CN106489997A - 一种微生物杀虫剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农用微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种微生物杀虫剂的制备方法，具体步骤为,步骤1：苏云金芽孢杆菌斜面培养；步骤2：苏云金芽孢杆菌摇瓶培养；步骤3：苏云金芽孢杆菌种子培养；步骤4：苏云金芽孢杆菌发酵培养，本发明的微生物杀虫剂具有芽孢数量高和伴胞晶体含量高的特点，用于植物虫害防控，随着害虫对植物的进食进入虫体肠道，通过营养菌体、菌体芽孢及其分泌的内毒素（伴孢晶体）、营养期杀虫蛋白、肠毒素、几丁质酶等的交互作用，使害虫进食后患败血症死亡，对瓜果、蔬菜、果树、大田类作物的菜青虫、小菜蛾、甜蛾、斜纹夜蛾、甘蓝夜蛾、烟青虫、玉米螟、稻纵卷叶螟、二化螟、小地老虎等都有毒杀作用。

Description

一种微生物杀虫剂的制备方法
技术领域
本发明涉及农用微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种微生物杀虫剂的制备方法。
背景技术
植物病虫害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织 (ＦＡＯ)统计每年因植物遭受病害造成的减产平均损失为总产量的15%～20%。长期以来，用于防治或扑灭农田害虫制剂一般均为化学农药，如六六六、敌敌畏等。长期频繁使用化学农药，导致害虫抗药性的出现，使化学农药的效力逐渐降低。目前，主要解决方式是加大用药量，直接导致农业成本提高；害虫抗药性加强，防治难度加大；天敌被杀死，生态平衡遭到破坏；毒害物质在农副产品中残留、积累，危害广大人民的身体健康。因此，寻找广谱、高效、低毒的生物农药已成为科研人员及农药使用人员的共识。
微生物杀虫剂是利用微生物活体或其代谢产物来防治害虫的。它具有特异性强，防治效果好，对人畜安全，不破坏生态平衡，害虫不易产生抗药性等优点。目前的微生物杀虫剂主要包括三类：1、细菌类杀虫剂：细菌杀虫剂是应用最早的微生物杀虫剂，根据对昆虫致病性的不同，分为转性病原体、碱性病原体和潜势病原体。目前被开发成产品投入实际使用的主要有4种：苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌，其中苏云金芽孢杆菌是当今研究最多、应用最广的微生物杀虫剂。其功效产物为伴胞晶体蛋白和苏云金素。2、真菌类杀虫剂：真菌类杀虫剂种类繁多，目前记载的约有800多种，其中大部分是兼性或转性病原体，研究应用较多的有白僵菌、绿僵菌、拟青霉菌、轮枝菌等。但其生长和繁殖在很大程度上受外界条件的限制，在实际应用中收到环境限制。3、病毒类杀虫剂：昆虫病毒的感染途径主要有食入感染和皮肤感染，目前该类制剂正处于研发阶段，工业化生产还不成熟。
综上，现有的微生物杀虫剂在实际应用过程中应用范围较为单一，菌种间的拮抗作用强，杀虫谱较窄；在工业化应用和环境适应性、抗逆性等方面现有产品也存在诸多不足，限制了微生物制剂在农作物杀虫上的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是通过菌种选育和发酵工艺优化，设计出一种工业化微生物杀虫剂的生产方法，即利用两种苏云金芽孢杆菌作为生产菌株，应用本发明所设计的工艺方案和优化的培养基配方，增强产品的杀虫性能，并扩展其实际应用范围。
为实现上述的发明目的，本发明的技术方案如下：
一种微生物杀虫剂的制备方法，具体步骤为：
步骤1：苏云金芽孢杆菌斜面培养，所述苏云金芽孢杆菌斜面培养温度为32℃～39℃，时间为43h～52h，所述苏云金芽孢杆菌斜面培养培养基配方为：氯化钠0.2%～0.8%，葡萄糖0.2%～0.8%，蛋白胨0.3%～0.7%，琼脂粉1%～3%，其余为水，将pH值调整至7.0～8.5，灭菌后倒斜面，接种培养。
步骤2：苏云金芽孢杆菌摇瓶培养，所述苏云金芽孢杆菌摇瓶培养温度为32℃～39℃，时间为22h～30h，转速为180rpm～220rpm，所述苏云金芽孢杆菌摇瓶培养培养基配方为：葡萄糖0.5%～2%，玉米蛋白粉0.5%～2%，蛋白胨0.2%～0.8%，淀粉0.2%～0.8%，将pH值调整至7.0～8.5，灭菌后接种培养。
步骤3：苏云金芽孢杆菌种子培养，所述苏云金芽孢杆菌种子培养培养温度为32℃～39℃，时间为24h～26h，起始搅拌转速为400rpm，接种量为2%～3%，通气比V空气/min：V发酵液体积为0.8:1，根据溶氧情况逐步提高搅拌转数和通气比，搅拌转数最高至600rpm，通气比V空气/min：V发酵液体积最高至1.5:1，待pH值开始回升且尾碳升至最高开始下降时移种，所述苏云金芽孢杆菌种子培养培养基配方为：葡萄糖0.5%～1%，玉米蛋白粉1%，棉籽饼粉0.5%～1%，玉米淀粉0.5%～1%，聚醚消泡剂0.01%，其余为水，灭菌前将pH值调整到7.0～7.5，装料系数为0.6，灭菌后通气保压，降温至32℃～39℃时，接种培养。
步骤4：苏云金芽孢杆菌发酵培养，所述苏云金芽孢杆菌发酵培养的温度为32℃～39℃，时间为24h～28h，接种量为10%～20%之间，启始搅拌转速为300rpm，当溶解氧低于20%时增加搅拌转数和通气量，维持溶氧在20%以上，当发酵液中菌体数量≥5*109cfu/ml后，降低发酵液溶氧至5%～10%之间，添加灭菌后的氯化钴、氯化锰等微量元素，添加量为氯化锰0.001%～0.002%，氯化钴0.0015%～0.003%，促进芽孢和伴胞晶体的形成，增加发酵液中的有效成分，待发酵结束时将发酵罐液体排出，进行成品灌装，所述苏云金芽孢杆菌发酵培养培养基配方为：葡萄糖0.2%～1.5%，棉籽饼粉0.5%～3%，玉米浆0.2%～2%，玉米淀粉1%～3%，聚醚消泡剂：0.005%～0.02%，其余为水，灭菌前将pH值调整到7.0～7.5，装料系数为0.6，灭菌后通气保压，降温至32℃～39℃时，接种培养。
本发明的有益效果为：
1、本发明的微生物杀虫剂具有芽孢数量高和伴胞晶体含量高的特点，其菌体数量远高于现有国家标准，用于植物虫害防控，随着害虫对植物的进食进入虫体肠道，通过营养菌体、菌体芽孢及其分泌的内毒素（伴孢晶体）、营养期杀虫蛋白、肠毒素、几丁质酶等的交互作用，使害虫进食后患败血症死亡；对瓜果、蔬菜、果树、大田类作物的菜青虫、小菜蛾、甜蛾、斜纹夜蛾、甘蓝夜蛾、烟青虫、玉米螟、稻纵卷叶螟、二化螟、小地老虎等都有毒杀作用。
2、两种菌种的混合发酵降低了设备投入和人工成本，便于产品的工业化生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步阐述。
一种微生物杀虫剂的制备方法，具体步骤为：
步骤1：苏云金芽孢杆菌斜面培养，所述苏云金芽孢杆菌斜面培养温度为32℃～39℃，时间为43h～52h，所述苏云金芽孢杆菌斜面培养培养基配方为：氯化钠0.2%～0.8%，葡萄糖0.2%～0.8%，蛋白胨0.3%～0.7%，琼脂粉1%～3%，其余为水，将pH值调整至7.0～8.5，灭菌后倒斜面，接种培养。
步骤2：苏云金芽孢杆菌摇瓶培养，所述苏云金芽孢杆菌摇瓶培养温度为32℃～39℃，时间为22h～30h，转速为180rpm～220rpm，所述苏云金芽孢杆菌摇瓶培养培养基配方为：葡萄糖0.5%～2%，玉米蛋白粉0.5%～2%，蛋白胨0.2%～0.8%，淀粉0.2%～0.8%，将pH值调整至7.0～8.5，灭菌后接种培养。
步骤3：苏云金芽孢杆菌种子培养，所述苏云金芽孢杆菌种子培养培养温度为32℃～39℃，时间为24h～26h，起始搅拌转速为400rpm，接种量为2%～3%，通气比V空气/min：V发酵液体积为0.8:1，根据溶氧情况逐步提高搅拌转数和通气比，搅拌转数最高至600rpm，通气比V空气/min：V发酵液体积最高至1.5:1，待pH值开始回升且尾碳升至最高开始下降时移种，所述苏云金芽孢杆菌种子培养培养基配方为：葡萄糖0.5%～1%，玉米蛋白粉1%，棉籽饼粉0.5%～1%，玉米淀粉0.5%～1%，聚醚消泡剂0.01%，其余为水，灭菌前将pH值调整到7.0～7.5，装料系数为0.6，灭菌后通气保压，降温至32℃～39℃时，接种培养。
步骤4：苏云金芽孢杆菌发酵培养，所述苏云金芽孢杆菌发酵培养的温度为32℃～39℃，时间为24h～28h，接种量为10%～20%之间，启始搅拌转速为300rpm，当溶解氧低于20%时增加搅拌转数和通气量，维持溶氧在20%以上，当发酵液中菌体数量≥5*109cfu/ml后，降低发酵液溶氧至5%～10%之间，添加灭菌后的氯化钴、氯化锰等微量元素，添加量为氯化锰0.001%～0.002%，氯化钴0.0015%～0.003%，促进芽孢和伴胞晶体的形成，增加发酵液中的有效成分，待发酵结束时将发酵罐液体排出，进行成品灌装，所述苏云金芽孢杆菌发酵培养培养基配方为：葡萄糖0.2%～1.5%，棉籽饼粉0.5%～3%，玉米浆0.2%～2%，玉米淀粉1%～3%，聚醚消泡剂：0.005%～0.02%，其余为水，灭菌前将pH值调整到7.0～7.5，装料系数为0.6，灭菌后通气保压，降温至32℃～39℃时，接种培养。
以上对本发明的实施进行了说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的保护范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (1)

1.一种微生物杀虫剂的制备方法，其特征在于,具体步骤为：
步骤1：苏云金芽孢杆菌斜面培养，所述苏云金芽孢杆菌斜面培养温度为32℃～39℃，时间为43h～52h，所述苏云金芽孢杆菌斜面培养培养基配方为：氯化钠0.2%～0.8%，葡萄糖0.2%～0.8%，蛋白胨0.3%～0.7%，琼脂粉1%～3%，其余为水，将pH值调整至7.0～8.5，灭菌后倒斜面，接种培养；
步骤2：苏云金芽孢杆菌摇瓶培养，所述苏云金芽孢杆菌摇瓶培养温度为32℃～39℃，时间为22h～30h，转速为180rpm～220rpm，所述苏云金芽孢杆菌摇瓶培养培养基配方为：葡萄糖0.5%～2%，玉米蛋白粉0.5%～2%，蛋白胨0.2%～0.8%，淀粉0.2%～0.8%，将pH值调步骤3：苏云金芽孢杆菌种子培养，所述苏云金芽孢杆菌种子培养培养温度为32℃～39℃，时间为24h～26h，起始搅拌转速为400rpm，接种量为2%～3%，通气比V空气/min：V发酵液体积为0.8:1，根据溶氧情况逐步提高搅拌转数和通气比，搅拌转数最高至600rpm，通气比V空气/min：V发酵液体积最高至1.5:1，待pH值开始回升且尾碳升至最高开始下降时移种，所述苏云金芽孢杆菌种子培养培养基配方为：葡萄糖0.5%～1%，玉米蛋白粉1%，棉籽饼粉0.5%～1%，玉米淀粉0.5%～1%，聚醚消泡剂0.01%，其余为水，灭菌前将pH值调整到7.0～7.5，装料系数为0.6，灭菌后通气保压，降温至32℃～39℃时，接种培养；
步骤4：苏云金芽孢杆菌发酵培养，所述苏云金芽孢杆菌发酵培养的温度为32℃～39℃，时间为24h～28h，接种量为10%～20%之间，启始搅拌转速为300rpm，当溶解氧低于20%时增加搅拌转数和通气量，维持溶氧在20%以上，当发酵液中菌体数量≥5*109cfu/ml后，降低发酵液溶氧至5%～10%之间，添加灭菌后的氯化钴、氯化锰等微量元素，添加量为氯化锰0.001%～0.002%，氯化钴0.0015%～0.003%，促进芽孢和伴胞晶体的形成，增加发酵液中的有效成分，待发酵结束时将发酵罐液体排出，进行灌装成品，所述苏云金芽孢杆菌发酵培养培养基配方为：葡萄糖0.2%～1.5%，棉籽饼粉0.5%～3%，玉米浆0.2%～2%，玉米淀粉1%～3%，聚醚消泡剂：0.005%～0.02%，其余为水，灭菌前将pH值调整到7.0～7.5，装料系数为0.6，灭菌后通气保压，降温至32℃～39℃时，接种培养。
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