评价试验均可多次重复后取平均值。
所述步骤(1)中，平板培养条件为：25-28℃培养5-7天；液体培养条件为：25-28℃摇床培养2-4d，摇床转速180-210r/min。
所述步骤(2)中，对峙培养条件为：25-28℃培养3-5天；
所述步骤(2)中和(5)中的病原真菌选自：大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖镰刀菌(Fusarium oxysporum)之一。
所述步骤(3)中，固体发酵条件为：28-30℃，保湿培养2-3d，然后20-28℃，自然湿度培养3-5天。所述的固体发酵也可按照现有技术进行，如可参照公开号为CN101028006A、申请号为200610011087.8、名称为：木霉生物农药的制备工艺中的记载进行。
所述步骤(4)中，将木霉固体发酵物用无菌水稀释为106-109个/ml，稀释平板培养基每升组分如下：
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水定容至1000ml；
所述步骤(5)中，灭菌采用60Co-γ射线照射，照射剂量1-5kGy；所述病原真菌菌丝及孢悬液是将病原真菌培养10天后用组织捣碎器捣碎稀释至浓度为106-107cfu/mL菌丝体及孢子的悬浮液。病原真菌选自：大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖镰刀菌(Fusarium oxysporum)之一。。
上述PDA平板培养基、PD液体培养基均为本领域常用培养基，PDA平板培养基每升组分如下：
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水定容至1000ml；
PD液体培养基每升组分如下：
马铃薯200g，葡萄糖20g，水定容至1000ml；
上述步骤(5)和(6)中的作物为：棉花、小麦、花生之一；棉花的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治棉花黄、枯萎病GB/T17980.92-2004；小麦的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治小麦纹枯病GB/T17980.108-2004，花生的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004。
上述测定、检测、计算方法如无特别说明均为本领域惯用测定、检测、计算方法，本领域技术人员通过相同的测定、检测、计算方法获得的待评价木霉的相关数据与哈茨木霉菌T-22的相关数据进行比较，均能够实现本发明的发明目的。
有益效果
本发明通过将待评价木霉菌株在生长特性、拮抗作用、固体发酵产孢量、耐贮性与孢子存活率、盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果、在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应方面与哈茨木霉菌T-22进行对比，构建出一套木霉生防菌种质评价方法体系。该体系有利于筛选生防效果良好、对自然环境友好的新的木霉菌株，并且可以加快菌种筛选速度，为快速寻找发现具有经济价值的新木霉菌株提供了有效的途径。
附图说明
图1是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22培养皿中生长24小时菌落直径的柱状图；
图2是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22液体培养3天菌丝重量的柱状图；
图3是以菌落形成单位(cfu)数表示实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22固体培养7天产孢量结果；
图4是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22在55℃耐高温14天孢子萌发结果；
图5是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22在0℃耐低温7天孢子萌发结果；
图6是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22在常温阴凉贮存180天孢子存活率；
图7是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22在常温阴凉贮存360天孢子存活率；
图8是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22在常温阴凉贮存540天孢子存活率；
图9是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22在常温阴凉贮存720天孢子存活率；
图10以菌落形成单位(cfu)数表示实施例1盆栽试验中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22应用后土壤定殖结果；
图11是实施例1盆栽试验中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22施用后对大丽轮枝菌发病的抑制作用；
图12以菌落形成单位(cfu)数表示实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22田间试验施用后土壤定殖结果；
图13是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22田间试验对棉花黄萎病的防病效果；
图14是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22田间施用后对土壤有机质的影响；
图15是实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22田间试验对土壤水稳性团聚体数量的影响；
图16以菌落形成单位(cfu)数表示实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22田间试验对土壤中固氮菌群落数量的影响；
图17以菌落形成单位(cfu)数表示实施例1中待测木霉菌株和哈茨木霉菌T22田间试验对土壤中放线菌群落数量的影响；
具体实施方式
下面结合实例对本发明的技术方案进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所述哈茨木霉菌T22购自美国Bioworks有限公司(下简称木霉菌T22)；棉花鲁棉11号购自山东棉花研究中心，小麦济麦17号购自山东省农业科学院作物研究所，花生花育16号购自山东省花生研究所；
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)购自山东棉花研究中心，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)购自烟台市农业科学研究所，尖镰刀菌(Fusarium oxysporum)购自山东农业大学。
培养基
稀释平板培养基每升组分如下：
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水定容至1000ml；
PDA平板培养基每升组分如下：
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水定容至1000ml；
PD液体培养基每升组分如下：
马铃薯200g，葡萄糖20g，水定容至1000ml；
实施例中的实验材料
木霉菌株来源：木霉T36、木霉T52、木霉T64、木霉T80从山东各生态区自然分离纯化，其中：木霉T36分离自青岛常绿山林的耕层土壤、木霉T52分离自济南多年发病棉田的耕层土壤、木霉T64分离自寿光日光温室老棚的耕层土壤、木霉T80分离自淄博蔬菜田的耕层土壤，上述木霉菌株通过土样稀释涂皿、显微镜下单孢分离纯化培养，继代培养20次稳定，低温保存；
木霉T128、木霉T309、木霉T317、木霉T406为山东省农业科学院农产品研究所复合诱变所得，原始菌株为木霉T64，此菌株生长速度较快、产孢量较多，拮抗作用较强，通过60Co-γ射线和紫外线复合诱变后再通过稳定性试验、系列逆境处理和拮抗作用筛选获得；
木霉T33购自中国农业科学院土壤肥料研究所；
木霉T48购自中国农业大学资源与环境学院生态科学与工程系；
木霉T62购自山东大学生命科学学院生物科学系；
木霉T153购自中国科学院微生物研究所；
实施例中待评价木霉菌株为：木霉T33、木霉T36、木霉T48、木霉T52、木霉T62、木霉T64、木霉T80、木霉T128、木霉T153、木霉T309、木霉T317、木霉T406。
实施例参照标准：
田间药效试验，棉花的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治棉花黄、枯萎病GB/T17980.92-2004；小麦的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治小麦纹枯病GB/T17980.108-2004，花生的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004；水稳性团聚体数量的检测标准执行中华人民共和国农业行业标准NY/T1121.19-2008，有机质检测标准执行中华人民共和国农业行业标准NY/T 1121.6-2006；
微生物群落测定：用去离子无菌水稀释平板培养法，放线菌培养用高氏一号培养基，固氮菌培养用阿须贝氏培养基，菌体个数计算方法按惯用方式计算。土样稀释105倍，取0.1ml在高氏一号培养基涂皿，30℃培养5-7天，测定放线菌数量，土样稀释106倍，取0.1ml涂皿，在阿须贝氏培养基上涂皿，37℃培养3-5天，测定固氮菌数量。
高氏一号培养基每升组分如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，3％K2Cr2O72ml，琼脂20g，pH 7.0-7.4，水定容至1000ml。
阿须贝氏培养基每升组分如下：
KH2PO4 0.2g，MgSO4.7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4.2H2O 0.2g，CaCO3 3.0g，甘露醇10.0g，琼脂20g，pH 7.2，水定容至1000ml。
实施例1
本实施例实验地块为山东省农业科学院试验田。
一种木霉生防菌种质评价方法，包括：木霉生防菌生长特性评价，木霉生防菌拮抗作用评价，木霉生防菌固体发酵产孢量评价，木霉生防菌制剂耐贮性与孢子存活率评价，木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价，木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价：
(1)木霉生防菌生长特性评价：
将待评价木霉菌株和哈茨木霉菌T-22分别接种于PDA平板培养基上，28℃平板培养7天；然后分别转接到PD液体培养基中28℃摇床液体培养4天，摇床转速180r/min；
测定平板培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌落直径，按照本发明生长特性中菌落直径的种质评价标准：待评价木霉菌株菌落直径比哈茨木霉菌T-22菌落直径提高5％以上的菌株是木霉T80、木霉T317、木霉T309、木霉T128，7各菌株与木霉T-22持平，木霉T36、木霉T62菌株生长稍慢；
测定平板培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的产孢量，按照本发明生长特性中产孢量的种质评价标准：待评价木霉菌株产孢量＞1.5×109cfu/皿有10株，比哈茨木霉菌T-22产孢量提高15％以上的菌株是木霉T309、木霉T48、木霉T128、木霉T64、木霉T153，木霉T62、木霉T80、木霉T317产孢量少；
测定液体培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌丝重量，按照本发明生长特性中菌丝重量的种质评价标准：待评价木霉菌株菌丝重量比哈茨木霉菌T-22菌丝重量提高10％以上的菌株是木霉T309、木霉T128、木霉T48、木霉T153，菌株木霉T33、木霉T62、木霉T80、木霉T317菌丝重量低；
重复上述待评价木霉的检测实验10次，结果取平均值，见图1、表1、图2。
表1、平皿培养产孢
| 菌株号 | 产孢量 |
| T22 | C |
| T33 | C |
| T36 | C |
| T48 | E |
| T52 | C |
| T62 | B |
| T64 | D |
| T80 | A |
| T128 | D |
| T153 | D |
| T309 | E |
| T317 | B |
| T406 | C |
产孢量(109个/皿)：A＜1.5，B＝1.5--2.5，C＝2.5--3.5，D＝3.5--4.5，E＞4.5
(2)木霉生防菌拮抗作用评价：
在PDA平板培养基上，在25℃对峙培养大丽轮枝菌与待评价木霉菌株、大丽轮枝菌与哈茨木霉菌T-22，培养时间5天，具体步骤参照中华人民共和国农业行业标准NY/T1156.2-2006进行；
对峙培养结束后测定大丽轮枝菌菌落半径和病原真菌被覆盖率，按照5级拮抗标准评价：待评价木霉菌株对病原真菌的拮抗程度为2级有10株，拮抗程度比哈茨木霉菌T-22高的菌株是T309、T128，菌株T36、T80拮抗程度为3级；
所述5级拮抗标准如下：
1级：木霉菌完全长过病菌，并覆盖整个培养皿；2级：木霉菌占整个培养皿面积的2/3以上；3级：木霉菌占整个培养皿面积的1/2至2/3；4级：病菌占整个培养皿面积的2/3以上；5级：病菌长过木霉菌，并覆盖整个培养皿。
重复上述待评价木霉的检测实验10次，结果取平均值，见表2。
表2、平皿拮抗试验
| 菌株号 | 拮抗程度 |
| T22 | 2级 |
| T33 | 2级 |
| T36 | 3级 |
| T48 | 2级 |
| T52 | 2级 |
| T62 | 2级 |
| T63 | 2级 |
| T80 | 3级 |
| T128 | 2级 |
| T153 | 2级 |
| T309 | 2级 |
| T317 | 2级 |
| T406 | 2级 |
(3)木霉生防菌固体发酵产孢量评价：
对待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22进行固体发酵，固体发酵培养基按70wt％的麦麸与30wt％的棉籽壳混合，再加入1.3倍重量的水搅拌均匀，调pH为6制得；培养初期温度稳定在30℃，保湿培养，3天后温度降至28℃以下，待菌丝发酵过程产孢过半时，保持其自然的湿度，发酵完毕，制得固态木霉菌。
测定产孢量，按照上述制得的固态木霉菌中产孢量的种质评价标准：哈茨木霉菌T-22产孢量为5.42×1010cfu/g，待评价木霉比哈茨木霉菌T-22产孢量提高10％以上的菌株是木霉T128、木霉T309，产孢量只有109cfu/g的菌株木霉T33、木霉T36、木霉T80；
重复上述待评价木霉的检测实验10次，结果取平均值，见图3。
(4)木霉生防菌制剂耐贮性与孢子存活率评价。
参照农药热贮测定标准GB/T19136-2003和低温稳定性测定标准GB/T 19137-2003，将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别0℃处理7d、55℃处理14d，室温放置180天、360天、540天、720天后，进行稀释平板培养，将木霉固体发酵物用无菌水稀释为106-109个/ml，稀释液平板涂皿，26℃培养3-10小时，显微镜下计孢子萌发数。
通过测定稀释平板培养基上的孢子萌发数，计算孢子存活率，按照本发明孢子存活率的种质评价标准：哈茨木霉菌T-22孢子存活率分别为86.8％、94.8％、98.4％、93.3％、84.5％、65.1％，取平均值为：87.2％，待评价木霉耐热贮存孢子存活率大于75％有8株，T309孢子存活率比哈茨木霉菌T-22孢子存活率提高10.13％；待评价木霉低温贮存孢子存活率全部75％以上，T309孢子存活率比哈茨木霉菌T-22孢子存活率提高5.06％；放置180天后，孢子存活率全部75％以上；放置360天后，8个菌株孢子存活率75％以上；放置540天后，7个菌株孢子存活率75％以上；放置720天后，菌株T309孢子存活率比哈茨木霉菌T22高20.43％。
重复上述待评价木霉的检测实验10次，结果取平均值，见图4-9。
(5)木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价：
取当地耕层土壤，晾干至含水率5％，过孔径为4mm的筛，经60Co-γ射线照射灭菌，照射剂量5kGy，随机取样进行无菌检查，得灭菌土壤；种植作物前10天，按每克灭菌土壤加入1.5×105cfu分生孢子的量，将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别与100kg上述灭菌土壤混合，加25kg水定殖，然后按1kg的装土量装入盆中，同时每盆播种棉花种5粒，然后采用灌土法每盆注入15mL每毫升107cfu的大丽轮枝菌菌丝及孢悬液；
分别于播后20d、40d、60d对盆栽试验不同处理的土壤进行取样，采用平板计数法，测定木霉定殖存活的数量，按照本发明盆栽试验条件下定殖存活量的种质评价标准：哈茨木霉菌T-22土壤中群落数为5.6×104cfu/g，待评价木霉T309在土壤中存活量比哈茨木霉菌T-22在土壤中存活量提高19.64％；
观察记录棉花出苗率、长势、健康情况，参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治棉花黄、枯萎病GB/T17980.92-2004的观察记录方法，按照本发明盆栽试验条件下生物防治效果的种质评价标准：哈茨木霉菌T-22的棉花苗发病率为28.4％，施用待评价木霉，8株待评价木霉菌株发病率稍重，分别为木霉T33、木霉T36、木霉T52、木霉T62、木霉T80、木霉T153、木霉T317、木霉T406，待评价木霉T309的棉花苗发病率为25.1％，比施用哈茨木霉菌T-22的棉花苗发病率降低11.62％；
重复上述待评价木霉的检测实验10次，结果取平均值，见图10、11。
(6)木霉生防菌在大田应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价：
棉花种植前20天，按200kg/hm2用量将步骤(3)制得的固态木霉菌，待评价木霉、哈茨木霉菌T-22施入大田15-20cm的耕层土壤，将试验地块分为面积为6.67m2的小区，重复5次，灌溉至耕层土壤相对含水量为55-60％；
分别于棉花种植后苗期、开花期、吐絮期对耕层土壤进行取样，采用平板计数法，测定待评价木霉和哈茨木霉菌T-22定殖存活的数量，按照本发明田间应用条件下定殖存活量的种质评价标准：棉花生长后期，哈茨木霉菌T-22土壤中群落数为2.34×105cfu/g，待评价木霉T309在土壤中存活量为2.8×105cfu/g干土，比哈茨木霉菌T-22提高23.08％；
观察记录棉花出苗率、长势、健康情况，黄萎病的分级标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治棉花黄、枯萎病GB/T17980.92-2004的方法，按照本发明田间应用条件下生物防治效果的种质评价标准：施用哈茨木霉菌T-22的防病效果为71.4，施用待评价木霉T309的防病效果达70％以上，比施用哈茨木霉菌T-22的提高14.57％；
测定耕层土壤水稳性团聚体数量、土壤有机质、土壤有益微生物群落数，按照本发明田间应用条件下生态效应的种质评价标准：哈茨木霉菌T-22土壤水稳性团聚体数量为402.11g/kg，土壤有机质为1.78％，土壤有益微生物放线菌、固氮菌群落数分别为4.6×106cfu/g、53.1×106cfu/g；施用待评价木霉T309的土壤与施用哈茨木霉菌T-22的土壤相比，土壤水稳性团聚体数量提高22.16％、土壤有机质提高11.79％、土壤有益微生物放线菌、固氮菌群落数分别提高8.69％、29.00％。
重复上述待评价木霉的检测实验10次，结果取平均值，见图12-17。
因此待测菌株中，只有木霉T309符合本评价方法。
在小面积试验的基础上，将木霉T309进行大面积推广应用，比未施用木霉T309的对照田亩增产籽棉26公斤以上，亩增加产值234元，亩减少用药节约开支6.7元，节约劳动力为18小时，小时工5元计算，节约劳动力90元，合计亩共增收节支330.7元。
实施例2
本实施例实施地块为山东省济南市华山镇。
如实施例1所述的木霉生防菌种质评价方法，不同之处在于：
木霉生防菌拮抗作用评价中：
病原真菌为立枯丝核菌，木霉T309的拮抗程度为1级，木霉T80拮抗程度为3级，木霉T22与其他剩余11种木霉菌株拮抗程度为2级，按照本发明种质创新的评价标准：木霉T309对立枯丝核菌的拮抗作用比木霉T22提高10％。
木霉生防菌固体发酵产孢量评价中：
固体发酵培养基按75wt％的麦麸与25％wt％的小麦秸秆粉末混合。
木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价中：
取小麦田耕作层土壤，自然晾干至含水量4％过4mm筛，经4kGy60Co-γ射线照射灭菌后，随机取样进行无菌检查，确定样品达到灭菌要求后备用，种植小麦前10d，按每克灭菌土壤加入1.0×105cfu分生孢子的量，将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别与100kg土壤混合处理，加20kg水定殖，然后按1kg的装土量装入盆中，每盆播种小麦种10粒，采用灌土法每盆注入15mL立枯丝核菌106cfu/mL菌丝悬浮液，重复10次。分别于播后15d、25d、40d对盆栽试验不同处理的土壤进行取样，采用平板计数法，培养测定木霉定殖存活的数量，按盆栽试验条件下定殖存活量的种质评价标准：在土壤中存活量哈茨木霉菌T22为1.7×104cfu/g，木霉T309为1.9×104cfu/g，比对照菌株木霉菌T22提高11.76％。观察记录小麦出苗率、长势、健康情况，参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治小麦纹枯病GB/T17980.108-2004的观察记录方法，按盆栽试验条件下生物防治效果的种质评价标准：其中6株待评价木霉菌株(T33、T36、T52、T80、T317、T406)发病严重，哈茨木霉T22处理发病率为19.4％，木霉T309处理发病率为17.1％，比对照菌株降低11.86％。
木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价中：
小麦种植前10天，按200kg/hm2用量将步骤(3)制得的固态木霉菌，施入耕层土壤，将实验地块分为面积为50m2的小区，分别于小麦种植后返青期、拔节期、抽穗期对不同处理的耕层土壤进行取样，采用平板计数法，培养测定木霉定殖存活的数量，按田间应用条件下定殖存活量的种质评价标准：小麦生长后期，木霉菌T-22在土壤中存活量为1.0×104cfu/g干土，木霉菌T309在土壤中存活量为1.1×104cfu/g干土，比对照菌株T22提高10％。观察记录小麦出苗率、长势、健康情况，参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治小麦纹枯病GB/T17980.108-2004的观察记录方法，按照田间应用条件下生物防治效果的种质评价标准：哈茨木霉菌T-22的防治效果为75.4％，防治效果达70％以上的制剂有，木霉T309、木霉T128、木霉T48、木霉T64、木霉T317、木霉T153，木霉T309比木霉T22防治效果提高16.4％。测定耕层土壤水稳性团聚体数量、土壤有机质、土壤有益微生物群落数，哈茨木霉菌T-22土壤水稳性团聚体数量为368.41g/kg，土壤有机质为1.37％，土壤有益微生物放线菌、固氮菌群落数分别为3.4×106cfu/g、8.5×106cfu/g，按照木霉生防菌在田间应用条件下生态效应的种质评价标准：木霉T309与对照菌株木霉菌T-22相比，土壤水稳性团聚体数量提高12.5％、土壤有机质提高9％、土壤固氮菌、放线菌群落数提高12.3％和14.7％。
因此待测菌株中，只有木霉T309符合本评价方法。
在小面积试验的基础上，将木霉菌株T309进行大面积推广应用，比未施用木霉T309的对照田亩增产小麦47公斤以上，亩增加产值51.7元，亩减少用药节约开支4.5元，节约劳动力为10小时，小时工5元计算，节约劳动力50元，合计亩共增收节支106.2元。
实施例3
本实施例实施地块为山东省荣成市成山卫镇。
如实施例1所述的木霉生防菌种质评价方法，不同之处在于：
木霉生防菌拮抗作用评价中：
病原真菌为尖镰刀菌，木霉T309的拮抗程度为2级，木霉T80、木霉T36、木霉T62、木霉T317拮抗程度为3级，木霉T22与其他剩余7种木霉菌株拮抗程度为2级，按木霉生防菌拮抗作用中的种质评价标准：木霉T309对尖镰刀菌拮抗程度为2级，拮抗程度稍高于木霉菌T22。
木霉生防菌固体发酵产孢量评价中：
固体发酵培养基按65wt％的麦麸与35％wt％的花生秸秆粉末混合。
木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价中：
取耕作层土壤，自然晾干至含水量3％过4mm筛，经1kGy60Co-γ射线照射灭菌后，随机取样进行无菌检查，确定样品达到灭菌要求后备用。种植花生前15d，按每克灭菌土壤加入1.3×105cfu分生孢子的量，将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别与100kg土壤混合处理，加25kg水定殖，每盆装土1kg，播种花生3粒，采用灌土法每盆注入10mL尖镰刀菌107cfu/mL菌丝悬液，重复10次。分别于播后30d、60d、90d对盆栽试验不同处理的土壤进行取样，采用平板计数法，培养测定木霉定殖存活的数量，按照木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量的种质评价标准：木霉菌T22为1.9×104cfu/g，木霉T309为2.3×104cfu/g，木霉T309比对照菌株T22提高21.05％。观察记录花生出苗率、长势、健康情况，参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004的观察记录方法，按照木霉生防菌在盆栽试验条件下生物防治效果的种质评价标准：其中9株待评价木霉菌株(T33、T36、T52、T62、T80、T153、T317、T406)发病较重，木霉菌T22处理发病率为32.1％，木霉T309处理发病率比对照菌株木霉菌T22降低12.3％。
木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价中：
花生种植前20d，按150kg/hm2用量将将步骤(3)制得的固态木霉菌施入耕层土壤，并进行灌溉。将实验地块分为面积为30m2的小区，分别于花生种植后苗期、开花期、结荚期对不同处理的耕层土壤进行取样，采用平板计数法，培养测定木霉定殖存活的数量，按照木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量的种质评价标准：花生生长后期，哈茨木霉菌T-22在土壤中存活量为1.2×105cfu/g干土，待测木霉菌土壤定殖量高于1.4×105cfu/g，木霉T309比对照菌株木霉T22提高16.7％。观察记录花生出苗率、长势、健康情况，参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004的观察记录方法，按照木霉生防菌在田间应用条件下生物防治效果的种质评价标准：哈茨木霉菌T-22的防治效果为67.3％，防治效果达70％以上的菌株是木霉T309。测定耕层土壤水稳性团聚体数量、土壤有机质、土壤有益微生物群落数，哈茨木霉菌T-22土壤水稳性团聚体数量为381.12g/kg，土壤有机质为1.65％，土壤有益微生物放线菌、固氮菌群落数分别为5.4×106cfu/g、31.2×106cfu/g按照木霉生防菌在田间应用条件下生态效应的种质评价标准：与对照菌株木霉T22相比，施用木霉T309后土壤水稳性团聚体数量提高28.6％、土壤有机质提高10.8％、土壤固氮菌、放线菌群落数提高25.7％、10.4％。
因此待测菌株中，只有木霉T309符合本评价方法。
在小面积试验的基础上，将优选木霉菌株T309进行大面积推广应用，比未施用木霉T309的对照田亩增产花生33公斤以上，亩增加产值165元，亩减少用药节约开支5.2元，节约劳动力为9小时，小时工5元计算，节约劳动力45元，合计亩共增收节支215.2元。
Claims (2)
1.一种木霉生防菌种质评价方法，其特征在于，包括：木霉生防菌生长特性评价，木霉生防菌拮抗作用评价，木霉生防菌固体发酵产孢量评价，木霉生防菌制剂耐贮性与孢子存活率评价，木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价，木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价：
（1）木霉生防菌生长特性评价：
将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别接种于PDA平板培养基上平板培养；然后分别转接到PD液体培养基中液体培养；
测定平板培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌落直径，生长特性中菌落直径的种质评价标准为：待评价木霉菌株菌落直径比哈茨木霉菌T-22菌落直径提高5%-10%；
测定平板培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的产孢量，生长特性中产孢量的种质评价标准为：待评价木霉菌株产孢量比哈茨木霉菌T-22产孢量提高10%-20%；
测定液体培养条件下待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌丝重量，生长特性中菌丝重量的种质评价标准为：待评价木霉菌株菌丝重量比哈茨木霉菌T-22菌丝重量提高10%-15%；
（2）木霉生防菌拮抗作用评价：
在PDA平板培养基上对峙培养病原真菌与待评价木霉菌株、病原真菌与哈茨木霉菌T-22，具体步骤参照中华人民共和国农业行业标准NY/T1156.2-2006；
对峙培养结束后测定病原真菌菌落半径和被覆盖情况，分为5级拮抗标准，拮抗作用中拮抗程度的种质评价标准为：待评价木霉菌株拮抗程度为1级或2级；
所述5级拮抗标准如下：
1级：木霉菌完全长过病菌，并覆盖整个培养皿；2级：木霉菌占整个培养皿面积的2/3以上；3级：木霉菌占整个培养皿面积的1/2至2/3；4级：病菌占整个培养皿面积的2/3以上；5级：病菌长过木霉菌，并覆盖整个培养皿；
（3）木霉生防菌固体发酵产孢量评价：
对待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22进行固体发酵，固体发酵培养基按65-75wt%的麦麸与25-35wt%的作物秸秆粉末混合，再加入1.1-1.3倍重量的水搅拌均匀，调pH为6-6.5制得；
测定产孢量，固体发酵中产孢量的种质评价标准为：待评价木霉固体培养物产孢量2.5-6.5×1010cfu/g，比哈茨木霉菌T-22产孢量提高10%-20%；
（4）木霉生防菌制剂耐贮性与孢子存活率评价：
参照农药热贮测定标准GB/T19136-2003和低温稳定性测定标准GB/T19137-2003，将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别0℃处理7d、55℃处理14d，室温放置180天、360天、540天、720天后，进行稀释平板培养；
通过测定稀释平板培养基上的萌发孢子数，计算孢子存活率，孢子存活率的种质评价标准为：待评价木霉孢子存活率达75%以上，或较哈茨木霉菌T-22孢子存活率提高10%-20%；
（5）木霉生防菌在盆栽试验条件下定殖存活量、生物防治效果评价：
取当地耕作层土壤，晾干至含水率3wt%-5wt%，过孔径为4mm的筛，经灭菌后，得灭菌土壤；种植作物前10-15天，按每克灭菌土壤加入1-1.5×105cfu分生孢子的量，将待评价木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分别与上述灭菌土壤混合，加灭菌土壤重量20%-30%的水定殖，然后按0.5-1.5kg的量装入盆中，同时向每盆中播种作物种子3-10粒，然后采用灌土法每盆注入10-15mL每毫升106-107cfu的病原真菌菌丝及孢悬液；
分别于种植后15-90天对盆栽土壤进行取样，采用平板计数法，测定木霉定殖存活的数量，盆栽试验条件下定殖存活量的种质评价标准为：待评价木霉在土壤中存活量达1.5-2.3×104cfu/g，或比哈茨木霉菌T-22在土壤中存活量提高10%-25%；
观察记录作物出苗率、长势、健康情况，盆栽试验条件下生物防治效果的种质评价标准为：施用待评价木霉的作物发病率比施用哈茨木霉菌T-22的作物发病率降低10%-15%；
（6）木霉生防菌在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果及生态效应评价：
作物种植前10-30天，按150-200kg/hm2用量将待评价木霉、哈茨木霉菌T-22施入大田15-20cm的耕层土壤，灌溉至耕层土壤相对含水量为55%-65%；
分别于作物种植后苗期、生长期、结果期对耕层土壤进行取样，采用平板计数法，测定待评价木霉和哈茨木霉菌T-22定殖存活的数量，田间应用条件下定殖存活量的种质评价标准为：待评价木霉在土壤中存活量为1-28×104cfu/g干土，或比哈茨木霉菌T-22提高10%-20%；
观察记录作物出苗率、长势、健康情况，参照中华人民共和国国家标准杀菌剂GB/T17980.88-2004、GB/T17980.92-2004、GB/T17980.108-2004标准，田间应用条件下生物防治效果的种质评价标准为：施用待评价木霉的作物防病效果比施用哈茨木霉菌T-22的提高10%-15%，或防病效果达70%以上；
测定耕层土壤水稳性团聚体数量、土壤有机质、土壤有益微生物群落数，田间应用条件下生态效应的种质评价标准为：施用待评价木霉的土壤与施用哈茨木霉菌T-22的土壤相比，土壤水稳性团聚体数量提高10%-30%、土壤有机质提高5%-10%、土壤有益微生物群落数提高10%-30%；
检测标准：水稳性团聚体数量的检测标准执行中华人民共和国农业行业标准NY/T 1121.19-2008，有机质检测标准执行中华人民共和国农业行业标准NY/T 1121.6-2006；有益微生物群落数测定：用去离子无菌水稀释平板培养法，放线菌培养用高氏一号培养基，固氮菌培养用阿须贝氏培养基；
所述步骤（2）中和（5）中的病原真菌选自：大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖镰刀菌(Fusarium oxysporum)之一；
所述步骤（5）和（6）中的作物为：棉花、小麦、花生之一；棉花的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治棉花黄、枯萎病GB/T17980.92-2004；小麦的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治小麦纹枯病GB/T17980.108-2004，花生的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004。
2.如权利要求1所述的木霉生防菌种质评价方法，其特征在于，所述步骤（1）中，平板培养条件为：25-28℃培养5-7天；液体培养条件为：25-28℃摇床培养2-4d，摇床转速180-210r/min。
3. 如权利要求1所述的木霉生防菌种质评价方法，其特征在于，所述步骤（2）中，对峙培养条件为：25-28℃培养3-5天。
4. 如权利要求1所述的木霉生防菌种质评价方法，其特征在于，所述步骤（3）中，固体发酵条件为： 28-30℃，保湿培养2-3d，然后20-28℃，自然湿度培养3-5天。
5. 如权利要求1所述的木霉生防菌种质评价方法，其特征在于，所述步骤（4）中，将木霉固体发酵物用无菌水稀释为106-109个/ml，稀释平板培养基每升组分如下：
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水定容至1000ml。
6. 如权利要求1所述的木霉生防菌种质评价方法，其特征在于，所述步骤（5）中，灭菌采用60Co-γ射线照射，照射剂量1-5kGy。
7. 如权利要求1所述的木霉生防菌种质评价方法，其特征在于，所述步骤（5）中，病原真菌菌丝及孢悬液是将病原真菌培养10天后用组织捣碎器捣碎稀释至浓度为106-107cfu/mL菌丝体及孢子的悬浮液。
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- 2012-04-17 CN CN 201210112684 patent/CN102660627B/zh not_active Expired - Fee Related
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| CN102660627A (zh) | 2012-09-12 |
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