CN102051337B - 一种拮抗害虫的新颖苏云金杆菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种拮抗害虫的新颖苏云金杆菌菌株，应用于生物性控制虫害的技术领域，利用一PCR筛选方式鉴定出含cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E基因的该菌株，该菌株可制成一种用于控制害虫的组合物，该组合物包括可接受的载体及杀虫有效剂量的δ-内毒素，对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的该组合物，可有效防治害虫的生长。
Description
技术领域
本发明是关于一种新颖的苏云金杆菌菌株，特别是关于一种具有cty1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E基因片段的苏云金杆菌菌株，该菌株可用于拮抗鳞翅目的害虫。
背景技术
随着人们对于生活质量的重视以及环保意识的兴起，目前以生物性杀虫剂取代传统农药来避免食物链的最终累积的趋势已成为主流，而且传统农药的使用已破坏生态系统平衡，并产生抗药性的问题，以致某些害虫发生猖獗，造成很大的防治困难及损失。其中，以苏云金杆菌为生物性杀虫剂中最广为应用，且使用简便又安全。
苏云金杆菌(苏力菌，Bacillus thuringiensis)是一种昆虫病源细菌，为革兰氏阳性杆菌，在营养缺乏或环境不良的时候，苏云金杆菌会进入不分裂的半静止期，或是分化形成孢子和杀虫结晶蛋白，其结晶蛋白具有专一性，对特定的昆虫具有毒性，且毒性大小依昆虫的种类有所强弱，但对人类、鸟类、害虫的天敌、蜜蜂等均无害。因此，过去20年来科学家已分离出许多苏云金杆菌内的杀虫基因，并研制成重组基因产品，或是将杀虫基因直接注入植物体内而免去喷洒杀虫剂的动作等等。真正活化苏云金杆菌内孢子的是肠液的碱性环境，而非蛋白酶，肠道的高pH值不仅对苏云金杆菌结晶的溶解、消化很重要，且对毒性表现相当重要。
苏云金杆菌的内毒素基因位于质体上，因此很容易进行转殖基因工程。早期的内毒素重组基因大多限制于单一基因片段的转殖。最近则利用多重内毒素基因或是差异性很大的基因，甚至是嵌合(chimeric)基因，以增强杀虫效果、扩大杀虫范围。
各类苏云金杆菌毒蛋白间的类源关系，因其内含质体核酸序列的变异所产生的杀虫结晶蛋白不同，杀虫对象亦互异，主要分成六大类(Hoffe andWhiteley，1989；Gill et al.，1992；Gleave et al.，1993；Lereclus et al.，1993；Shinet al.，1995；Kostichka et al.，1996)，其中：Cry1类对鳞翅目有毒杀虫效果；Cry2类对鳞翅目及双翅目或只对双翅目有效；Cry3类只对鞘翅目有效；Cry4只对双翅目有效；Cry5不产生结晶，部分可杀鳞翅目和鞘翅目，部分则否；CytA则是无特定杀虫作用范围，但会产生细胞溶解和溶血的效果(cytolyticand hemolytic efficiency)；其中以Cry1所编码(encode)的氨基酸最多，而CytA最少。
中国台湾专利号385229揭露了一种新颖的生物杀虫组合物，其包含：一种由杀虫细菌与病毒，如苏云金杆菌结晶蛋白质或孢子或相关混合物，和核多角体病毒，从中挑选而得的活性杀虫成份；一种聚合物；及一种无机光线阻碍剂。此发明亦包含生物杀虫组合物的方法和控制昆虫的方法；中国台湾专利号385229专利与本发明的差异在于本发明的新颖苏云金杆菌菌株是利用基因片段产生的内毒素拮抗害虫，并非以结晶蛋白或孢子或相关混合物控制害虫。
美国专利号6500617揭露了一种非天然获得抗虫基因的方法，此方法以DNA重组的方式建立重组基因库，并纯化重组抗虫基因的有效多肽，其中此对昆虫有毒性的多肽为苏云金杆菌的δ-内毒素；美国专利号6500617专利与本发明的差异在于，本发明的新颖苏云金杆菌菌株是以天然方式获得该抗虫基因片段，而非以DNA重组的方式获得。
美国专利号6177615揭露了一种新颖合成的苏云金杆菌核酸片段，该核酸片段可以转译出δ-内毒素，具有拮抗鳞翅目昆虫的杀虫活性，此发明也揭露此序列可转译成结晶蛋白；美国专利号6177615专利与本发明的差异在于，本发明的新颖苏云金杆菌菌株所含的抗虫基因片段并非合成，而是本身即具有该基因片段，经由筛选获得该新颖菌株并使用。
美国专利号5994266揭示了一种杀虫组合物，其杀虫成分为δ-内毒素或可引发杀虫活性的片段，且该δ-内毒素或可引发杀虫活性的片段选自cry IA，cry IB，cry IC，cry ID，cryIIA，cry IIB，cry IC，cryIIIA，cryIIIB，cryIIIC，cryIVA，cryIVB，cryIVC，cryIVD，cryV及cryVI，美国专利号5994266专利与本发明的差异在于，本发明的新颖苏云金杆菌菌株所含的抗虫基因片段并非经人工方式获得，而是本身即具有该基因片段，经由筛选得到该新颖菌株并用于拮抗昆虫。
由上述文献可知苏云金杆菌的内毒素基因产物具拮抗昆虫效果，故目前科学家大多以遗传工程的方式筛选或合成具多种抗虫活性基因的片段。本发明的新颖苏云金杆菌菌株，为一天然菌株，具cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E，经筛选后获得该菌株，并非由人为进行遗传工程合成，仅利用不同基因片段的引物对(primer)进行筛选及确认，得到具有多种抗虫活性基因片段的新颖苏云金杆菌。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种苏云金杆菌菌株，应用于生物性控制虫害的技术领域，利用一PCR筛选方式鉴定出含cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E基因的菌株(strain)，该苏云金杆菌菌株可有效拮抗害虫的侵袭。
本发明的第二目的在于提供一种苏云金杆菌菌株，应用于生物性控制虫害的技术领域，可制成一种用于控制害虫的组合物，该组合物为一可接受的载体及一杀虫有效剂量的δ-内毒素，对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加一有效剂量的该组合物，可有效防治害虫的生长，进而提升作物的产能。
本发明的第三目的在于提供一种苏云金杆菌菌株，应用于生物性防治虫害的技术领域，利用苏云金杆菌菌株和/或其内毒素控制害虫的方法，所防治的害虫包含夜蛾科、螟蛾科或菜蛾科。
本发明首先提供了一种拮抗害虫的苏云金杆菌菌株，该苏云金杆菌菌株具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D和cry1E基因片段。
根据上述方案，所述苏云金杆菌菌株进一步含有cry2A基因片段。
本发明还提供了一种用于控制害虫的组合物，该组合物包括可接受的载体及杀虫有效剂量的δ-内毒素，所述内毒素得自具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D和cry1E基因片段的苏云金杆菌菌株。
根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株，进一步含有cry2A基因片段。
本发明还提供了一种控制害虫的方法，该方法包括：
对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的苏云金杆菌菌株和/或具其内毒素的组合物，其特征在于所述苏云金杆菌菌株为具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D和cry1E基因片段的苏云金杆菌菌株。
根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株进一步含有cry2A基因片段。
根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株的内毒素为δ-内毒素。
本发明还提供了一种利用苏云金杆菌菌株和/或其内毒素防治害虫的方法，该方法包括：
对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的所述苏云金杆菌菌株和/或具其内毒素的组合物，其特征在于所述苏云金杆菌菌株为具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E基因片段的苏云金杆菌菌株。
根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株进一步含有cry2A基因片段。
根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株可用于控制害虫。
根据上述方案，其中所述害虫选自夜蛾科、螟蛾科或菜蛾科所组成群组的其中之一。
根据上述方案，其中所述夜蛾科选自玉米穗虫或拟尺蠖的族群。
根据上述方案，其中所述螟蛾科选自豆荚螟、大菜螟或粉斑螟蛾的族群。
根据上述方案，其中所述菜蛾科选自小菜蛾的族群。
根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株的内毒素为δ-内毒素。
本发明还提供了一种经分离的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株F201及其代谢物。所述的苏云金杆菌菌株F201已经于2009年7月10日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)(德国微生物和细胞培养物保藏中心地址：Inhoffenstr.7B D-38124 Braunschweig)，取得的保藏编号为DSM 22750。本发明所述的苏云金杆菌菌株F201亦称为苏云金杆菌DSM22750。
附图说明
图1为本发明的苏云金杆菌菌株(F201)以PCR扩增的cry1基因产物的电泳分析图；
图2为本发明的苏云金杆菌菌株(F201)以PCR扩增的cry2基因产物的电泳分析图。
用于专利程序的微生物保存：
保藏日期：2009年7月10日；
保藏单位：德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)；
保藏编号：DSM 22750；
分类命名：苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。
为了易于说明，本发明藉由下述的较佳实施例并配合附图而得到充分了解，并使得熟悉本领域的技术人员可以据以完成本发明，然本发明的实施型态并不限制于下列实施例中。
具体实施方式
本发明提供一种新颖的苏云金杆菌菌株，该苏云金杆菌菌株能够抑制害虫的生长。以下为该苏云金杆菌菌株的来源、纯化与分离方式、鉴定方式以及拮抗标的害虫的效果的详细说明。
菌种采集
根据Smith and Couche(1991)的方法，选择座落于非农业区的中国台湾台北市区-行政院农业委员会林业试验所台北植物园，以采集不同科、不同种的植物，每棵植物选取距离地面3m以上的分枝，以大型封口袋带携回，并保存于4℃备用。
菌种分离与鉴定
携回植物分枝，处理前先阴干，每一分枝取3叶片，以灭菌过的不锈钢圆柱模型(直径4.4cm)，在一叶片上截取固定叶面积(30cm2)一片，正反面总计叶面积120cm2/样品(sample)为量，用灭菌棉花棒沾TritonX-100(Amresco)稀释液(50ppm)6ml刷洗叶面及叶背，收集洗叶水，进行离心(15,000xg，6分钟)，收集沉淀物以0.5ml无菌水再次悬浮(Smithand Couche，1991)。
依据Akiba and Katoh(1986)，Travers et al.(1987)，Chak and Yang(1990)，Chilcott and Wigley(1993)等四种方法进行分离。经热处理过的洗叶悬浮液，涂于NA(nutrient agar)平板培养基上，28℃培养五天，挑单一菌落，在位相差光学显微镜下，以1,000倍油镜进行观察，并选取含结晶及孢子的菌株，分别编号保存于4℃(Kao et al.，1996)。
菌种培养
各菌株分别以无菌水悬浮稀释，在NA平板培养基以划线法，再纯化3次并确认，挑单一菌落，分别移到5ml LB液体培养基(Luria-Bertani Medium：bacto-tryptone 1％，bacto-yeast extract 0.5％，NaCl 1％，pH 7.0)，于恒温振荡培养箱(28℃，250rpm)隔夜培养，再取0.5ml继代培养5ml同条件3小时。
菌种鉴定
对继代培养后的菌株进行分析，挑选一菌株命名为F201(即本发明的苏云金杆菌DSM 22750)，进行菌种型态分析与后续实验。
DNA聚合酶链连锁反应(PCR)与载体选殖
本发明参照Kalman et al.(1993)所发表的各个内毒素特异性的核苷酸引物(如下所示)的组合来确认本发明的F201苏云金杆菌中的内毒素基因型态。
(1)cry1Ab基因片段的扩增
以cry1专一性序列作为反向引物(SEQ ID NO.1)以及以cry1Ab专一性序列作为正向引物(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增反应来确认是否有cry1Ab基因片段的存在。
(2)cry1Ac基因片段的扩增
以cry1专一性序列作为反向引物(SEQ ID NO.3)以及以cry1Ac专一性序列作为正向引物(SEQ ID NO.4)进行PCR扩增反应来确认是否有cry1Ac基因片段的存在。
(3)cry1D基因片段的扩增
以cry1专一性序列作为反向引物(SEQ ID NO.3)以及以cry1D专一性序列作为正向引物(SEQ ID NO.5)进行PCR扩增反应来确认是否有cry1D基因片段的存在。
(4)cry1E基因片段的扩增
以cry1专一性序列作为反向引物(SEQ ID NO.3)以及以cry1E专一性序列作为正向引物(SEQ ID NO.6)进行PCR扩增反应来确认是否有cry1E基因片段的存在。
(5)cry2A基因片段的扩增
以cry IIA2专一性序列作为反向引物(SEQ ID NO.7)以及以cry IIA1专一性序列作为正向引物(SEQ ID NO.8)进行PCR扩增反应来确认是否有cry2A基因片段的存在。
F201苏云金杆菌的内毒素基因组合
请参阅图1，其为利用上述SEQ ID NO.1～6引物对进行PCR的筛选结果。根据Kalman et al.(1993)，已知cry1Ab基因片段长度为238bp、cry1Ac基因片段长度为487bp、cry1D基因片段长度为414bp、cry1E基因片段长度为883bp。因此，根据图1所示的片段长度可以得知本发明F201苏云金杆菌具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E的内毒素多重基因片段。
请参阅图2，其为利用上述SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物对进行PCR的筛选结果。根据Ka1man et al.(1995)，已知cry2A基因片段长度为569bp。因此，根据图2所示的片段长度可以得知本发明F201苏云金杆菌进一步具有cry2A的内毒素基因片段。
F201苏云金杆菌拮抗标的害虫的活性
本发明更进一步提供一种具有杀虫作用的组合物，其中该组合物包含有效剂量的F201苏云金杆菌菌株的培养物以及其可接受的载体。并且，该培养物中包含有内毒素。采用有效生产杀虫内毒素的标准培养方法及发酵方式(Yamamoto，1990)培养本发明的F201苏云金杆菌菌株或其变异株(Yamamoto，T.1990.Identification of entomocidal toxins of Bacillusthuringiensis by high-performance liquid chromatography.Pp.46-60.In“Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis”.L.A.Hickle，and W.L.Fitch Eds.American Chemical Society，Washington，D.C.)。再取发酵后的培养沉淀物，依发酵后的培养沉淀物中总蛋白在混拌后饲料中的质量含量(ppm)的不同，进行试验以确认其拮抗标的害虫的效果。
实施例部分，共有三科，分别为夜蛾科、螟蛾科及菜蛾科，此类昆虫是蔬菜、豆科作物、纤维作物等的害虫，会造成作物开花受影响、无法结穗等伤害，使得农民收成受到极大的损失。以下针对此三科昆虫，分别测试F201对其拮抗的效果；对照组则使用市售Valent BioScience公司的见达利(Xentari)作为比较，分别测试昆虫幼虫的死亡率，以下表1为F201试验昆虫的科别总表；表2为各科供试昆虫进行试验的数据总表。
表1 F201试验昆虫分科
| 夜蛾科 | 螟蛾科 | 菜蛾科 |
| 玉米穗虫拟尺蠖 | 豆荚螟粉班螟蛾大菜螟 | 小菜蛾 |
表2 苏云金杆菌F201与市售苏云金杆菌菌株生物活性比较
| 样品及条件 | 玉米穗虫 | 拟尺蠖 | 豆荚螟 | 大菜螟 | 粉斑螟蛾 | 小菜蛾 |
| 虫龄 | L2 | L2 | L3 | L3 | L3 | L3 |
| 试验浓度(ppm) | 500 | 12.5 | 100 | 50 | 100 | 2.5 |
| 处理时间(hr) | 120 | 72 | 72 | 120 | 336 | 48 |
| 实验组死亡率(％) | 80.0 | 100 | 100 | 100 | 62.5 | 96.7 |
| 对照组死亡率(％) | 40.0 | 6.7 | 75.0 | 85.7 | 54.9 | 85.0 |
对照组使用Xentari处理
其中夜蛾科包含玉米穗虫以及拟尺蠖。
表3 夜蛾科昆虫使用F201处理结果
| 样品及条件 | 玉米穗虫 | 拟尺蠖 |
| 虫龄 | L2 | L2 |
| 试验浓度(ppm) | 500 | 12.5 |
| 处理时间(hr) | 120 | 72 |
| 实验组死亡率(％) | 80.0 | 100 |
| 对照组死亡率(％) | 40.0 | 6.7 |
对照组使用Xentari处理
实施例一：玉米穗虫(Helicoverpa armigera)
大量发酵F201苏云金杆菌后，取5升的发酵培养物进行顺序稀释后，将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法，测试处理玉米穗虫第二龄初幼虫连续120小时后的生物活性(每组实验的供试虫数为30只，不更换饲料连续观察)，纪录以苏云金杆菌处理前后的死亡虫数后，计算幼虫死亡率。
请参阅表4，其为F201苏云金杆菌对于玉米穗虫的死亡率测试数据。由此结果可以得知F201苏云金杆菌在处理浓度为500ppm时，较Xentari(对照组)的致死率高大约两倍，且死亡率高达80％，具有对害虫致死的效果。
表4 F201苏云金杆菌发酵培养物抗玉米穗虫的活性数据
| 样品 | 处理F201 | 对照组 | 控制组 |
| 试验虫数(只) | 30 | 30 | 30 |
| 处理浓度(ppm) | 500 | 500 | H2O |
| 处理时间(hr) | 120 | 120 | 120 |
| 死亡率(％) | 80.0 | 40.0 | 0 |
对照组使用Xentari处理
实施例二：拟尺蠖(Trichoplusia ni)
试验处理方式同实施例一。将稀释浓度后的发酵培养物以饲料混拌法测试处理拟尺蠖第二龄初幼虫连续72小时(每组实验的供试虫数为50只，48小时后，更换无处理人工饲料)，纪录以苏云金杆菌处理前后的死亡虫数后，计算幼虫死亡率。
请参阅表5，其为F201苏云金杆菌对于拟尺蠖的死亡率测试数据。由此结果可以得知F201苏云金杆菌在处理浓度仅12.5ppm的情况下，对于拟尺蠖即具有100％的杀虫效率，比起Xentari的6.7％更是高出许多，证实其确具有对害虫致死的效果。
表5 F201苏云金杆菌发酵培养物抗拟尺蠖的活性数据
| 样品 | 处理F201 | 对照组 | 控制组 |
| 试验虫数(只) | 50 | 50 | 50 |
| 处理浓度(ppm) | 12.5 | 12.5 | H2O |
| 处理时间(hr) | 72 | 72 | 72 |
| 死亡率(％) | 100 | 6.7 | 0 |
对照组使用Xentari处理
其中螟蛾科包含豆荚螟、粉班螟蛾及大菜螟。
表6 螟蛾科昆虫使用F201处理结果
| 样品及条件 | 豆荚螟 | 大菜螟 | 粉斑螟蛾 |
| 虫龄 | L3 | L3 | L3 |
| 试验浓度(ppm) | 100 | 50 | 100 |
| 处理时间(hr) | 72 | 120 | 336 |
| 实验组死亡率(％) | 100 | 100 | 62.5 |
| 对照组死亡率(％) | 75.0 | 85.7 | 54.9 |
对照组使用Xentari处理
实施例三：豆荚螟(Maruca vitrata)
试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法测试处理豆荚螟第三龄初幼虫处理72小时(每组实验的供试虫数为24只，不更换饲料连续观察)，纪录72小时幼虫死亡率。
参阅表7，其为F201苏云金杆菌对于豆荚螟的死亡率测试数据。由此结果可以得知，在处理浓度为100ppm的时候，F201苏云金杆菌较市售的Xentari对于豆荚螟，具有较高的致死率，且F201的杀虫效果可达100％，确实具有对害虫致死效果。
表7 F201苏云金杆菌发酵培养物抗豆荚螟的活性数据
| 样品 | 处理F201 | 对照组 | 控制组 |
| 试验虫数(只) | 24 | 24 | 24 |
| 处理浓度(ppm) | 100 | 100 | H2O |
| 处理时间(hr) | 72 | 72 | 72 |
| 死亡率(％) | 100 | 75.0 | 0 |
对照组使用Xentari处理
实施例四：大菜螟(Crocidalomia binotalis)
试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法测试大菜螟的第三龄初幼虫连续120小时(每个浓度30只幼虫，不更换饲料连续观察)，纪录其120小时死亡虫数的情况。
参阅表8，其为F201苏云金杆菌对于大菜螟的死亡率测试数据。由此结果可以得知在处理浓度为50ppm时，F201苏云金杆菌有较Xentati高的致死率，且达100％杀虫效果，确实具有对害虫致死效果。
表8 F201苏云金杆菌发酵培养物对于抗大菜螟的活性数据
| 样品 | 处理F201 | 对照组 | 控制组 |
| 试验虫数(只) | 30 | 28 | 30 |
| 处理浓度(ppm) | 50 | 50 | H2O |
| 处理时间(hr) | 120 | 120 | 120 |
| 死亡率(％) | 100 | 85.7 | 0 |
对照组使用Xentari处理
实施例五：粉斑螟蛾(Ephestia cautella Walker)
试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法分别测试处理粉斑螟蛾第三龄初幼虫连续336小时(每个浓度30只幼虫，不更换饲料连续观察)，纪录死亡虫数的情况后，计算幼虫死亡率。
参阅表9，其为F201苏云金杆菌对于粉斑螟蛾的死亡率测试数据。由此结果可以得知F201苏云金杆菌相较于Xentari，确实具有较佳的害虫致死效果。
表9 F201苏云金杆菌发酵培养物对于抗粉斑螟蛾的活性数据
| 样品 | 处理F201 | 对照组 | 控制组 |
| 试验虫数(只) | 30 | 30 | 30 |
| 处理浓度(ppm) | 100 | 100 | H2O |
| 处理时间(hr) | 336 | 336 | 336 |
| 死亡率(％) | 62.5 | 54.9 | 0 |
对照组使用Xentari处理
其中菜蛾科包含小菜蛾。
表10 菜蛾科昆虫使用F201处理结果
| 样品及条件 | 小菜蛾 |
| 虫龄 | L3 |
| 试验浓度(ppm) | 2.5 |
| 处理时间(hr) | 48 |
| 实验组死亡率(％) | 96.7 |
| 对照组死亡率(％) | 85.0 |
对照组使用Xentari处理
实施例六：小菜蛾(Plutella xylostella)
试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法分别测试处理小菜蛾第三龄初幼虫连续48小时(每个浓度30只幼虫，不更换饲料连续观察)，纪录其48小时后死亡虫数的情况后，计算幼虫死亡率。
参阅表11，其为F201苏云金杆菌对于小菜蛾的死亡率测试数据。由此结果可以得知在处理浓度仅2.5ppm时，F201苏云金杆菌即具有96.7％的高致死率；且相较于Xentari，也有较佳的害虫致死效果。
表11 F201苏云金杆菌发酵培养物对于抗小菜蛾的活性数据
| 样品 | 处理F201 | 对照组 | 控制组 |
| 试验虫数(只) | 30 | 30 | 30 |
| 处理浓度(ppm) | 2.5 | 2.5 | H2O |
| 处理时间(hr) | 48 | 48 | 48 |
| 死亡率(％) | 96.7 | 85.0 | 0 |
对照组使用Xentari处理
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围。故凡依本发明内容所述的形状、构造、特征及精神所作的均等变化或修饰，均应包括于本发明的保护范围内。
参考文献
1.Akiba，Y.，and K.Katoh.1986.Microbial ecology of Bacillus thuringiensisV.Selective medium for Bacillus thuringiensis vegetative cells.Appl.Entomol.Zool.21：210-215.
2.Chak，K.F.，and Y.M.Yang.1990.Characterization of the Bacillusthuringiensis strains isolated from Taiwan.Proc.Natl.Sci.Counc.B.ROC14：175-182.
3.Chilcott，C.N.，and P.J.Wigley.1993.Isolation and toxicity of Bacillusthuringiensis from soil and insect habitats in New Zealand.J.Invertebr.Pathol.61：244-247
4.Gill，S.S.，E.A.Cowles，and P.V.Pietrantonio.1992.The mode of action ofBacillus thuringiensis endotoxins.Annu.Rev.Entomol.37：615-636.
5.Gleave A.P.，R.Williams，and R.J.Hedges.1993.Screening by polymerasechain reaction of Bacillus thuringiensis serotypes for the presence ofcry V-like insecticidal protein genes and characterization of a cry V genecloned from B.thuringiensis subsp.kurstaki.Appl.Environ.Microbiol.59：1683-1687.
6.
H.，and H.R.Whiteley.1989.Insecticidal crystal proteins of Bacillusthuringiensis.Microbiol.Rev.53：242-255.
7.Kalman，S.，K.L.Kiehne，N.Cooper，M.S.Reynoso，and T.Yamamoto.1995.Enhanced production of insecticidal proteins in Bacillus thuringiensisstrains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes.Appl.Environ.Microbiol.61：3063-3068.
8.Kalman，S.，K.L.Kiehne，J.L.Libs，and T.Yamamoto.1993.Cloning of anovel cryIC-type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp.galleriae.Appl.Environ.Microbiol.59：1131-1137.
9.Kao，S.S.，C.C.Tzeng，S.J.Tuan，and Y.S.Tsai.1996.Isolation，characterization and cry gene typing of Bacillus thuringiensis isolates fromstored product material samples collected around Taiwan，pp132-151.Proceedings，The Second Pacific Rim Conference on Biotechnology ofBacillus thuringiensis and its Impact to the Environment.November 4-8，1996.Chiang Mai，Thailand.
10.Kostichka，K.，G.W.Warren，M.Mullins，A.D.Mullins，J.A.Craig，M.G.Koziel，and J.J.Estruch.1996.Cloning of a cryV-type insecticidal proteingene from Bacillus thuringiensis：the cryV-encoded protein is expressed earlyin stationary phase.J.Bacteriol.178：2141-2144.
11.Lereclus，D.，A.Delecluse，and M-M.Lecadet.1993.Diversity of Bacillusthuringiensis toxins and genes.pp.37-69 In″Bacillus thuringiensis，AnEnviromental Biopesticide：Theory and Practice″P.F.Entwistle，J.S.Cory，M.J.Bailey and S.Higgs.Eds.John Wiley & Sons Ltd.Press，England.
12.Shin，B.S.，S.H.Park，S.K.Choi，B.T.Koo，S.T.Lee，and J.I.Kim.1995.Distribution of cryV-type insecticidal protein genes in Bacillus thuringiensisand cloning of cryV-type genes from Bacillus thuringiensis subsp.kurstakiand Bacillus thuringiensis subsp.entomocidus.Appl.Environ.Microbiol.61：2402-2407.
13.Smith，R.A.，and G.A.Couche.1991.The phylloplane as a source ofBacillus thuringiensis variants.Appl.Environ.Microbiol.57：311-315.
14.Travers，R.S.，P.A.W.Martin，and C.F.Reichelderfer.1987.Selectiveprocess for efficient isolation of soil Bacillus spp.Appl.Environ.Microbiol.53：1263-1266.
序列表
<110>行政院农业委员会农业药物毒物试验所
<120>一种拮抗害虫的新颖苏云金杆菌菌株
<130>GAI09TW1966C
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cry1Ab基因的专一性序列(反向引物)
<400>1
ggtcgtggct atatccttcg tgtcacagc 29
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cry1Ab基因的专一性序列(正向引物)
<400>2
gaattgcttt cataggctcc gtc 23
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cry1基因的专一性序列(反向引物)
<400>3
atcactgagt cgcttcgcat gtttgacttt ctc 33
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cry1Ac基因的专一性序列(正向引物)
<400>4
tcacttccca tcgacatcta cc 22
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cry1D基因的专一性序列(正向引物)
<400>5
ggtacattta gatattcaca gccac 25
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cry1E基因的专一性序列(正向引物)
<400>6
cttagggata aatgtagtac ag 22
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cry2A基因的专一性序列(反向引物)
<400>7
aattccccat tcatctgc 18
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cry2A基因的专一性序列(正向引物)
<400>8
actatttgtg atgcgtataa tgta 24
Claims (9)
1.一种拮抗害虫的苏云金杆菌菌株，该苏云金杆菌菌株具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E和cry2A基因片段，且所述苏云金杆菌菌株的保藏编号为DSM 22750，其中所述苏云金杆菌菌株具有拮抗夜蛾科、螟蛾科以及菜蛾科害虫的能力。
2.一种用于控制害虫的组合物，该组合物包括可接受的载体及杀虫有效剂量的δ-内毒素，所述内毒素得自具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E和cry2A基因片段的苏云金杆菌菌株，且所述苏云金杆菌菌株的保藏编号为DSM 22750，其中所述苏云金杆菌菌株具有拮抗夜蛾科、螟蛾科以及菜蛾科害虫的能力。
3.一种控制害虫的方法，该方法包括：
对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的苏云金杆菌菌株和/或具其内毒素的组合物，其特征在于所述苏云金杆菌菌株为具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E和cry2A基因片段的苏云金杆菌菌株，且所述苏云金杆菌菌株的保藏编号为DSM 22750，其中所述苏云金杆菌菌株具有拮抗夜蛾科、螟蛾科以及菜蛾科害虫的能力。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述苏云金杆菌菌株的内毒素为δ-内毒素。
5.一种利用苏云金杆菌菌株和/或其内毒素防治害虫的方法，该方法包括：
对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的所述苏云金杆菌菌株和/或具其内毒素的组合物，其特征在于所述苏云金杆菌菌株为具有cry1Ab、cry1Ac、cry1D、cry1E和cry2A基因片段的苏云金杆菌菌株，且所述苏云金杆菌菌株的保藏编号为DSM 22750，其中所述苏云金杆菌菌株具有拮抗夜蛾科、螟蛾科以及菜蛾科害虫的能力。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述夜蛾科选自玉米穗虫或拟尺蠖的族群。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述螟蛾科选自豆荚螟、大菜螟或粉斑螟蛾的族群。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述菜蛾科选自小菜蛾的族群。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述苏云金杆菌菌株的内毒素为δ-内毒素。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1302866A (zh) * | 2001-02-26 | 2001-07-11 | 南开大学 | 具优良基因组合的高效Bt15A3菌株、分离及应用 |
| CN1337461A (zh) * | 2001-09-19 | 2002-02-27 | 华中农业大学 | 苏云金芽胞杆菌高毒力基因工程菌wg001及生产工艺与产品 |
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| M.S. Li.Isolation Characterization of a Strain of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki Containing a New δ-Endotoxin Gene.《CURRENT MICROBIOLOGY》.2002,第45卷第299-302页. * |
| 苏旭东等.苏云金芽孢杆菌及其δ-内毒素基因的分类与鉴定.《植物保护》.2006,第32卷(第2期),全文. * |
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