CN1337461A - 苏云金芽胞杆菌高毒力基因工程菌wg001及生产工艺与产品 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物农药技术领域,涉及苏云金芽胞杆菌基因工程菌的构建、生产工艺及产品。特征是,将含有crylAa10－P20基因的重组质粒pBMB1808转入对棉铃虫高毒力菌株YBT－1520中,获得一株适合生产微生物杀虫剂的高毒力基因工程菌WG001(一种苏云金芽胞杆菌,Bacillusthuringiensis,保藏在CCTCC,保藏日:2001年9月13日,保藏号:M201033)。该菌株带有crylAa、crylAb和crylAc杀虫晶体蛋白基因。与天然菌株相比,WG001的杀虫晶体蛋白产量提高一倍以上,伴胞晶体增大2.1倍,对小菜蛾和棉铃虫均具有良好的防效。

Description

苏云金芽胞杆菌高毒力基因工程菌WG001及生产工艺与产品

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及用于微生物杀虫剂的高毒力苏云金芽胞杆菌基因工程菌菌株的选育，它的生产工艺及其产品开发。

苏云金芽胞杆菌杀虫剂的生产离不开菌株，菌株性能好坏直接影响着品质。自1901年分离到苏云金芽胞杆菌第一个菌株的近百年来，在世界范围内已分离筛选到大量性能优良的苏云金芽胞杆菌野生菌株并用作生产菌种，不仅大大提高了发酵效价和杀虫毒力，而且也大大拓宽了其杀虫活性谱。但是，近十年来的生产与应用实践也证明，以天然菌株作为生产菌的苏云金芽胞杆菌制剂也不可避免地存在一些弊端，突出表现在：专一性太强，对老龄害虫和多种害虫复合发生的控制效果较差；持效期较短；大面积单一制剂的反复使用会导致昆虫抗性的产生等。很显然，靠进一步从自然界分离新菌株是很难克服这些弊端的。因此，自80年代中后期以来，随着对苏云金芽胞杆菌分子生物学和遗传学的深入研究，构建具有优良性能的重组菌株成为国内外微生物农药发展的一个方向。工程菌商品制剂，如MVP、Foil相继投产。90年代以来被批准登记或进入后期田间试验的有10余种遗传重组杀虫剂。

用苏云金芽胞杆菌野生型生产的第一代产品，虽然已经广泛应用，并取得了较好的防治效果，而在发酵和产品质量效价方面有待进一步提高，从而可提高产量，降低成本，提高防治效果，进一步扩大应用规模。

本发明的目的在于克服已有技术不足，通过基因工程方法从苏云金芽胞杆菌中选育用于生产微生物农药的高毒力基因工程菌，应用该基因工程菌发酵生产微生物杀虫剂，以提高微生物杀虫剂的发酵水平和产品质量。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明的特征包括苏云金芽胞杆菌基因工程菌株WG001的筛选方法，液体深层发酵工艺及苏云金芽胞杆菌制剂的液剂和粉剂产品的制备。

本发明出发菌株是用对棉铃虫、小菜蛾等害虫高毒力的专利菌株YBT-1520(中国发明专利，专利号为ZL95106749.4，专利权人：华中农业大学)作受体菌，将辅助蛋白基因P20和杀虫晶体蛋白基因CrylAc10与解离载体重组，转入到受体菌中，筛选出一种高效基因工程菌WG001。通过对生产工艺的研究，开发出新一代基因工程菌杀虫剂产品。

以下对本发明的具体技术细节作进一步的描述：

一种生产微生物杀虫剂的高毒力基因工程菌株，具有crylAa、crylAb和crylAc杀虫晶体蛋白基因，所述的菌株为WG001(一种苏云金芽胞杆菌，分类命名：Bacillusthuringiensis，保藏在CCTCC，保藏日：2001年9月13日，保藏号：CCTCC NO：M201033)。

利用苏云金芽胞杆菌作为微生物杀虫剂的发酵方法，所用的菌株是分离筛选得到的的高毒力基因工程菌株WG001(一种苏云金芽胞杆菌，分类命名：Bacillus thuringiensis，保藏在CCTCC，保藏日：2001年9月13日，保藏号：CCTCC NO：M201033)，该菌株的分离、培养按照以下步骤进行：

(1)起始菌种接种于试管斜面培养基上，30℃培养24小时进行活化，然后转接于茄子瓶斜面，30℃培养72小时，即为生产用斜面菌种；

(2)培养好的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水，制成每毫升含0.2-1.0亿活细胞的悬液，然后转入500ml血清瓶内，塞上灭过菌的针头或接种管，将瓶置80℃水浴锅内保温15-20分钟，对菌悬液进行热处理，用压差法将该菌悬液接入种子罐，接种时该罐培养基pH为6.5-7.5；

(3)按种子罐容积的60-80％投入培养基，高压蒸汽灭菌(15磅/平方英寸，121℃)保持30分钟，冷却30-35℃后，接入经活化的斜面菌苔制成的菌悬液；

(4)按发酵罐容积60-70％投入培养基，高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力为15磅/平方英寸，搅拌200-250rpm条件下，维持30分钟灭菌，冷却至30-33℃后按投料体积的1％移入种子液；

(5)种子罐培养：在温度30-32℃，罐压0.3-0.5Kg/cm²，通气量1∶0.6-1∶0.8(V/V)，搅拌200-250 rpm条件下培养6-12小时；

(6)发酵罐培养：在温度28-32℃，罐压0.3-0.8Kg/cm²，通气量1∶0.6-1∶1.2(V/V)，搅拌200-250rpm条件下培养24-48小时，用显微镜检查有20-40％的芽胞囊破裂，便可放罐；

(7)种子罐培养基配方为：黄豆饼粉3.0-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)1.0-5.0％，酵母粉0.1-1.0％，玉米浆1.0-4.0％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.1-2.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

(8)发酵罐培养基配方为：黄豆饼粉3.0-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)1.0-5.0％，酵母粉0.1-1.0％，玉米浆1.0-4.0％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.1-2.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

发酵罐培养基配方为：黄豆饼粉3.5-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)2.0-5.0％，酵母粉0.1-0.5％，玉米浆1.0-3.0％，蛋白胨0.2-0.5％，无机盐0.1-1.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

发酵罐培养基配方也可以为：黄豆饼粉3.5-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)2.0-5.0％，酵母粉0.1-0.5％，玉米浆1.0-3.0％，蛋白胨0.2-0.5％，无机盐0.1-1.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

在发酵罐发酵进入对数期，保持其通气量为：1∶1.0-1∶1.2(V/V)。

生产含有苏云金牙胞杆菌的微生物杀虫剂产品的制备方法，所用的菌株属于分离筛选得到的一株高效基因工程菌株WG001(一种苏云金芽胞杆菌，分类命名：Bacillusthuringiensis，保藏在CCTCC，保藏日：2001年9月13日，保藏号：CCTCC NO：M201033)，其制备步骤为：

(1)发酵液液剂化：用HCl将发酵液pH调至4.5-6.5，根据发酵液水平，采用离心机将发酵液浓缩0.5-1倍，使毒力效价达到所需水平，然后加入3-10％NaCl、0.1-0.5％苯甲酸钠和1-3％农乳100号，经检验，包装后即为液体剂型生物杀虫剂。

(2)在浓缩发酵液中，加入适量硅藻土或碳酸钙和1-3％农乳100号，使毒力效价达到所需水平，经喷雾干燥工序，使制剂含水量控制在4％以下，并经检验，包装后即为粉剂型生物杀虫剂。菌株WG001的生物学及遗传特性描述：

生物学特性：菌体直杆状，营养体呈链状或单生，长3-5微米，宽1-1.2微米，革兰氏染色阳性，芽胞呈圆柱状或近似椭圆，偏端生，芽胞囊不膨大，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落圆形，边缘平滑，菌苔丰满呈蜡质状，生长温度10-45℃，最适生长温度26-32℃，适宜pH6.8-7.4，兼性嫌氧，在含7％NaCl的牛肉蛋白胨培养基中生长，在核糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和可溶性淀粉培养基中产酸，甲基红反应阳性，伴胞晶体长、宽均比YBT-1520的伴胞晶体增加32％，呈双金字塔型。在发酵培养中，可以在以多种农副产品为原料的培养基中旺盛生长，产生大量伴胞晶体，对昆虫的毒力效价在4000IU/mg-6000IU/mg之间。

遗传学特性：本发明是以苏云金芽胞杆菌天然菌株YBT-1520为出发菌株得到的基因工程菌，其鞭毛抗原血清型为H3ab，伴胞晶体有130KDa和65KDa晶体蛋白组成。经继代培养，辅助基因能够在工程菌中稳定存在，表达正常，对受体菌的生长无重大影响。

本发明的实施例：实施例1基因工程菌WG001的构建和保藏：

本发明出发菌株是用对棉铃虫、小菜蛾等害虫高毒力的专利菌株YBT-1520作受体菌，将辅助蛋白基因P20和杀虫晶体蛋白基因crylAc10与解离载体重组，转入到受体菌中，筛选获得本发明的高效工程菌株WG001。

应用本申请人建立的一套新的PCR克隆技术，已成功地从以色列亚种中克隆了辅助蛋白基因P20，并证实了P20对鳞翅目特异基因crylAb和对野生菌株杀虫晶体蛋白的增效作用

本发明以苏云金芽胞杆菌天然菌株YBT-1520为受体菌，通过电转化将含crylAc10-P20基因的重组质粒pBMB1808转化到此菌株中，用25μg/ml的红霉素平板28℃筛选获得转化子WG001，提取质粒，通过质粒图谱、Southern杂交和聚丙烯酰胺电泳验证转化子。用专一性引物作PCR，鉴定结果表明转化子质粒被扩增出583bps的阳性带。此外将WG001的质粒再次转回大肠杆菌DH5α，又重新获得含有pBMB1808大肠杆菌转化子。这些结果说明pBMB1808已经转入到天然菌株中。WG001菌种先经LB过夜活化，然后1％转接于20mlPM培养基中(加红霉素)，28℃培养至90％以上的菌体芽胞脱落，定量取样作聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明WG001的130KDa的杀虫晶体蛋白的表达量明显提高，生物成像系统密度扫描定量分析显示WG001的表达量是YBT-1520的2.14倍。

所述的含crylAc10-P20基因的重组质粒pBMB1808电转化入天然菌株YBT-1520的方法包括：

以272mM蔗糖，15％甘油配制的溶液作为缓冲液，在0.4cm电脉冲杯中置50-80μl感受态细胞，加入质粒5μl(约1μg)。电脉冲采用25μF，200Ω，6.25-9KV/cm的条件电击一次。

所述的通过质粒图谱、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行转化子的筛选与鉴定步骤包括：

以1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl，pH7.2的培养液过夜活化菌种，再用活化菌液接种(1/100)LB培养液。待菌体生长至对数中期，收集菌体，TE(10mM Tris.Cl，1mM EDTA，pH8.0)洗菌一次。菌体悬于100μl溶液I(50mM Glucose，25mM Tris.Cl(pH8.0)，10mMEDTA)，加入5-10μl溶菌酶(20mg/ml)，以后的操作按碱法质粒抽提进行。

所述的大肠杆菌的质粒抽提沿用常规的方法。

所述的PCR的条件是：94℃1分钟，49℃1分钟，72℃1分钟，25个循环。

所述的DNA-RNA杂交方法包括：质粒电泳采用0.55％琼脂糖凝胶，杂交膜使用硝酸纤维素膜(Hybond)，具体转膜步骤和杂交及显色按常规方法。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法包括：L₈培养基发酵液200μl离心，沉淀用1MNaCl和无菌水各洗两次，沉淀物再悬于1ml无菌水中，取100μl与等量上样缓冲液(2X)混合，沸水中处理3分钟，取10-20μl点样，溶液配制及其他操作按常规方法。实施例2菌种培养、传代和保藏：

在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上于30℃培养，可于4℃短期保藏，以冷冻管或砂土管长期保藏，作为原始菌种，生产菌种需从原始菌种中转接，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上。实施例3苏云金芽胞杆菌工程菌WG001杀虫剂的生产工艺

菌株WG001作为生物杀虫剂的发酵工艺分为液体深层发酵和制剂化两部分：液体深层发酵和制剂化过程如下：

一、菌种制备：

1、原始菌种：用冷冻管或砂土管保藏于华中农业大学微生物农药室的毒力高，性能稳定的苏云金芽胞杆菌WG001菌株作为原始菌株。

2、斜面菌种：

斜面培养基配方：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％，琼脂2.0％，Ph7.2。将培养基分装入试管或茄子瓶，湿热灭菌(15磅/平方英寸，121℃)30分钟，待温度降至50℃左右摆成斜面，如果温度太高，冷凝水多，可将斜面置37℃培养一天，如无菌生长，方可使用。

斜面菌种的培养：将原始菌种接种于试管斜面培养基上，30℃培养24小时进行活化。然后从试管斜面转接于茄子瓶斜面，30℃培养72小时，肉眼观察菌苔丰满，表面乳白色，无噬菌斑，显微镜观察无杂菌，90％以上芽胞脱落方可用于生产。供生产用斜面菌种，在冰箱内保存最多不超过一周。

二、发酵工艺：

1、种子罐培养：

种子罐培养基配方为：黄豆饼粉3.0-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)1.0-5.0％，酵母粉0.1-1.0％，玉米浆1.0-4.0％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.1-2.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0。按种子罐容积的60-80％。按种子罐容积的60-80％投入培养基，然后把高压蒸汽直接通入发酵罐使罐温达到121℃，压力为15磅/平方英寸，维持30分钟，冷却30-35℃后，接入经活化的斜面菌种制成的菌悬液。灭菌后pH为6.5-7.5。

种子罐的培养基也可采用以下配方：黄豆饼粉3.5-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)2.0-5.0％，酵母粉0.1-0.5％，玉米浆1.0-3.0％，蛋白胨0.2-0.5％，无机盐0.1-1.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

种子罐的接种：在已培养好的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水，制成每毫升含0.2-1.0亿活细胞的菌悬液，转入500毫升血清瓶内，塞上经灭菌的针头或接种管，并用绳索捆紧置80℃水浴锅内保温15-20分钟，以杀死游离的噬菌体并活化芽胞。经热处理的芽胞悬液，用压差法接入种子罐。接种时种子罐培养基pH值为7.0。

种子罐培养：在温度30-32℃，罐压0.3-0.5Kg/cm²，通气量1∶0.6-1∶0.8(V/V)，搅拌200-250rpm条件下培养6-12小时。经显微镜观察芽胞全部萌发长成营养体，菌形正常，无杂菌污染，培养液含活菌数0.6-1.0亿个/毫升，方可作合格的种子液应用。

2、发酵罐培养：

发酵罐培养基配方：黄豆饼粉3.0-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)1.0-5.0％，酵母粉0.1-1.0％，玉米浆1.0-4.0％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.1-2.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5。

发酵罐也可采用以下配方：黄豆饼粉3.5-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)2.0-5.0％，酵母粉0.1-0.5％，玉米浆1.0-3.0％，蛋白胨0.2-0.5％，无机盐0.1-1.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5。

发酵培养：按发酵罐容积60-70％投入培养基，通过高压蒸汽使发酵罐温度达到121℃，压力为15磅/平方英寸，维持30分钟灭菌，冷却至30-33℃后按投料体积的1％移入种子液。在温度28-32℃，罐压0.3-0.8Kg/cm²，通气量1∶0.6-1∶1.2(V/V)，搅拌200-250rpm条件下培养24-48小时，用显微镜检查有20-40％的芽胞囊破裂，便可放罐。

发酵控制：本培养基灭菌前调至8.0左右；灭菌后的pH值为7.0-7.2左右，使芽胞萌发率达到最高。当菌体开始生长后pH下降至5.8-6.0，随后又回升至放罐时的pH值8.5左右。通气：在发酵前期，菌数低，耗氧少；进入对数期，耗氧增大，一般要求通气流量达到1∶1.0至1∶1.2(指发酵培养基体积与每分通入空气的体积之比)。当芽胞开始形成以后，虽然菌体代谢活性降低，但氧对芽胞的成熟和伴胞晶体的形成有重要影响，因此在发酵后期仍应保持较大的通气量。温度：随时检查温度值，控制温度变化在30±2℃。

3、发酵物后处理及包装：

发酵液经酸化和适量浓缩后加入助剂制成液剂产品或经喷雾干燥制成粉剂。

发酵液液剂化：首先用HCl将发酵液调pH值4.5-6.5，然后根据发酵液水平进行适当浓缩。采用流体式连续离心机将发酵液浓缩0.5-1倍，使毒力效价达到所需水平，然后加入3-10％NaCl和0.1-0.5％苯甲酸钠防腐剂和其它助剂。

发酵液粉剂化：发酵液经流体式连续离心机浓缩达到一定浓度后，加入适量的填料(如硅藻土或碳酸钙)和润湿剂(1-3％农乳100号)，打入喷雾干燥塔顶的高位槽中。当进口温度达到200-220℃，开始喷雾，控制流入离心盘浆液的速度，这样使所干燥塔中层温度保持在65-70℃，使所干燥的制剂含水量在4％以下。

粉剂按每袋250克、500克、1000克或更大，用铝箔袋或塑料袋包装；悬浮剂和油剂按每瓶250ml、500ml、1000ml，用塑料瓶包装。

三、质量检验：

1、生物效价检验：

发酵中间产物以及产品质量检验，按《中华人民共和国农业行业标准NY293-95苏云金芽胞杆菌制剂》规定的方法，以小菜蛾幼虫作供试昆虫进行生物测定，采用本实验室制备的标准品[Cs3ab-1999，毒力效价20000IU/mg(国际单位/毫克)]，将标准品和待测样品进行系列稀释，将不同浓度的感染液和小菜人工饲料混合制成感染饲料，感染三龄小菜蛾幼虫，检查不同浓度下的幼虫死亡率，用统计法计算待测样品和标准品的LC50值，由下列公式计算样品的毒力效价：

2、晶体蛋白含量测定(SDS-PAGE方法)：

(1)取200μl发酵液加800μl水或原粉稀释一定倍数，用超声波处理30秒钟。

(2)取100μl稀释液至另一个Eppendorf管中，并加0.5mol/1NaOH25μl，室温放置5分钟。

(3)加65μ1 3Xlaemmli样品缓冲液(850μl 3×1aemmli＋150μl巯基乙醇)。

(4)加盖后100℃水浴5分钟。

(5)高速(1000rpm)离心3分钟。

(6)加上清10μl至10％SDA-PAGE凝胶槽内。

(7)分别加10μl、15μl、20μl标准蛋白到指定的对照凝胶槽内。

(8)在120V-150V条件下电泳。

(10)用考马斯亮蓝染色凝胶后，再用脱色液脱色至背景清晰。

(11)用可见光对凝胶进行扫描，并用Image-Master软件处理图相像。

(12)根据晶体蛋白吸收峰的积分值参照标准品计算被测样品的晶体含量。

3、检测结果：

1、发酵液技术指标：经生物测定，发酵液对小菜蛾的毒力效价在4000-6000IU/μl之间，对棉铃虫的毒力效价在3500-5500IU/μl之间；蛋白质含量在3.5-5.5g/l之间。

2、产品技术指标：

悬浮剂：毒力效价为8000IU/μl以上；

油剂：毒力效价为8000IU/μl以上；

可湿性粉剂：毒力效价为16000IU/mg以上；

高效可湿性粉剂：毒力效价为32000IU/mg以上；

原粉：毒力效价为60000IU/mg左右。

本发明的积极效果：

与已有技术相比，本发明的苏云金芽胞杆菌高毒力基因工程菌株WG001比出发菌株(天然菌株)相比，杀虫晶体蛋白产量提高一倍以上，伴胞晶体增大2.1倍，对小菜蛾和棉铃虫均具有良好的防治效果。

利用p20构建的防治棉花和蔬菜害虫高效苏云金芽胞杆菌工程菌WG001，其田间防治小菜蛾效果比美国Abbott公司产品Dipel提高2.65倍，比化学农药20％速灭杀丁EC提高3.1倍，防治效果大85％-90％。对棉铃虫的防治效果比Dipel提高20％，与40％的甲胺磷的800倍稀释液的毒力相当，防效在80％-91％。

Claims (6)

1.一种生产微生物杀虫剂的高毒力基因工程菌株，具有cry1Aa、cry1Ab和cry1Ac杀虫晶体蛋白基因，其特征在于，所述的菌株为WG001(一种苏云金芽胞杆菌，分类命名：Bacillus thuringiensis，保藏在CCTCC，保藏日：2001年9月13日，保藏号：CCTCC NO：M201033)。

2、一种利用苏云金芽胞杆菌作为微生物杀虫剂的发酵方法，所用的菌株是分离筛选得到的如权利要求1所述的高毒力基因工程菌株WG001(一种苏云金芽胞杆菌，分类命名：Bacillus thuringiensis，保藏在CCTCC，保藏日：2001年9月13日，保藏号：CCTCC NO：M201033)，其特征包括以下步骤：

(1)起始菌种接种于试管斜面培养基上，30℃培养24小时进行活化，然后转接于茄子瓶斜面，30℃培养72小时，即为生产用斜面菌种；

(2)培养好的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水，制成每毫升含0.2-1.0亿活细胞的悬液，然后转入500ml血清瓶内，塞上灭过菌的针头或接种管，将瓶置80℃水浴锅内保温15-20分钟对菌悬液进行热处理用压差法将该菌悬液接入种子罐，接种时该罐培养基pH为6.5-7.5；

(3)按种子罐容积的60-80％投入培养基，高压蒸汽灭菌(15磅/平方英寸，121℃)保持30分钟，冷却30-35℃后，接入经活化的斜面菌苔制成的菌悬液；

(4)按发酵罐容积60-70％投入培养基，高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力为15磅/平方英寸，搅拌200-250rpm条件下，维持30分钟灭菌，冷却至30-33℃后按投料体积的1％移入种子液；

(5)种子罐培养，在温度30-32℃，罐压0.3-0.5Kg/cm²，通气量1∶0.6-1∶0.8(V/V)，搅拌200-250rpm条件下培养6-12小时；

(6)发酵罐培养，在温度28-32℃，罐压0.3-0.8Kg/cm²，通气量1∶0.6-1∶1.2(V/V)，搅拌200-250rpm条件下培养24-48小时，用显微镜检查有20-40％的芽胞囊破裂，便可放罐；

(7)种子罐培养基配方为：黄豆饼粉3.0-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)1.0-5.0％，酵母粉0.1-1.0％，玉米浆1.0-4.0％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.1-2.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

(8)发酵罐培养基配方为：黄豆饼粉3.0-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)1.0-5.0％，酵母粉0.1-1.0％，玉米浆1.0-4.0％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.1-2.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵罐培养基配方为：黄豆饼粉3.5-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)2.0-5.0％，酵母粉0.1-0.5％，玉米浆1.0-3.0％，蛋白胨0.2-0.5％，无机盐0.1-1.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵罐培养基配方为：发酵罐培养基配方为：黄豆饼粉3.5-5.0％，液化玉米淀粉(每克玉米淀粉加2000IU/g的α-淀粉酶0.005g，在80℃条件下液化10分钟)2.0-5.0％，酵母粉0.1-0.5％，玉米浆1.0-3.0％，蛋白胨0.2-0.5％，无机盐0.1-1.0％，泡敌0.05-0.2％，所有原料都需要过80-100目筛，灭菌前pH为7.5-9.0，灭菌后pH为6.5-7.5；

5、根据权利要求2所述的方法，其特征是发酵罐发酵进入对数期，其通气量为：1∶1.0-1∶1.2(V/V)。

6、如权利要求2的所述微生物杀虫剂的制备方法，该方法所用的菌株属于分离筛选得到的高效基因工程菌株WG001(一种苏云金芽胞杆菌，分类命名：Bacillus thuringiensis，保藏在CCTCC，保藏日：2001年9月13日，保藏号：CCTCC NO：M201033)，其特征在于：

(1)发酵液液剂化：用HCl将发酵液pH调至4.5-6.5，根据发酵液水平，采用离心机将发酵液浓缩0.5-1倍，使毒力效价达到所需水平，然后加入3-10％NaCl、0.1-0.5％苯甲酸钠和1-3％农乳100号，经检验，包装后即为液体剂型生物杀虫剂。

(2)在浓缩发酵液中，加入适量硅藻土或碳酸钙和1-3％农乳100号，使毒力效价达到所需水平，经喷雾干燥工序，使制剂含水量控制在4％以下，并经检验，包装后即为粉剂型生物杀虫剂。