CN110144361A - Cry1Ab/Cry1AcZM基因的抗粘虫新用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了Cry1Ab/Cry1AcZM基因的抗粘虫新用途，可用于控制或杀死东方粘虫(Mythimna separate(Walker))，以及减轻东方粘虫对植物的伤害。

Description

Cry1Ab/Cry1AcZM基因的抗粘虫新用途
技术领域
本申请涉及植物生物技术领域，具体涉及Cry1Ab/Cry1AcZM基因的抗粘虫新用途。
背景技术
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)的杀虫蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫和无脊椎动物有特异毒杀作用。
然而，同一Bt杀虫蛋白对鳞翅目不同害虫的毒杀作用存在明显差异。例如，转基因棉花已在我国大面积种植多年，其主要含有Cry1Ac杀虫蛋白，该蛋白对棉铃虫具有很强的毒杀作用，有效控制了棉铃虫的危害；但是，该杀虫蛋白对同属鳞翅目的害虫甜菜夜蛾却无法达到致死效果，从而使得该次要害虫甜菜夜蛾上升为主要害虫，危害棉花产量(陈瑞瑞.甜菜夜蛾和棉铃虫对CrylCa和CrylAc敏感性差异的机理研究.南京农业大学硕士毕业论文,2012.)。
现已有大量研究表明Bt杀虫蛋白对粘虫具有毒杀作用，并且不同的Bt杀虫蛋白的毒杀作用有所差异。其差异主要体现在所针对的靶标粘虫种类以及对同一种类靶标粘虫毒杀程度的不同两方面。Williams等报道在美国南部种植的一种转Bt杀虫蛋白基因的玉米杂交种对秋粘虫(Spodoptera frugiperda)表现出很高的抗虫性；R.E.lynch等1999年在室内用8个转Bt杀虫蛋白基因甜玉米的杂交种喂养3天和6天的秋粘虫，其中7个杂交种的叶和茎杆对秋粘虫有较高的抗性(杨春英等.转Bt毒蛋白基因玉米及其抗虫性研究进展.玉米科学，2001,9:88-93)。对不同Bt杀虫蛋白以人工饲料喂饲方式进行东方粘虫(Mythimnaseparate(Walker))生物活性测定，结果表明：Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白具有杀虫活性；Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对粘虫生长具有抑制作用；Cry1Ba、Cry1Ca无显著活性(杨素娟等.对黏虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选及分析.植物保护，2016,42:30-35)。美国孟山都公司研发的转基因玉米MON810，对二龄期、四龄期到六龄期秋粘虫的密度有影响(Chilcutt,C.F.,et al.,2007.Effects of Bacillus thuringiensis transgeniccorn on corn earworm and fall armyworm(Lepidoptera:Noctuidae)densities.J.Econ.Entomol.100:327-334)，可减少秋粘虫虫害(Buntin G.D.,et al.,Evaluation of yieldgard transgenic resistance for control of fall armywormand corn earworm(Lepidoptera:Noctuidae)on Corn.Armyworm Symposium 2000:37-42)，而对东方粘虫的初孵幼虫有致死效果(王振营等，2005.转Bt基因玉米对粘虫的室内杀虫效果评价，植物保护学报，32:153-157)。
此外，进一步地研究表明，人工构建的Bt杀虫融合蛋白的功能与原蛋白相比会存在巨大差异。例如，Cry1Ab和Cry1Ah均对鳞翅目害虫具有较高活性，但是人工构建的融合蛋白Cry1Ab/Cry1Ah的杀虫活性却发生了显著变化，丧失了对棉铃虫的杀虫活性，降低了对玉米螟、小菜蛾的杀虫活性(徐曼等，Cry1Ab/Cry1Ah杂合蛋白构建与功能研究，生物技术通报，2015，31(9):91-96)。
发明内容
一方面，本申请提供了控制东方粘虫群体的方法，包括使所述东方粘虫群体接触基因组中整合了Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分。
本申请还提供了杀死东方粘虫的方法，包括使所述东方粘虫接触杀虫有效量的基因组中整合了Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分。
本申请还提供了减轻东方粘虫对植物的伤害的方法，包括将包含Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的表达载体稳定整合进植物的基因组中。
在具体实施方案中，上述各方法中的Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或以上的互补序列。
在具体实施方案中，上述各方法中的植物为单子叶植物；任选地，所述植物选自：玉米、水稻、小麦、燕麦、大麦、青稞、粟、高粱和甘蔗。
另一方面，本申请提供了由Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列所表达的蛋白在杀死东方粘虫中的用途。
本申请还提供了由Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列所表达的蛋白在制备抗东方粘虫的杀虫剂或生物制剂中的用途。
在具体实施方案中，上述各用途中的Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或以上的互补序列。
附图说明
图1为粘虫抗性鉴定的离体生测照片，叶片上缺失部分为被粘虫蚕食后的虫孔，其中：
A为转基因事件ZZM0103；B为转基因事件ZZM030，C为阳性对照Bt11，D为阴性对照祥249。
图2为粘虫抗性鉴定的田间照片，叶片边缘及叶片上缺失部分为被粘虫蚕食后的虫孔，其中：
A为转基因事件ZZM030；B为阴性对照祥249。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。
本申请所涉及的Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列，其编码的蛋白质含有3个功能区段，其中N端两个功能区高度同源于Cry1Ab对应部分，C端的功能区高度同源于Cry1Ac对应部分。
在具体实施方案中，本申请所涉及的Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，或由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成。
在一些实施方案中，可以对本申请的基因序列，例如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
具体地，本申请涉及对SEQ ID NO:1进一步优化所得的核苷酸序列。该方法的更多细节描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。优化核苷酸序列可用于提高杀虫蛋白在植物中的表达，所述植物例如单子叶植物，例如禾本科植物，例如玉米(Zeamays L.)。
在一些实施方案中，本申请涉及SEQ ID NO:1所示序列的变体。一般而言，所述变体与该特定核苷酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。
本申请发明人意外发现Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列对粘虫，尤其是东方粘虫(Mythimna separate(Walker))具有明显的抗性。
在此基础上，本申请提供了控制东方粘虫群体的方法、杀死东方粘虫的方法、以及减轻东方粘虫对植物的伤害的方法。
在一实施方案中，本申请提供的控制东方粘虫群体的方法，包括使所述东方粘虫群体进食基因组中整合了Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分。
在一实施方案中，本申请提供的杀死东方粘虫的方法，包括向所述东方粘虫喂食杀虫有效量的基因组中整合了Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分。
如本文所用，“有效量”或“杀虫有效量”指存在于害虫环境的具有杀虫活性的物质或生物体的量。
在一实施方案中，本申请提供的减轻东方粘虫对植物的伤害的方法，包括将包含Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的表达载体稳定整合进植物的基因组中。
在具体实施方案中，上述各方法中的Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或以上的互补序列。
在具体实施方案中，上述各方法中的植物为单子叶植物；任选地，所述植物选自：玉米、水稻、小麦、燕麦、大麦、青稞、粟、高粱和甘蔗。
此外，本申请还提供了由Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列所表达的蛋白在杀死东方粘虫中的用途，或者在制备抗东方粘虫的杀虫剂或生物制剂中的用途。
在具体实施方案中，上述各用途中的Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或以上的互补序列。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。
若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例所涉及的玉米品种材料均由中国种子集团有限公司提供，其中玉米自交系祥249为玉米品种长城799的母本，是以国外引进的玉米种质资源为材料，用系谱法自交分离和严格选择，经过10个世代，于1996年选育而成。
实施例1.抗虫基因的设计与合成
本申请的基因以经过融合与改造的Cry1Ab和Cry1Ac N端608个氨基酸序列为基础，并用植物偏爱的密码子置换编码序列。排除了DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列以及常用限制性酶切位点，然后通过置换密码子的方法进行改正消除；并在3’端加上终止密码子TAA，进而获得一个改造的DNA序列；确定并化学合成改造的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
改造后的DNA序列编码的蛋白质含有3个功能区段，其中N端两个功能区高度同源于Cry1Ab对应部分，C端的功能区高度同源于Cry1Ac对应部分，因此本申请基因定名为Cry1Ab/Cry1AcZM。
实施例2.创制含有Cry1Ab/Cry1AcZM基因的转基因事件
1.载体的构建
(1)构建转化载体pZHZH25018
对Cry1Ab/Cry1AcZM基因编码区上下游进行了表达优化设计，以此提高基因在转录水平上的强度和蛋白质翻译的效率，包括在5’端增加了一段67个核苷酸的欧米茄(Ω)序列和3个核苷酸(ACC)的Kozak序列用来增强真核基因的翻译效率，以及一段在3’端真核生物mRNA的polyA尾巴序列，以增加由胞核向胞质的运输及mRNA的稳定性和翻译效率。
在合成的SEQ ID NO:1的5’端添加HindIII和PstI酶切位点，3’端添加PmeI酶切位点，并将合成的序列克隆在Puc57simple载体上，命名为pzz01194。
利用限制内切酶PstI处理pzz01194，用T4DNA聚合酶补平末端，将Ubi启动子通过平末端连接方式连入，获得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM片段的载体，命名为pzz01201。利用限制内切酶HindIII+BamHI处理含有ubi启动子的载体pzz00002获得Ubi启动子片段，用T4DNA聚合酶补平末端。
已有含有Tocs终止子(5’端有EcoRI酶切位点，3’端有PmeI，EcoRI位点)的载体，命名为pzz01131，Tocs终止子序列可通过EcoRI单酶切pzz01131获得。
EcoRI处理pzz01131获得Tocs终止子片段，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端。
PmeI处理pzz01201，将Tocs终止子通过平末端连接方式连入，获得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs片段的载体，命名为pzz01206(见图1D)。
已构建好载体pzz00015，以该载体pCambia3300(带有35s-BAR-T35spolyA元件)为骨架通过HindIII+PmeI双酶切加入Ubi-EGFP-T35spolyA元件构成，可通过HindIII+PmeI去除Ubi-EGFP-T35spolyA，然后在该位点添加新元件。
HindIII+PmeI处理pzz01206载体，获得Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs片段。
HindIII+PmeI处理pzz00015载体，切口处连入Ubi-Cry1 Ab/Cry1AcZM-Tocs，获得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs和35s-BAR-T35spolyA两个表达盒的表达载体，该载体命名为pZHZH25018。
(2)构建转化载体pZHZH35006
在合成的cry1Ab/cry1Ac Zm的5’端添加HindIII和PstI酶切位点，3’端添加PmeI酶切位点，并将合成的序列克隆在Puc57simple载体上，命名为pZZ01194。
对已有含ubiquitin promoter(5’端有HindIII酶切位点，3’端有BamHI酶切位点)的中间载体pZZ00005，使用限制酶HindIII和BamHI进行双酶切，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端，获得ubiquitin promoter片段。
限制酶PstI处理pZZ01194，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端，将ubiquitinpromoter通过平末端连接方式连入，获得含有ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm片段的载体，命名为pZZ01201。对已有含有nos terminator(5’端有EcoRI酶切位点，3’端有PmeI，EcoRI位点)的中间载体pZZ01188，使用限制酶EcoRI进行单酶切，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端，获得nos terminator序列。PmeI处理pZZ01201，将nos terminator通过平末端连接方式连入，获得含有ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm-nos terminator片段的载体，命名为pZZ01205。
对中间载体pZZ00015(含有CaMV 35S promoter-bar-CaMV35S terminator和ubiquitin promoter–egfp-nos terminator表达元件)，通过限制酶HindIII和PmeI去除ubiquitin promoter-egfp-nos terminator。使用限制酶HindIII和PmeI处理pZZ01205载体，获得ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm-nos terminator片段。将两者进行连接，获得含有ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm-nos terminator和CaMV 35Spromoter-bar-CaMV 35S terminator两个表达盒的表达载体,命名为pZHZH25017。
对中间载体pZZ01337(CaMV 35S promoter-cp4Zm-nos terminator)使用限制酶HindIII和BamHI切除CaMV 35S promoter。对中间载体pZZ00033使用限制酶HindIII和BamHI获得ubiquitin4promoter。将两者进行连接，获得含有ubiquitin4promoter-cp4Zm-nos terminator片段的载体，命名为pZZ01383。
使用限制酶HindII和PmeI双酶切处理pZZ01383获得ubiquitin4promoter-cp4Zm-nos terminator片段，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端。使用限制酶PmeI处理pZHZH25017，将ubiquitin4promoter-cp4Zm-nos terminator通过平末端连接方式连入，获得含有ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm-nos terminator,CaMV 35S promoter–bar-CaMV 35S terminator和ubiquitin4promoter-cp4Zm-nos terminator三个表达盒的植物表达载体，命名为pZHZH35006。
2.遗传转化
将上述两个转化载体分别利用农杆菌介导的遗传转化方法转入受体玉米祥249中。
先将载体pZHZH25018和pZHZH35006的质粒分别通过电击法转化到农杆菌EHA105中，鉴定后备用。
玉米自交系祥249自交后取长度1.5mm左右的幼胚用于转化。收集约200个果穗的幼胚为一批次，置于EP管中把悬浮液吸出，加入含有200μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液，共培养5分钟，然后把幼胚转移到共培养基上，暗培养三天。
将暗培养后的幼胚放置在愈伤诱导培养基上，待有愈伤组织长出后，放置含5mg/L双丙氨膦的筛选培养基上，筛选培养，每两周继代一次。当抗性愈伤长出时，挑选出状态良好的胚性愈伤转到分化培养基上，培养条件为26℃，每日3000Lux光强，光照16小时，两周后出现再生小苗。
将再生的小植株移到生根培养基中，待小苗长出二级次根后，移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小盆中。
3.转化事件的确定
(1)转基因阳性检测
采用天根生化技术公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，DNAsecurePlant Kit)抽提玉米基因组DNA。
将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：10倍PCR缓冲液(Takara)、脱氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)、包括正向引物5’-CACGCAGATTCCAGCGGTCAA-3’；反向引物：5’-GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA-3’以及玉米叶片DNA模板。所有试剂解冻完毕后，离心数秒，置于冰上待用。配制PCR反应体系的混合液，混匀，离心数秒。PCR反应体系(20μL)：2μL 10倍PCR缓冲液(Takara)，0.5μL脱氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)，0.8μL正反向引物混合物(5μM)，0.2μL r-Taq(5U，Takara)，其余为dd H2O。将混合液分装至200μL规格的PCR管中，再加入1μL玉米叶片DNA模板，对于不同样品分别做好标记以便区分。将PCR反应管放入ABI9700型PCR扩增仪，选择预设PCR扩增程序，开始运行反应。PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；30个循环：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5分钟。
PCR结束后，取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。配制1.5％的琼脂糖凝胶，150V电泳25分钟后在溴化乙啶(EB)中染色10分钟，在紫外凝胶成像系统中拍照。
能扩增出333bp大小条带的材料为转基因阳性植株，不能扩增出该条带大小的材料为转基因阴性植株。
(2)Southern印迹
以5’-CACGCAGATTCCAGCGGTCAA-3’、5’-GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA-3’为引物，采用罗氏公司PCR地高辛探针合成试剂盒(货号：11636090910)合成用于检测cry1Ab/cry1AcZM的探针。扩增体系包含：DNA模板5μL(50pg)，引物各0.5μL，PCR DIG混合物5μL，DNA聚合酶0.75μL，PCR缓冲液(10倍)5μL，ddH2O 33.25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；35个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒；最后72℃延伸7分钟。使用1％琼脂糖凝胶检测标记扩增效果。将特异性扩增的扩增产物，即用于检测cry1Ab/cry1AcZM的探针，于-20℃保存。
提取转基因玉米材料的叶片基因组总DNA，获得的DNA沉淀干燥后溶于无离子水，测定浓度后备用。
使用HindIII或KpnI对玉米基因组DNA进行单酶切。使用200μL酶切体系，其中含有20μg玉米基因组DNA、20μL限制性内切酶、20μL 10倍缓冲液，加ddH2O补齐至200μL。酶切16h后取20μL进行电泳检测，检测酶切是否彻底。
酶切产物加ddH2O补充至400μL，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH5.2)，加入4μL的TaKaRa Dr.GenTLE Precipitation Carrier，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，12,000rpm 4℃离心15分钟。将沉淀用50μL ddH2O溶解，加5μL 6倍上样缓冲液。
将DNA通过0.8％凝胶，20V电泳16h。切掉多余泳道及点样孔，剩余凝胶用变性溶液处理2次，每次15分钟，在摇床上轻摇。再用中和缓冲液处理2次，每次15分钟，在摇床上轻摇。超纯水清洗一次。20倍SSC处理10分钟中，用Whatman系统进行转膜4小时以上。
转膜结束后，将膜放置在用10倍SSC浸润的Whatman 3MM滤纸上，紫外交联仪交联3-5分钟。用ddH2O简单洗膜，于空气中干燥。杂交及显影过程均按照罗氏地高辛检测试剂盒I(货号：11745832910)或者罗氏地高辛检测试剂盒II(货号：11585614910)的操作手册进行。
(3)玉米螟抗性鉴定
采用心叶期活体接虫法在田间对植株的螟虫抗性进行了鉴定。
在玉米植株生长发育至心叶中期(7叶片期)进行接虫。供试昆虫为亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)，将黑头期卵约60粒放入离心管中，用脱脂棉塞住管口。将离心管放入28℃、湿度80％的培养箱中，或置于室温条件下盖上湿毛巾保湿，待卵块孵化后将脱脂棉拔掉，投放入心叶丛中，每个植株接虫10-20头。接虫2-3周后逐株调查植株心叶的被害程度，根据被害叶片上的虫孔大小和多少划分受害等级，称为食叶级别。本申请采用国际玉米螟协作组制定的9级分级标准(表1)。逐株调查食叶级别，以各株平均值作为供鉴定品系的食叶级别，并根据表1的评价标准确定其抗螟性级别。
表1.玉米抗螟虫性田间鉴定评价标准
注：*蛀茎评估时隧道2.5cm为1个孔。
**HR：高抗；R：抗；MR：中抗；S：感；HS：高感
经过上述步骤，分别筛选出转化载体pZHZH25018对应的转基因事件ZZM0103，转化载体pZHZH35006对应的转基因事件ZZM030。
实施例3.转基因事件ZZM0103和ZZM030的粘虫抗性鉴定
以先正达商业化转基因玉米品种Bt11为阳性对照，该材料含有Cry1Ab基因，已报道具有粘虫抗性；以构建转基因事件所使用的受体玉米祥249为阴性对照；对ZZM0103、ZZM030、Bt11和祥249，进行粘虫抗性的离体生测；供试粘虫为东方粘虫(Mythimnaseparate(Walker))。
具体的鉴定方法如下：分别取生长至3-4和8-10叶期的新鲜玉米植株地上部分带回室内，取幼嫩心叶，放入培养皿内，接入10头1日龄虫；每皿一个处理，每个处理重复3次；放置在温度28±1℃、光周期14:20小时(L:D)、相对湿度70-80％的人工气候箱中培养。3d后统计存活幼虫数并计算幼虫存活率。
对不同品种玉米粘虫存活率进行多重比较分析，显著水平为0.05，存活率在统计分析前进行一次开方和反正弦转化，比较各处理间差异显著性。根据取食转基因玉米和对照玉米组织幼虫存活率差异显著性，参考表2定性判定其对粘虫的抗性。
表2.东方粘虫离体生测评价标准
其鉴定结果如表3和图1所示。图1中，A为转基因事件ZZM0103，B为转基因事件ZZM030，C为阳性对照Bt11，D为阴性对照祥249；叶片上缺失部分为被粘虫蚕食后的虫孔。
表3.不同玉米材料粘虫离体生测结果
实施例4.转基因事件ZZM0103和ZZM030的粘虫抗性鉴定
以先正达商业化转基因玉米品种Bt11为阳性对照，该玉米品种含有Cry1Ab基因，已报道具有粘虫抗性；以构建转基因事件所使用的受体玉米祥249和中国农业科学院植物保护研究所迁飞害虫研究组累代饲养粘虫的常规玉米苗为阴性对照；对ZZM0103、ZZM030进行粘虫抗性的离体生测；供试粘虫为东方粘虫(Mythimna separate(Walker))。
具体的鉴定方法如下：选择材料3-4和8-10叶期的新鲜叶片为供试粘虫的食物；所有的玉米叶片用0.1％的次氯酸纳溶液浸泡3分钟消毒，然后用蒸馏水冲洗干净晾干；将l整株玉米放入750ml的罐头瓶中，每瓶接入初孵幼虫40头，每个处理做3次重复；置于温度(24±1)℃，湿度(70±5)％，光周期14L:10D的人工气候箱中饲养；每隔2天更换新鲜的相应处理的玉米植株，分别于试验开始后的第3、6、9天检查幼虫的死亡情况。
试验得到不同处理的第3、6、9天幼虫的存活数据用Excel整理后，采用美国SPSSInc公司的SPSS软件(SPSS 16.0)对不同处理的粘虫存活率进行方差分析，差异显著后采用Tukey's HSD进行多重比较。存活率数据在统计分析前进行一次开方和反正弦转化。
表4为不同材料3-4叶期对初孵粘虫存活率的影响，表中数据为平均数±标准误，同一列中相同字母表示经Tukey's HSD法检验在P<0.05水平差异不显著。常规玉米苗的粘虫幼虫存活率在处理后和第3、6、9天的存活率均在95％以上，表明试验所用虫体健康，试验操作可行。不同材料3-4叶期对初孵幼虫存活率有显著影响，第3天的各材料幼虫存活率均较高，除Bt11的幼虫存活率显著低于其他材料外(P<0.05)，其余处理间无显著差异(P>0.05)。第6天各处理间幼虫存活率差异更加明显，特别是Bt11的幼虫存活率显著下降，仅为3l.7％，根据表2的评价标准，抗虫水平为中抗。第9天各处理间幼虫存活率差异进一步加剧。
表4.不同材料3-4叶期对初孵粘虫存活率的影响
表5为不同材料8-10叶期对初孵粘虫存活率的影响，表中数据为平均数±标准误，同一列中相同字母表示经Tukey's HSD法检验在P<0.05水平差异不显著。从试验后3天的幼虫存活率来看，Bt11的幼虫存活率显著低于祥249和常规玉米苗。处理后第6天的幼虫存活率差异显著增大：其中ZZM0103和ZZM030幼虫存活率均低于45％，表现为中抗；祥249和常规玉米苗表现为高感。处理后9天的幼虫存活率以祥249和常规玉米苗表现为高感，并显著高于其它材料；ZZM030表现为高抗，ZZM0103表现为抗，但两者无显著差异。
表5.不同材料8-10叶期对初孵粘虫存活率的影响
实施例5.转基因事件ZZM030的田间粘虫抗性鉴定
在吉林公主岭、济南饮马泉、云南景洪三地，以活体接虫的方式分别对ZZM030进行了田间抗性鉴定，以祥249为对照，供试粘虫为东方粘虫(Mythimna separate(Walker))。
接虫方法为：4-6叶期接虫，每小区人工接40株，每株接初孵幼虫40头；接虫两次，间隔3天；最后一次接虫14天后，逐株调查每个小区接虫株被粘虫为害的食叶级别，并根据标准评价材料心叶期抗性水平。分级标准及抗性级别判定标准按照农业部953号公告-10.1-2007的规定执行。
鉴定结果见表6和图2。表6中，数值以3次重复的平均值±标准差表示，同列小写字母不同表示相同地点不同材料之间差异显著(P<0.01)。
在图2中，A为转基因事件ZZM030，B为阴性对照受体玉米祥249。叶片边缘及叶片上缺失部分为被粘虫蚕食后的虫孔。公主岭试验点ZZM030的平均食叶级别为1.2，抗性类型为高抗，阴性对照受体玉米祥249的平均食叶级别为5.8，抗性类型为中抗；济南试验点ZZM030的平均食叶级别为2.7，抗性类型为抗，阴性对照受体玉米祥249的平均食叶级别为5.4，抗性类型为中抗，；景洪试验点ZZM030的平均食叶级别为1.5，抗性类型为高抗，阴性对照受体玉米祥249的平均食叶级别为9.0，抗性类型为高感。三个试验点转化事件ZZM030与阴性对照(受体玉米祥249)对粘虫的抗性差异显著，表明田间条件下转化事件ZZM030在4-6叶期对粘虫的抗性较好。
表6.不同材料田间抗性鉴定结果
序列表
<110> 中国种子集团有限公司
<120> Cry1Ab/Cry1AcZM基因的抗粘虫新用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1824
<212> DNA
<213> 单子叶植物(monocotyledonous plant)
<400> 1
atggattgcc ggccctacaa ctgcctgtcg aaccctgagg tggaggtcct gggcggcgag 60
cggattgaga ctggctacac accgattgac atctcactct ccctgaccca gttcctcctg 120
tcggagttcg tgccaggcgc tgggttcgtt ctcggcctgg tggatatcat ttggggcatc 180
ttcgggccaa gccagtggga cgctttcctg gtccagatcg agcagctcat taatcagagg 240
atcgaggagt tcgcgcggaa ccaggctatt agccgcctcg agggcctgtc gaacctctac 300
cagatctacg ccgagagctt cagggagtgg gaggctgatc cgacgaaccc cgccctgagg 360
gaggagatgc ggattcagtt caatgacatg aactccgctc tgaccacggc tatcccactc 420
ttcgcggtgc agaattacca ggtcccactc ctgagcgtct acgtgcaggc tgcgaacctc 480
cacctgtctg tgctgcgcga tgtttcagtg ttcggccaga cctgggggtt cgacgctgct 540
acgattaatt ccaggtacaa cgatctgaca cggctcatcg gcaattacac tgaccatgcc 600
gttcggtggt acaacaccgg cctcgagagg gtgtgggggc cagactccag ggattggatt 660
aggtacaacc agttccgcag ggagctcaca ctgactgtcc tggacatcgt ttccctcttc 720
ccaaactacg atagccggac ctaccctatt cgcacggtgt cccagctgac aagggagatc 780
tacactaatc cagtcctcga gaacttcgac ggctctttcc gcgggtcagc tcagggcatt 840
gaggggtcca tcaggagccc tcacctgatg gatatcctca actcaatcac catctacacg 900
gacgctcacc gcggcgagta ctactggtcc gggcatcaga tcatggcttc cccagtcggc 960
ttcagcgggc cagagttcac cttcccactg tacggcacga tggggaacgc tgctccacag 1020
cagaggatcg ttgctcagct cggccagggg gtgtaccgca cactgtccag cactctctac 1080
cggcgcccgt tcaacatcgg cattaacaat cagcagctga gcgtgctcga cggcacagag 1140
ttcgcctacg ggacttcgtc taacctgccc tcggcggtct acaggaagtc gggcaccgtt 1200
gactctctcg atgagatccc gccccagaac aataacgtcc cacctcgcca gggcttctcg 1260
cacaggctgt cgcatgtttc tatgttccgg tcaggcttct ccaactcatc cgtctccatc 1320
attagggccc cgatgttctc atggatccac cggtccgcgg agttcaataa catcattgct 1380
agcgattcga tcacgcagat tccagcggtc aagggcaatt tcctcttcaa cgggagcgtt 1440
atctcgggcc ctgggttcac aggcggggac ctggtgaggc tcaatagctc gggcaataac 1500
atccagaaca ggcggtacat tgaggtccca atccacttcc cttctacctc aacgcgctac 1560
agggtccggg ttcgctacgc gtccgtgaca ccaattcatc tgaatgtcaa ctggggcaat 1620
tcttcaatct tctcgaacac tgtgcctgcc acagcgactt ctctggacaa tctccagtcc 1680
agcgatttcg gctacttcga gtctgctaac gccttcacct cgtctctcgg caatatcgtg 1740
ggggtccgca acttcagcgg cacggctggc gttattattg ataggttcga gttcatccct 1800
gttactgcta ccctggaggc tgag 1824

Claims (6)

1.控制东方粘虫群体的方法，包括使所述东方粘虫群体接触基因组中整合了Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分，所述Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含：
i)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
ii)与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或者
iii)以上的互补序列。
2.杀死东方粘虫的方法，包括使所述东方粘虫接触杀虫有效量的基因组中整合了Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分，所述Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含：
i)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
ii)与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或者
iii)以上的互补序列。
3.减轻东方粘虫对植物的伤害的方法，包括将包含Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列的表达载体稳定整合进植物的基因组中，所述Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含：
i)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
ii)与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或
iii)以上的互补序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物；任选地，所述植物选自：玉米、水稻、小麦、燕麦、大麦、青稞、粟、高粱和甘蔗。
5.由Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列所表达的蛋白在杀死东方粘虫中的用途，所述Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含：
i)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
ii)与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或
iii)以上的互补序列。
6.由Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列所表达的蛋白在制备抗东方粘虫的杀虫剂或生物制剂中的用途，所述Cry1Ab/Cry1AcZM基因序列包含：
i)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
ii)与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或
iii)以上的互补序列。
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