CN108559719B

CN108559719B - 一种液体微生物菌肥

Info

Publication number: CN108559719B
Application number: CN201810264765.4A
Authority: CN
Inventors: 赵学强; 胡晓敏; 李春田; 李欣; 苑丽蒲; 孟肖; 胡艳霞; 郎国桥
Original assignee: NORTH CHINA PHARMACEUTICAL GROUP AINO CO Ltd
Current assignee: NORTH CHINA PHARMACEUTICAL GROUP AINO CO Ltd
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2038-03-28
Also published as: CN108559719A

Abstract

本发明公开了一种液体微生物菌肥及其制备方法，属于微生物应用领域，包括甲基营养型芽孢杆菌，甲基营养型芽孢杆菌已于2010年12月09日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M2010343。本发明的液体微生物菌肥具有组成成分少、制备方法简单，所需的菌种成分单一、杂菌少、菌株活性保持时间长；将其应用到农作物生产中时，对番茄灰霉病等病害具有较强的防治作用、能有效提高肥料和土壤有机质的利用率、调节作物代谢、促进作物根系的生长和发育、能显著提高农作物的品质及产量，并且具备无毒、无害的优点。

Description

一种液体微生物菌肥

技术领域

本发明涉及甲基营养型芽孢杆菌，尤其是一种菌肥，属于生物肥料领域。

背景技术

随着农业生产集约化、可持续发展的要求，作物病虫害已经成为制约现代农业可持续发展的瓶颈。各种真菌性病害，造成大量农作物与经济作物减产甚至绝收，给国家和人民财产造成大量损失。

灰霉病是露地、保护地作物常见且比较难防治的一种真菌性病害，属低温高湿型病害，病原菌生长温度为20～30℃，温度20～25℃、湿度持续90％以上时为病害高发期。灰霉病由灰葡萄孢菌侵染所致，属真菌病害，花、果、叶、茎均可发病。

番茄灰霉病病原为半知菌亚门的灰葡萄孢菌。病菌主要以菌核(寒冷地区)或菌丝体及分孢梗(温暖地区)随病残体遗落在土中越夏或越冬，条件适宜时，萌发菌丝，产生分生孢子，借气流、雨水和人们生产活动进行传播。分生孢子依靠气流传播，从寄主伤口或衰老器官侵入致病。针对番茄灰霉病，现有的防治手段主要为施用化学药剂，如啶酰菌胺或嘧霉胺悬浮剂等。

黄瓜灰霉病也是由真菌半知菌亚门灰葡萄孢侵染引起的，病原菌以菌丝、分生孢子及菌核附着于病残体或遗留在土壤中越冬，靠风雨及农事操作传播，黄瓜结瓜期是病菌侵染和发病的高峰期，黄瓜灰霉病会引起花器变软、萎缩和腐烂，还会侵染到果实及叶片，严重危害黄瓜的品质及产量。针对黄瓜灰霉病，现有的防治手段主要为施用化学药剂，如施用速克灵烟剂或嘧霉胺悬浮剂等。

我国为了满足粮食生产的需要，化学肥料投入达到了相当高的比例。过量使用化学肥料，给中国的环境和食品安全造成了巨大的威胁。化肥中的硝酸盐物质会被人体细菌还原成亚硝酸盐，这是一种致癌物质。这种物质不断地在人体内积累，引发了多种现代疾病，如高血压、心脏病、糖尿病和癌症等。化肥已经成为了我们食物结构中最大的潜在杀手。为了人类的健康，需研发出更为绿色环保的生态农药。

微生物农药具有安全、无毒副作用、不污染环境等优点，而且，随着国际有机农产品市场的不断发展，无化肥副作用的农产品的市场需求增长，大力发展生物农药已经成为了必然的趋势。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种液体微生物菌肥，能减少微生物菌肥的组成成分、延长菌株的活性保持时间，并简化制备方法、有效防治番茄灰霉病、草莓灰霉病及黄瓜灰霉病等病害。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种液体微生物菌肥，包括甲基营养型芽孢杆菌，甲基营养型芽孢杆菌已于2010年12月9日保存在地址为中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo:M2010343。

本发明技术方案的进一步改进在于制备步骤为：先将甲基营养型芽孢杆菌进行活化，得到活化液；然后将活化液接种至发酵培养基中进行发酵，制得发酵菌液；最后向发酵菌液中加入助剂，得到液体微生物菌肥。

本发明技术方案的进一步改进在于：活化是将甲基营养型芽孢杆菌接种到含有活化培养基的种子罐中，甲基营养型芽孢杆菌的接种量占活化培养基的体积百分含量为0.1～0.3％，培养时间为11～13h；种子罐的罐压为0.05～0.07Mpa，风量为2～4:10vvm，转速为220～250rpm，温度为35～37℃，pH值为6～8。

本发明技术方案的进一步改进在于：发酵是在发酵罐中进行，发酵培养时间为22～26h；发酵罐中的罐压为0.05～0.07Mpa，风量为100:100～150vvm，转速为220～250rpm，温度为35～37℃，pH值为6～8。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述发酵菌液中甲基营养型芽孢杆菌活菌数为3～10亿个/毫升。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述助剂包括黄腐酸、氨基酸、保鲜剂和抑菌剂中的任一种或几种的混合；黄腐酸的加入量为0～1％，氨基酸的加入量为0～0.2％，保鲜剂的加入量为0～0.1％，抑菌剂的加入量为0～0.1％。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述氨基酸为丙氨酸、谷氨酸或脯氨酸中的一种或多种的组合；所述保鲜剂为壳聚糖、肉桂酸和β-环糊精中的任一种或几种的混合；所述抑菌剂为苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾和苯甲酸中的任一种或几种的混合。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述液体微生物菌肥用于防治番茄灰霉病时的施用方法为喷施，施用剂量为8～12公斤/亩；所述液体微生物菌肥在草莓移栽时，用于促进根系生长的施用方法为蘸根或喷施，施用剂量为8～12公斤/亩。

本发明技术方案的进一步改进在于：液体微生物菌肥的包装内预留有空气，包装上设有带透气孔的呼吸垫。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述液体微生物菌肥的包装为PET阻隔桶，桶内预留的空气体积占包装容积的5～10％。

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：

本发明的液体微生物菌肥具有组成成分少、制备方法简单的优点，所需的菌种成分单一、杂菌少、菌株活性保持时间长；将其应用到农作物生产中时，对灰霉病等病害具有较强的防治作用、能有效提高肥料和土壤有机质的利用率、调节作物代谢、促进作物根系的生长和发育，还能显著提高农作物的品质及产量，并且具备无毒、无害的优点。

本发明的液体微生物菌肥活性成分单一、杂菌少。本发明的液体微生物菌肥活性成分为甲基营养型芽孢杆菌这一种微生物，该菌菌株是由中科院沈阳应用生态研究所分离自渤海海泥的海洋细菌，属于革兰氏阳性杆菌，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，该菌在自然界以营养体和休眠性芽孢的形式存在，适应性强，能在各种环境中生存繁殖；本发明制备工艺中菌种的活化及发酵过程中均是对甲基营养型芽孢杆菌这一种菌进行操作，不涉及其他的菌种，与传统将多种菌种进行混合发酵相比，避免了菌种比例难控制、菌种活性难检测及发酵结束时间难确定等问题的发生，并且由于制备过程只涉及一种菌，菌株之外的助剂在加入之前都进行了杀菌操作，这些都保证了本发明的低杂菌率。

本发明的液体微生物菌肥能防治多种作物病害。本发明的液体微生物菌肥能防治番茄灰霉病、黄瓜灰霉病等病害，本发明所用甲基营养型芽孢杆菌，能适应各种不同的环境，并且该菌菌株生长速度快、产孢量大、抗逆性强，能在作物表面快速大量定殖，该菌菌株能够产生次生代谢产物抗菌活性物质，如短杆菌肽、多粘菌素、制霉菌素、大环内酯类活性物质等，可降解病原菌的细胞壁，对病原菌的孢子萌发和芽管伸长都有一定的抑制作用；另外，本发明的液体微生物菌肥中的活菌，具备能高密度地在植物根系定殖，协助释放土壤中潜在养分的功效，对土壤中的氮的转化率达到了5～13.6％，磷的转化率可达7～15.7％，钾的转化率可达8～16.6％，从而提高了土壤中有机质的利用率、促进了作物根系的生长和发育并能显著提高农作物的品质及产量；此外，本发明的液体微生物菌肥中添加的黄腐酸助剂是一种植物生长调节剂，能够促进植株的生长发育，显著提高植株的抗逆能力，进一步提高了农作物的品质及产量。

本发明的液体微生物菌肥保质期长。首先，本发明制备过程所用到的助剂不仅能延长菌肥的保质期，还能促进作物的生长，本发明所用到的助剂有黄腐酸、氨基酸、保鲜剂和抑菌剂，其中氨基酸可以是丙氨酸、谷氨酸或脯氨酸中的一种或者多种的组合，氨基酸一方面在做成的菌肥中能为甲基营养型芽孢杆菌提供一定的营养成分，保证菌种的活性，另一方面施用到土壤中后也可为作物的根系提供营养，促进根部的发育；保鲜剂可以是壳聚糖、肉桂酸和β-环糊精中的一种或者多种的组合，其中壳聚糖的加入能起到防止菌肥氧化腐败的作用；抑菌剂可以是苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾和苯甲酸中的一种或多种的组合，抑菌剂的加入能防止杂菌的生长；抑菌剂优选苯甲酸钠，与使用山梨醇相比，具有成本低且抑制杂菌生长效果好的优点，与使用廉价的亚硝酸钠相比，使用苯甲酸钠无健康隐患，安全性强。其次，本发明将制备好的液体微生物进行包装时，所用的包装材料为PET材质，密封口处带有呼吸垫，呼吸垫上有透气孔，透气孔能起到过滤和遮挡外界杂菌进入的作用，只能进干净空气，袋内还预留一部分空气，进一步保证了菌株的活性，延长了液体微生物菌肥的保质期。最后，本发明液体微生物菌肥中的菌体多以芽孢形式存在，通过控制生产工艺中的发酵培养时间及发酵时的罐压、风量、培养基组成、培养温度等，确保发酵液中活性菌的数量在3～10亿个/毫升范围内，在上述条件下得到的发酵液中菌体以芽孢体的形式存在，芽孢率大于80％，此种菌株对环境的抗逆性强，芽孢体能保存较长时期并且活性较强。

本发明的液体微生物菌肥具有无毒、无害的优点。由于甲基营养型芽孢杆菌是天然存在的菌种，没有进行过任何改造，对人、畜、农作物和自然环境安全，不会导致抗药性的产生，即使施用过量也不会对农作物造成任何损害，具有施用操作安全的优点；与传统使用化学农药防治病原菌相比，减少了化学农药的用量，提高了经济和环境效益。

本发明液体微生物菌肥的组成成分少、制备工艺简单且施用方式多样。本发明液体微生物菌肥仅由甲基营养型芽孢杆菌和三种助剂组成，成分种类少；制备工艺仅需将菌种进行活化、发酵培养，然后将加工助剂加入发酵液中混匀即可，制备工艺简单，设备方面仅需发酵所用常规设备，无需昂贵的设备投入，成本低廉，适合工业化大规模生产；施用方式既能蘸根又能通过喷施的方式进行施用，施用方式简单便捷，适合广大农民选择施用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：

一种液体微生物菌肥，活性成分为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，该菌是由中科院沈阳应用生态研究所分离自渤海海泥的海洋细菌，命名为甲基营养型芽孢杆菌9912，属于革兰氏阳性杆菌，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，并且已于2010年12月09日保存于地址为中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M2010343，保藏证明中分类学命名为地衣芽孢杆菌9912，2012年经中国科学院微生物研究所进行鉴定，根据鉴定结果更名为甲基营养型芽孢杆菌9912；该菌株为能形成芽孢(内生孢子)的杆菌，在自然界以营养体和休眠性芽孢的形式存在。

将上述的甲基营养型芽孢杆菌作为活性成分制备液体微生物菌肥，制备步骤如下：

先将冷冻保存的甲基营养型芽孢杆菌斜面菌种进行活化，活化是在种子罐中进行的，将菌株接种到种子罐中的培养基中，接种量为种子罐培养基(活化培养基)体积的0.1～0.3％，并且调节种子罐中的发酵条件为罐压0.05～0.07Mpa、风量为2～4:10vvm、转速为220～250rpm、温度为35～37℃、pH值为6～8，培养11～13h后得到活化液；种子罐培养基的各组成成分及含量为玉米粉1.5～2.1％、麸皮0.12～0.18％、黄豆饼粉0.25～0.35％、十二水磷酸二氢钾0.04～0.06％、无水碳酸钙0.06～0.08％，其余为水，PH值为6.4～6.6；

然后将活化液转移到发酵罐中，调整发酵罐的罐压为0.05～0.07Mpa、风量为100:100～150vvm、转速为220～250rpm、温度为35～37℃、pH值为6～8，继续培养22～26h后得到发酵液；发酵罐培养基的各组成成分及含量为玉米粉1.5～2.1％、麸皮0.30～0.40％、黄豆饼粉0.08～0.12％、十二水磷酸二氢钾0.04～0.06％、无水碳酸钙0.06～0.08％，其余为水，PH值为6.4～6.6；

发酵罐进行发酵时需对发酵液进行活性检测，当发酵液中甲基营养型芽孢杆菌的活菌数达到5亿个/毫升以上(活菌数达到3～10亿个/毫升时即可用于本发明液体微生物菌肥的制备，达到5亿个/毫升以上时制备出的液体微生物菌肥在疾病防治及促进植株根系生长发育方面效果更佳)、杂菌率小于5％，并且PH在6.0～8.0时停止发酵，得到达标的发酵液，发酵液活性检测的步骤为取一定量的发酵液，接种到改良淀粉琼脂培养基上，采用平板计数法，计算发酵液中甲基营养型芽孢杆菌活菌数和杂菌率，具体检测步骤如下：

用一支1ml无菌吸管吸取1ml的发酵液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分振荡混匀，即得10^-1个/ml稀释液。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10^-2个/ml稀释液、10^-3个/ml稀释液、10^-4个/ml稀释液、10^-5个/ml稀释液、10^-6个/ml稀释液。上述称量及稀释过程进行5个重复，即分别取5个样品进行稀释。稀释完成后吸取10^-6个/ml稀释液100μL分别涂布到预先准备好的改良淀粉培养基上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，30～36℃下培养45～50h后考察其菌落数；发酵液中甲基营养型芽孢杆菌活菌数和杂菌率的计算方法如下：

a)含菌量计算

含菌量按式(1)计算。

式中：

A——含菌量，CFU/g；

N——每平板生长的活性成分菌落数，CFU；

0.1——涂布平板时取样100μL换算为ml，ml；

M——稀释倍数，10⁶；

按照上述公式，计算每个平板菌落数对应的含菌量，每个平板含菌量的算术平均值即为该试样的含菌量。

b)杂菌率计算

杂菌含量按式(1)计算，其中：

A——杂菌含量，CFU/g；

N——每平板生长的杂菌菌落数，CFU；

其他各项含义与含菌量计算过程相同。

杂菌率(％)按式(2)计算。

式中：

X——杂菌率，％；

A₁——样品中杂菌含量，CFU/g；

A₂——样品中活性成分含量(含菌量)，CFU/g。

其中改良淀粉培养基的各组成成分及含量为牛肉膏0.45～0.50g/100ml、酵母膏0.8～1.2g/100ml、氯化钠0.45～0.50g/100ml、可溶性淀粉18～22g/100ml、琼脂/1.8～2.2g/100ml、pH 6.5～7.0；

向上述达标的发酵液中加入助剂，加入的助剂有黄腐酸、氨基酸、保鲜剂和抑制剂，各助剂的加入量分别为0～1％、0～0.2％、0～0.1％和0～0.1％，其中氨基酸助剂可以是丙氨酸、谷氨酸或脯氨酸中的一种或多种的组合，保鲜剂可以是壳聚糖、肉桂酸和β-环糊精中的任一种或几种的混合，优选壳聚糖；所述抑菌剂为苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾和苯甲酸中的任一种或几种的混合，优选苯甲酸钠。将各助剂加入发酵液中后搅拌均匀即得到液体微生物菌肥；

将制备得到的微生物菌肥进行包装，液体微生物菌肥的包装内预留有空气，包装上设有带透气孔的呼吸垫，透气孔具有过滤和阻挡外界杂菌的作用；包装优选用PET阻隔桶进行包装，液体微生物菌肥的包装内预留空气的体积占包装容积的5～10％。

上述制备好的微生物菌肥的施用方法为：用于防治番茄灰霉病或黄瓜灰霉病时的施用方法为喷施，施用剂量为8～12公斤/亩；在草莓移栽时，用于促进根系生长的施用方法为蘸根或喷施，施用剂量为8～12公斤/亩。

实施例1

一种液体微生物菌肥，活性成分为甲基营养型芽孢杆菌，制备步骤如下：

先将冷冻保存的甲基营养型芽孢杆菌斜面菌种进行活化，活化是在种子罐中进行的，将菌株接种到种子罐中的培养基中，接种量为种子罐培养基体积的0.1％，并且调节种子罐中的发酵条件为罐压0.05Mpa、风量为2:10vvm、转速为250rpm、温度为35℃、pH值为6.4，培养13h后得到活化液；种子罐培养基的各组成成分及含量为玉米粉1.5％、麸皮0.18％、黄豆饼粉0.25％、十二水磷酸二氢钾0.06％、无水碳酸钙0.06％，其余为水，PH值为6.4；

然后将活化液转移到发酵罐中，调整发酵罐的罐压为0.05Mpa、风量为100:100vvm、转速为250rpm、温度为35℃、pH值为6，继续培养22h后得到发酵液；发酵罐培养基的各组成成分及含量为玉米粉1.5％、麸皮0.40％、黄豆饼粉0.08％、十二水磷酸二氢钾0.06％、无水碳酸钙0.06％，其余为水，PH值为6.4；

发酵罐进行发酵时需对发酵液进行活性检测，具体检测步骤如下：

用一支1ml无菌吸管吸取1ml的发酵液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分振荡混匀，即得10^-1个/ml稀释液。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10^-2个/ml稀释液、10^-3个/ml稀释液、10^-4个/ml稀释液、10^-5个/ml稀释液、10^-6个/ml稀释液。上述称量及稀释过程进行5个重复，即分别取5个样品进行稀释。稀释完成后吸取10^-6个/ml稀释液100μL分别涂布到预先准备好的改良淀粉培养基上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，30℃下培养50h后考察其菌落数。其中改良淀粉培养基的各组成成分及含量为牛肉膏0.45g/100ml、酵母膏1.2g/100ml、氯化钠0.45g/100ml、可溶性淀粉18g/100ml、琼脂1.8g/100ml、pH 6.5；检测结果为活菌数6.1亿个/毫升，杂菌数为0，pH值为6.5；

向上述达标的发酵液中加入助剂，加入的助剂有黄腐酸、丙氨酸、壳聚糖和苯甲酸钠，各助剂的加入量为0.5％、0.2％、0.1％和0.1％，将各助剂加入发酵液中后搅拌均匀即得到液体微生物菌肥；

将制备得到的微生物菌肥用PET阻隔桶进行包装，包装内预留空气的体积占包装容积的5％；所用的包装在密封口处设有呼吸垫，呼吸垫上设有透气孔，透气孔具有过滤和阻挡外界杂菌的作用。

实施例2

先将冷冻保存的甲基营养型芽孢杆菌斜面菌种进行活化，活化是在种子罐中进行的，将菌株接种到种子罐中的培养基中，接种量为种子罐培养基体积的0.3％，并且调节种子罐中的发酵条件为罐压0.07Mpa、风量为4:10vvm、转速为220rpm、温度为37℃、pH值为6.6，培养11h后得到活化液；种子罐培养基的各组成成分及含量为玉米粉2.1％、麸皮0.12％、黄豆饼粉0.35％、十二水磷酸二氢钾0.04％、无水碳酸钙0.08％，其余为水，PH值为6.6；

然后将活化液转移到发酵罐中，调整发酵罐的罐压为0.07Mpa、风量为100:150vvm、转速为220rpm、温度为37℃、pH值为8，继续培养22h后得到发酵液；发酵罐培养基的各组成成分及含量为玉米粉2.1％、麸皮0.30％、黄豆饼粉0.12％、十二水磷酸二氢钾0.04％、无水碳酸钙0.08％，其余为水，PH值为6.6；

用一支1ml无菌吸管吸取1ml的发酵液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分振荡混匀，即得10^-1个/ml稀释液。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10^-2个/ml稀释液、10^-3个/ml稀释液、10^-4个/ml稀释液、10^-5个/ml稀释液、10^-6个/ml稀释液。上述称量及稀释过程进行5个重复，即分别取5个样品进行稀释。稀释完成后吸取10^-6个/ml稀释液100μL分别涂布到预先准备好的改良淀粉培养基上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，36℃下培养45h后考察其菌落数。其中改良淀粉培养基的各组成成分及含量为牛肉膏0.50g/100ml、酵母膏0.8g/100ml、氯化钠0.50g/100ml、可溶性淀粉18g/100ml、琼脂2.2g/100ml、pH 7.0；检测结果为活菌数5.54亿个/毫升，杂菌数为0，PH值为6.6；

向上述达标的发酵液中加入助剂，加入的助剂有黄腐酸、谷氨酸、壳聚糖和苯甲酸钠，各助剂的加入量为0.6％、0.1％、0.05％和0.05％，将各助剂加入发酵液中后搅拌均匀即得到液体微生物菌肥；

将制备得到的微生物菌肥用PET阻隔桶进行包装，包装内预留空气的体积占包装容积的10％；所用的包装在密封口处设有呼吸垫，呼吸垫上设有透气孔，透气孔具有过滤和阻挡外界杂菌的作用。

实施例3

先将冷冻保存的甲基营养型芽孢杆菌斜面菌种进行活化，活化是在种子罐中进行的，将菌株接种到种子罐中的培养基中，接种量为种子罐培养基体积的0.2％，并且调节种子罐中的发酵条件为罐压0.06Mpa、风量为3:10vvm、转速为235rpm、温度为36℃、pH值为7，培养12h后得到活化液；种子罐培养基的各组成成分及含量为玉米粉1.8％、麸皮0.15％、黄豆饼粉0.30％、十二水磷酸二氢钾0.05％、无水碳酸钙0.07％，其余为水，PH值为6.5；

然后将活化液转移到发酵罐中，调整发酵罐的罐压为0.06Mpa、风量为100:130vvm、转速为235rpm、温度为36℃、pH值为6.5，继续培养24h后得到发酵液；发酵罐培养基的各组成成分及含量为玉米粉1.8％、麸皮0.35％、黄豆饼粉0.10％、十二水磷酸二氢钾0.05％、无水碳酸钙0.07％，其余为水，pH值为6.5；

用一支1ml无菌吸管吸取1ml的发酵液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分振荡混匀，即得10^-1个/ml稀释液。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10^-2个/ml稀释液、10^-3个/ml稀释液、10^-4个/ml稀释液、10^-5个/ml稀释液、10^-6个/ml稀释液。上述称量及稀释过程进行5个重复，即分别取5个样品进行稀释。稀释完成后吸取10^-6个/ml稀释液100μL分别涂布到预先准备好的改良淀粉培养基上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，33℃下培养48h后考察其菌落数。其中改良淀粉培养基的各组成成分及含量为牛肉膏0.48g/100ml、酵母膏0.10g/100ml、氯化钠0.48g/100ml、可溶性淀粉20g/100ml、琼脂2.0g/100ml、pH 6.7；检测结果为活菌数5.18亿个/毫升，杂菌数为0，pH值为6.6；

向上述达标的发酵液中加入助剂，加入的助剂有黄腐酸、丙氨酸和脯氨酸组成的混合氨基酸、壳聚糖和苯甲酸钠，各助剂的加入量为0.8％、0.15％、0.04％和0.08％，将各助剂加入发酵液中后搅拌均匀即得到液体微生物菌肥；

将制备得到的微生物菌肥用PET阻隔桶进行包装，包装内预留空气的体积占包装容积的8％；所用的包装在密封口处设有呼吸垫，呼吸垫上设有透气孔，透气孔具有过滤和阻挡外界杂菌的作用。

实施例4

本实施例为将上述实施例1制备的液体生物菌肥应用到番茄灰霉病的防治中。

在番茄苗木移栽时，将实施例1制备的液体生物菌肥采用喷施或者蘸根的方式，施肥1次，用药量为10公斤/亩。在番茄植株需肥高峰期时再追肥一次。与施用传统肥料对比，施用上述实施例1制备的液体生物菌肥的番茄植株，可有效降低番茄灰霉病发病率30％，产量提高25％。

实施例5

本实施例为将上述实施例2制备的液体生物菌肥应用到黄瓜灰霉病的防治中。

在黄瓜苗木移栽时，将实施例2制备的液体生物菌肥采用喷施或者蘸根的方式，施肥1次，用药量为8公斤/亩。在黄瓜植株需肥高峰期时再追肥2次。与施用传统肥料对比，施用上述实施例2制备的液体生物菌肥的黄瓜植株，可有效降低黄瓜灰霉病发病率25％，产量提高20％。

实施例6

本实施例为将上述实施例3制备的液体生物菌肥应用到草莓移栽壮苗、壮根中。

在草莓苗木移栽时，将实施例3制备的液体生物菌肥采用蘸根的方式，施肥1次，用药量为12公斤/亩。在草莓植株需肥高峰期时再追肥2次。与施用传统肥料对比，施用实施例3制备的液体生物菌肥的草莓植株，根系发育更为发达，虚根数量比对照组多20％，最大根长比对照组长30％，并可有效降低草莓灰霉病发病率15％，产量提高10％。

Claims

1.一种液体微生物菌肥，其特征在于：包括甲基营养型芽孢杆菌，所述甲基营养型芽孢杆菌已于2010年12月9日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M2010343；制备步骤为：先将甲基营养型芽孢杆菌进行活化，得到活化液；然后将活化液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵菌液；最后向发酵菌液中加入助剂，制得液体微生物菌肥；活化是将甲基营养型芽孢杆菌接种到含有活化培养基的种子罐中，甲基营养型芽孢杆菌的接种量占活化培养基的体积百分含量为0.1～0.3％，培养时间为11～13h；种子罐的罐压为0.05～0.07Mpa，风量为2～4:10vvm，转速为220～250rpm，温度为35～37℃，pH值为6～8；发酵是在发酵罐中进行，发酵培养时间为22～26h；发酵罐中的罐压为0.05～0.07Mpa，风量为100:100～150vvm，转速为220～250rpm，温度为35～37℃，pH值为6～8；所述发酵菌液中甲基营养型芽孢杆菌活菌数为3～10亿个/毫升；所述助剂包括黄腐酸、氨基酸、保鲜剂和抑菌剂，保鲜剂为壳聚糖，抑菌剂为苯甲酸钠；黄腐酸的加入量为0～1%，氨基酸的加入量为0～0.2%，保鲜剂的加入量为0～0.1%，抑菌剂的加入量为0～0.1%。

2.根据权利要求1所述的一种液体微生物菌肥，其特征在于：所述氨基酸为丙氨酸、谷氨酸或脯氨酸中的一种或多种的组合。

3.根据权利要求1所述的一种液体微生物菌肥，其特征在于：所述液体微生物菌肥用于防治番茄灰霉病时的施用方法为喷施，施用剂量为8～12公斤/亩；所述液体微生物菌肥在草莓移栽时，用于促进根系生长的施用方法为蘸根或喷施，施用剂量为8～12公斤/亩。

4.根据权利要求3所述的一种液体微生物菌肥，其特征在于：液体微生物菌肥的包装内预留有空气，包装上设有带透气孔的呼吸垫。

5.根据权利要求4所述的一种液体微生物菌肥，其特征在于：所述液体微生物菌肥的包装为PET阻隔桶，桶内预留的空气体积占包装容积的5～10%。