CN103052712A - 用于在植物中表达基因产物的组合物、生物体、体系和方法 - Google Patents

Abstract

在一些实施方案中，本公开涉及使用在单子叶植物和/或双子叶植物中可操作的表达控制序列（ECS）在植物中表达基因产物的组合物、生物体、体系和方法。举例来说，（i）分离的核酸可以包括ECS（例如，甘蔗杆状病毒启动子）和可选的，可操作地连接于所述ECS的外源核酸（ExNA）；（ii）表达载体可以包括ECS；ExNA；以及可选的3’终止序列，其中所述ECS具有足以在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中表达所述ExNA的启动子活性；（iii）微生物、植物细胞或植物可以包括分离的核酸；（iv）用于在植物（例如，单子叶植物和/或双子叶植物）中组成型地表达ExNA的方法可以包括将表达载体与所述植物的细胞的细胞质接触，其中所述表达载体包括所述ExNA和可操作来驱动所述ExNA表达的ECS；和/或（v）在植物（例如，单子叶植物和/或双子叶植物）中介导组成型表达核酸的方法可以包括用包括ECS，ExNA和3’终止序列的表达核酸转化所述植物。

Description

用于在植物中表达基因产物的组合物、生物体、体系和方法

相关申请：本申请要求2010年5月10日递交的美国临时申请号61/395,197和2010年8月5日递交的美国临时申请号61/400,976的优先权，所述申请全部内容通过该引用被整体并入本文。

发明领域

在一些实施方案中，本公开涉及使用在单子叶植物，双子叶植物，或单子叶植物和双子叶植物二者中可操作的启动子在植物中表达基因产物的组合物、生物体、体系和方法。

发明背景

生物技术有望变革从农业到现代医药的一切事物。举例来说，遗传工程改造（genetically engineering）植物的方法被探索，以通过更大的干旱抵抗力和昆虫抵抗力，以及提高的产量来提高生产力。此外，作为用于人用药和兽用药（veterinary medicine）的蛋白质（例如抗体）和其他化合物的生产的潜在的生物工厂（biofactory），植物正在被仔细检测。然而，对于驱动植物中被关注的基因产物的表达，存在数量有限的启动子。这些启动子的一些仅在一些植物中对于驱动表达有效。其他的启动子在一些组织和/或细胞中对驱动表达有效，但对于其他组织和/或细胞则无效。

发明内容

相应地，对于在植物中可操作的启动子的需求已经出现，所述在植物中可操作的启动子包括在单子叶植物，双子叶植物或单子叶植物和双子叶植物二者中可操作的启动子和/或在多种组织和/或细胞中可操作的启动子。

在一些实施方案中，本公开涉及使用在单子叶植物，双子叶植物，或单子叶植物和双子叶植物二者中可操作的启动子在植物中表达基因产物的组合物、生物体、体系和方法。举例来说，组合物可以包括核酸（例如，分离的和/或纯化的核酸），所述核酸包括表达控制序列（例如启动子）。在一些实施方案中，表达控制序列可以包括与选自（a）SEQ ID NO：1的核苷酸1-1786，（b）SEQ ID NO：1的核苷酸1450-1786，（c）SEQ ID NO：1，（d）SEQ ID NO：17，（e）SEQ ID NO：18，（f）SEQ ID NO：26，（g）SEQ ID NO：27，（h）SEQ ID NO：32和/或（i）SEQ ID NO：33的序列至少约85%一致的核酸序列；其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有启动子活性。根据一些实施方案，表达控制序列可以在至少两种单子叶植物和至少两种双子叶植物中具有启动子活性。在一些实施方案中，核酸可以包括表达控制序列（例如SEQ ID NO：1）和外源核酸，其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中可操作来驱动外源核酸的转录。根据一些实施方案，根据权利要求3的分离的核酸，其中所述外源核酸包括转基因。分离的核酸可以包括外源核酸，（a）当被表达或被转录时，所述外源核酸改变所述植物细胞中的碳代谢和/或（b）在一些实施方案中，所述外源核酸编码有效抵御至少一种茎钻蛀昆虫的杀虫剂。

根据一些实施方案，本公开涉及表达载体。举例来说，在5’至3’方向上，表达载体可以包括，甘蔗杆状病毒（SCBV）启动子（例如，（a）SEQ ID NO：1的核苷酸1-1786，（b）SEQ ID NO：1的核苷酸1450-1786，（c）SEQ ID NO：1，（d）SEQ ID NO：17，（e）SEQ ID NO：18，（f）SEQ ID NO：26，（g）SEQ ID NO：27，（h）SEQ ID NO：32，和/或（i）SEQ ID NO：33）；外源核酸（例如转基因）；以及3’终止序列，其中所述SCBV启动子在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有足以表达所述外源核酸的启动子活性。根据一些实施方案，表达载体可以位于细胞中（例如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞）。根据一些实施方案，表达载体可以包括-3至+4位置（例如，在SEQ ID NO：18的核苷酸1819-1825处）为AAAATGG的核苷酸序列。在一些实施方案中，表达载体可以包括具有从约1至约200核苷酸的长度的接头（例如，在所述表达控制序列和所述外源核酸之间）。

在一些实施方案中，本公开还涉及包括表达载体的细胞（例如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞），所述表达载体包括表达控制序列（例如SCBV启动子）。举例来说，细胞可以包括表达载体，所述表达载体具有SCBV启动子（例如，具有与SEQ ID NO：1至少约85%一致的核苷酸序列）；外源核酸；以及3’终止序列，其中所述SCBV启动子在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有足以表达所述外源核酸的启动子活性。在一些实施方案中，外源核酸可以包括转基因。举例来说，（a）当被表达或被转录时，外源核酸可以改变所述植物细胞中的碳代谢和/或（b）外源核酸可以编码有效抵御至少一种茎钻蛀昆虫的杀虫剂。在一些实施方案中，细胞可以是植物细胞（例如，位于植物中）。细胞可以包括选自单子叶植物细胞和双子叶植物细胞的植物细胞（或植物）。单子叶植物可以选自甘蔗、芒草、芒草与甘蔗杂种、柳枝稷、燕麦、小麦、大麦、玉米、稻米、香蕉、丝兰、洋葱、芦笋、高粱及其杂种。双子叶植物可以选自咖啡、番茄、胡椒、烟草、利马豆（lima bean）、拟南芥、橡胶、橙、葡萄柚、马铃薯、南瓜（squash）、豌豆以及甜菜。在一些实施方案中，植物可以包括表达载体，所述表达载体具有启动子（例如，具有与SEQ ID NO：1至少约85%一致的核苷酸序列），可操作地连接于所述启动子的外源核酸，以及3’终止序列，其中所述启动子在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有足以表达所述外源核酸的启动子活性。

在一些实施方案中，本公开涉及在植物中组成型地表达外源核酸的方法。举例来说，方法可以包括用植物细胞的细胞质（cytosol）接触表达盒或表达载体，其中所述表达盒或表达载体包括（i）所述外源核酸，（ii）可操作来驱动所述外源核酸的表达的表达控制序列（例如，具有与SEQ ID NO：1至少约85%一致的核苷酸序列的SCBV启动子），以及（iii）可操作地连接于所述外源核酸的3’终止序列，并且其中所述植物选自由单子叶植物和双子叶植物组成的组。根据一些实施方案，接触的步骤可以包括用包括所述表达盒的颗粒以生物弹射的方式轰击（biolistically bombard）所述细胞和/或将所述细胞与包括所述表达盒的土壤杆菌属（Agrobacterium）细胞共培养。

在一些实施方案中，本公开涉及在植物中介导组成型表达核酸的方法。举例来说，方法可以包括用表达核酸转化植物（例如，植物、植物细胞、叶盘（leaf disc）、胚性愈伤组织（embryonic callus）），所述表达核酸（例如，表达载体）包括表达控制序列（例如，具有与SEQ ID NO：1至少约85%一致的核苷酸序列的启动子），外源核酸以及3’终止序列，其中所述植物选自由单子叶植物和双子叶植物组成的组。根据一些实施方案，转化的步骤可以包括用包括所述表达盒的颗粒以生物弹射的方式轰击所述植物和/或将所述植物与包括所述表达盒的土壤杆菌属细胞共培养。在一些实施方案中，方法可以包括从转化的细胞（例如，胚性愈伤组织）再生植物，以形成所述转化的细胞的一个或更多个后代（progeny）。根据一些实施方案，方法可以包括培养和/或培育转化的细胞的后代。

根据一些实施方案，本公开涉及包括表达控制序列的分离的核酸（例如分离的和/或纯化的核酸）。举例来说，表达控制序列可以包括SEQ ID NO：33的核苷酸632-716的序列；其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有启动子活性。在一些实施方案中，表达控制序列可以具有足够的长度（例如，多于约0.3kb，多于约0.4kb，多于约0.5kb，多于约0.6kb，多于约0.7kb，和/或多于约0.8kb），以使在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中作为表达控制序列是可操作的。举例来说，表达控制序列可以是至少约0.75kb。在一些实施方案中，核酸（例如，分离的和/或纯化的核酸）可以包括表达控制序列，所述表达控制序列具有选自由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及其组合组成的组的序列；其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有启动子活性。举例来说，核酸可以包括（例如，在5’至3’方向上）表达控制序列，从约1至约75个核苷酸长度的接头，以及起始密码子，所述表达控制序列包括SEQ ID NO:30序列和SEQ ID NO:31序列，所述SEQID NO:30序列和SEQ ID NO:31序列由约630个核苷酸的间隔区（spacer）分隔，其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有启动子活性。在一些实施方案中，接头可以具有与SEQ ID NO：32的核苷酸778-805的序列至少约85%，至少约90%，至少约95%，至少约98%，和/或至少约99%的一致性。根据一些实施方案，间隔区可以具有与SEQ ID NO：32的核苷酸96-726的序列至少约85%，至少约90%，至少约95%，至少约98%，和/或至少约99%的一致性。表达控制序列可以在其5’端包括具有与SEQ ID NO:32的核苷酸1-44的序列至少约85%，至少约90%，至少约95%，至少约98%，和/或至少约99%的一致性的序列。

在一些实施方案中，本公开还涉及用于表达期望量的关注的基因产物（例如蛋白质）的表达体系。举例来说，表达体系可以包括具有两个或更多个表达控制序列的核酸、表达盒、细胞和/或植物，所述表达控制序列的每个可操作地连接于编码关注的基因产物（例如，蛋白质）的编码序列（例如，转基因）。根据一些实施方案，表达体系可以包括具有两个或更多个表达盒的植物，所述表达盒的每个包括表达控制序列（例如，启动子），编码关注的基因产物（例如，蛋白质）的编码序列，和/或一个或更多个终止子，其中每个表达控制序列（例如，启动子）与其他一个或多个表达控制序列不同，和/或编码关注的基因产物（例如，蛋白质）的所述编码序列的每个拷贝与编码序列的其他一个或多个拷贝基本上一致和/或一致。表达控制序列（例如，启动子）可以包括在植物中可操作的任意启动子，举例来说，所述启动子包括玉米泛素1（ubiquitin1）启动子（具有或不具有热激元件（heat shock element，hse）），甘蔗富含脯氨酸的蛋白质的启动子，甘蔗延伸因子1α启动子，甘蔗茉莉酸酯诱导启动子，甘蔗杆状病毒启动子，甘蔗O-转甲基酶启动子，和/或其组合。表达体系可以包括具有2、3、4、5或更多个启动子的植物，所述启动子的每个独立地选自由玉米泛素1启动子（具有或不具有热激元件），甘蔗富含脯氨酸的蛋白质启动子，甘蔗延伸因子1α启动子，甘蔗茉莉酸酯诱导启动子，甘蔗杆状病毒启动子，甘蔗O-转甲基酶启动子，和/或其组合组成的组，并且所述启动子的每个可操作地连接于（例如，反式）编码关注的基因产物（例如，蛋白质）的编码序列（例如，转基因），其中编码关注的基因产物（例如，蛋白质）的编码序列的每个拷贝与其他一个或多个拷贝基本上一致和/或一致。在一些实施方案中，关注的编码序列可以包括在本公开中引用的任意编码序列。

附图简要说明

本公开的一些实施方案可以通过部分地参考本公开和所附附图而被理解，其中：

图1图示说明用于根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的载体；

图2图示说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的载体；

图3图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的GUS表达，与在35S启动子的控制下的GUS表达相比较；

图4图示说明示出根据本公开的具体实施例的实施方案的转基因植物叶中的GUS活性的柱状图；

图5图示说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的载体；

图6A图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的甘蔗幼叶中的GUS表达；

图6B图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的甘蔗幼叶（卷（roll））中的GUS表达；

图6C图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的甘蔗茎中的GUS表达；

图6D图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的甜高粱（sweet sorghum）幼叶中的GUS表达；

图6E图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的烟草叶中的GUS表达；

图6F图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的利马豆种子中的GUS表达；

图6G图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的甘蔗幼叶中的GFP表达；

图6H图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的甘蔗幼叶（卷）中的GFP表达；

图6I图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的甘蔗茎中的GFP表达；

图6J图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的甜高粱幼叶中的GFP表达；

图6K图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的烟草叶中的GFP表达；以及

图6L图示说明在根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的控制下的利马豆种子中的GFP表达。

图7A图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒转化的甘蔗茎杆（stalk）中的GUS表达；

图7B图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒转化的甘蔗叶中的GUS表达；

图7C图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒转化的甘蔗根中的GUS表达；

图8A图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒转化的甘蔗茎秆中的GUS表达；

图8B图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒转化的甘蔗茎秆中的GUS表达；

图8C图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒转化的甘蔗茎秆中的GUS表达；

图8D图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒转化的甘蔗茎秆中的GUS表达；

图9A图示说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的载体（SEQ IDNO：19）；

图9B图示说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体B）的载体（SEQ IDNO：20）；

图9C图示说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体C）的载体（SEQ ID NO：21）；

图9D图示说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体D）的载体（SEQ ID NO：22）；

图9E图示说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体E）的载体（SEQ ID NO：23）；

图9F图示说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体F）的载体（SEQ ID NO：24）；

图10A图示说明根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子；

图10B图示说明根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体B）；

图10C图示说明根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体C）；

图10D图示说明根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体D）；

图10E图示说明根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体E）；

图10F图示说明根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体F）；

图11A图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒转化的甘蔗叶中的EYFP表达；

图11B图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒（包括缺失B）转化的甘蔗叶中的EYFP表达；

图11C图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒（包括缺失C）转化的甘蔗叶中的EYFP表达；

图11D图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒（包括缺失D）转化的甘蔗叶中的EYFP表达；

图11E图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒（包括缺失E）转化的甘蔗叶中的EYFP表达；以及

图11F图示说明用根据本公开的实施例的实施方案的表达盒（包括缺失F）转化的甘蔗叶中的EYFP表达。

序列表简要说明

本公开的一些实施方案可以通过部分地参考本公开和所附序列表而被理解，其中：

SEQ ID NO：1说明根据本公开的具体实施例的实施方案的甘蔗杆状病毒启动子；

SEQ ID NO：2说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗杆状病毒启动子，GUS编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：3说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗杆状病毒启动子，增强的YFP编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：4说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括35S启动子，GUS编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：5说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括35S启动子，增强的YFP编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：6说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括E35S启动子，增强的YFP编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：7说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括玉米泛素启动子（无hse（热激元件）的mUbi1），GUS编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：8说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括玉米泛素启动子（无hse的mUbi1），增强的YFP编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：9说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括玉米泛素启动子，GUS编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：10说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括泛素启动子，增强的YFP编码序列，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：11说明根据本公开的具体实施例的实施方案的P-2PCR引物；

SEQ ID NO：12说明根据本公开的具体实施例的实施方案的P-W3F PCR引物；

SEQ ID NO：13说明根据本公开的具体实施例的实施方案的P-W4F PCR引物；

SEQ ID NO：14说明根据本公开的具体实施例的实施方案的P-W1R PCR引物；

SEQ ID NO：15说明根据本公开的具体实施例的实施方案的SCBV/Prom/F PCR引物；

SEQ ID NO：16说明根据本公开的具体实施例的实施方案的SCBV/Prom/R PCR引物；

SEQ ID NO：17说明根据本公开的具体实施例的实施方案的甘蔗杆状病毒启动子；

SEQ ID NO：18说明根据本公开的具体实施例的实施方案的甘蔗杆状病毒启动子；

SEQ ID NO：19说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子的载体（野生型pSK-SCBV21-EYFP-Nos）；

SEQ ID NO：20说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体B）的载体；

SEQ ID NO：21说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体C）的载体；

SEQ ID NO：22说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体D）的载体；

SEQ ID NO：23说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体E）的载体；

SEQ ID NO：24说明具有根据本公开的具体实施例的实施方案的启动子（缺失突变体F）的载体；

SEQ ID NO：25说明根据本公开的具体实施例的实施方案的甘蔗杆状病毒启动子（缺失B）；

SEQ ID NO：26说明根据本公开的具体实施例的实施方案的甘蔗杆状病毒启动子（缺失C）；

SEQ ID NO：27说明根据本公开的具体实施例的实施方案的甘蔗杆状病毒启动子（缺失D）；

SEQ ID NO：28说明根据本公开的具体实施例的实施方案的甘蔗杆状病毒启动子（缺失E）；

SEQ ID NO：29说明根据本公开的具体实施例的实施方案的甘蔗杆状病毒启动子（缺失F）；

SEQ ID NO：30说明根据本公开的具体实施例的实施方案的转录起始位点（TSS1）；

SEQ ID NO：31说明根据本公开的具体实施例的实施方案的转录起始位点（TSS2）；

SEQ ID NO：32说明根据本公开的具体实施例的实施方案的具有TSS1和TSS2的甘蔗杆状病毒启动子；

SEQ ID NO：33说明根据本公开的具体实施例的实施方案的具有TSS2的甘蔗杆状病毒启动子；

SEQ ID NO：34说明根据本公开的具体实施例的实施方案的正向PCR引物F1；

SEQ ID NO：35说明根据本公开的具体实施例的实施方案的正向PCR引物F2；

SEQ ID NO：36说明根据本公开的具体实施例的实施方案的反向PCR引物R1；

SEQ ID NO：37说明根据本公开的具体实施例的实施方案的反向PCR引物R2；

SEQ ID NO：38说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗杆状病毒启动子，牛溶菌酶编码序列，35S终止子，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：39说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括玉米泛素启动子（不具有热激元件），牛溶菌酶编码序列，以及35S终止子的表达盒；

SEQ ID NO：40说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括玉米泛素启动子（不具有热激元件），牛溶菌酶编码序列，高粱花叶病毒蛋白质的3’非翻译区，以及35S终止子的表达盒；

SEQ ID NO：41说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括玉米泛素启动子（不具有热激元件），高粱花叶病毒蛋白质的5’非翻译区，牛溶菌酶编码序列，高粱花叶病毒蛋白质的3’非翻译区，以及35S终止子的表达盒；

SEQ ID NO：42说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括玉米泛素启动子（不具有热激元件），牛溶菌酶编码序列，35S终止子，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：43说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗富含脯氨酸的启动子（不具有5’UTR（非翻译区）），牛溶菌酶编码序列，高粱花叶病毒蛋白质的3’非翻译区，以及35S终止子的表达盒；

SEQ ID NO：44说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗富含脯氨酸的启动子（不具有5’UTR），高粱花叶病毒蛋白质的5’非翻译区，牛溶菌酶编码序列，高粱花叶病毒蛋白质的3’非翻译区，以及35S终止子的表达盒；

SEQ ID NO：45说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗富含脯氨酸的启动子（不具有5’UTR），牛溶菌酶编码序列，35S终止子，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：46说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗延伸因子1α启动子，牛溶菌酶编码序列，高粱花叶病毒蛋白质的3’非翻译区，以及35S终止子的表达盒；

SEQ ID NO：47说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗延伸因子1α启动子，牛溶菌酶编码序列，35S终止子，以及NOS终止子的表达盒；

SEQ ID NO：48说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括茉莉酸酯应答的（responsive）启动子，牛溶菌酶编码序列，以及35S终止子的表达盒；

SEQ ID NO：49说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括茉莉酸酯应答的启动子，牛溶菌酶编码序列，高粱花叶病毒蛋白质的3’非翻译区，以及35S终止子的表达盒；以及

SEQ ID NO：50说明根据本公开的具体实施例的实施方案的包括甘蔗杆状病毒启动子，牛溶菌酶编码序列，35S终止子，以及NOS终止子的表达盒。

具体实施方式

在一些实施方案中，本公开涉及使用在单子叶植物，双子叶植物，或单子叶植物和双子叶植物二者中可操作的启动子在植物中表达基因产物的组合物、生物体、体系和方法。举例来说，本公开涉及包括甘蔗杆状病毒（SCBV）启动子的表达控制序列（例如，启动子）、表达盒、表达载体、微生物和/或植物。根据一些实施方案，表达控制序列可以（a）在选自根、叶、茎、花、种子、果实和/或块茎（tuber）的器官中组成型地有活性或条件性地有活性，和/或（b）在选自表皮、周皮、薄壁组织、厚角组织、厚壁组织、木质部、韧皮部和/或分泌结构的组织中有活性。

在一些实施方案中，可以在方法、组合物、体系和/或生物体中包括表达控制序列，以在植物中（例如，在甘蔗中）改变碳代谢（例如，在蔗糖积累组织中）和/或表达蛋白质（例如，杀虫蛋白）。根据一些实施方案，可以在方法、组合物、体系和/或生物体中包括表达控制序列以改进害虫耐受度和/或疾病耐受度和/或疾病抵抗力（例如，水稻）。

甘蔗杆状病毒（Sugarcane bacilliform virus，SCBV）属于花椰菜病毒科（Caulimoviridae）Badnavirus属。那些属于Badnavirus属的物种的病毒体具有无包膜（non-enveloped）的杆状颗粒。血清学上，SCBV与香蕉条斑病毒（Banana streak virus，BSV）相关联。SCBV的基因组由~7600bp大小的单一的双链DNA组成，所述DNA编码三个可读框（openreading frame），所述可读框的转录由存在于ORF3的3’部分和接近ORF1的5’端之间的单一启动子介导。

SCBV Mor分离株的启动子可以在单子叶植物和双子叶植物二者中是有活性的。来自其他Badnavirus属（例如水稻东格鲁病杆状病毒（Rice tungro bacilliform virus），鸭跖草属黄花叶病毒（Commelina yellow mosaic virus），香蕉条斑病毒和芋杆状病毒（Taro bacilliformvirus））的启动子已经进行外源基因表达测试。在一些实施方案中，来自这些病毒的启动子对于在单子叶植物中的转基因表达可以是有用的，因为上述Badnavirus属感染单子叶植物。尽管看起来来自RTBV、CoYMV和TaBV的启动子典型地在维管组织中是有活性的，来自SCBV和BSV的启动子介导外源基因的组成型表达。

SCBV与BSV紧密关联并且可以在不同SCBV分离株之间表现出相当大的序列变异性。在由SCBV感染的高贵蔗（Sacchaum officinarum）克隆的SCBV启动子区中可以存在相似的序列变异性。尽管由S.officinarum Ireng Maleng克隆的PCR衍生的（PCR-derived）启动子序列仅显示出与另一SCBV Ireng Maleng分离株（SCBVIM-12）的启动子序列~53%的序列同源性，该PCR衍生的启动子显示出与BSV启动子区~74%的序列同源性。

在位于德克萨斯里奥格兰德谷中部的甘蔗田中的SCBV发病率的初步筛选证实了在该区的甘蔗田中SCBV是普遍的。来自SCBV阳性的商业化的甘蔗杂种CP72-1210的SCBV启动子已经被分离、纯化和克隆。其启动子活性已经在各种单子叶植物和双子叶植物中以及转基因甘蔗植物中被证实。

表达控制序列

在一些实施方案中，表达控制序列可以包括一个或更多个启动子，一个或更多个操纵基因，一个或更多个增强子，一个或更多个核糖体结合位点，和/或其组合。举例来说，表达控制序列可以包括核酸，所述核酸具有（a）在单子叶植物、双子叶植物、或单子叶植物和双子叶植物二者中的启动子活性，以及（b）与SEQ ID NO：1多于约70%一致、与SEQ ID NO：1多于约75%一致、与SEQ ID NO：1多于约80%一致、与SEQ ID NO：1多于约81%一致、与SEQ ID NO：1多于约82%一致、与SEQ ID NO：1多于约83%一致、与SEQ ID NO：1多于约84%一致、与SEQ ID NO：1多于约85%一致、与SEQ ID NO：1多于约86%一致、与SEQ ID NO：1多于约87%一致、与SEQ ID NO：1多于约88%一致、与SEQ ID NO：1多于约89%一致、与SEQ ID NO：1多于约90%一致、与SEQ ID NO：1多于约92%一致、与SEQ ID NO：1多于约94%一致、与SEQ ID NO：1多于约96%一致、与SEQ ID NO：1多于约98%一致，和/或与SEQ ID NO：1多于约99%一致的核苷酸序列。根据一些实施方案，与SEQ ID NO：1在全长上不是100%一致的序列可以具有在目标核酸的长度上分散（例如，均匀地，随意地（haphazardly））的变异点和/或变异区。举例来说，表达控制序列可以包括与SEQ ID NO：1100%一致的序列的一个或更多个区（例如，在TATA盒、CCAAT盒，和/或TSS模体（motif）中或与之接近）以及低于100%一致的长度和/或序列的一个或更多个区。举例来说，表达控制序列可以包括与SEQ ID NO：1的核苷酸1-1450约95%一致的区（在长度和/或序列上）以及与SEQ ID NO：1的核苷酸1450-1786100%一致的区。

根据一些实施方案，表达控制序列可以与（a）SEQ ID NO：1的核苷酸1-1786，（b）SEQ ID NO：17，（c）SEQ ID NO：18，（d）SEQ ID NO：26，（e）SEQ ID NO：27，（f）SEQ ID NO：32，和/或（g）SEQ ID NO：33共享（share）相似性（例如，如在上文公开的从多于约70%至100%的一致性）。举例来说，表达控制序列可以与SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32和/或SEQ ID NO：33多于约85%一致；与SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32和/或SEQ ID NO：33多于约95%一致；和/或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32和/或SEQ ID NO：33多于约98%一致。

在一些实施方案中，表达控制序列可以包括TSS1（SEQ ID NO:30），TSS2（SEQ ID NO：31）或TSS1和TSS2二者。举例来说，表达控制序列可以至少约0.76kb长，其中，TSS1的5’端（如果存在）在-760位置的100个核苷酸之内，并且TSS2的5’端（如果存在）在-80位置的100个核苷酸之内。举例来说，表达控制序列可以至少约0.7kb长，其中，TSS1的5’端（如果存在）在表达控制序列的5’端的100个核苷酸之内，并且TSS2的5’端（如果存在）在-80位置的100个核苷酸之内。在一些实施方案中，TSS2（如果存在）可以被这样放置：所述TSS2不延伸越过起始密码子。在一些实施方案中，TSS1可以是TSS2的5’。在一些实施方案中，表达控制序列可以包括由间隔区（例如，多于约500个核苷酸、多于约550个核苷酸、多于约600个核苷酸和/或多于约650个核苷酸）分隔的TSS1和TSS2，从约1至约75个核苷酸长的接头，和/或起始密码子。举例来说，间隔区可以具有与SEQ ID NO：32的核苷酸96-726的序列多于约85%的一致性、多于约90%的一致性、多于约95%的一致性、和/或多于约98%的一致性。举例来说，接头可以具有与SEQ IDNO:32的核苷酸778-805的序列多于约85%的一致性、多于约90%的一致性、多于约95%的一致性、和/或多于约98%的一致性。表达控制序列可以还包括（例如，TSS1的5’）具有与SEQ ID NO:32的核苷酸1-44的序列多于约85%一致性的序列。

根据一些实施方案，表达控制序列可以包括SEQ ID NO：1的片段。举例来说，表达控制序列可以包括为转录起始位点上游（例如，核苷酸1787的上游）的SEQ ID NO：1的部分。在一些实施方案中，表达控制序列可以包括具有与SEQ ID NO：1的核苷酸1-1786至少70%一致性的核酸。

根据一些实施方案，表达控制序列可以包括在病毒中（例如，植物病毒）发现的核酸序列。举例来说，根据一些实施方案，表达控制序列可以包括SCBV启动子、水稻东格鲁病杆状病毒启动子、鸭跖草属黄花叶病毒启动子、香蕉条斑病毒启动子、芋杆状病毒启动子和/或其组合。在一些实施方案中，表达控制序列可以包括具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸。

根据一些实施方案，与35S启动子相比，表达控制序列可以可操作来驱动细胞中的核酸序列（例如，编码序列）的更高表达（例如，从约5%更高至约50%更高、从约50%更高至约500%更高）。举例来说，表达的度量标准可以包括出现率和/或基因产物的积累（例如，RNA和/或蛋白质）和/或自一个或更多个时间点起（例如，起始点和/或发展阶段后的经过时间）的基因产物的总积累量。在一些实施方案中，基因产物的比较试验（comparativeassay）可以是定性的、半定量的和/或定量的。比较试验可以间接和/或直接评定基因产物的存在和/或量。在一些实施方案中，表达控制序列可以对一种或更多种刺激物（例如，一种或更多种小分子、一种或更多种植物防御诱导剂、机械损伤、温度、压力）敏感。举例来说，表达控制序列的活性可以在感染病毒（例如，杆状病毒）时被增强或抑制。在一些实施方案中，表达控制序列可以包括光应答元件、铜应答元件、水杨酸应答元件、植物生长素应答元件、硫应答元件和/或脱水应答元件。模体的识别可以通过可获得的模体预测软件（例如日本国立农业科学研究所的PLACE数据库）和/或实验数据获知。

根据一些实施方案，本公开涉及一个或更多个表达控制序列，所述表达控制序列像SEQ ID NO:1的核苷酸-1816至-1的核苷酸序列，和/或所述表达控制序列可操作来在至少一种单子叶植物和/或至少一种双子叶植物中介导表达。举例来说，表达控制序列可以包括与SEQ ID NO：1在一个或更多个位置处不同的核酸序列。在一些实施方案中，与SEQID NO：1不同的表达控制序列的实施例可以包括来自一种或更多种杆状病毒分离株的启动子。根据一些实施方案，在严格条件下，表达控制序列可以与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸杂交。举例来说，严格条件可以包括（a）4×SSC，65℃，接下来0.1×SSC，65℃，60分钟，和/或（b）50%甲酰胺、4×SSC，65℃。在一些实施方案中，表达控制序列可以包括具有SEQ ID NO：1的序列的核酸和在至少一种单子叶植物和/或至少一种双子叶植物中具有介导表达能力的核酸的缺失片段（deletion fragment）。得益于本公开的本领域普通技术人员可以制备具有SEQ ID NO：1的序列的核酸的一个或更多个缺失片段。

可以通过使用表达控制序列的启动子或元件作为查询序列，使用Gapped BLAST算法（Altschul等，1997年，核酸研究（Nucl.Acids Res.）25：3389-3402）（BLOSUM62矩阵，gap成本（cost）为11，存留（persistence）成本每个残基为1并且期望值（E value）为10）进行数据库搜索来识别具有像SEQ ID NO：1的序列的表达控制序列。根据一些实施方案，可以通过任何可利用的方法来评估序列一致性。举例来说，可以在FASTA应用程序套件中（Pearson和Lipman，1988年，美国科学院院刊（Proc.Nat.Acad.Sci.）85：2444-24448；Pearson，1990年，酶学方法（Methods in Enzymology）183：63-98）用ALIGN（全球比对）或LALIGN（本地同源性比对）（BLOSUM50矩阵并且gap罚分为-16、-4）来比较两个序列。可以根据ClustalW（Larkin等，2007年，生物信息学（Bioinformatics）23（21）：2947-2948）、BLAST、FASTA或相似的算法来评估序列相似性。

表达盒和载体

在一些实施方案中，本公开涉及表达载体和/或表达盒，所述表达载体和/或表达盒用于在细胞中表达核酸序列（例如，编码序列）并包括表达控制序列，并且所述核酸序列可操作地连接于所述表达控制序列。在一些实施方案中，盒可以包括能够表达特定的编码序列的核苷酸序列，所述特定的编码序列被插入以便成为可操作地连接于在所述核苷酸序列中存在的一个或更多个表达控制序列。因此，举例来说，根据一些实施方案，表达盒可以包括被期望在植物种子中表达的异源编码序列。

在一些实施方案中，本公开涉及表达载体，举例来说，所述表达载体可以包括具有表达控制序列和可操作地连接于所述表达控制序列的编码序列的核酸。在允许编码序列表达（例如，转录）的条件下，表达载体可以与细胞（例如，植物细胞）接触。根据一些实施方案，在允许编码序列在由植物细胞衍生的一个细胞和/或多个细胞中表达的条件下，表达控制序列可以与植物细胞（例如，胚细胞、干细胞、愈伤组织细胞）接触。在一些实施方案中，在允许表达载体的至少一部分在细胞的后代中遗传的条件下，表达载体可以与细胞（例如，植物细胞）接触。表达载体的实施例可以包括（并非限制）在图1、图2、图5和图9中示出的载体。根据一些实施方案，表达载体可以包括一个或更多个筛选标记（selectable marker）。举例来说，当载体在细菌宿主、酵母宿主和/或植物宿主中时，表达载体可以包括用于筛选的标记（marker for selection）。

根据一些实施方案，本公开涉及表达盒，举例来说，所述表达盒可以包括具有表达控制序列和可操作地连接于所述表达控制序列的编码序列的核酸。表达盒可以被包括在表达载体中。在一些实施方案中，编码序列可以包括在至少一种植物细胞中可表达的任何编码序列。举例来说，编码序列可以包括人类的序列（例如，抗体序列），非人类动物的序列，植物的序列，酵母的序列，细菌的序列，病毒的序列（例如，植物病毒，动物病毒和/或疫苗序列），人造序列，其反义（antisense）序列，其片段，其变异体和/或其组合。根据一些实施方案，编码序列可以包括糖运输基因和/或糖积累基因。糖运输基因的实施例可以包括（并非限制）二糖转运体（例如，蔗糖转运体）和/或单糖转运体。在一些实施方案中，编码序列可以包括编码具有杀虫活性、抗菌活性和/或抗病毒活性的一种或更多种基因产物的序列。可以具有杀虫活性、抗菌活性和/或抗病毒活性的基因产物的实施例可以包括（并非限制）抗生物素蛋白、植物杀虫蛋白质（例如，Vip3A）、来自苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的杀虫结晶蛋白质（例如，Cry1、Cry1Ab、Cry2、Cry9）、豌豆蛋白（例如PA1b）、hirsutellinA、凝集素（例如，smow drop lily凝集素、大蒜凝集素、洋葱凝集素）、淀粉酶抑制剂（例如，α淀粉酶抑制剂）、arcelins（例如，来自豆类的arcelins）、蛋白酶抑制剂、溶菌酶（例如，牛溶菌酶、人溶菌酶、软体动物溶菌酶）、防御素、壳多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、其变异体，和/或其组合。根据一些实施方案，编码序列可以包括用于形成和/或修饰聚合物的酶。用于形成和/或修饰聚合物的酶的实施例可以包括（并非限制）聚羟基脂肪酸酯合酶、4-羟基丁酸酰基-CoA转移酶、其变异体和/或其组合。在一些实施方案中，编码序列可以包括编码水解纤维素的一种或更多种酶的序列。水解纤维素的酶的实施例包括（并非限制）纤维素酶、内切葡聚糖酶（例如，内切β-1,4葡聚糖酶）、葡糖苷酶（例如β葡糖苷酶），水解酶（例如β-1,4-葡聚糖纤维二糖水解酶）、外切纤维素酶（exocellulases））、其变异体和/或其组合。在一些实施方案中，编码序列可以包括编码形成和/或修饰糖（例如，蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、果聚糖、果糖、塔格糖、三氯蔗糖）的一种或更多种酶的序列。形成和/或修饰糖的酶的实施例可以包括（并非限制）海藻糖-6-磷酸盐合酶（TPS）和海藻糖-6-磷酸盐磷酸酶（TPP）。根据一些实施方案，编码序列可以包括编码用于形成或修饰甜菜碱、聚胺、脯氨酸、海藻糖、其变异体、和/或其组合的酶的序列。在一些实施方案中，编码序列可以包括起始密码子、内含子、和/或翻译终止序列。根据一些实施方案，编码序列可以包括一种或更多种天然或人造编码序列（例如，编码单一蛋白质或嵌合体（chimera））。根据一些实施方案，表达盒可以可选地包括终止序列。

在一些实施方案中，表达控制序列被用来构建表达盒，在5’至3’方向上，所述表达盒包括（a）表达控制序列（例如，SCBV启动子），（b）异源基因或编码序列，或者在所述表达控制序列的控制下与原生植物基因互补的序列，和/或（c）3’终止序列（例如，包括多聚腺苷化位点的终止序列）。在一些实施方案中，表达盒的实施例可以包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO:19的核苷酸710-3538、SEQ ID NO:21的核苷酸674-2472、SEQ ID NO:22的核苷酸674-2377、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:50和/或与其具有至少约98%和/或至少约99%一致性的序列。表达盒可以被包括在各种各样的自主复制载体中以便构建表达载体。举例来说，可以通过将表达控制序列连接到要被表达的序列（例如，编码序列）来构建表达盒。

一些用于构建表达盒的技术对于本领域技术人员来说是公知的。举例来说，对于连接DNA片段，各种各样的策略是可利用的，所述策略的选择取决于DNA片段末端的性质。包含目标启动子TATA盒的限制和/或缺失片段可以在正向上被连接于无启动子的异源基因或编码序列，例如GUS的编码序列。如得益于本公开的本领域普通技术人员可以领会的，表达控制序列和/或其部分可以通过其他手段被提供，例如，化学合成或酶促合成。

根据一些实施方案，在5’至3’方向上，核酸可以包括表达控制序列、接头（可选）以及编码序列。在一些实施方案中，接头可以是从约1个核苷酸至约200个核苷酸的长度和/或可以包括一个或更多个限制性位点。可操作地连接于表达控制序列的核酸序列（例如，编码序列）的表达水平可以被接头的长度和/或序列，和/或编码序列的5’序列影响。举例来说，表达水平可以被从约-4位置至约+4位置的序列影响。在一些实施方案中，在5’至3’方向上，核酸可以包括表达控制序列、接头以及编码序列，其中-4至+4位置的序列包括选自表1示出的序列的序列。根据一些实施方案，在5’至3’方向上，核酸可以包括表达控制序列和编码序列，其中-4至+4位置的序列包括选自表1示出的序列的序列。在一些实施方案中，与其他-3至-1序列相比，为AAA的-3至-1序列可以与较高（例如，最高）的表达水平相关联。与其他+1至+4序列（例如，ATGC、ATGA、ATGT）相比，为ATGG的+1至+4序列可以与较高（例如，最高）的表达水平相关联。

表1.可选的衔接点（Junction）序列

在一些实施方案中，异源编码序列的3’端可以可操作地连接于终止序列，举例来说，所述终止序列包括多聚腺苷化位点，示例性地为（但不限于）胭脂碱合酶多聚腺苷化位点和/或章鱼碱T-DNA基因7多聚腺苷化位点。根据一些实施方案，多聚腺苷化位点可以由异源基因或编码基因提供。根据一些实施方案，核酸可以包括5’非翻译区（5’UTR）、3’非翻译区（3’UTR）和/或其组合。举例来说，核酸可以包括（例如，在5’至3’方向上）表达控制序列、5’UTR、编码序列（例如，转基因）、3’UTR和/或终止序列。

微生物

在一些实施方案中，本公开涉及包括表达控制序列的微生物。举例来说，微生物可以包括细菌、酵母和/或病毒。在一些实施方案中，表达控制序列可以包括SCBV启动子。微生物可以包括表达控制序列和可操作地连接于所述表达控制序列的编码序列。微生物的实施例可以包括（并非限制）农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、大肠杆菌（Escherichiacoli）、鳞翅类细胞系、水稻东格鲁病杆状病毒、鸭跖草属黄花叶病毒、香蕉条斑病毒和芋杆状病毒和/或杆状病毒（baculovirus）。表达控制序列可以在基因组核酸上和/或基因组外（extra-genomic）核酸上存在。

植物

在一些实施方案中，本公开涉及包括表达控制序列的植物细胞（例如，胚细胞、干细胞、愈伤组织细胞）、组织和/或植物。在一些实施方案中，植物和/或植物细胞可以选自单子叶植物和/或双子叶植物。单子叶植物的实施例可以包括（并非限制）甘蔗、芒草、芒草与甘蔗杂种、柳枝稷、燕麦、小麦、大麦、玉米、稻米、香蕉、丝兰、洋葱、芦笋和/或高粱。双子叶植物的实施例可以包括（并非限制）咖啡、番茄、胡椒、烟草、利马豆、拟南芥、橡胶、橙、葡萄柚、马铃薯、葡萄柚、马铃薯、南瓜、豌豆和/或甜菜。在一些实施方案中，植物细胞可以被包括在植物组织、植物器官和/或整株植物中。根据一些实施方案，在组织、器官和/或整株植物中的植物细胞可以与一个或更多个等同基因的细胞和/或一个或更多个异源细胞邻接。在一些实施方案中，植物可以包括原代转化株和/或其后代。在一些实施方案中，包括表达控制序列的植物可以进一步包括可操作地连接于所述表达控制序列的转基因。根据一些实施方案，转基因可以在植物中被表达，所述植物在所有的（例如，基本上所有的）器官类型、组织类型和/或细胞类型中包括表达控制序列，所述器官类型、组织类型和/或细胞类型包括（并非限制）茎秆（stalk）、叶、根、种子、花、果实、分生组织、薄壁组织、贮藏薄壁组织、厚角组织、厚壁组织、表皮、叶肉、维管束鞘、保卫细胞、原生木质部、后生木质部、韧皮部、韧皮部伴随物（companion）和/或其组合。在一些实施方案中，转基因和/或其基因产物可以位于和/或易位于一个或更多个细胞器中（例如，液泡、叶绿体、线粒体、质粒）。

表达体系

根据一些实施方案，本公开涉及用于表达（例如，到高水平）核酸序列（例如，包括一个或更多个编码序列）的体系。举例来说，表达体系可以在植物中被包括，以被用作高价值的蛋白质的生物工厂。不必被限制于任何特定作用机制，表达体系可以得益于附加的和/或协同的表达控制序列活性、转录协同效应、和/或引入的编码序列（例如，转基因）的降低的沉默作用，所述沉默作用是当相同的启动子被用来表达相同或不同转基因时，在植物中频繁观察到的现象，并且构成植物作为生物工厂的经济开发的主要风险。包括表达体系的植物可以贯穿转基因植物的一个或更多个连续世代保持符合期望的（例如，高的）表达水平。

在一些实施方案中，表达体系可以包括两个或更多个表达控制序列（例如，启动子），所述表达控制序列的每个可操作地连接于各自数量的单一编码序列的克隆。根据一些实施方案，两个、三个、四个、五个或更多个表达控制序列（例如，启动子）可以被可操作地连接于单一编码序列的两个、三个、四个、五个或更多个克隆。根据一些实施方案，每个表达控制序列可以独立地是组成型的和/或被调控的（例如，组织特异性表达、发育诱导表达，应激诱导表达、防卫诱导表达和/或干旱诱导表达）。在一些实施方案中，编码序列的每个克隆可以与一个或更多个其他克隆相同。根据一些实施方案，编码序列的拷贝可以某种程度上互相不同，举例来说，在一个拷贝可以是为一个科、属和/或种优化的密码子的情况下，另一拷贝可以是为不同的科、属和/或种优化，或者根本不是优化的密码子。在一些实施方案中，每个表达控制序列-编码序列克隆可以独立地在表达载体上、在基因组核酸上和/或在基因组外核酸上存在（例如，在微生物和/或植物中）。在一些实施方案中，每个表达控制序列-编码序列克隆还可以独立地包括一个或更多个终止子。

根据一些实施方案，本公开涉及甘蔗的转基因植物（一种高的生物量生产者和糖积累器），所述甘蔗的转基因植物是由用表达体系（例如，多个启动子-一个转基因体系）转化的外植体（explant）产生的。根据本公开的一些实施方案的转基因甘蔗植物被观察到表达高水平的（多达6.0mg每千克总茎秆鲜重=~1%总可溶的蛋白质（total soluble protein）或TSP）可提取的活性牛胃溶菌酶（bovine stomach lyzozyme，BvLz，一种抗菌蛋白质）。所述高的BvLz表达水平在转基因植物的连续的世代中是稳定的，容许相应蛋白质的经济化的生产和纯化。

在一些实施方案中，本公开涉及用于生产多个启动子-一个转基因表达载体和转基因植物的方法。举例来说，方法可以被用来转化不同种类的甘蔗，所述方法通过在来自各自的载体的多个启动子的控制下，用BvLz转基因来共轰击目标外植体组织（例如，胚性愈伤组织或叶卷盘（leafroll disc）），所述BvLz转基因编码在牛胃中正常存在的蛋白质并且是用于在单子叶植物植株中表达而优化的密码子。

方法

根据一些实施方案，本公开涉及用包括表达控制序列的核酸来转化和/或转染植物的方法。举例来说，方法可以包括用包括表达控制序列的核酸来接触细胞（例如，酵母细胞和/或植物细胞）。在一些实施方案中，用核酸与细胞接触可以包括将目标细胞与包括所述核酸（例如，在二元载体中）的细菌（例如，土壤杆菌属）共培养、在所述核酸存在下电穿孔所述细胞、用包括所述核酸的病毒（杆状病毒）感染所述细胞、用包括所述核酸的颗粒轰击所述细胞（例如，在叶、茎和/或愈伤组织中的细胞）、在包括所述核酸和一种或更多种晶须（例如，碳化硅晶须）的溶液中搅拌所述细胞，和/或化学地诱导所述细胞吸收细胞外的DNA。在一些实施方案中，使核酸与细胞接触可以包括使所述核酸与植物叶盘和/或植物原生质体接触。

在一些实施方案中，本公开涉及用于在细胞中表达核酸序列（例如，包括一个或更多个编码序列）的方法。举例来说，方法可以包括在允许编码序列表达的条件下，用核酸接触细胞（例如，酵母细胞和/或植物细胞），所述核酸包括表达控制序列和可操作地连接于所述表达控制序列的编码序列。根据一些实施方案，表达可以是组成型的、条件性的、原生的（例如，在正常时间和/或组织中），和/或异位的（ectopic）。在一些实施方案中，方法还可以包括在植物中（例如，单子叶植物和/或双子叶植物）表达核酸序列。根据一些实施方案，方法可以包括从植物收获（例如，部分纯化）在植物中表达的核酸序列（例如，外源序列）的基因产物。

在一些实施方案中，本公开涉及用于分离在至少一种单子叶植物和/或至少一种双子叶植物中可操作的表达控制序列的方法。举例来说，方法可以包括用包括核酸的探针进行文库（例如，植物基因组文库、细菌人工染色体文库、植物病毒基因组文库）筛选，所述核酸具有SEQ ID NO：1的核酸序列、其互补基因（complement）和/或其一部分（例如，在严格杂交条件下）。方法可以包括使用一个或更多个引物扩增（例如，使用聚合酶链式反应）来自文库的表达控制序列，所述引物衍生自SEQ ID NO：1的核酸序列、其互补基因和/或其一部分的核酸序列。在一些实施方案中，在至少一种单子叶植物和/或至少一种双子叶植物中的候选表达控制序列的可操作性可以由形成候选表达控制序列和编码序列（在所述至少一种单子叶植物和/或所述至少一种双子叶植物中可表达）的转录和/或翻译的融合基因（fusion）来形成表达盒，将所述表达盒转移至所述至少一种单子叶植物和/或所述至少一种双子叶植物中，和/或检测所述编码序列的表达来确认。用于检测编码序列的表达的试验可以取决于编码序列的性质。举例来说，编码序列可以包括报告基因（例如，自发荧光蛋白质、氯霉素乙酰转移酶和β-萄糖醛酸酶（GUS））。可以利用标准试验来高灵敏度地检测转基因生物体中的报告酶。

根据一些实施方案，本公开涉及用于分离在至少一种单子叶植物和/或至少一种双子叶植物中可操作的表达控制序列的方法。举例来说，方法可以包括从与在SEQ ID NO：1的5’和/或3’端处或接近SEQ ID NO：1的5’和/或3’端的序列对应的（但不必需相等）从约15至约40个核苷酸的长度选择一个或更多个引物，在允许表达控制序列扩增的条件下，将所述一个或更多个引物与扩增文库（例如，部分或全部的病毒基因组文库、部分或全部的植物基因组文库）和核酸聚合酶接触。根据一些实施方案，植物基因组文库可以包括从被病毒感染的植物和/或脱毒（virus-free）植物分离的核酸。在一些实施方案中，方法可以包括用包括SEQ ID NO:1或其片段的探针进行文库筛选。一个或更多个候选的表达控制序列（例如，扩增产物）可以被克隆到表达载体中驱动编码序列（例如，GUS，一种自发荧光蛋白质）表达的位置。举例来说，扩增产物的可操作性可以通过在允许编码序列表达的条件下，用这样的表达载体接触植物细胞（例如，微粒弹射轰击法（microprojectilebombardment）、土壤杆菌属介导转化法）并且检查所述植物细胞编码序列的基因产物（例如，被编码的蛋白质）的出现。

在一些实施方案中，本公开涉及在至少一种单子叶植物和/或至少一种双子叶植物中提高编码序列的表达水平的方法。举例来说，表达盒和/或表达载体可以被引入植物以便有效表达编码序列。根据一些实施方案，产生具有水平提高的蔗糖积累基因产物和/或防卫基因产物的植物的方法可以包括用表达载体和/或表达盒转化植物细胞，并且再生具有水平提高的蔗糖积累基因或防卫基因的产物的植物，所述表达载体和/或表达盒包括可操作地连接于蔗糖积累基因或防卫基因的表达控制序列。在本公开的一些实施方案中，转基因甘蔗株系可以被产生，其中糖代谢被改变以提高茎干重（例如，多于约50%的蔗糖、多于约60%的蔗糖、多于约70%的蔗糖）。根据一些实施方案，转基因蔗糖株系可以被生产为具有增强的生物杀虫活性（例如，用于防止茎钻蛀昆虫，可能是最具破坏力的害虫）。

在一些实施方案中，本公开涉及在至少一种单子叶植物和/或至少一种双子叶植物中降低编码序列（例如，原生植物序列、病毒序列）的表达水平的方法。举例来说，方法可以包括用表达载体接触至少一种单子叶植物细胞和/或至少一种双子叶植物细胞，所述表达载体包括表达控制序列和与编码序列的至少一部分互补并且可操作地连接于所述表达控制序列的反义序列。在一些实施方案中，方法可以包括用RNA干扰（RNA interference，RNAi）表达载体接触至少一种单子叶植物细胞和/或至少一种双子叶植物细胞，所述RNA干扰表达载体包括表达控制序列和核酸序列，所述核酸序列是其表达水平要被降低的和/或沉默的原生植物基因的反向重复，并且可操作地连接于所述表达控制序列。在一些实施方案中，方法可以包括用共抑制表达载体接触至少一种单子叶植物细胞和/或至少一种双子叶植物细胞，所述共抑制表达载体包括表达控制序列以及编码原生植物基因、可操作地连接于所述表达控制序列的核酸序列。

在一些实施方案中，胚性愈伤组织和其他易感组织可以用不含（“disarmed”）外源含有DNA的A.tumefaciens接种，培养若干天并且转移到含有抗生素的介质中。在包含合适的抗生素的介质中生根后，被转化的枝条（shoot）可以被选择并且被转移至土壤。转基因植物可以被授粉，来源于这些植物的种子可以被收集并且在抗生素介质中生长。

根据一些实施方案，通过免疫学的、组织化学的、mRNA表达或活性试验，组织、发育中的种子、幼苗和成熟的植物中的异源或报告基因的表达可以被监控。对于表达盒的表达试验的选择可以取决于异源编码序列的性质。举例来说，若合适的核苷酸探针是可获得的，则可以使用RNA凝胶印记分析（RNA gel blot analysis）来评估转录。若由异源基因编码的多肽的抗体是可获得的，则可以使用western分析和免疫组织化学定位来评估多肽的生产和定位。取决于所述异源基因，可以使用合适的生物化学试验。

本公开还涉及用于从植物分离和/或纯化（“purifying”）基因产物（例如，核酸和/或蛋白质）的方法。举例来说，方法可以包括提供包括核酸的植物，所述核酸具有表达控制序列和可操作地连接于所述表达控制序列的编码序列，其中所述编码序列编码关注的基因产物。根据一些实施方案，方法可以包括在植物中生产转基因蛋白质、从植物中提取包含所述转基因蛋白质的汁液、清洁所述汁液以移除颗粒物质，和/或将所述汁液传送通过至少一个膜以产生两个部分（fraction），所述部分中的一个包含所述转基因蛋白质。在一些实施方案中，转基因蛋白质可以包括凝集素、酶、疫苗、细菌裂解肽、细菌裂解蛋白、抗菌肽、抗菌肽蛋白、抗病毒肽、抗病毒蛋白、杀虫肽、杀虫蛋白、治疗肽以及治疗蛋白。

如将被得益于本公开的本领域技术人员所理解的，用于在至少一种单子叶植物和/或至少一种双子叶植物中表达核酸序列的其他等同的或可替代的组合物、设备、方法和体系可以被预想，而不背离本文所包含的描述。相应地，所示出和描述的实施本公开的方式仅被理解为是说明性的。

本领域技术人员可以在多个部件的形状、尺寸、数量和/或排列方面进行各种变化，而不背离本公开的范围。举例来说，表达控制序列的位置和数量可以被改变。每个公开的方法和方法步骤可以与任何其他公开的方法和方法步骤关联进行并且可以以任何顺序进行。同样地，在已经提供范围的情况下，公开的端点可以被认为是如特定的实施方案所期望或需要的精确值和/或近似值。当端点是近似的，灵活度可以根据范围的数量级成比例地改变。举例来说，一方面，在约5至约50的范围的上下文中，约50的范围端点可以包括50.5，但是不包括52.5或55，而另一方面，在约0.5至50的范围的上下文中，约50的范围端点可以包括55，但是不包括60或75。此外，在一些实施方案中，混合和匹配范围端点可能是符合期望的。同样地，在一些实施方案中，每个公开的图（例如，在一个或更多个实施例和/或附图）可以形成范围的基础（例如，公开值+/-约10%、公开值+/-约100%）和/或范围端点。本领域熟练技术人员可以对制备和使用本公开的组合物、设备和/或体系的方法进行各种变化。举例来说，组合物、设备和/或体系可以视情况而被制备和/或使用来用于动物和/或人类用途（例如，关于公共卫生、传染性、安全、毒性、生物计量以及其他考虑）。

这些等同物和替代物以及显而易见的改变和修饰被意图包括在本公开的范围内。相应地，前述公开意图是说明性的（但非限制性的），本公开的范围，如所附的权利要求书所说明的。

实施例

本公开的一些具体实施例的实施方案可以通过本文所提供的一个或更多个实施例而被说明。

实施例1：德克萨斯里奥格兰德谷中部（Mid Rio Grande Valley）的甘蔗田中的SCBV感染

从在德克萨斯里奥格兰德谷中部的田里随机挑选的甘蔗植株中收获叶。从被收获的甘蔗叶中提取DNA后，通过Southern印记的方法检查SCBV感染的发生率（表2）。用于Southern印记的³²P-dCTP标记的DNA探针是由约1.4Kb的SCBV片段制备的，该片段包含SCBV ORF1，ORF2以及ORF3的5’端450nt，所述片段是以由CP72-1210制备的甘蔗DNA通过PCR克隆得到的。Southern印记的结果显示，在被检测的14个甘蔗品种/克隆中，有11个品种/克隆为SCBV阳性，这表明在里奥格兰德谷中部的田地中，SCBV的感染是普遍存在的。

表2.在商业化甘蔗品种中的SCBV发生率

*结果基于Southern印记。

实施例2：SCBV启动子（SCBV21）的克隆和测序

从SCBV阳性的甘蔗栽培品种CP72-1210的叶组织中分离总基因组DNA。调整DNA浓度至约100ng/μl，约250ng DNA用于PCR反应。引物序列信息由中国广州华南农业大学的Zhou Guohui博士提供，Zhou博士克隆过SCBV的华南地区分离株（isolate）。引物名称及序列如下所示：P-2（5’-acg cgg taa cac gta gtc cta agg t-3’；SEQ ID NO：11），P-W3F（5’-gac atc aaa tgg ttg tat cc-3’；SEQ ID NO：12），P-W4F（5’-aca ccg cat tca gag tga ag-3’；SEQ ID NO：13）和P-W1R（5-ccg cat taa cgt tct cc-3’；SEQ ID NO：14）。所有PCR反应均使用Taq DNA聚合酶（NEB），遵循厂商的建议，在20μl反应混合物中完成。引物对P-2和P-W3F用于第一轮PCR反应，采用用于包含其启动子序列的SCBV基因组预扩增的下列PCR参数：在94°C4分钟，1个循环；每个循环94°C30秒、48°C30秒以及72°C5分钟，10个循环。随后，5μl第一轮PCR反应混合物用作第二轮PCR反应的模板，第二轮PCR反应采用引物对P-W1R和P-W4F，通过下列PCR程序：94°C4分钟，1个循环；每个循环94°C30秒、52°C30秒以及72°C4分钟，35个循环；以及72°C5分钟，1个循环。PCR反应混合物通过在1%的琼脂糖凝胶上电泳被分析。所得到的PCR产物的大小为约2kb，被克隆至pGEM T-Easy载体（Promega）。通过测序，分析克隆产物的核酸序列，确认被克隆的片段与SCBV ORF3具有同源性。在与其他SCBV启动子序列的序列比对之后，由保守区域设计两个引物：SCBV/Prom/F（5’-GAAGAACAG CAT GCT GAACAT CTGTGG AAG ATG C-3’；SEQ ID NO：15）和SCBV/Prom/R（5’-CAAACT TGC TCAAAT GATCAT GTG GTGAAC TAC CGATG-3’；SEQ ID NO：16）。采用这两个引物的PCR条件是：94°C4分钟，1个循环；每个循环94°C30秒、52°C30秒以及72°C2分钟，35个循环；以及72°C5分钟，1个循环。1%的琼脂糖凝胶上分析PCR产物，将该PCR产物克隆至pGEM T-Easy，并且通过测序验证该克隆序列。被克隆的PCR产物被命名为pGEM/SCBV21（图1）。

实施例3：SCBV21启动子活性

为了检测被克隆的SCBV21的启动子活性，将该启动子亚克隆至β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因的上游来构建pBI/SCBV21-GUS（图2）。通过用基因枪将包裹着DNA的钨粒轰击洋葱表皮层来测试SCBV21的启动子活性。轰击后2天通过组化GUS试验确认GUS表达（图3）。

实施例4：来自不同SCBV分离株的SCBV启动子的序列比较

将SCBV21的序列和两个SCBV分离株——SCBV Ireng Maleng（IM）和SCBVMorocco（Mor）进行比较。表3显示SCBV21具有与SCBV-IM和SCBV-Mor分别为87%和71%的一致性。

表3.SCBV21与两个其他的SCBV分离株的序列比较

	SCBV-IM-AJ277091*	SCBV-Mor M89923*
			SCBV21	87%	71%

*NCBI Genebank数据库编号

**序列一致性（%）：通过在NCBI GeneBank中用SCBV21的BLASTn检索得到。

实施例5：转基因甘蔗中SCBV21驱动的GUS转基因表达

转基因甘蔗是用DNA构建体pBI/SCBV21-GUS（图1）生成，并将此转基因株系的GUS基因表达水平与其他转基因株系进行比较，其中，其他转基因株系的GUS转基因表达用CaMV35S启动子驱动，或者缺乏热激元件的玉米Ubi启动子（mUbi1-no hse）驱动（图4）。在SCBV21/GUS转基因株系中，GUS基因的表达水平大约比在35S/GUS转基因株系中高约四到六倍，而mUbi1-no hse/GUS转基因株系显示最高的GUS基因的表达水平，高于SCBV21/GUS株系中六到十倍（图4）。

实施例6：在高粱、烟草和利马豆种子中SCBV21介导GUS表达

通过将DNA包裹的钨粒在制备的植物样品上进行轰击，在另一种单子叶植物（高粱）和两种双子叶植物物种（烟草和利马豆）中，SCBV21的启动子活性被瞬时地检测（图6）。结果显示，不管是何种组织的样品（叶或种子）或何种植物物种（单子叶植物或双子叶植物），SCBV21都起启动子的作用（图6）。

实施例7：各种启动子的相对表达水平：在叶组织中的GUS和EYFP瞬时表达

在轰击之前，将幼嫩的叶段在MS_0.6固体培养基（Murashige and Skoog，1962），B5G1mg/L，0.6mg/L2,4-D，500mg/L水解酪蛋白，20g/L蔗糖和7g/L琼脂中培养4天，叶卷被保存10天或28天。用氯化钙和亚精胺将质粒DNA以每mg钨4μg（针对GUS构建体）或1μg（针对EYFP构建体）沉淀到钨粒（1.1μm，Bio-Rad公司）上。

实施例8：各种启动子的相对表达水平：GUS组化

轰击后48小时之后，将叶段转移至0.1%X-Gluc染色液中，此染色液含0.1%（v/v）Triton X-100和0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）。随后，组织在37°C孵育过夜（24小时）。染色之后，通过将组织浸泡在70%（v/v）乙醇中并换液两次，除去叶绿素。观察组织的GUS染色情况，并用OLYMPUS D71相机连接至SZX7立体显微镜（日本）拍摄照片。

实施例9：各种启动子的相对表达水平：GUS活性定量试验

GUS定量荧光试验按照改进的Jefferson程序（1987）进行。称取500mg植物组织并在液氮中研磨，然后，与750μL GUS提取缓冲液一起转移至1.5ml微量离心管中，所述GUS提取缓冲液含50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0），10mM2-巯基乙醇，10mM EDTA（pH8.0）和0.1%（v/v）Triton X-100。短暂涡旋振荡后，将这些管在冰上孵育1小时，并且在4℃12000g离心10分钟。上清的一份（aliquot）用于蛋白质浓度确定和GUS活性试验。按照基于DC蛋白试验试剂盒（Bio-Rad公司）的使用手册的Lowry试验确定蛋白质浓度。通过向25μLMUG（4mM）试验缓冲液添加10μL蛋白质提取物和15μLGUS提取缓冲液，对叶样品进行荧光酶法GUS试验。针对根样品，25μL蛋白质提取物被用来与25μL MUG溶液反应。在37°C孵育1小时后，添加950ml 0.2M Na₂CO₃溶液以终止反应。在VersaFluor^TM荧光计（BIO-RAD公司）上在365nm激发后，读取在455nm的光度值。未转染植株的蛋白质提取物被用作为负对照样品，GUS提取缓冲液中4-甲基伞形酮（MU，Sigma）溶液的一系列稀释液被用作标准。

实施例10：各种启动子的相对表达水平：EYFP图像采集及分析

轰击后，每6小时针对红、绿、蓝通道采集4080x3072像素、256灰度水平的图像至少240小时。使用ImageJ软件（Rasband1997-2009）根据Chiera等人（2007和2008）描述的修订方法量化EYFP表达。每个图像系列都通过Adobe Imageready CS（8.0.1版）被输入、调整大小至800x600像素并排列。排列后，该系列图像被输出为“mov”文件。使用ImageJ软件打开该“mov”文件，从该系列图像中剪切出一块包括400x300像素、含最高表达细胞数目的区域，然后将其保存为“avi”文件用于EYFP定量分析。在“avi”文件中的每一系列图像都被分为红、绿和蓝通道。在绿色通道背景中的一没有EYFP表达的20×20像素区域被选择用于背景灰度值的确定，并被从后续图像中扣除以消除背景荧光。调整好阈值水平后，通过由Chiera和Hernandez-Garcia善意赠送的宏指令程序，生成荧光点（focui number）数值、平均灰度值以及总面积值。用每个像素的平均灰度值乘以总面积计算“总表达”值。

实施例11：各种启动子的相对表达水平：原生质体的分离和转染

采用Chen（1987）和Yoo等人（2007）的改进方法，从愈伤组织分离原生质体。在摇床（250mL三角瓶；100rpm）上，在MS3液体培养基（Murashige和Skoog，1962）中培养愈伤组织培养物2-3个月，每周转接一次（1：5稀释），MS3液体培养基含B5G1mg/L，3.0mg/L2,4-D，500mg/L酪蛋白水解物和20g/L蔗糖。收获新鲜的悬浮细胞（被转接2-3天）并在酶溶液（20mM MES（pH5.7），2.0%

纤维素酶（EMDBiosciences，USA），0.1%果胶酶Y-23（Duchefa Biochemie，USA），0.4M甘露糖醇，20mM KCl，10mM CaCl₂和0.1%BSA）中消化过夜。收集原生质体，并在W5溶液中洗两遍，100g离心两分钟。洗第二遍后，将原生质体重悬在MMG溶液（4mM MES-KOH，pH5.7，0.4M甘露糖醇，15mM MgCl₂）中达到1~2×10⁶个原生质体/ml的终浓度。100μL原生质体被转移至2-ml圆底微型离心管中，与质粒DNA（10μL中10μg）轻柔混合。等体积的灭菌去离子水（模拟转染）作为对照转染。通过添加110μL PEG-钙溶液（40%PEG-4000，0.2M甘露糖醇，100mM CaCl₂）启动转染。轻轻拍打所述管使原生质体和PEG-钙溶液混合，并在室温孵育10分钟。用440μL W5溶液稀释该混合物终止转染。通过100g离心2分钟收集被转染的原生质体，并将其重悬在250μL W5溶液中。在将原生质体在暗处室温保持16小时后，研究EYFP和GUS表达分析。在进行GUS活性分析之前，通过在100g离心2分钟收获原生质体，随后弃除上清并在-80°C贮存。向冷冻的原生质体中添加100μL GUS提取缓冲液，通过漩涡振荡2秒强力混合以破裂原生质体。在冰上保持5分钟之后，1000g离心2分钟。取25μL原生质体裂解物加入25μL4mM MUG试验缓冲液，37°C孵育60分钟。

实施例12：各种启动子的相对表达水平：统计分析

各种启动子的相对表达水平示于表4-10。数据采集自2-4次独立实验，每次实验6-10次事件（event）。Statistical Analysis System（统计分析系统）（8.0版，SAS Institute，美国）的GLM程序被用于统计分析。用Student-Newman-Keuls（SNK）检验进行平均值的多重比较。

表4.甘蔗叶段中GUS的瞬时表达——斑点（spot）数*

*图像使用显微镜拍摄得到（15倍）。

表5.甘蔗叶段中EYFP的瞬时表达——荧光点（foci）数*

*数据采集自轰击后48小时时间点。图像使用带YFP滤光片的荧光显微镜拍摄得到（15倍）。

表6.甘蔗叶段中EYFP的瞬时表达——总表达*

*总表达作为每个像素的平均灰度值×总面积×1000测得。数据采集自轰击后48小时时间点。图像使用带YFP滤光片的荧光显微镜拍摄得到（15倍）。

表7.甘蔗原生质体中GUS的瞬时表达——GUS活性*

*每分钟p-mole4-MU/μg蛋白质

表8.甘蔗原生质体中EYFP的瞬时表达——荧光点数*

*图像使用带YFP滤光片的荧光显微镜拍摄得到（85.5倍）。

表9.转基因甘蔗叶中的GUS表达——GUS活性*

数据来自两次独立的实验。mUbi1-no hse/GUS：2次事件，5棵植株；SCBV21/GUS：2次事件，6棵植株；35S/GUS：6次事件，18棵植株。*每分钟p-mole4-MU/μg蛋白质

表10.转基因甘蔗茎中的GUS表达——GUS活性*

数据来自两次独立的实验。mUbi1-no hse/GUS：5棵植株，1次事件；SCBV21/GUS：1棵植株，1次事件；35S/GUS：3棵植株，1次事件。*每分钟p-mole4-MU/μg蛋白质

实施例13：SCBV21的表达模式

图7A、7B和7C分别显示了在SCBV21控制下实施例5的转基因甘蔗中的茎秆、叶和根部中的GUS表达。全部三种组织中都观察到染色。图7A显示径向截切的茎秆段的相对两半的剖面图（左），以及两个茎杆段的等轴图，每一个图都包含了一个削去了叶片的叶节点（右上），以及茎秆段的大体上的平视图和横截的茎秆断面图（右下）。图7B显示了来自单个节点的两张叶片和叶鞘。图7C显示在基本分生组织附近区域具最高表达的单个转基因植株的根蘖（shoot root）。

此外，我们也观察了各种细胞类型中的SCBV21的表达水平。例如，转基因SCBV21/GUS茎秆的显微照片（图8A-8D）显示贮藏薄壁组织和维管系统的强的染色（使用实施例9的GUS染色方案）。在这些图像中标记出了木质部（x），韧皮部（p）和贮藏薄壁组织（pa）。转基因SCBV21/GUS茎秆也显示强的厚壁组织的染色。

实施例14：SCBV21中潜在的转录起始位点的识别

用Promoter Finder（通过Berkeley Drosophila Genome Project在fuitfly.org/seq_tools/promoter.html可获得）分析1816bp的被克隆的SCBV启动子序列（SEQ ID NO：1），以识别潜在的转录起始位点。Promoter Finder预测了两个可能的转录起始位点，TSS1（SEQ ID NO：1的核苷酸1055-1104）和TSS2（SEQ ID NO：1的核苷酸1737-1786）。

实施例15：SCBV21的缺失突变的生成

本实施例中所有的缺失突变体都由pSK-SCBV21-EYFP-Nos（图9A；SEQ ID NO：19）生成。用于缺失的限制性内切酶位点被标示在图谱中。TSS1和TSS2用水平散列线显示。用于生成缺失突变的引物的大致位置以实心箭头标出。引入正向引物（F1和F2；分别是SEQ ID NOS：34和35）中的XhoI酶切位点和反向引物（R1和R2；分别是SEQ ID NOS：36和37）中的NcoI位点用于克隆目的。

缺失突变B是通过从pSK-SCBV2V-EYFP-Nos（图7A）删除StuI和NcoI位点之间的区域生成的。首先，用StuI和NcoI对pSK-SCBV21-EYFP-Nos进行双酶切，之后通过Klenow反应将消化的片段成为平末端。将4964bp的消化的片段从琼脂糖凝胶中洗脱用于平末端连接。连接衔接点的核苷酸序列通过测序被验证。突变B的质粒图谱如图9B所示。在图9B中，SCBV21的截掉区域用黑条标示，SCBV21的剩余片段用十字形填充图案显示。

为了生成缺失突变C，使用引物F1（SEQ ID NO：34）和R1（SEQ ID NO：36）从pSK-SCBV21-EYFP-Nos PCR扩增StuI位点和SCBV213’末端之间的区域（图9A）。引物R1被设计来除去pSK-SCBV21-EYFP-Nos中存在的EYFP起始密码子和SCBV213’末端之间的19个核苷酸（图9A）。这段序列来自于pGEM T-Easy载体的多克隆位点。将805bp的PCR产物（SCBV21突变C片段）克隆至pGEM T-Easy（Promega）载体上，突变C片段的核苷酸序列通过测序被验证。XhoI和NcoI双酶切（其酶切位点分别在突变C片段5’和3’末端旁侧）将突变C片段从pGEM T-Easy载体切下。pSK-SCBV21-EYFP-Nos的XhoI-NcoI片段被突变C片段替换，生成突变C（图9C）。在图9C中，SCBV21的截掉区域用黑条标示，SCBV21的剩余片段用十字形填充图案显示。图谱中也标示出了TSS1和TSS2。

为了生成缺失突变D，用引物F2（SEQ ID NO:35）和R1（SEQ ID NO:36）从pSK-SCBV21-EYFP-Nos PCR扩增SCBV213’端的710bp（图9A）。该PCR产物（SCBV21的突变D片段）被克隆至pGEM T-Easy载体，且突变D片段的核苷酸序列通过测序验证。通过与制成突变C所使用的相同程序生成突变D。XhoI和NcoI双酶切（其酶切位点分别在突变D片段5’和3’末端的旁侧）将突变D片段从pGEM T-Easy载体切下。pSK-SCBV21-EYFP-Nos的XhoI-NcoI片段被突变D片段替换，生成突变D（图9D）。在图9D中，SCBV21的截掉区域用黑条标示，SCBV21的剩余片段用十字形填充图案显示。图谱中也标示出了TSS2。

为了生成缺失突变E，用引物F1（SEQ ID NO:34）和R2（SEQ ID NO:37）从pSK-SCBV21-EYFP-Nos PCR扩增nt1722至nt2440之间的区域（图9A）。该PCR片段（突变E片段）被克隆至pGEM T-Easy载体，且突变E片段的核苷酸序列通过测序验证。通过与制成突变C和D所使用的相同程序生成突变E。通过XhoI和NcoI双酶切（其酶切位点在突变E片段5’和3’末端两者的旁侧）将突变E片段从pGEM T-Easy载体切下。pSK-SCBV21-EYFP-Nos的XhoI-NcoI片段被突变E片段替换，生成突变E（图9E）。在图9E中，SCBV21的截掉区域E1和E2用黑条标示，SCBV21的剩余片段用十字形填充图案显示。图谱中也标示出了TSS1。

为了生成缺失突变F，用引物F2（SEQ ID NO:35）和R2（SEQ ID NO:37）从pSK-SCBV21-EYFP-Nos PCR扩增nt1815至nt2440之间的区域（图9A）。该PCR片段（突变F片段）被克隆至pGEM T-Easy载体，且突变F片段的核苷酸序列通过测序验证。通过与制成上述三个突变，突变C、D和E，所使用的相同程序生成获得突变F。通过XhoI和NcoI双酶切（其酶切位点分别在突变F片段5’和3’末端的旁侧）将突变F片段从pGEMT-Easy载体切下。pSK-SCBV21-EYFP-Nos的XhoI-NcoI片段被突变F片段替换，生成突变F（图9F）。在图9F中，SCBV21的截掉区域用黑条标示，SCBV21的剩余片段用十字形填充图案显示。

实施例16：甘蔗叶段上的瞬时表达试验

用于瞬时EYFP表达试验的靶甘蔗叶组织由商业化甘蔗杂种CP72-1210制备。从生长在田里的甘蔗收获处于活跃生长期的包含从顶部第一个2-3个节的茎秆顶部部分。去除所有完全展开的叶片直到第一个肉眼可见的芽点（dewlap）暴露出来，将甘蔗茎尖（sugarcanetop）用10%漂白水消毒20min。将第一个节上的最外面2-3层绿叶鞘去除，将接下来的1-2层叶鞘去掉中央叶脉（mid rib）后切成10mm×20mm大小的片。将制备好的组织切片正面朝下放在MS固体培养基上在暗处培养3天。之后将每个组织切片都转移到一块新的MS培养基上，并用于以按照使用手册（Bio-rad）制备的包裹着DNA的1.1μm钨粒的粒子轰击。

对于粒子轰击，500μg包裹500ng DNA的钨粒被放置在微载体滤膜上，然后，该滤膜被装在喷嘴的顶端，喷嘴在真空室中释放110psi的氦气。MS培养基上的每个靶组织都放在真空室中微载体滤膜顶端下方7cm。DNA包裹的钨粒以110psi在26英寸汞柱的压强轰击到靶组织上。轰击之后，将靶组织在暗处保持2天。在带EYFP或者GFP滤光片的荧光显微镜下研究EYFP的表达。结果在表11和图11A-11F中示出。

表11.转基因甘蔗叶中的EYFP表达

在以SCBV21-EYPF-Nos（未改造）、SCBV21Δnt1-nt1010-EYFP-Nos（缺失C）和SCBV21Δnt1-nt1104-EYFP-Nos（缺失D）轰击的组织中观察到黄色荧光蛋白（YFP），分别如图11A、图11C和图11D所示；在以SCBV21Δnt1014-nt1837-EYFP-Nos（缺失B）、SCBV21Δnt1-nt1010Δnt1732-nt1837-EYFP-Nos（缺失E）或SCBV21Δnt1-nt1104Δnt1732-nt1837-EYFP-Nos（缺失F）轰击的组织中观察到几乎没有或没有YFP，分别如图11B、图11E和图11F所示。

实施例17：在烤烟（Nicotiana Tabacum）叶段中的瞬时表达试验

针对在烤烟中的瞬时EYFP表达试验，收集在品红盒子中生长45天的烤烟叶，并在轰击前将其正面朝下放在补充有0.1M甘露糖醇和0.2M山梨糖醇的MS培养基上在暗处放置4个小时。制备的靶组织用500μg包裹了500ng DNA的1.1μm钨粒以60psi在26英寸汞柱的压强下轰击。在将被轰击的组织在补充有0.1M甘露糖醇和0.2M山梨糖醇的MS培养基上在暗处保持约12小时之后，该靶组织被转移到MS培养基并被保持24小时。在带GFP滤光片的荧光显微镜下检查YFP的表达。结果总结在下面的表12中。

结果如表12所示。在以SCBV21-EYPF-Nos（未改造）、SCBV21Δnt1-nt1010-EYFP-Nos（缺失C）和SCBV21 Δnt 1-nt 1104-EYFP-Nos（缺失D）轰击的组织中观察到了黄色荧光蛋白（YFP）。在以SCBV21 Δnt 1014-nt 1837-EYFP-Nos（缺失B）、SCBV21Δnt1-nt1010 Δnt 1732-nt 1837-EYFP-Nos（缺失E）或SCBV21 Δnt 1-nt 1104 Δnt 1732-nt1837-EYFP-Nos（缺失F）轰击的组织中观察到几乎没有或没有YFP。这样的表达模式和实施例16中针对单子叶植物看到的是一致的。

表12.转基因烟草叶中的EYFP表达

实施例18：牛胃溶菌酶的多启动子表达

甘蔗（甘蔗属，Saccharum spp.）在基于蛋白质的治疗剂的生产方面具有高的潜力。它具有快的生长周期和有效率的碳固定途径，产出大量生物质，并提供廉价的生物药生产前景。本实施例阐释开发甘蔗作为一重组表达系统，该重组表达系统用于具有广谱抗微生物活性、在食品、化妆品和农业中有潜在应用的哺乳类动物的酶（牛胃溶菌酶）的生产。通过调节转录、转录产物的稳定性以及翻译可以使这个哺乳类动物的基因的表达在甘蔗中被增加。表达载体使用合成基因生成，所述合成基因经密码子优化使其在植株单子叶植物系统中得以表达（例如SEQ ID NO：38）。单启动子和多启动子系统被用于驱动表达。感染甘蔗的病毒的5’和3’非翻译区与基因的编码区融合以增强翻译。两种商业化甘蔗品种的胚性愈伤组织和叶卷被用于以生物弹射的方式转化，并使用草胺膦乙酰转移酶（phosphinothricin acetyl transferase BAR）基因作为筛选标记。在稳定转化的甘蔗植株中的免疫印迹分析以及酶活性检测显示存在完整的牛胃溶菌酶，在由单启动子载体表达该牛胃溶菌酶的植株茎秆中，所述牛胃溶菌酶以多达0.33mg/kg的水平积累，在由三个不同启动子在各自的载体中共表达BvLz基因的转基因的茎秆中，所述牛胃溶菌酶以多达6.0mg/kg的水平积累。每个载体对其他载体并没有不利的影响，如由拷贝数、稳态的mRNA水平以及有功能酶的存在所示。这些结果提示通过叠加的启动子活性导致转录协同效应并且转录协同效应提高基因表达。一11个月时间段的生长周期的研究显示，随着时间的推移，转基因株系中酶的积累的实质性增加。这项研究提示在转基因甘蔗中生产稳定的重组酶并开发甘蔗成为高价值蛋白质的生物工厂的商业上可行性。

实施例19：牛胃溶菌酶的单启动子表达

A.甘蔗单启动子BvLz转基因株系生长周期的研究：针对7个月、9个月和11个月时间段监测转基因株系BvLz活性

根据本实施例生成若干甘蔗BvLz转基因株系。这些株系代表：（1）在强组成型玉米泛素1启动子（不具有热激元件（pMUbi））的控制下，被转基因以BvLzm（maize BvLz，玉米BvLz）的36个株系的74棵植株，（2）被转基因以pMUbi BvLzm和P1HcPro的4个株系的18棵植株，所述P1HcPro为本实验室分离出的基因沉默的抑制子（美国专利号7,001,739）。一共选出15个BvLz转基因株系用于进一步的BvLz活性水平的特征化。

为了研究甘蔗中BvLz随时间的积累，对选出的15个BvLz转基因株系进行了11个月温室生长周期研究，并分别在7个月、9个月和11个月收获。针对三次收获所收获的茎秆破碎后冷冻运输至Texas A&M University的BioSeparations Laboratory（College Station）。针对三次不同收获从15个BvLz转基因株系中通过手工压榨的方法提取汁液，并通过标准浊度试验评估BvLz。调整提取液至pH4.0，离心澄清，通过SP-Sepharose阳离子交换柱得到BvLz浓缩液。在浓缩后的提取液中测试BvLz的活性。

表13列出了针对在7个月、9个月和11个月收获的15个BvLz甘蔗转基因株系BvLz活性（每kg收获的甘蔗茎（cane）/茎秆中BvLz的mg数）。（在200mL来自7个月收获的茎秆提取液以及650-700mL（1kg甘蔗茎/茎秆）来自11个月收获的茎秆提取液中检测BvLz活性）。总的来说，针对这15个转基因株系，在11个月收获时BvLz的产量有实质性的提高。15个株系中的9个显示其BvLz活性水平的两倍提高。在7个月收获的茎秆中发现较低水平的BvLz活性。

进行额外的实验以评估从当前的BvLz转基因株系中BvLz提取和纯化的效率。这些实验包括如下：

1.进行了在所述柱的流穿组分中的BvLz的Western分析，没有观察到BvLz的可察觉量。

2.还进行了在15个BvLz转基因株系的切碎的茎秆的BvLz的Western分析。BvLz活性的数据与通过Western分析探测得的茎秆中BvLz的水平有非常好的相关性。

用多克隆抗BvLz抗体借助Western印记对来自叶和茎秆中的总可溶蛋白质（叶40μg，茎秆2-5μg）进行分析。分析来自11个月收获的1kg甘蔗茎/茎秆（650-700mL提取液）的BvLz活性。还测定了三个不同时期、相同生理年龄（完全伸展的第二叶阶段）的叶中的转基因植株的BvLz表达水平。Western分析显示在7个月、9个月和11个月收获的叶的BvLz水平没有差别。而且，转基因植株叶的BvLz水平与同时收获的茎秆的BvLz水平的关联性非常好。

表13.通过BvLz活性水平对甘蔗单启动子BvLz转基因株系进行分类

B.甘蔗单启动子BvLz转基因株系的农艺性状表现

为了评估甘蔗BvLz表达株系是否会招致任何生长障碍，在三个月的时间段里每两周对叶和茎秆的高度以及分蘖的数目进行测量。

甘蔗BvLz转基因株系的农艺性状表现的差异独立于BvLz的积累之外。对BvLz转基因株系而言，在叶高度、茎秆高度以及分蘖的数目方面没有可观察到的障碍。BvLz高表达株系（例如EM116和EM123）的生长模式并未受到影响。

然而，在一些BvLz高表达株系（例如EM116、EM123、EM112、EM114和EM96）中，萌发仅在种下第一周受影响。一些BvLz中等表达的株系（例如EM108、EM38和EM33）以及BvLz低表达株系（例如EM35）在第一周甚至不萌发。除了两个高表达株系EM112和114以及低表达株系EM35（图3D）以外，BvLz转基因株系被注意到在种下第二周期间萌发情况有所好转。但是，所有BvLz表达株系在种下后的第三周期间都能够完全萌发（数据未列出）。

为了探查甘蔗BvLz转基因株系的光合作用是否受到限制，通过Western印迹分析了叶中三种关键的光合作用酶，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶（Rubisco，大亚基/RbcL）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）的水平。用多克隆抗RbcL、抗PEPC或抗PPDK抗体对来自叶提取物总可溶蛋白质（40μg）进行分析。扫描western印迹并记录RbcL、PPDK和PPDK条带的净强度。

三种主要光合作用酶的水平并没有受到转基因株系BvLz表达水平的影响。高、中和低BvLz表达株系表现良好的RbcL、PEPC和PPDK水平，该水平与未转化植株的水平具有可比性。在大多数BvLz转基因株系中，RbcL、PEPC和PPDK扫描条带的净强度都是高的。每种光合作用酶的强度水平都与不同株系的BvLz表达水平具有非常好的相关性。

实施例20：牛胃溶菌酶的多启动子表达

在植物细胞中特定异源基因/转基因的表达以及接下来其蛋白质的生产受到几个因素的影响。这些因素包括：

（1）转录的因素，例如转基因的拷贝数以及启动子的活性。无论是组成型、组织特异性（在甘蔗的情形中即茎特异性）或是诱导型启动子，对特定的生长和发育阶段或是在特殊的组织中，在控制异源蛋白质的生产方面都起着至关重要的作用。在甘蔗中组成型表达的两个启动子pSPRP和pSEF1α是在我们的实验室中被分离出来的；这两个启动子来自于一甘蔗富含脯氨酸蛋白（SPRP）和一延伸因子1α（SEF1α）。两个茎表达和应激诱导的启动子，pJAS和pOMT，也被分离出来；这两个启动子分别来自于甘蔗受茉莉酸酯诱导的蛋白（或引导蛋白）（JAS）和o-甲基转移酶（OMT）。pSPRP、pSEF1α和pJAS，作为单独的或者三个启动子的组合，与来自玉米泛素1的强组成型启动子pUbi（不具有热激元件）（pMUbi）一起用于驱动BvLz基因的表达。

（2）转录后的因素，例如mRNA的剪接、mRNA的稳定性以及翻译。

a.用于翻译增强作用的非翻译区域，例如感染单子叶植物的病毒的5’和3’非翻译区域（UTR）被融合进了BvLz基因。这些区域包括高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus,SrMV）的5’和3’UTRs。

b.转录后基因沉默（PTGS）的抑制子与BvLz遗传构建体一起用于共转化。这些抑制子包括从高粱花叶病毒中分离出来的Pl/HC-Pro蛋白，和从柑橘速衰病病毒（Citrustristeza virus）中分离出来的CTV P23蛋白。

（3）翻译和翻译后的因素，例如密码子的使用、蛋白质稳定性、修饰、运输（trafficking）以及最终区室化作用（compartmentalization）。

A.新遗传构建体的组装

使用不同的组成型和茎调控/诱导型启动子的组合来驱动BvLzm基因（按照玉米密码子使用合成的BvLz）或者BvLzsc基因（按照对甘蔗特异性的密码子使用合成的BvLz）的表达，组装几个遗传构建体。SrMV的非翻译区域也被融合进了BvLz基因以增强翻译。基因沉默的抑制子也和BvLz基因一起引入甘蔗来减低其沉默。

B.甘蔗的转化

生物弹射转化：以生物弹射的方式将新的遗传构建体引入甘蔗（经由微粒弹射轰击的直接基因转移）。尽管用物理手段（即，微粒弹射轰击）将DNA引入细胞的方法已经使作物植株的基因转化领域革命化，但在稳定性、整合性以及引入基因的表达上可能会被看到有相当大的变数。

土壤杆菌属（Agrobacterium）介导的转化：这种转化类型利用农杆菌的特性，将一离散的DNA段递送进受体基因组。在我们实验室中，用一包含了玉米泛素1组成型启动子控制下的BvLz基因的二元载体引发甘蔗农杆菌属介导的转化。

用于转化的靶植物组织：在我们常规的转化实验中正在被使用的是甘蔗的愈伤组织和叶卷。和当前的转化愈伤组织的方法相比，转化叶卷后直接进行胚再生以生产转基因植株的方法已经被证明有所改进。经由愈伤组织培养物的植株再生是耗时耗力的，并且增加了体细胞无性系变异（somaclonal variation）的机会。

甘蔗品种：商业化甘蔗品种，CP72-1210，以及其他的一些商业化品种，例如TCP87-3388、TCP89-3505和TCP99-4454正被用于以新的BvLz构建体的转化。形成超过3000个新株系，并筛选表达水平比实施例19中表达量最高的株系还要高的株系。表14总结了用于新的甘蔗转化的新的BvLz构建体。

表14.用于甘蔗生物弹射转化的BvLz构建体

在所形成并被针对其BvLz表达水平进行过分析的BvLz转基因植株中，23个株系显示与实施例19中表达量最高的株系还要好的表达水平。这些植株包括pSPU（16棵植株），pSPnU（1棵植株）和pSPJ（6棵植株）的植株，这些植株是BvLz在三启动子控制下的转基因植株（在同一株植物中，三个启动子每个都驱动了单个转基因（BvLz）各自拷贝的表达）。

pSPU指的是针对BvLz基因、其表达受三个组成型启动子驱动的转基因植株，所述三个组成型启动子是：pSEF1α（针对蔗糖延伸因子1α的启动子）、pSPRP（针对蔗糖富脯氨酸蛋白的启动子）和pMUbi（针对玉米泛素1的启动子）。植株用三个遗传构建体转化：pSEF1α BvLzm SrMV 3’、pSPRP BvLzm SrMV 3’和pMUbi 5’SrMV BvLzsc SrMV 3’。BvLzm指的是合成的BvLz基因，该基因具有针对玉米优化的密码子，而BvLzsc指的是合成的BvLz基因，该基因具有针对甘蔗优化的密码子。5’和3’SrMV指的是高粱花叶病毒的5’和3’非翻译区域（UTR）（参见表14）。

pSPnU指的是针对BvLz基因、其表达受三个组成型启动子驱动的转基因植株，所述三个组成型启动子是：pSEF1α、没有5’UTR的pSPRP和pMUbi。植株用三个遗传构建体转化：pSEF1αBvLzm SrMV3’、pPRP（无5’UTR）5’SrMV BvLzsc SrMV3’和pUbi BvLzmSrMV3’（参见表14）。

pSPJ指的是针对BvLz基因、其表达受两个组成型启动子，pSEF1α和pPRP，以及一个茎调控启动子pJAS（茉莉酸酯诱导蛋白或引导蛋白的启动子）驱动的转基因植株。植株用三个遗传构建体转化：pSEF1α BvLzm SrMV 3、pSPRP BvLzm SrMV 3’和pJAS BvLzmSrMV3’（参见表14）。

在新形成的pSPU和pSPJ植株中，基因组DNA凝胶印迹分析被用来确定BvLz转基因的拷贝数以及整合事件。在这些植株的基因组中检测到了多个条带，体现BvLz转基因插入有多个拷贝。DNA凝胶印迹分析鉴定了总共5个独立的pSPU株系的16棵植株，1个独立的pSPnU的1棵植株以及2个独立的pSPJ株系的6棵植株。

首先，通过western印迹分析来评价所形成的pSPU和pSPJ植株在叶中的BvLz表达。使用多克隆抗-BvLz抗体来分析来自26棵转基因甘蔗植株的叶的总可溶蛋白质（40μg）。大部分植株显示比单启动子BvLz植株高的BvLz的表达水平。

通过Western分析，在pSPU和pSPJ植株的叶中检测到的BvLz表达水平得到在茎秆中BvLz酶活性的支持（表15）。在0.105到0.345kg的约7个月大的茎秆做了BvLz活性的试验。pSPU32E,pPSU19A和pSPJ10A植株在其茎秆中累积了最高量的BvLz水平。总的来说，新形成的BvLz转基因株系在其BvLz表达水平方面显示高于实施例19株系的提高。在新的株系中BvLz表达水平通过使用三启动子驱动BvLz表达来提高。

表15.甘蔗茎秆中的BvLz表达

总而言之，在本实施例中表达量最高的株系每千克鲜重具有4.7mg的BvLz，较之于实施例19中的单启动子高表达株系，每千克茎秆只具有0.33mg的BvLz。

实施例21：牛胃溶菌酶的表达：pJSUBvLzm植株

pJSU三元BvLzm植株：针对BvLzm、其表达在三个启动子控制下被驱动的植株（在同一株植物中用三个启动子驱动BvLz表达）。使用两个组成型启动子，pSEFlα（针对甘蔗延伸因子1α基因的启动子）和pMUbi（针对玉米泛素1基因的启动子），以及一个茎调控启动子pJAS（针对编码茉莉酸酯诱导蛋白的基因的启动子）。

用以下三个遗传构建体以生物弹射的方式（经由微弹射体轰击的直接基因转移）转化甘蔗品种TCP98-4454的叶卷：

pJAS BvLzm/

pSEF1αBvLzm SrMV3’/

pMUbi(no hse)BvLzm SrMV3’

得到的植株通过Western印迹分析对BvLz表达做试验来确定表达，并通过Southern分析来估计构建体的拷贝数。观察到了最少6次独立事件。

首先，对新形成的pJSU植株的BvLz水平在甘蔗叶中作出估计。使用多克隆抗-BvLz抗体对来自26棵转基因甘蔗植株的叶总可溶蛋白质（40μg）进行分析。使用实施例20形成的一棵植株pSPU32E作为阳性对照。该植株是高表达BvLz植株，其中，BvLzm基因在三个组成型启动子pSEF1α、pSPRP和pMUbi的控制之下。在所有被检测的pJSU的叶中，观察到强的BvLz表达。

还通过ELISA对新形成的pJSU植株BvLz积累水平在茎秆中进行了确定。表16显示了17棵植株的BvLz的活性，所述BvLz的活性是在7-8个月生长阶段时作出的分析。

表16.通过ELISA确定的在一些代表性的甘蔗pJSU BvLz转基因株系的茎秆中的BvLz表达

^a实施例20中形成的pSPU32C植株被用作正对照。pSPU32C是一棵高表达BvLz的植株，其中，BvLzm是在三种组成型启动子（pSEF1α、pSPRP和pUbi）的控制之下的。

在新形成的pJSU植株中，Southern印迹分析被用来确定BvLz转基因的拷贝数以及整合事件。用HindIII对20棵BvLz转基因植株的基因组DNA（15μg）进行消化，然后与全长BvLz cDNA杂交。在这些植株的基因组中检测到了多条BvLz转基因条带，体现插入了多个BvLz拷贝。带型模式揭示了四种独立的转化事件的存在。事件1由植株23、27、30和42代表，事件2由植株22代表，事件3由植株24、25、26、28、52、53和54代表，事件4由植株29代表。

总共分析了35棵pJSU Bvlz高表达植株，在被分析的植株中，所检测得到的最高BvLz活性水平是6.0mg BvLz/kg茎秆（约1%TSP），较之于从pSPU32C（实施例20中描述的参考BvLz植株）得到的平均值2.4mg/kg。因此，BvLz活性有2.5倍提高。

实施例22：牛胃溶菌酶表达的诱导性

防御诱导/应激调控的激素对增强甘蔗三启动子Pjsu BvLz的表达株系的BvLz水平的效果被评估。具体地，植株被喷涂（或离体培养来自茎杆顶部的叶卷）以应激调控激素茉莉酸（JA）和水杨酸（SA），所述茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）是已知能诱导pUbi和pJAS启动子，所述pUbi和pJAS启动子在存在三启动子BvLz甘蔗株系中驱动BvLz表达。从处理过的植株叶（或离体培养较高的叶卷）提取总可溶蛋白质，并通过Western分析和酶法试验来检测其BvLz水平。

将来自pJSU BvLz53和66的植株的叶卷在补充以SA（5mM）或JA（25mM）的MS（Murashige and Skoog）介质中培养0、24和40小时。从每种处理提取总可溶蛋白质并且确定每种处理的BvLZ表达和活性水平。三启动子pJSU BvLz表达株系的BvLz活性水平受到应激调控激素SA和JA的诱导。BvLz活性在40小时（对于pJSU53为2.4倍，对于pJSU66为2.0倍）被SA最大程度地诱导，在24小时（对于pJSU53为1.5倍，对于pJSU66为2.7倍）和40小时（对于pJSU53为2.6倍，对于pJSU66为3.9倍）被JA最大程度地诱导。

氮施肥对于增强合作用率并且从而增强存在三启动子的pJSU和pSPU最高BvLz表达株系的生物量的效果也被评估。对于具有提高的蛋白质含量的高质量农作物的生产，氮（N）是施肥程序的主要组分。三启动子BvLz表达植株从播种（seed setts）起始直至成熟，并且在6个月时间里，以低氮水平（每植株1.43g的Peters溶液20-20-20；每周两次）和高氮水平（每植株2.38g的Peters溶液20-20-20肥料；每周两次）被施肥。施肥后2个月和6个月时收集BvLz植株的茎杆，将其切碎，由生物分离实验室（BioSeparation Laboratory）确定所述茎秆的总BvLz产量。

被施肥的三启动子BvLz表达植株的光合作用活性也通过测量叶绿素荧光而被确定，所述测量叶绿素荧光检测光系统II的光化学效率以及叶的绿度。在施肥后，三启动子BvLz表达植株对必需大量营养元素的吸收也被确定（表17）。

氮施肥对于提高甘蔗三启动子BvLz表达株系的生物量以及BvLz产量是重要的。例如，对于pSPU 32C株系（品种CP-72-1210），与低施肥量相比，具有高施肥量的茎秆生物量和BvLz产量在2个月和6个月生长阶段分别有6.3倍和2.3倍的提高。此外，与低施肥量相比，高施肥量的pJSU19株系（品种TCP98-4454）的茎秆生物量和BvLz产量在2个月和6个月生长阶段分别有7.5倍和2.0倍的提高。

通过施肥，三启动子BvLz表达植株的叶绿素荧光被增强。与低施肥量相比，高施肥量的这些植株的叶绿素荧光的增加倍数在1.1-1.5倍的范围内。

表17.三启动子BvLz植株对氮/大量营养元素的吸收

如表1所示，与低氮施肥量（LF）相比，伴随高氮施肥量（HF）的三启动子BvLz表达株系的叶对于氮、磷和镁有更高的吸收。显然，为提高甘蔗杆和BvLz的产量，氮的吸收以及磷和镁的吸收都是必要的，因为所有这三种元素之间是互相关联的。

实施例23：牛胃溶菌酶的多启动子表达

四启动子驱动的BvLz表达：分别由四个不同的启动子（四启动子体系）驱动的BvLz的遗传构建体以生物弹射的方式被引入数个甘蔗品种的每个（表18）。已经检测数个幼苗来确认BvLz的活性。

表18.用于甘蔗四启动子植物的BvLz构建体

在本工作中，由四种遗传构建体以生物弹射的方式转化外植体（叶卷或愈伤组织），所述遗传构建体的每个包含由不同的启动子驱动的牛溶菌酶（BvLz）基因。

驱动基因表达的启动子：pSEF1α是从甘蔗延伸因子1α基因分离的组成型启动子，pPRP是从编码甘蔗富含脯氨酸的蛋白质的基因分离的组成型启动子，pSCBV是从甘蔗杆状病毒分离的茎部表达的启动子，pJAS是从甘蔗茉莉酸酯诱导/引导基因分离的茎部表达的启动子，而pMUbi是常用于单子叶植物的组成型启动子，并且衍生自玉米泛素1基因。

所表达的基因：BvLzm指的是合成的BvLz，该BvLz具有对玉米优化的密码子，而BvLzsc指的是合成的BvLz，该BvLz具有对甘蔗优化的密码子。

转录终止子：35ST指的是源自花椰菜花叶病毒的35S RNA的35S终止子。NOST指的是源自胭脂碱合酶基因（来自农杆菌Ti质粒）的NOS终止子。所述NOST是转录终止子。35ST NOST指的是由35ST和NOST组成的双重终止子。最近的研究已经证明将35STNOST双重终止子融合在转基因的3’端可以对减少基因沉默和增强转基因表达具有显著效果。

翻译增强子：5’和3’SrMv指的是高粱花叶病毒蛋白的5’和3’非翻译区（UTR）。所述5’和3’SrMv可以被用来增强翻译。

用于植株转化的筛选标记：BAR指的是bar基因，所述bar基因是用于植株转化的最常使用的筛选标记。该基因编码草铵膦乙酰转移酶，所述草胺膦乙酰转移酶能够使双丙氨膦（Bialaphos）或草胺膦酸（phophinothricin）脱毒，所述草胺膦酸是除草剂（例如Basta和Finale）中的活性成分。BAR基因活性的筛选可以通过对植物喷涂除草剂来容易地并且低成本地达到。NPTII指的是NPTII基因，所述NPTII基因是最广泛使用的用于植物转化的筛选标记之一。其编码新霉素磷酸转移酶（或氨基糖苷3’-磷酸转移酶），所述新霉素磷酸转移酶通过磷酸化作用使一系列氨基糖苷抗生素（例如遗传霉素）失活。

pJSU指的是被针对BvLz基因、其表达受两个组成型启动子（pSEF1α和pMUbi）以及茎调控的启动子pJAS驱动的转基因甘蔗植株。以三个遗传构建体转化植株，所述遗传构建体为：pJAS BvLzm、pSEF1αBvLzm SrMV3’和pMUbi BvLzm SrMV3’。

实施例24：牛胃溶菌酶的多启动子表达

数个BvLz的遗传构建体被以生物弹射的方式引入甜高粱和谷高粱（grain sorghum）中（表19）。已经检测数个幼苗来确认BvLz的活性。

表19.用于高粱四启动子植物的BvLz构建体

PMI指的是大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因（由Getu Beyene分离，用于本工作的高粱转化）。PMI是用于植物转化的多用途的可选择的标记。其在高粱转化中非常有效。

实施例25：从转基因植株中收获蛋白质

通过纯化所表达的转基因蛋白质来评价实施例的表达体系（三启动子的植株）作为生物工厂的潜力。实验方案调整自美国申请号2007/0130655。首先，在中试规模的Squire碾压机中不加浸泡的水将所述转基因甘蔗切碎和压碎一次，而后，加20%重量的水切碎和压碎两次以上。基本上，甘蔗茎杆被压碎，然后通过Squire碾压机上的三个辊以每平方英寸3000磅的压力按压。这产生约70%水，15%蔗糖以及10%纤维的混合物。剩余5%混合物由蛋白质和其他糖类、盐和有机分子组成。随后，含有高价值蛋白质（BvLz）的汁液被泵入纯化滑轨（skid）并通过一组震动（自清洁）筛并进入槽。该步骤移除了纤维。第一筛是150微米，而第二筛为100微米。调节汁液的pH至5.2并补充以1mM EDTA和0.1%的亚硫酸钠以防止氧化和酚类物质（phenolics）的形成。汁液自所述槽渗透通过0.2微米的交叉流滤膜。该步骤移除除所有不溶固体和高分子量的可溶性固体，例如细菌、淀粉和葡聚糖。包含糖和高价值蛋白质的渗过物进入第二槽，并且在第一槽中的滞留物被丢弃。汁液自第二槽渗透通过0.05微米的膜。该步骤移除分子量高于150,000kd的可溶性分子。具有分子量大于150,000kd的高价值蛋白质被留在第二槽中，并且可以通过下面所描述的HPLC（高压液相色谱）步骤被进一步纯化。包含糖和小于150,000W的高价值蛋白质（本实施例中为BvLz）的第二渗过物进入第三槽，并且第二槽中的滞留物被丢弃。此时，我们得到了相对纯净的样品，所有高分子量的材料（即，细菌、淀粉、葡聚糖和高分子量的蛋白质）从所述样品中被移除。

样品自第三槽在3kDa的膜上被浓缩（约30倍），并且随后通过两个循环的高压液相色谱（HPLC）被进一步纯化。第一循环使用SP

离子交换树脂，同时第二循环使用疏水交互树脂（hydrophobic interaction resin）。初步运行所生产蛋白质。

我们已经鉴定流出膜的低分子量的物质可以被用来在第三槽中浓缩样品。水、糖类和其他小分子将流动通过膜，但高价值蛋白质将在第三槽中被浓缩。

这将大大提高HPLC步骤性能。使用不同的初始提取条件（不同的离子交换树脂/膜、亲和性树脂（affinity resin）和HPLC柱）的进一步改进可以被用来增强性能。第一次运行和第二次运行的结果分别在表21和表22中示出。

表21.从转基因植株分离的BvLz

*代表被装载在SP柱上的一部分滤液

**冷冻干燥前通过活性以及280nm处的光密度移除硫酸铵后获得

表22.从三启动子驱动的BvLz转基因植株中提取的BvLz

因此，从约500磅三启动子植株中收获多达14mg99%纯度的BvLz是可能的。

实施例26：牛胃溶菌酶的多启动子表达

如在表23和表24中所示出的，具有一个或更多个启动子的额外构建体被制备并且被用于转化甘蔗品种。

表23.具有一个或更多个启动子的转基因BvLz植株

表24.具有一个或更多个启动子的转基因BvLz植株

表25.用于实施例的DNA构建体

ProMUbi(nohse):BvLz(m)35ST	SEQ ID NO:39
		ProMUbi(nohse):BvLz(m)3’SrMV35ST	SEQ ID NO:40
ProMUbi(nohse):5’SrMv BvLz(sc)3’SrMV35ST	SEQ ID NO:41
		ProMUbi(nohse):BvLz(m)35ST NOST	SEQ ID NO:42
ProSPRP:BvLz(m)3’SrMV35ST	SEQ ID NO:43
		ProSPRP(no5’UTR):5’SrMv BvLz(sc)3’SrMV35ST	SEQ ID NO:44
ProSPRP:BvLz(m)35ST NOST	SEQ ID NO:45
		ProSEF1:BvLz(m)3’SrMV35ST	SEQ ID NO:46
ProSEF1:BvLz(m)35ST NOST	SEQ ID NO:47
		ProJAS:BvLz(m)35ST	SEQ ID NO:48
ProJAS:BvLz(m)3’SrMV35ST	SEQ ID NO:49
		ProSCBV21:BvLz(m)35ST NOST	SEQ ID NO:50

BvLz(m)：具有针对玉米优化的密码子的合成牛溶菌酶基因。

BvLz(sc)：具有针对甘蔗优化的密码子的合成牛溶菌酶基因。

Pro_MUbi(nohse)：不具有热激元件的玉米泛素1启动子。所述泛素1启动子是常用于单子叶植物的组成型启动子。

Pro_{MUbi(nohse)(no5’UTR)}：不具有热激元件和5’非翻译区（UTR）的玉米泛素1启动子。

Pro_SPRP：从编码甘蔗富含脯氨酸的蛋白质的基因中分离的启动子。该启动子是组成型启动子。

Pro_{SPRP(no5’UTR)}：不具有5’UTR的甘蔗富含脯氨酸的蛋白质启动子。

Pro_SEF1a：从编码甘蔗延伸因子1a蛋白质实验室的基因分离的启动子。该启动子是组成型启动子。

Pro_JAS：从编码甘蔗茉莉酸酯诱导蛋白的基因分离的启动子。该启动子是在茎部表达的应激诱导启动子。

Pro_SCBV21：从甘蔗杆状病毒分离的启动子。

5’和3’SrMV指的是高粱花叶病毒蛋白的5’和3’非翻译区（UTRs）。所述5’和3’SrMV是用于增强翻译。

35ST：衍生自花椰菜花叶病毒的35S RNA的35S终止子。该终止子是转录终止子。

NOST：衍生自农杆菌Ti质粒的胭脂氨酸合酶基因的NOS终止子。该终止子是转录终止子。

35ST NOST：包含35ST和NOST的双终止子。最近公布的研究已经证明将35ST NOST双终止子融合在转基因的3’端将对于减少基因沉默和增强转基因表达有显著效果。

Claims (55)

1.一种分离的核酸，所述核酸包括表达控制序列，所述表达控制序列具有选自由SEQID NO：1、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及其组合的核苷酸1-1786组成的组的序列；其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有启动子活性。

2.根据权利要求1的分离的核酸，其中所述表达控制序列在至少两种单子叶植物和至少两种双子叶植物中具有启动子活性。

3.一种分离的核酸，所述分离的核酸包括（a）表达控制序列，所述表达控制序列具有选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及其组合的核苷酸1-1786组成的组的序列；和（b）外源核酸，其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中可操作来驱动外源核酸的转录。

4.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中所述外源核酸包括转基因。

5.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中当被表达或被转录时，所述外源核酸改变所述植物细胞中的碳代谢。

6.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中所述外源核酸编码有效抵御至少一种茎钻蛀昆虫的杀虫剂。

7.一种表达载体，在5’至3’方向上，所述表达载体包括：具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的甘蔗杆状病毒（SCBV）启动子；外源核酸；以及3’终止序列，其中所述SCBV启动子在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有足以表达所述外源核酸的启动子活性。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述外源核酸包括转基因。

9.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述表达载体位于细菌细胞中。

10.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述表达载体位于植物细胞中。

11.根据权利要求7所述的表达载体，其中-3至+4位置的核苷酸序列是AAAATGG。

12.根据权利要求7所述的表达载体，还包括表达控制序列的3’、所述外源核酸的5’接头，并且具有从约1至约200核苷酸的长度。

13.一种包括表达载体的细菌细胞，所述表达载体具有：SCBV启动子，所述SCBV启动子具有选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及其组合的核苷酸1-1786组成的组的序列；

外源核酸；以及

3’终止序列，其中所述SCBV启动子在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有足以表达所述外源核酸的启动子活性。

14.一种包括表达载体的植物细胞，所述表达载体具有：

启动子，所述启动子具有选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及其组合的核苷酸1-1786组成的组的序列；

可操作地连接于所述启动子的外源核酸；以及

3’终止序列，其中所述启动子在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有足以表达所述外源核酸的启动子活性。

15.根据权利要求14所述的植物细胞，其中所述外源核酸包括转基因。

16.根据权利要求14所述的植物细胞，其中当被表达或被转录时，所述外源核酸改变所述植物细胞中的碳代谢。

17.根据权利要求14所述的植物细胞，其中所述外源核酸编码有效抵御至少一种茎钻蛀昆虫的杀虫剂。

18.根据权利要求14所述的植物细胞，其中所述植物细胞位于植物中。

19.根据权利要求18所述的植物细胞，其中所述植物是单子叶植物。

20.根据权利要求18所述的植物细胞，其中所述植物选自由甘蔗、芒草、芒草与甘蔗杂种、柳枝稷、燕麦、小麦、大麦、玉米、稻米、香蕉、丝兰、洋葱、芦笋、高粱及其杂种组成的组。

21.根据权利要求18所述的植物细胞，其中所述植物是双子叶植物。

22.根据权利要求18所述的植物细胞，其中所述植物选自由咖啡、番茄、胡椒、烟草、利马豆、拟南芥、橡胶、橙、葡萄柚、马铃薯、葡萄柚、马铃薯、南瓜、豌豆以及甜菜组成的组。

23.一种包括表达载体的植物，所述表达载体具有：

启动子，所述启动子具有选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO：32、SEQ ID NO：33及其组合的核苷酸1-1786组成的组的序列；

可操作地连接于所述启动子的外源核酸；以及

3’终止序列，其中所述启动子在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有足以表达所述外源核酸的启动子活性。

24.根据权利要求23所述的植物，其中当被表达或被转录时，所述外源核酸改变所述植物细胞中的碳代谢。

25.根据权利要求23所述的植物，其中所述外源核酸编码有效抵御至少一种茎钻蛀昆虫的杀虫剂。

26.根据权利要求23所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。

27.根据权利要求23所述的植物，其中所述植物选自由甘蔗、芒草、芒草与甘蔗杂种、柳枝稷、燕麦、小麦、大麦、玉米、稻米、香蕉、丝兰、洋葱、芦笋、高粱及其杂种组成的组。

28.根据权利要求23所述的植物，其中所述植物是双子叶植物。

29.根据权利要求23所述的植物，其中所述植物选自由咖啡、番茄、胡椒、烟草、利马豆、拟南芥、橡胶、橙、葡萄柚、马铃薯、葡萄柚、马铃薯、南瓜、豌豆以及甜菜组成的组。

30.一种在植物中组成型地表达外源核酸的方法，所述方法包括：

用所述植物的细胞的细胞质接触表达盒或表达载体，

其中所述表达盒或表达载体包括（i）所述外源核酸，（ii）SCBV启动子，所述SCBV启动子包括选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO：32、SEQID NO：33及其组合的核苷酸1-1786组成的组的序列，并且可操作来驱动所述外源核酸的表达，以及（iii）可操作地连接于所述外源核酸的3’终止序列，并且

其中所述植物选自由单子叶植物和双子叶植物组成的组。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述接触的步骤还包括用包括表达盒的颗粒以生物弹射的方式轰击所述细胞。

32.根据权利要求28所述的方法，其中所述接触的步骤还包括将所述细胞与包括所述表达盒的土壤杆菌属细胞共培养。

33.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

34.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物选自由甘蔗、芒草、芒草与甘蔗杂种、柳枝稷、燕麦、小麦、大麦、玉米、稻米、香蕉、丝兰、洋葱、芦笋、高粱及其杂种组成的组。

35.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。

36.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物选自由咖啡、番茄、胡椒、烟草、利马豆、拟南芥、橡胶、橙、葡萄柚、马铃薯、葡萄柚、马铃薯、南瓜、豌豆以及甜菜组成的组。

37.一种在植物中介导组成型表达核酸的方法，所述方法包括：

用表达核酸转化所述植物，所述表达核酸包括启动子，所述启动子具有选自由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及其组合的核苷酸1-1786组成的组的序列，外源核酸，以及3’终止序列，

其中所述植物选自由单子叶植物和双子叶植物组成的组。

38.根据权利要求37所述的方法，所述表达核酸包括表达载体。

39.根据权利要求37所述的方法，其中转化的步骤还包括用包括所述表达盒的颗粒以生物弹射的方式轰击所述植物。

40.根据权利要求37所述的方法，其中转化的步骤还包括将所述植物与包括所述表达盒的土壤杆菌属细胞共培养。

41.根据权利要求37所述的方法，还包括转化胚性愈伤组织。

42.根据权利要求37所述的方法，还包括从胚性愈伤组织再生植物。

43.根据权利要求37所述的方法，还包括转化植物细胞。

44.根据权利要求43所述的方法，还包括培育所述转化的植物的后代。

45.根据权利要求37所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

46.根据权利要求37所述的方法，其中所述植物选自由甘蔗、芒草、芒草与甘蔗杂种、柳枝稷、燕麦、小麦、大麦、玉米、稻米、香蕉、丝兰、洋葱、芦笋、高粱及其杂种组成的组。

47.根据权利要求37所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。

48.根据权利要求37所述的方法，其中所述植物选自由咖啡、番茄、胡椒、烟草、利马豆、拟南芥、橡胶、橙、葡萄柚、马铃薯、葡萄柚、马铃薯、南瓜、豌豆以及甜菜组成的组。

49.一种包括表达控制序列的分离的核酸，所述表达控制序列具有SEQ ID NO：33的核苷酸632-716的序列；其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有启动子活性。

50.根据权利要求49所述的分离的核酸，其中所述表达控制序列是至少约0.75kb。

51.一种包括表达控制序列的分离的核酸，所述表达控制序列具有选自由SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及其组合组成的组的序列；其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有启动子活性。

52.一种分离的核酸，在5’至3’方向上，所述分离的核酸包括：

包括SEQ ID NO:30序列和SEQ ID NO:31序列的表达控制序列，所述SEQ ID NO:30序列和SEQ ID NO:31序列由约630个核苷酸的间隔区分隔；

从约1至约75个核苷酸长度的接头；以及

起始密码子，

其中所述表达控制序列在至少一种单子叶植物和至少一种双子叶植物中具有启动子活性。

53.根据权利要求52所述的分离的核酸，其中所述接头具有与SEQ ID NO:32的核苷酸778-805的序列至少约85%的一致性。

54.根据权利要求53所述的分离的核酸，其中所述间隔区具有与SEQ ID NO:32的核苷酸96-726的序列至少约85%的一致性。

55.根据权利要求54所述的分离的核酸，其中所述表达控制序列在其5’端包括具有与SEQ ID NO:32的核苷酸1-44的序列至少约85%的一致性的序列。

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