CN103403170A - 植物中的蛋白质表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物中的蛋白质表达，尤其在完整普通烟草植株中大规模生产重组多肽。普通烟草品种和农杆菌属菌株的预选定组合的使用，任选地包括对本发明瞬时表达方法的一种或多种改善，使经济地并在短时间内生产大量异源多肽成为可能。

Description

植物中的蛋白质表达
本发明涉及植物中的蛋白质表达。具体而言，本发明涉及在完整烟草植株中大规模生产重组多肽的方法。
已经使用烟草作为研究异源蛋白在植物中表达的宿主植物。已经描述了使用本生烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达各种异源蛋白，不过，尽管作为试验模型可用于实验室中，这个物种产生较少生物质并且对于短时间内制造大量重组蛋白的平台的工业化不可操作。已经开发在植物和植物细胞中的瞬时基因表达主要作为展示少量生产给定蛋白质和用于测试遗传构建体的快速手段。将蛋白质编码序列导入植物或植物细胞的方法包括例如粒子枪递送、真空浸润、农杆菌介导的传递和聚乙二醇递送裸DNA至植物原生质体中。
稳定转化已经对许多不同植物物种展示，如例如蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、欧洲油菜(Brassica napus)、莴苣(Lactuca sativa)、玉蜀黍(Zea mays)、稻(Oryza sativa)和烟草物种，包括普通烟草(Nicotiana tabacum)。认为普通烟草(N.tabacum)是林烟草(Nicotiana sylvestris)、茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)和可能地耳状烟草(Nicotiana otophora)的杂交种。它仅以栽培存在，并且众多变体和栽培品种在许多不同的气候区域和地理区域中商业培育。在普通烟草变体和栽培品种之间存在充分认识的形态学变异、农艺性能和化学差异。然而，仅可获得关于普通烟草变体及栽培品种的物理特征和遗传多样性之间关系的有限信息。关于这类变体和栽培品种每一种用于生产重组蛋白的适应性甚至知之甚少。用于生产重组蛋白的当前商业大规模动物细胞培养物在已经各自被广泛表征的仅数个宿主细胞系上建立。相比之下，尚未形成针对源自烟草变体、育种系和栽培品种的植物细胞和针对完整植株的这种信息。
虽然已经建立通常用于生产重组蛋白的普通烟草的稳定转化，但是外来基因在普通烟草植物细胞中的瞬时表达仅在几个例子中展示。这些在普通烟草(Nicotiana tabacum)中的瞬时表达研究限于浸润幼龄切下叶或叶盘普通烟草栽培品种Petit Havana内部所包含的植物细胞(Rodriguez等人,Biotechnol.Bioeng.,2004,89:188-194；Potula等人,Transgenic Res.,2008,17:19-32)或通过使用1ml注射器就在表皮表面下方手工注入完整叶的远轴面气腔来注射仍与植物连接的叶。这些实验均没有公开基于完整普通烟草植物的用于大规模生产重组蛋白的技术上稳健和有商业意义的系统。
Conely等人(Plant Biotehnol J,20101-11)的一项最近对比分析表明，瞬时表达水平在测试的不同烟草属(Nicotiana)品种的小样本之间显著变动，并且在给定品种的瞬时表达和稳定表达的产量之间不存在相关性。这项研究下强调如下观念：对于重组蛋白的瞬时表达，在普通烟草品种和栽培品种之间存在巨大的产量不可预测性。Conely等人报道的瞬时表达分析在叶上实施，所述叶以实验室规模用农杆菌悬液直接注射。不了解瞬时表达方法的可能影响产量的许多其他方面，尤其当放大该方法时，如浸润方法学、表达构建体设计和本体生长/农艺条件。
鉴于已经将植物表达系统视为动物细胞培养的有前景替代物用于大规模生产重组蛋白，存在开发商业上可行的基于植物的生产平台的迫切需要，其中研究并优化了在工业规模下重要的变量。
这种未满足的需求由本发明通过提供如独立权利要求特征定义的方法来处理并解决。优选实施方案是从属权利要求的主题。本发明提供了使用预选定和相容的普通烟草品种与农杆菌菌株组合，通过瞬时表达法大规模生产异源多肽的方法。下文描述的结果出乎意料地显示，在测试的许多普通烟草品种之间，高水平异源多肽积累和低蛋白酶活性之间不存在相关性-一个已经由其他人指出作为重要因素的特征。因此，不考虑本发明中提供的许多普通烟草品种作为生产异源蛋白的宿主。本发明也提供对该方法的各种改善，所述改善进一步增强异源多肽的总产量，如使用最小尺寸双元载体、宿主植物中存在病毒基因沉默阻抑因子、浸润完整植株和特定本体生长条件和实践。普通烟草品种和农杆菌菌的预选定组合的使用，任选地包括对本发明瞬时表达方法的一种或多种改善，使经济地并在短时间(相对于转基因植物所要求的时间)内生产大量异源多肽成为可能。
本发明涉及一种用于普通烟草中产生蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的方法，所述方法包括步骤：
(i)提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株注射后5日显示出少于10%坏死、少于5%坏死、少于2%坏死、少于1%坏死；
(ii)用OD600为0.1和4.0之间的农杆菌属物种选定菌株的悬液浸润普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株，所述菌株包含在植物中可操作的调节序列控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列；
(iii)将浸润的植株在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下温育5日至20日之间、尤其7日至15日之间，但是特别8日至10日之间的时期。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于在普通烟草中产生蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的方法，所述方法包括步骤：
(i)提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株注射后5日显示出少于10%坏死、少于5%坏死、少于2%坏死、少于1%坏死；
(ii)用OD600为0.1和4.0之间的农杆菌属物种选定菌株浸润普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株，所述菌株包含在植物中可操作的调节序列控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列；
(iii)将浸润的植物在允许该核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下温育5日至20日之间、尤其7日至15日之间、但是特别8日至10日之间的时期；
条件是，当可表达核苷酸序列编码绿色荧光蛋白时，绿色荧光蛋白的积累是浸润的植株或植物细胞的可溶性总蛋白的至少1%；或该多肽的积累处于这样的水平，所述水平是在包含相同的可表达核苷酸序列的选定农杆菌菌株如步骤ii)和步骤iii)中所述使用时在本生烟草中可获得的水平的至少25%。
因此，优选在根据本发明和如本文在任一个前述实施方案中定义的方法中使用时，普通烟草品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种菌株的选定组合是这样的组合，当可表达核苷酸序列编码绿色荧光蛋白时，所述组合在根据本发明使用时导致绿色荧光蛋白积累到浸润的植株的可溶性总蛋白的至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%或至少20%。
还优选在如本文在任一个前述实施方案中定义的本发明方法中，普通烟草品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种菌株的选定组合，导致异源蛋白积累到这样的水平，所述水平是当应用相同的可表达核苷酸序列和相同的条件时本生烟草中可获得的水平的至少25%、至少50%、至少75%或与之相等，或是该水平的至少110%、至少125%、至少150%、至少200%、至少250%、至少300%、至少400%或至少500%。异源蛋白的积累可以按异源蛋白单位质量(如克)/单位质量(如kg)叶鲜重(FW)，即g/kgFW表述。
在备选实施方案中，本发明涉及一种用于在普通烟草中产生蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的方法，所述方法包括步骤：
(i)提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株注射后5日显示出少于10%坏死、少于5%坏死、少于2%坏死、少于1%坏死；
(ii)用OD600为0.1和4.0之间的农杆菌属物种选定菌株浸润普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株，所述菌株包含在植物中可操作的调节序列控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列；
(iii)将浸润的植株在允许该核苷酸序列在浸润的植株中表达和重组蛋白积累的条件下温育5日至20日之间、尤其7日至15日之间、但是特别8日至10日之间的时期；
条件是根据步骤ii)的浸润不用如2010年7月16日提交的EP专利申请10169888.4中描述并要求保护的方法实施，尤其不用以下方法实施，所述方法包括：
(i)使完整植株或植物部分与流体中的农杆菌细胞接触，其中所述农杆菌细胞包含编码异源肽或蛋白质的可表达构建体；
(ii)用一个或多个压力循环处理完整植株或植物部分和农杆菌细胞，因而所述农杆菌细胞浸润完整植株或植物部分，并且
其中至少一个所述压力循环包括相对于大气压增加压力。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中农杆菌细胞包含双元载体，尤其最小尺寸双元载体，所述双元载体包含对大肠杆菌(Escherichia coli)及农杆菌(Agrobacterium)细胞中维持和复制质粒以及对转移T-DNA至烟草植物细胞必需的序列元件，并且还包含T-DNA区域，所述T-DNA区域包含在普通烟草植物中有功能的调节元件控制下的肽或蛋白质编码序列，以及任选地包含植物选择标记基因，其中必需序列元件的比例占到完整最小尺寸双元载体的至少60%、65%、70%、75%、80%。
在一个具体实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中使用最小双元载体，其包含以下核酸元件、由其组成或基本上由其组成：
a)包含编码选择标记的核苷酸序列的第一核酸元件，所述选择标记在大肠杆菌和农杆菌属物种中有功能；
b)包含第一复制起点的核苷酸序列的第二核酸元件，所述第一复制起点在大肠杆菌中有功能；
c)包含编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第三核酸元件；
d)包含第二复制起点的核苷酸序列的第四核酸元件，所述第二复制起点与第一复制起点不同并且在农杆菌中有功能；和
e)包含T-DNA区域的核苷酸序列的第五核酸元件，所述T-DNA区域包含瘤诱导型根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)质粒或根诱生性发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)质粒的T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列；
其中将上述核酸元件在环状多核苷酸分子上提供并且由不在复制、维持或核酸转移中发挥作用的间隔（gap）核苷酸序列分隔，并且其中所述间隔核苷酸序列占据少于20%、25%、30%、35%、40%、45%的载体总尺寸。优选地，间隔核苷酸序列占据少于20%的载体总尺寸。
在本发明的一个实施方案中，本发明方法中使用的载体分子具有小于5,900bp、尤其小于5,500bp、尤其小于5,200bp、尤其小于5,100bp，但是特别5139bp的总尺寸。
在一个实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中所述最小双元载体基于宽宿主范围质粒pRK2。
在一个实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中所述最小双元载体具有与如SEQ ID NO:1中所述的多核苷酸序列相同至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%但是尤其100%的多核苷酸序列并且其中核酸元件(a)至(e)显示与SEQID NO:1中提供的对应元件相同的功能性。
在一个具体实施方案中，最小尺寸的双元载体具有如SEQ ID NO:1中所显示的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中将编码该多肽的可表达核苷酸序列克隆在最小尺寸的双元载体中，所述双元载体包含对大肠杆菌及农杆菌细胞中维持和复制质粒以及对转移T-DNA至烟草植物细胞必需的序列元件以及任选地植物选择标记基因，其中必需序列元件的比例占到不含编码多肽的可表达核苷酸序列的完整最小尺寸双元载体的至少70%核苷酸。
在一个实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中当编码异源多肽的核苷酸序列表达时，基因沉默阻抑因子在普通烟草植物的所述选定品种、育种系或栽培品种中瞬时表达。
在一个实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中基因沉默阻抑因子是马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)。
在一个实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中基因沉默阻抑因子由包含SEQ ID NO:5中所述核苷酸序列的核酸分子编码。
在一个实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中基因沉默阻抑因子，尤其马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)，尤其SEQ ID NO:5的马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)，位于第一双元载体上并且异源多肽位于第二双元载体上。
在一个实施方案中，本发明涉及如任一个前述实施方案中定义的本发明方法，其中将第一双元载体在第一农杆菌菌株中提供并且将第二载体在第二农杆菌菌株中提供，并且其中在步骤(ii)中，包含第一双元载体的第一农杆菌菌株的细胞对包含第二双元载体的第二农杆菌菌株的细胞的比率处于3:1至1.6:1范围内，所述第一双元载体包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述第二双元载体包含编码基因沉默阻抑因子、尤其马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)、尤其SEQ ID NO:5的马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及前述实施方案中任一项的方法，其中在植物中可操作的控制异源多肽表达的调节序列包含启动子，尤其如下文公开的启动子之一，但是尤其是HT-CPMV启动子，尤其HT-CPMV启动子本身或与如SEQ ID NO:2中所示的最小35S CaMV启动子组合的HT-CPMV启动子。
在另一个实施方案中，本发明涉及前述实施方案中任一项的方法，其中在植物中可操作的控制异源多肽表达的调节序列包含启动子，尤其如下文公开的启动子之一，但是尤其是FLt启动子或其功能性片段，其中所述FLt启动子是MMV、FMV或PCISV的FLt启动子，尤其如SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14中提供的FLt启动子。
在一个具体实施方案中，本发明涉及一种用于在普通烟草产生异源多肽的方法，其包括步骤：
(i)提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株注射后5日显示出少于10%的坏死；
(ii)用OD600为0.1至4.0之间的农杆菌属物种选定菌株的悬液浸润普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株，所述菌株包含马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)、尤其SEQ ID NO:5的马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)和编码该多肽的可表达核苷酸序列，并且任选地，施加一个或多个压力循环，其中至少一个所述压力循环包括相对于大气压增加压力。
(iii)将浸润的植物在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下温育5日至10日之间的时间。
在另一个具体实施方案中，本发明涉及一种用于普通烟草产生异源多肽的方法，其包括步骤：
(i)提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株注射后5日显示出少于10%的坏死；
(ii)用OD600为0.1和4.0之间的农杆菌属物种选定菌株的悬液浸润普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株，所述菌株包含马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)、尤其SEQ ID NO:5的马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)和在FLt启动子或其功能性片段的控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列，其中所述FLt启动子是MMV、FMV或PCISV的FLt启动子，尤其是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中提供的FLt启动子；并且任选地，施加一个或多个压力循环，其中至少一个所述压力循环包括相对于大气压增加压力，
(iii)将浸润的植物在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下温育5日至10日之间的时间。
任选地，调节序列包括5'非翻译前导序列、多聚腺苷化信号、或一个或多个增强子，或前者的组合。本发明进一步构思如本领域技术人员已知的和如下文公开的其他调节序列，包括基因沉默阻抑因子。
因此，在又一个实施方案中，本发明涉及前述实施方案中任一项的方法，其中包含编码该蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的可表达核苷酸序列的双元载体还包含与烟草植物中可操作的调节元件有效连接的基因沉默阻抑因子编码序列。
在一个实施方案中，本发明涉及前述实施方案的方法，其中普通烟草植物的所述选定品种，育种系或栽培品种包含基因沉默阻抑因子，尤其病毒来源的基因沉默阻抑因子，和尤其选自黄瓜坏死性病毒(CNV)p19蛋白、稻黄斑驳病毒(RYMV)p1蛋白、马铃薯病毒X(PVX)p25蛋白、非洲木薯花叶病毒(ACMV)的AC2蛋白、黄瓜花叶病毒(CMV)2b蛋白和马铃薯Y病毒辅助组分蛋白酶(HcPro)的基因沉默阻抑因子。
在又一个实施方案中，本发明涉及前述实施方案中任一项的方法，其中所述方法包括用含双元载体的农杆菌细胞的第二悬液浸润所述选定品种、育种系或栽培品种，所述双元载体包含基因沉默阻抑因子的编码序列。农杆菌细胞的第二悬液可以任选地是与选定农杆菌菌株相同的菌株。农杆菌细胞的第一悬液和第二悬液可以按任何顺序或同时浸润。农杆菌细胞的第一悬液和第二悬液可以在用来浸润烟草植物之前混合。任选地，农杆菌细胞的第一悬液和第二悬液以来自每种悬液的细胞数目的限定比率混合。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中在用于浸润普通烟草品种、育种系或栽培品种的步骤(ii)中以0.1至1.0、尤其0.3至0.9、尤其0.5至0.8和尤其0.15至0.35范围内的细胞密度(OD600)使用农杆菌细胞悬液。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中步骤i)中提供的选定普通烟草品种、育种系或栽培品种是选自以下的普通烟草品种、育种系或栽培品种：普通烟草登录号NCIMB PM016、PM021、PM92、PM102、PM132、PM204、PM205、PM215、PM216或PM217，或DAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX2A、Coker319、Hicks、McNair944(MN944)、Burley21、K149、Yaka JB125/3、KasturiMawar、NC297、Coker371Gold、PO2、
Figure BDA0000369555190000101
Simmaba、TurkishSamsun、AA37-1、B13P、来自杂交BU21x Hoja Parado的F4、品系97、Samsun NN、Izmir、Xanthi NN、Karabalgar、Denizli和PO1。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中步骤i)中提供的选定普通烟草植物品种、育种系或栽培品种是以下任何普通烟草品系之一：PM016，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41798保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司（NCIMB Ltd，根据布达佩斯条约的国际保藏机构，位于FergusonBuilding，Craibstone Estate，Bucksburn，阿伯丁，AB219YA，英国)；PM021，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41799保藏于NCIMB Ltd.；PM092，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41800保藏于NCIMB Ltd.；PM102，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41801保藏于NCIMB Ltd.；PM132，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41802保藏于NCIMB Ltd.；PM204，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41803保藏于NCIMB Ltd.；PM205，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41804保藏于NCIMB Ltd.；PM215，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41805保藏于NCIMB Ltd.；PM216，以登录号NCIMB41806保藏；和PM217，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41807保藏于NCIMB Ltd.。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中步骤i)中提供的选定农杆菌菌株是选自AGL1、EHA105、GV2260、GV3101和Chry5的根癌农杆菌菌株。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中步骤i)中提供的选定农杆菌菌株是农杆菌菌株AGL1或EHA105。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中步骤i)中提供的选定普通烟草品种、育种系、或栽培品种和选定农杆菌菌株的组合是选自以下的组合：普通烟草品系PM132与根癌农杆菌菌株AGL1以及普通烟草品系PM132与根癌农杆菌菌株EHA105。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中步骤i)中提供的选定普通烟草品种、育种系、或栽培品种和选定根癌农杆菌菌株的组合是选自以下的组合：普通烟草品系PM132与根癌农杆菌菌株AGL1以及普通烟草品系PM204与根癌农杆菌菌株AGL1。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述根癌农杆菌菌株还包含马铃薯Y病毒辅助组分蛋白酶(HcPro)的可表达核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于在植物、尤其烟草属植物、尤其普通烟草植物中产生蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的方法，所述方法包括步骤：
用在植物中可操作的调节序列控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列，尤其用OD600为0.1和4.0之间的农杆菌属物种选定菌株的悬液浸润普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株、尤其烟草属植株、尤其普通烟草植株，所述菌株包含在植物中可操作的调节序列控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列；
(iii)将浸润的植株在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下温育，尤其5日至20日之间、尤其7日至15日之间、但是特别8日至10日之间的时期。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中，在浸润之前，将植物暴露于光，从而气孔导度处于70μmolm-2s-1和600μmol m-2s-1之间、尤其100μmol m-2s-1和500μmol m-2s-1之间、尤其200μmol m-2s-1和300μmol m-2s-1之间、尤其250μmol m-2s-1和450μmol m-2s-1之间的范围内。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述浸润步骤包括使所述植物的主要部分(包括植物叶和/或植物花和/或植物茎和/或植物根，但是尤其整个植株)在原位暴露于低于大气压的压力或真空。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述浸润步骤包括使所述植物的主要部分(包括植物叶和/或植物花和/或植物茎和/或植物根，但是尤其整个植株)在原位暴露于高于大气压的压力。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中步骤iii)包括在日光条件下温育植物每日7至9小时，优选地每日8小时。这种方法特别可用于改善异源蛋白的瞬时表达水平。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中步骤iii)包含将所述浸润的植株以直立（up-right）位置或备选地以倒转的位置温育。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述异源多肽是流感血凝素或其免疫原性片段。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述方法还包括将以完整的浸润植株以倒转的位置温育或在日光条件下温育每日7至9小时，或这两者。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，所述方法还包括(a)在浸润之前，将完整植株、尤其烟草属的完整植株、尤其选定普通烟草品种、育种系或栽培品种的烟草植株以每平方米至少100个植株的密度、尤其以每平方米200和600个植株之间的密度、尤其以每平方米400和550个植株之间的密度培育，或(b)在浸润后，将浸润的完整植株以每平方米至少100个植株的密度，尤其以每平方米200和600个植株之间的密度、尤其以每平方米400和550个植株之间的密度温育，或(c)在浸润之前，将完整植株、尤其烟草属的完整植株、尤其选定普通烟草品种、育种系或栽培品种的烟草植株以每平方米至少100个植株的密度、尤其以每平方米200和600个植株之间的密度、尤其以每平方米400和550个植株之间的密度培育，并且在浸润后，将浸润的完整植株以每平方米至少100个植株的密度，尤其以每平方米200和600个植株之间的密度、尤其以每平方米400和550个植株之间的密度温育。
在一个具体实施方案中，根据前述实施方案中任一项的方法包括(a)在浸润之前，将完整植株、尤其烟草属的完整植株、尤其选定普通烟草品种、育种系或栽培品种的烟草植株以每平方米至少100个植株的密度、尤其以每平方米200和600个植株之间的密度、尤其以每平方米400和550个植株之间的密度培育，并且(b)当所述植株已经达到30cm和50cm之间、尤其35cm和45cm之间的高度时，将它们浸润。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中浸润的植株、尤其浸润的烟草属植株、尤其农杆菌浸润的烟草植株用包含一种或多种降解或消化植物细胞壁以辅助异源蛋白提取和纯化的酶的水质酶溶液浸润。具体而言，酶溶液包含一种或多种酶，其选自纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和多聚半乳糖醛酸酶。可以使用的纤维素酶包括葡聚糖内切酶(E.C.3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(也称作葡聚糖外切酶，E.C.3.2.1.91)、或β-葡糖苷酶(还称作纤维二糖酶，E.C.3.2.1.21)。用酶浸润后，可以将植物温育范围从至少1、2、5、10、12、18至24小时的一段时间。
在又一个实施方案中，本发明提供了包含流感血凝素5多肽(H5)、尤其如SEQ ID NO:8中所示的流感血凝素5多肽(H5)的组合物，其中所述流感血凝素5多肽通过根据前述实施方案中任一项的方法，在植物、尤其烟草属植物、尤其选定普通烟草品种、育种系或栽培品种的烟草植物中产生。
在又一个实施方案中，本发明提供在完整植株、尤其烟草属完整植株、尤其根据前述实施方案中任一项的选定普通烟草品种、育种系或栽培品种的完整烟草植株中产生异源多肽的体系；在植物中可操作的调节序列控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列；尤其悬液，其包含根据前述实施方案中任一项的农杆菌属物种的菌株的细胞，所述细胞包含在植物中可操作的调节序列控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列；用于浸润完整植株、尤其用农杆菌细胞浸润的手段，和任选地，用于温育浸润植株的温室，所述温室适应于支持(a)以倒转位置温育浸润的植株，同时每日从上方光照7至9小时，(b)每平方米至少75个植株的密度培育或温育完整植株，或(c)前两者。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述异源多肽是生长因子、受体、配体、信号传导分子；激酶、酶、激素、瘤抑制因子、凝血蛋白、细胞周期蛋白、代谢蛋白、神经元蛋白、心肌蛋白、特定疾病状态中缺乏的蛋白质、抗体、抗原、提供疾病抗性的蛋白质、用于人类遗传疾病替代疗法的蛋白质、抗微生物蛋白、干扰素和细胞因子。例子包括但不限于病毒抗原，如流感血凝素。
在本发明的另一个方面，提供了用于温育浸润的植株的一般方法，所述浸润的植株包含编码多肽、尤其异源多肽的可表达核苷酸序列，所述方法包括以倒转的位置温育植株。这种方法特别可用于改善异源蛋白的瞬时表达水平。优选地，以倒转的位置温育的植株是用农杆菌细胞的悬液浸润的完整植株，所述农杆菌细胞包含编码多肽、尤其异源多肽的可表达核苷酸序列。在另一个实施方案中，以倒转位置温育的植物是转基因植物。在某些实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述温育步骤包括以倒转的位置温育浸润的植株。还提供一种温室，其适应于支持以倒转位置温育浸润植株持续任何时间长度，其中倒转的浸润植株从上方光照。
在本发明的又一个方面，提供了用于温育浸润植株的一般方法，所述浸润的植株包含编码多肽、尤其异源多肽的可表达核苷酸序列，所述方法包括在日光条件下温育植株每日7至9小时、优选地每日8小时。这种方法特别可用于改善异源蛋白的瞬时表达水平。优选地，浸润的植株是用农杆菌细胞的悬液浸润的完整植株，所述农杆菌细胞包含编码多肽、尤其异源多肽的可表达核苷酸序列。优选地，在工厂中温育的植物每日处于光照下7至9小时每日，优选地每日8小时。在某些实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述温育步骤包括以倒转的位置温育浸润的植株。
在本发明的又一个方面，提供在限定区域内温育多个浸润植株的一般方法，其中每单位面积的浸润植株数目高于用于培育转基因植物的平均数。该方法包括温育每平方米至少25至500个浸润的植株，或每平方米至少50、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400个浸润的植株。优选地，该植株是用农杆菌细胞的悬液浸润的完整植株，所述农杆菌细胞包含编码多肽、尤其异源多肽的可表达核苷酸序列。该方法特别可用于降低产生异源多肽的成本。还提供一种温室，其适应于温育每平方米至少25至500个浸润的植株，或每平方米至少100个浸润的植株。在某些实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述温育步骤包括在限定区域内温育浸润的植株连同其他的浸润植株，其中浸润的植株在该区域内的密度是每平方米至少25至500个浸润的植株，或每平方米至少100个浸润的植株。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株注射后5日显示出少于10%的坏死。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的组合物，其包含普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株与OD600为0.1和4.0之间的农杆菌属物种选定菌株的组合，所述菌株包含在植物中可操作的调节序列控制下编码多肽的可表达核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述组合物中的农杆菌细胞具有至少2.1、至少2.4、至少2.7、至少3.0、至少3.3、至少3.6、至少3.8、至少3.9、至少4.0的细胞密度(OD600)。
在一个实施方案中，所述组合物中的普通烟草品种、育种系或栽培品种选自普通烟草登录号PO2、AS44、Wislica、Simmaba、PM132、PM092、PM016、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX2A、Coker319、Hicks、McNair944(MN944)、Burley21、K149、YakaJB125/3、PM102、NC297、PM021、AA37-1、B13P、来自杂交BU21xHoja Parado的F4、品系97、Samsun、PO1、PM204、PM205、PM215、PM216和PM217。
在一个实施方案中，所述组合物中的普通烟草品种、育种系或栽培品种选自以下任何普通烟草品系：PM016，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41798保藏于NCIMB Ltd(根据布达佩斯条约的国际保藏机构，位于Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，阿伯丁，AB219YA，英国)；PM021，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41799保藏于NCIMB Ltd.；PM092，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41800保藏于NCIMB Ltd.；PM102，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41801保藏于NCIMB Ltd.；PM132，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41802保藏于NCIMBLtd.；PM204，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41803保藏于NCIMB Ltd.；PM205，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41804保藏于NCIMB Ltd.；PM215，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41805保藏于NCIMB Ltd.；PM216，其种子以登录号NCIMB41806保藏；和PM217，其种子在2011年1月6日以登录号NCIMB41807保藏于NCIMB Ltd.。
在一个实施方案中，在前述组合物的任一者中的选定农杆菌菌株是选自AGL1、EHA105、GV2260、GV3101和Chry5的根癌农杆菌菌株。
在一个实施方案中，在前述组合物的任一者中的选定农杆菌菌株是农杆菌菌株AGL1或EHA105。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含普通烟草品系PM132与根癌农杆菌菌株AGL1或普通烟草品系PM132与根癌农杆菌菌株EHA105的组合。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含普通烟草品系PM132与根癌农杆菌菌株AGL1或普通烟草品系PM204与根癌农杆菌菌株AGL1的组合。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的组合物根，其中所述农杆菌菌株还包含马铃薯Y病毒辅助组分蛋白酶(HcPro)的可表达核苷酸序列。
定义
通常向本申请范围内所用的技术与科学术语和表述给予在植物生物学的相关领域中常适用于它们的含义。本文中参考本领域技术人员已知的各种方法学。将描述加以参考的这类方法学的出版物和其他材料如同完整阐述那样，通过引用的方式完整并入本文。除非另外说明，否则本发明的实施将使用本领域技术人员能力范围内的化学、分子生物学、微生物学、基因工程和植物生物学的常规技术。
可以在实施本发明中使用本领域技术人员已知的任何适合材料和/或方法；然而，描述优选的材料和/或方法。除非另外指出，在以下描述和实施例中加以参考的材料、试剂等是从商业来源可获得的。
以下全部术语定义均适用于本申请的完整内容。词“包含”不排除其他要素或步骤，并且不定冠词“一个”或“一种”不排除复数。单个步骤可以满足权利要求书中所提到的几个特征的功能。与某属性或值相联系的情况下，术语“基本上”、“约”、“大约”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语“约”指处于给定值或范围的20%以内、10%以内或5%以内的值或范围。
如本发明范围内所用，术语“植物”指处于其生活周期或发育的任何阶段的任何植物及其子代。
如本文所用，“植物部分”或“植物的部分”意指植物的任何部分，即植物中或处于培养的植物器官、植物组织、植物细胞、胚、叶等。在本发明的涉及在高压或低压或其组合下接种植物的某些实施方案中，这个术语指植物中的植物部分。
如本发明范围内所用的“烟草植物”指属于烟草属的物种的植物，包括但不限于普通烟草(Nicotiana.tabacum或N.tabacum)。在此使用术语“烟草植物”描述本发明的某些实施方案，而不特指普通烟草，此类描述意在解读为已经具体地包括普通烟草。
如本发明范围内所用的术语“植物细胞”或“烟草植物细胞”指植物、尤其烟草植物的结构及生理单元。植物细胞可以处于以下形式：无细胞壁的原生质体、分离的单个细胞或培养的细胞、或作为高级组织化单元(如但不限于植物组织、植物器官或完整植物)的部分。
如本发明范围内所用的“植物材料”指任何固体、液体或气态组合物或其组合，其从植物，包括叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、配子、种子、插枝、分泌物、提取物、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产物可获得。
如本文所用的“植物组织”意指组织成结构单元或功能单元的一组植物细胞。包括植物中或处于培养的植物的任何组织。该术语包括，但不限于完整植株、植物器官和种子。
如本文所用的“植物器官”涉及植物的不同或分化部分，如根、茎、叶、花芽或胚。
术语“光密度”或“OD”涉及在给定波长(例如600nm=OD600)在分光光度计中测量的光学元件吸光度的光学测定。
术语“多核苷酸”在本文中用来指核苷酸聚合物，其可以是未修饰或修饰的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。因此，多核苷酸可以是，而不限于基因组DNA、互补性DNA(cDNA)、mRNA或反义RNA。另外，多核苷酸可以是单链或双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、包含DNA和RNA的杂合分子或存在单链区和双链区混合的杂合分子。此外，多核苷酸可以由包含DNA、RNA或这两者的三链区组成。一种多核苷酸可以含有一个或多个修饰的碱基，如硫代磷酸酯，并且可以是肽核酸(PNA)。通常，由本发明提供的多核苷酸可以从分离或克隆的cDNA片段、基因组DNA片段、寡核苷酸片段或独立核苷酸片段或前述组合中装配出来。
如本文所用的术语“基因序列”指编码蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽或活性RNA的核酸分子或多核苷酸的核苷酸序列，并且包括仅编码异源蛋白片段的部分编码序列的核苷酸序列。基因序列也可以包括对相对于编码序列位于上游或下游的基因的表达具有调节功能的序列以及基因的内含子序列。
术语“转录调节性核苷酸序列”或“调节序列”分别指影响结合(或功能性连接)的待转录核苷酸序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。转录调节性核苷酸序列可以相对于待转录的核苷酸序列具有各种定位转录调节性核苷酸序列可以位于待转录序列(例如，编码序列)的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)。转录调节性核苷酸序列可以选自包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子、5'-非翻译序列、3'-非翻译序列和多聚腺苷化信号序列的组。它们包括天然和合成性序列以及可以作为合成序列和天然序列组合的序列。
术语“启动子”指在基因5'末端处指导基因转录起始的核苷酸序列。通常，启动子序列是必需的，但是并不总是足以驱动与之有效连接的基因表达。在可表达的基因构建体的设计中，将基因置于与启动子足够靠近并且相对于它处于合适取向，从而该基因的表达受启动子序列控制。将启动子偏好地置于基因上游并且与转录起始位点相距一段距离，所述距离接近于该启动子和它在其天然背景下控制的基因之间的距离。如本领域已知的，可以耐受这个距离的某些变化而不丧失启动子功能。如本文所用，术语“有效连接”意指启动子与编码区以如此方式连接，从而这个编码区的转录受此启动子控制和调节。用于使启动子与编码区有效连接的方式是本领域熟知的。
在本发明情景下使用的术语“基因沉默阻抑因子”指病毒编码的蛋白质，所述蛋白质允许某些病毒规避因结合至沉默性RNA所致的转录后基因沉默。当导入植物细胞时，转基因也可能触发转录后基因沉默，因此确立这类基因低表达或不表达。
如本文所用的术语“蛋白质”、“多肽”、“肽”或“肽片段”是可互换的并且定义成意指由肽键连接的两个或更多个氨基酸所组成的生物分子，所述生物分子可以折叠成二级、三级或四级结构以实现特定形态。
如本文所用的术语“异源”指在细胞或生物中特定多核苷酸或多肽背景下不天然存在的生物序列。如本文所用的术语“重组蛋白”或“异源蛋白”或“异源多肽”互换地指由细胞产生但是不天然存在于这种细胞中的蛋白质或多肽。例如，在植物细胞或完整植株中产生的重组或异源蛋白可以是哺乳动物蛋白或人蛋白。
可以在修饰的植物细胞中表达的异源蛋白可以是抗原(其可以用于疫苗中，而不限于此)，包括但不限于病原体的蛋白质、病毒蛋白、细菌蛋白、原虫蛋白、线虫蛋白；酶，包括但不限于酶(其可以用于治疗人类疾病或用于工业用途，而不限于此)；细胞因子；细胞因子受体的片段；血液蛋白质；激素；激素受体的片段、脂蛋白；抗体或抗体片段。
术语“抗体”指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体（camelised antibodies）、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体(VH、VHH、VLA)、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)和上述任一者的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段(即，含有抗原结合位点的分子)。免疫球蛋白分子可以属于任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“可表达的”在本发明的语境下指基因与调节元件有效连接，所述调节元件指导由叶内所包含的植物细胞中的基因编码的蛋白质或多肽表达。
如本文所用的术语“坏死”和“坏死反应”可互换地涉及在植物、尤其烟草植物的组织中的超敏反应，所述超敏反应例如因例如用农杆菌菌株接种植物组织而触发。当注射的叶组织已经塌陷并且细胞死亡时，观察到坏死(见Klement和Goodman,Annual Review ofPhytopathology5(1967)17-44)。本领域普通技术人员可区分坏死与黄化，所述黄化是一种其中不存在叶组织塌陷并且不存在广泛细胞死亡的情况。
如本文所用，“T-DNA边界”指一种DNA片段，所述DNA片段包含约25个核苷酸长度的能够被农杆菌菌株(如根癌农杆菌或发根农杆菌菌株)的毒力基因产物识别的序列或其修饰或突变形式，并且足以将与之连接的DNA序列转移至真核细胞、优选地植物细胞。该定义包括，但不限于，来自野生型Ti质粒的全部天然存在的T-DNA边界以及其任何功能衍生物，并且包括化学合成的T-DNA边界。在一个方面，本发明的表达构建体的编码序列和表达控制序列位于两个T-DNA边界之间。
如本文所用，术语“真空浸润”涉及允许病原菌(农杆菌)渗入胞间隙或间质隙中的方法。在物理上，真空产生导致植物组织中细胞之间气腔缩减的负大气压。持续期越长并且压力越低，则植物组织内部存在的气腔越少。压力的后续增加允许浸润中所用的细菌悬液迁移至植物组织中，并且造成农杆菌细胞接触植物组织内部的植物细胞。
如本文所用，“瞬时表达水平”指每kg植物组织质量表达至少约250微克、至少约500微克、至少约750微克、至少约1mg、至少约2mg、至少约3mg、至少约4mg、至少约5mg、至少约10mg、至少约15mg、至少约25mg、至少约50mg、至少约75mg、至少约100mg、至少约150mg、至少约200mg、至少约500mg、至少约1000mg、至少约1.5g、至少约2g、至少约2.5g、至少约5g、至少约7.5g、至少约10g、至少约15g或至少约20g的能力。
如本文所用，“瞬时”指长到足以允许从合适的植物组织分离蛋白质的一段时间。优选地，蛋白质表达在表达构建体导入植物组织后至少约1日、至少约2日、至少约3日、至少约4日、至少约5日、至少约6日、至少约7日、至少约8日、至少约9日、至少约10日、至少约11日、至少约12日、至少约13日、至少约14日，或至少约15日内处于适当高的水平。在一个方面，在表达构建体导入植物组织后3-7或5-10日内和更优选地在3-5或5-7日内获得适当高的水平。
本发明为基于瞬时表达的基于普通烟草品种和农杆菌菌株的预选定组合的已知方法提供几种改善，所述改善使经济地并在短时间(相对于转基因植物所要求的时间)内生产大量异源蛋白成为可能。
具体而言，本发明提供一种用于普通烟草中产生蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的方法，所述方法包括步骤：
(i)提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株注射后5日内显示出少于10%的坏死；
(ii)用OD600为0.1和4.0之间的农杆菌属物种选定菌株的悬液浸润普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株，所述菌株包含在植物中可操作的调节序列控制下编码该多肽的可表达核苷酸序列；
(iii)将浸润的植物在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下温育5日至10日之间的时间。
普通烟草品种
本发明提供预选定的普通烟草品种、育种系或栽培品种作为宿主植物用于通过瞬时表达产生异源多肽的方法中。特别合乎需要的是使用普通烟草品种、育种系或栽培品种之一作为待用预选定的农杆菌菌株浸润的宿主植物，目的是优化这种异源多肽的产量。普通烟草品种、育种系或栽培品种可以是选自以下的那些：普通烟草登录号PM016、PM021、PM92、PM102、PM132、PM204、PM205、PM215、PM216或PM217，或DAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma XanthiBX2A、Coker319、Hicks、McNair944(MN944)、Burley21、K149、Yaka JB125/3、Kasturi Mawar、NC297、Coker371Gold、PO2、
Figure BDA0000369555190000231
Simmaba、Turkish Samsun、AA37-1、B13P、来自杂交BU21x Hoja Parado的F4、品系97、Samsun NN、Izmir、Xanthi NN、Karabalgar、Denizli和PO1，或任何其他普通烟草品种、育种系或栽培品种，它们在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株、尤其下述段落中鉴定的农杆菌菌株、但是尤其农杆菌菌株AGL1或EHA105注射后5日显示出少于10%的坏死。在多种实施方案中，预选定普通烟草品种的植株用于本发明的浸润步骤中，所述植株具有5至7周龄，优选地从种子培育出来的6周。一般，这类普通烟草植株具有范围从40至60mm并优选地43至55mm的高度。
农杆菌属物种和菌株
本发明提供预选定的农杆菌菌株用作通过可表达序列的瞬时表达产生异源多肽的方法中。特别有利的是使用预选定的农杆菌菌株浸润预选定的普通烟草品种，目的是优化异源多肽的产量。在本发明的某些实施方案中，可以在本发明方法中使用的农杆菌属物种包括但不限于根癌农杆菌、发根农杆菌、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)、葡萄农杆菌(Argobacterium vitis)，但是尤其是根癌农杆菌和发根农杆菌。在一个实施方案中，至少一个农杆菌菌株包括根癌农杆菌。所用的农杆菌属物种可以是野生型(例如，强毒)或卸甲菌株。合适的农杆菌菌株包括野生型菌株(例如，如根癌农杆菌)或其中将一个或多个基因突变以增加转化效率的菌株，例如，其中vir基因表达和/或其诱导因存在突变体或嵌合virA或virG基因而改变的农杆菌菌株(例如Chen和Winans,1991,J.Bacteriol.173:1139-1144；和Scheeren-Groot等人,1994,J.Bacteriol.176:6418-6246)、包含额外virG基因拷贝(如源自pTiBo542，优选与多拷贝质粒连接的超级virG基因)的农杆菌菌株，如美国专利号6,483,013中所述。其他合适的菌株包括但不限于：根癌农杆菌C58C1(Van Larebeke等人,Nature252:169-170(1974))、A136(Watson等人,J.Bacteriol123:255-264(1975))；LBA4011(Klapwijk等人,J.Bacteriol141:128-136(1980))、LBA4404(Hoekema等人,Nature303:179-180(1983))；EHA101(Hood等人,J.Bac.168:1291-1301(1986))；EHA105(Hood等人,Trans Res.2:208-218(1993))；AGL1(Lazo等人,Bio/Technology2:963-967(1991))；A281(Hood等人,上文(1986))。
在本发明的各种具体实施方案中，根癌农杆菌菌株AGL1或EHA105可以用于本发明的方法中。
在本发明的某些实施方案中，分别表达不同基因的农杆菌细胞的多种悬液可以用来产生各种蛋白质或异源多聚体蛋白质或用来增强异源多肽的表达水平。在这类情况下，构思了不同农杆菌细胞悬液中的农杆菌细胞可以是相同的预选定菌株或不同的预选定菌株。备选或额外地，单一农杆菌菌株可以包含多个包含不同基因、尤其异源基因的序列。不同的基因可以包含于单一核酸分子(例如，单一载体)内部或可以在不同的载体中提供。可以在宿主植物中表达的第二基因的非限制性例子是编码病毒源沉默阻抑因子的基因。
坏死试验
本发明提供坏死试验以便预先选定作为宿主植物的普通烟草品种和作为载具用于导入编码异源多肽的可表达核苷酸序列至宿主植物细胞中的农杆菌菌株，其中这种预选定的组合高效地产生显著量的异源多肽。不受以下约束，本发明的坏死试验允许鉴定宿主植物，所述宿主植物易遭受农杆菌菌株细胞感染，并且仍抵抗农杆菌细胞对其组织的破坏，因而存活足够长的范围5至10日内的时间段，以允许感染的植物细胞中编码异源多肽的基因表达和异源多肽积累。导致明显坏死的普通烟草品种和农杆菌菌株的组合预期产生较少并积累较少异源多肽，因为感染的植物细胞早期且迅速死亡，并且任何产生的异源蛋白将在死细胞遭降解或在收获之前损失。
坏死试验包括通过用注射器注射细胞密度OD600为0.32的农杆菌细胞悬液，浸润6周龄普通烟草品种的叶。一般，浸润后马上可以见到注射部位附近正对叶脉的扇形叶区，其充满细菌悬液。标记该扇区的周长用于稍后评分。将带有浸润叶片的完整植株在正常生长条件下温育，并且浸润后5日检查叶片。坏死以浸润扇区内部植物组织塌陷和广泛细胞死亡为特征，并且可以由本领域熟知的方法评分(Klement和Goodman,Annual Review of Phytopathology5(1967)17-44)。如果浸润的叶显示少于20%、少于10%坏死、少于5%坏死、少于2%坏死、或少于1%坏死，则这种普通烟草品种和农杆菌菌株是本发明的普通烟草品种和农杆菌菌株的预选定组合。量化坏死百分比(坏死%)的方法是本领域熟知的，并且可以例如通过以下方式确定：测量出现坏死的一片或多片叶的面积和已经由农杆菌细胞浸润的一片或多片叶的总面积。
双元载体
任何双元载体可以用于本发明的方法中。在一个优选实施方案中，最小尺寸的双元载体(也称作最小双元载体)可以用于本发明的方法中。这些最小尺寸的双元载体在2011年1月17日提交的共同待决申请号EP11151187.9中公开，所述申请的公开内容完整并入本文。将它们专门设计成在浸润的烟草植物中驱动编码蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的编码序列(置于T-DNA区域内部)瞬时表达。在大部分实施方案中，可以在本发明方法中使用的双元载体不编码在浸润的植株中促进序列的全身性扩散或细胞-至-细胞运动的病毒蛋白或病毒功能。下文部分中描述载体的细节。
本申请因此提供载体用于本发明方法中农杆菌介导的转化、特别有利于核酸在植物细胞中表达、尤其用于在植物细胞、植物组织或植物细胞的特定区室中表达蛋白质或多肽、用于在植物细胞或植物细胞的部分中产生一种或多种代谢物或其他化合物、用于调节核酸的表达、用于鉴定在植物细胞中具有调节功能的序列、用于鉴定基因和一种或多种外源或内源核酸的核酸功能。
本文中提供的最小尺寸双元载体是特别有利的，因为它们具有最小尺寸，在细菌细胞中以高拷贝数稳定维持，高度灵活并可用于多种目的并且可以用于瞬时表达以及异源序列在稳定的转基因植物或植物细胞中的表达。
可以在本发明方法内部使用的最小尺寸双元载体可以包含以下核酸元件、由其组成、或基本上由其组成：
a)包含编码选择标记的核苷酸序列的第一核酸元件，所述选择标记在大肠杆菌和农杆菌属物种中有功能；
b)包含第一复制起点的核苷酸序列的第二核酸元件，所述第一复制起点在大肠杆菌中有功能；
c)包含编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第三核酸元件；
d)包含第二复制起点的核苷酸序列的第四核酸元件，所述第二复制起点与第一复制起点不同并且在农杆菌中有功能；和
e)包含T-DNA区域的核苷酸序列的第五核酸元件，所述T-DNA区域包含瘤诱导型根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)质粒或根诱生性发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)质粒的T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列；
其中将上述核酸元件在环状多核苷酸分子上提供并且由不在复制、维持或核酸转移中发挥作用的间隔核苷酸序列分隔，并且其中所述间隔核苷酸序列占据少于20%、25%、30%、35%、40%、45%的载体总尺寸。优选地，间隔核苷酸序列占据少于20%的载体总尺寸。
在本发明的一个具体实施方案中，最小尺寸双元载体可以在本发明方法中使用，其中
(i)T-DNA左边界序列和编码选择标记的核苷酸序列(a)由不多于300bp的第一间隔核苷酸序列分隔；
(ii)编码选择标记的核苷酸序列(a)和第一复制起点(b)的核苷酸序列由不多于200bp的第二间隔核苷酸序列分隔；
(iii)第一复制起点(b)的核苷酸序列和编码复制启动蛋白的核苷酸序列(c)由不多于200bp的第三间隔核苷酸序列分隔；
(iv)编码复制启动蛋白的核苷酸序列(c)和第二复制起点(d)的核苷酸序列由不多于500bp的第四间隔核苷酸序列分隔；和
(v)第二复制起点(d)的核苷酸序列和T-DNA右边界序列由不多于150bp的第五间隔核苷酸序列分隔。
在本发明的某些实施方案中，在如任一个前述实施方案中定义的本发明方法中使用的最小尺寸双元载体具有小于5,900bp、小于5,500bp、小于5,200bp、或小于5,100bp的总尺寸，但是尤其5,150bp的总尺寸。
在本发明的另一个具体实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中核酸元件(a)至(e)相对彼此以线性方式在载体分子上按本发明第一实施方案中所述的顺序(即(a)(b)(c)(d)(e))布置。
本领域技术人员将轻易地能够产生在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，所述双元载体包含骨架（backbone），所述骨架具有如任一个前述实施方案中定义的核酸元件a)至e)的不同顺序。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含编码选择标记的核苷酸序列的核酸元件(a)靠近T-DNA左边界序列存在，所述选择标记在大肠杆菌和农杆菌细胞中有功能。在一个具体实施方案中，包含编码选择标记的核苷酸序列的核酸元件(a)和T-DNA左边界序列由不多于300bp的间隔核苷酸序列分隔，其中所述选择标记在大肠杆菌和农杆菌细胞中有功能。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含编码选择标记的核苷酸序列的核酸元件(a)靠近T-DNA右边界序列存在，所述选择标记在大肠杆菌和农杆菌细胞中有功能。在一个具体实施方案中，包含编码选择标记的核苷酸序列的核酸元件(a)和T-DNA右边界序列由不多于150bp的间隔核苷酸序列分隔，其中所述选择标记在大肠杆菌和农杆菌细胞中有功能。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含第一复制起点(b)和第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件分别靠近T-DNA左边界序列和T-DNA右边界序列存在。
在本发明的一个具体实施方案中，提供根据本发明的和如任一个前述实施方案中定义的载体分子，其中第一复制起点(b)和第二复制起点(d)彼此不紧密相邻并且该载体的至少一个其他功能性元件分隔第一复制起点(b)和第二复制起点(d)。
在本发明的一个具体实施方案中，第一复制起点(b)和第二复制起点(d)分别选自Col E1 ori和RK2 oriV。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含第一复制起点(b)的核苷酸序列的核酸元件靠近T-DNA左边界序列存在并且包含第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件靠近T-DNA右边界序列存在。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含第一复制起点(b)的核苷酸序列的核酸元件靠近T-DNA右边界序列存在并且包含第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件靠近T-DNA左边界序列存在。
在本发明的一个实施方案中，提供根据本发明的和如任一个前述实施方案中定义的载体分子，其中第一复制起点(b)和第二复制起点(d)彼此不紧密相邻并且该载体的至少一个其他功能性元件分隔第一复制起点(b)和第二复制起点(d)。
在另一个实施方案中，包含第一复制起点(b)或第二复制起点(d)的核苷酸序列和T-DNA左边界序列的核酸元件由不多于300bp的间隔核苷酸序列分隔。在又一个实施方案中，包含第一复制起点(b)或第二复制起点(d)的核苷酸序列和T-DNA右边界序列的核酸元件由不多于150bp的间隔核苷酸序列分隔。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含第一复制起点(b)和第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件彼此相邻并且靠近T-DNA左边界序列存在。在一个具体实施方案中，提供了如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含第一复制起点(b)的核苷酸序列或第二复制起点(d)的核苷酸序列以及T-DNA左边界序列的核酸元件由不多于300bp的间隔核苷酸序列分隔，并且包含第一复制起点(b)和第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件由不多于200bp的间隔核苷酸序列分隔。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含第一复制起点(b)和第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件彼此相邻并且靠近T-DNA右边界序列存在。在本发明的一个具体实施方案中，提供了如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含第一复制起点(b)的核苷酸序列或第二复制起点(d)的核苷酸序列以及T-DNA右边界序列的核酸元件由不多于150bp的间隔核苷酸序列分隔，并且包含第一复制起点(b)和第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件由不多于500bp的间隔核苷酸序列分隔。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含编码复制启动蛋白(c)的核苷酸序列的核酸元件旁侧分布有包含第一复制起点(b)的核苷酸序列和第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含编码在大肠杆菌和农杆菌细胞中有功能的选择标记的核酸元件(a)旁侧分布有包含第一复制起点(b)的核苷酸序列和第二复制起点(d)的核苷酸序列的核酸元件。在一个具体实施方案中，包含第一复制起点(b)的核苷酸序列和第二复制起点(d)的核苷酸序列的侧翼核酸元件分别由不多于200bp和500bp的间隔核苷酸序列与包含编码复制启动蛋白的核苷酸序列(c)的核酸元件或包含编码在大肠杆菌和农杆菌细胞中有功能的选择标记的核苷酸序列的核酸元件(a)分隔。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中核酸元件(a)包含编码在大肠杆菌和农杆菌细胞中有功能的选择标记的核苷酸序列。这种选择标记可以是抗生素抗性，尤其针对选自以下的抗生素的抗性：氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、四环素、庆大霉素、壮观霉素、博来霉素、腐草霉素、利福平、链霉素和杀稻瘟素S。
在本发明的某些实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中核酸元件(b)包含在大肠杆菌中有功能的第一复制起点的核苷酸序列，所述第一复制起点选自ColE1复制起点(一个属于ColE1不相容组的复制起点)；pMB1复制起点，和属于不相容组FI、FII、FIII、FIV、I、J、N、O、P、Q、T或W中任一者的复制起点。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中核酸元件(b)包含ColE1复制起点的核酸。ColE1复制起点可以例如从pBluescript载体(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)获得。
在本发明的另一个具体实施方案中，本发明提供在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中核酸元件(b)包含pMB1复制起点的核酸。pMB1复制起点编码两种RNA：RNAI和RNAII和一种称作Rom或Rop的蛋白质。例如，pMB1复制起点可以是pGEM载体(Promega Corporation,Madison,WI,USA)或pUC载体如但不限于pUC8(GenBank：L08959.1)的并导致高拷贝数的复制起点。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中核酸元件(c)包含编码复制启动蛋白的核苷酸序列，所述复制启动蛋白是RK2TrfA复制启动蛋白。
在本发明的某些实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中核酸元件(d)包含与第一复制起点不同并且在农杆菌中有功能的第二复制起点的核苷酸序列，并且包含选自最小oriV复制起点、RK2 oriV和属于不相容组FI、FII、FIII、FIV、I、J、N、O、P、Q、T或W中任一者的复制起点中的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，提供了根据本发明和如任一个前述实施方案中定义的载体分子，其中第二核酸元件b)或第四核酸元件d)是复制起点(oriV)并且第三核酸元件c)是在大肠杆菌和农杆菌属物种中均有功能的宽宿主范围质粒RK2的TrfA复制启动蛋白(Schmidhauser和Helinski(1985).J.Bacteriol.164:446-455)。
在本发明的一个实施方案中，提供了根据本发明和如任一个前述实施方案中定义的载体分子，其中第五核酸元件e)包含两个T-DNA边界序列，即T-DNA左边界序列和T-DNA右边界序列。
在本发明的某些实施方案中，核酸元件e)包含胭脂碱家族的农杆菌属菌株T-DNA边界序列，所述胭脂碱家族能够催化胭脂碱、胭脂鸟氨酸、冠瘿亮氨酸、冠瘿谷氨酸(glutaminopine)或琥珀碱。
在本发明的可选实施方案中，核酸元件e)包含章鱼碱家族的农杆菌属菌株T-DNA边界序列，所述章鱼碱家族能够催化章鱼碱、章鱼鸟氨酸、章鱼赖氨酸或章鱼组氨酸。在本发明的某些其他实施方案中，核酸元件e)包含甘露基(mannityl)家族的农杆菌属菌株T-DNA边界序列，所述甘露基家族能够催化甘露碱、甘露鸟氨酸、农杆碱或农杆鸟氨酸。
在本发明的一个实施方案中，提供了在本发明方法中使用和如任一个前述实施方案中定义的最小尺寸双元载体，其中包含T-DNA区域的核苷酸序列的核酸元件(e)含有至少1个单一（unique）限制性核酸内切酶切割位点、尤其至少2个、3个、4个或5个单一限制性核酸内切酶切割位点，所述T-DNA区域包含根癌农杆菌瘤诱导型质粒或发根农杆菌根诱生性质粒的T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列。
所述限制性核酸内切酶切割位点可以是选自以下的切割位点：AatII、Acc65I、AclI、AflII、AflIII、AhdI、AloI、ApaBI、ApaI、AseI、AsiSI、AvrII、BaeI、BamHI、BanII、Bbr7I、BbsI、BbvCI、BfrBI、BlpI、BmtI、BplI、BpmI、Bpu10I、BsaAI、BsaI、BsaXI、BsiWI、BspEI、BsrGI、BstAPI、BstBI、BstZ17I、Bsu36I、DraIII、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、FalI、FseI、FspAI、HindIII、HpaI、KpnI、M.AclI、M.AflIII、M.AloI、M.ApaI、M.BaeI、M.BanII、M.BbvCIA、M.BbvCIB、M.BnaI、M.BsaAI、M.BstI、M.BstVI、M.DraIII、M.EcoAI、M.EcoKI、M.EcoR124I、M.HindIII、M.HpaI、M.KpnBI、M.KpnI、M.MunI、M.PaeR7I、M.PhiBssHII、M.PshAI、M.Rrh4273I、M.SacI、M.SalI、M.Sau3239I、M.SnaBI、M.Tth111I、M.VspI、M.XbaI、M.XhoI、MfeI、MluI、NheI、NruI、NsiI、PciI、PmlI、Ppu10I、PshAI、PspOMI、PsrI、RsrII、SacI、SalI、SanDI、SapI、SciI、SnaBI、SrfI、SwaI、Tth111I、XbaI、XhoI、XmnI和ZraI。这类切割位点可以容纳插入包含相容性5'末端、相容性3'末端或一个或两个平末端的任何DNA(如表达盒)。
在一个实施方案中，所述表达盒包含在植物、尤其烟草属植物中有功能的调节元件和目的核苷酸序列。
本领域技术人员可以通过突变或改变包含所述识别位点的核酸的一个或多个碱基对在不改变载体性能的情况下，轻易地移除切割一次或多次的核酸内切酶识别位点。可以理解，可以改变在编码序列、调节序列或具有载体必需功能的其他序列外部的这类限制性核酸内切酶识别位点中任一个，而不影响载体性能和功能。类似地，可以理解可以通过导入沉默突变来突变在编码蛋白质的片段内部所含的序列，而不改变所述蛋白质的功能。可以理解，本领域技术人员可能不需要用于克隆目的单一限制性位点或任何限制性位点或位点组合，因为也可以通过设计根据本发明和如任一个前述实施方案中定义的载体分子的核酸元件a)至e)并将它们以化学方式合成在一起，而不需要使用限制性核酸内切酶，将用于植物细胞中表达的核酸序列或任何其他核酸序列直接掺入载体的T-DNA区域中或其他地方。
本发明也提供在本发明方法中使用的最小尺寸双元载体，其中第五核酸元件(e)还包含在T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列之间的调节元件，所述调节元件在转化的植物或植物细胞中有功能并且在载体分子中插入目的产物的核苷酸序列时，将与编码这种核苷酸序列有效连接。这类载体分子可以轻易地用于插入目的核苷酸序列。一个或多个单一限制性切割位点可以存在于调节元件和一个T-DNA边界序列之间，以促进目的核苷酸序列的插入。在某些实施方案中，本发明还提供在本发明方法中使用的最小尺寸双元载体，其中第五核酸元件(e)还包含在T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列之间的调节元件，所述调节元件在植物细胞中有功能并且与编码目的蛋白的核苷酸序列有效连接。
在本发明的多种实施方案中，在T-DNA区域内存在的调节元件是选自以下的启动子：花椰菜花叶病毒35S启动子、修饰的花椰菜花叶病毒35S启动子、双重花椰菜花叶病毒35S启动子、最小35S启动子、胭脂碱合酶启动子、豇豆花叶病毒启动子、HT-CPMV启动子、烟草柯巴基合酶CPS2p启动子、dihydrinin启动子、质体蓝素启动子、35S/HT-CPMV启动子、和源自花椰菜花叶病毒的许多其他启动子，如但不限于紫茉莉花叶病毒(MMV)、玄参花叶病毒(FMV)、花生褪绿条纹病毒(PCLSV)、双重CaMV35S启动子(35Sx2)、双重MMV启动子(MMVx2)和双重FMV启动子(FMVx2)。
在本发明的某些实施方案中，在植物调节元件控制下的核苷酸序列编码植物细胞中有功能的选择标记、尤其选自抗生素抗性、除草剂抗性和产生目视可辨识特征的报道蛋白或多肽的选择标记。
在本发明方法中待使用的双元载体、尤其如本文先前所述的最小尺寸双元载体中存在的植物选择标记可以是标记提供针对氨基糖甙类抗生素如卡那霉素或新霉素、除草剂如膦丝菌素或草铵膦的抗性。在替代方案中，选择标记可以是可筛选标记如荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)。
然而，出于瞬时表达目的，植物中使用的选择标记的效用可以是最少的并且可以从载体省略。这种允许进一步明显缩减载体的尺寸。例如，如实例部分1.3中所示，通过从pC100缺失源自pBIN61的编码卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)构建pPMP1。因此，pPMP1是缺少植物选择标记的本发明载体的例子。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了根据本发明和如任一个前述实施方案中定义的载体分子，其中植物选择标记基因不存在或已经省略。
如实施例2中所例举，本发明还提供包含最小骨架和T-DNA区域的少于5,150碱基对的最小双元载体，所述最小双元载体在不影响在细菌细胞中复制和稳定维持的情况下可以作为可以在本发明方法中使用的高拷贝质粒维持于大肠杆菌和农杆菌属物种内。SEQ ID NO:1中提供最小pPMP1双元载体的序列。
因此，在一个实施方案中，本发明构思了载体分子在本发明方法中的用途，其中所述载体分子具有与如SEQ ID NO:1中所示的多核苷酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸序列，并且其中核酸元件(a)至(e)显示与SEQ ID NO:1中提供的对应元件相同的功能性。
本发明的载体和如任一个前述实施方案中定义并包含于这类载体内的核酸元件a)至e)可以是在环状DNA质粒上共价连接的天然存在的核酸序列，或是化学合成的核酸序列，或其混合物。当化学合成时，核酸元件a)至e)可以基于目的细菌或其他生物的天然存在的核酸和蛋白质或多肽序列，并且显示与天然存在序列相同的功能性。
在一个具体实施方案中，载体分子具有如SEQ ID NO:1中所示的多核苷酸序列。
pPMP1和其衍生物的使用导致核酸、蛋白质或肽在普通烟草和本生烟草的转化植物细胞中的良好、稳定以及瞬时表达，如实施例10中例举。另外，用pPMP1和其衍生物如植物可选性最小双元pC100载体转化优选地导致植物核基因组中的单拷贝数或低拷贝数整合和载体骨架序列的低整合或不整合。
启动子/增强子
如果所需，在植物细胞中有功能并且可以用于本发明方法中以便驱动和/或控制目的基因在烟草植物中表达的植物表达载体也可以含有启动子调节区(例如，赋予诱导型或组成型、环境调节或发育调节的、或细胞特异性或组织特异性表达的一种启动子调节区)、转录启动起始位点、核糖体结合位点，RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷化信号。待用于本发明方法中的调节元件可以是表达盒的部分并且在与编码目的蛋白的核苷酸序列有效连接的载体分子、尤其双元载体，但特别在根据如本文所述的前面实施方案任一者的最小尺寸双元载体中存在。
在本发明的多种实施方案中，调节元件在双元载体、尤其根据如本文所述的前面实施方案中任一者的最小尺寸双元载体的T-DNA区域中存在。在根据前述实施方案任一个的方法中使用的优选启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子、修饰的花椰菜花叶病毒35S启动子、双重花椰菜花叶病毒35S启动子、最小35S启动子、胭脂碱合酶启动子、豇豆花叶病毒启动子、HT-CPMV启动子、烟草柯巴基合酶CPS2p启动子、dihydrinin启动子、质体蓝素启动子、35S/HT-CPMV启动子和源自属于花椰菜病毒科的DNA病毒的许多其他启动子，或者全长转录物(FLt)启动子或亚基因组转录物启动子。这类DNA病毒的例子包括，而不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)、紫茉莉花叶病毒(MMV)、玄参花叶病毒(FMV)、花生褪绿条纹病毒(PCLSV)。
对于在根据前面实施方案任一者的方法中使用，特别优选属于花椰菜病毒科的DNA病毒的全长转录物(FLt)启动子，其包括但不限于FMV启动子，如在WO1998000534和US5994521中描述的那些；MMV启动子，如在US6420547和US6930182中描述的那些；和PCISV启动子，如在WO1998005198、US5850019和EP929211中描述的那些。
许多这类启动子可以通过以串联方式连接其增强子序列的多个拷贝(例如两个拷贝)进行修饰，以增强启动子活性，例如但不限于双重CaMV35S启动子(35Sx2)、双重MMV启动子(MMVx2)、双重FMV启动子(FMVx2)。在援引的参考文献中已知或描述过的这些启动子的功能性片段可以用于本发明的载体中。已经产生这类启动子的具体实例并且已经在末端包含EcoRI和HindIII限制性酶切割位点以促进克隆至本发明的最小载体中。也可以在本发明的载体中使用与这些序列相同至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%并且起到在植物中实现有效连接的核苷酸序列表达的作用的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方案中，一个或多个以下启动子序列可以用于根据本发明和如本文在前面实施方案任一者中所述的载体内部。
在本发明的一个具体实施方案中，一个或多个以下启动子序列可以用于根据本发明和如本文在前面实施方案任一者中所述的载体内部。
>在EcoR1和Hind3位点之间单增强（single enhanced）的pMMV
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>在EcoR1和Hind3位点之间双增强（double enhanced）的pMMV
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>在EcoR1和Hind3位点之间单增强的pFMV
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>在EcoR1和Hind3位点之间双增强的pFMV
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>在EcoR1和Hind3位点之间单增强的pPClSV
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>在EcoR1和Hind3位点之间双增强的pPClSV
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通过插入来自花椰菜病毒科的这些DNA病毒之一中的FLt启动子至T-DNA区域内，产生两个系列的源自pC100的载体。图7显示一系列9个载体即pC141、pC190、pC191、pC192、pC193、pC241、pC242、pC243和pC265的T-DNA区域。这些载体中存在于FLt启动子下游的多克隆位点允许插入目的核苷酸序列用于在植物细胞、尤其烟草属植物的、特别是普通烟草的植物细胞中表达。通过以下方式产生第二系列的较小载体：通过用SpeI和AvrII消化第一系列中的每种载体移走包含编码植物选择标记(nptII)的核苷酸序列的表达盒，并且使质粒重新环化。这些载体，即pC277、pC278、pC279、pC280、pC281和pC282，特别合适在植物细胞或植物、尤其烟草属植物、尤其普通烟草中瞬时表达目的多肽。因此，如本文在前面实施方案任一者中所述的本发明双元载体可以在其T-DNA区域内包含来自MMV、FMV或PCISV的DNA病毒的FLt启动子(例如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14)的一个或两个或更多个拷贝，并任选地包含表达盒，所述表达盒包含编码植物选择标记的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，用于表达异源多肽的基因序列的载体、尤其双元载体，但是尤其是如本文在前面实施方案任一者中所述的最小尺寸双元载体可以包含一个或多个调节序列，在这种情况下，包含源自豇豆花叶病毒非翻译区(HT-CPMV；通过引用方式完整并入本文的WO07/135480)。优选地，这种双元载体也包含最小35S CaMV启动子。HT-CPMV系统是基于最小启动子、含有超级可翻译(HT)元件的修饰的5'-UTR，和来自CPMV RNA-2的3'-UTR，所述3'-UTR使得植物中增强的重组蛋白翻译和高积累成为可能。
最小35S-CaMV启动子(SEQ ID NO:2)
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5'UTR HT-CPMV(SEQ ID NO:3)
tattaaaatcttaataggttttgataaaagcgaacgtggggaaacccgaaccaaaccttcttctaaactctctctcatctctcttaaagcaaacttctctcttgtctttcttgcgtgagcgatcttcaacgttgtcagatcgtgcttcggcaccagtacaacgttttctttcactgaagcgaaatcaaagatctctttgtggacacgtagtgcggcgccattaaataacgtgtacttgtcctattcttgtcggtgtggtcttgggaaaagaaagcttgctggaggctgctgttcagccccatacattacttgttacgattctgctgactttcggcgggtgcaatatctctacttctgcttgacgaggtattgttgcctgtacttctttcttcttcttcttgctgattggttctataagaaatctagtattttctttgaaacagagttttcccgtggttttcgaacttggagaaagattgttaagcttctgtatattctgcccaaatttgtcgggccc
3'UTR HT-CPMV(SEQ ID NO:4)
Attttctttagtttgaatttactgttattcggtgtgcatttctatgtttggtgagcggttttctgtgctcagagtgtgtttattttatgtaatttaatttctttgtgagctcctgtttagcaggtcgtcccttcagcaaggacacaaaaagattttaattttattaaaaaaaaaaaaaaaagaccggg
启动子序列可以由近端和更远端的上游元件组成，后一类元件经常称作增强子。因此，“增强子”是这样的DNA序列，该序列可以刺激启动子活性并且可以是该启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。它能够以两种取向(正常或反转)工作，并且甚至从启动子上游或下游被移动的情况下也能够发挥作用。增强子和其他上游启动子元件均结合介导它们作用的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以完全源自天然基因，或由不同的元件组成，源自自然界中存在的不同启动子，或甚至由合成性DNA区段组成。启动子也可以含有参与结合蛋白质因子的DNA序列，所述蛋白质因子控制响应于生理或发育状况时转录起始的有效性。
增强子的例子包括来自CaMV35S启动子，章鱼碱合酶基因(Ellis等人，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis1987)、玉米皱缩I基因(Vasil1989)、烟草蚀纹病毒(TEV)和烟草花叶病毒(TMV)ω翻译增强子(Gallie1989)和来自非植物真核生物的启动子(例如酵母；Ma1988)中的元件。可以构建根据本发明使用的载体以包含这种增强子元件。在植物转化的情景下应用时，增强子元件并且尤其该元件的多个拷贝的使用可以起到增加从相邻启动子转录的水平的作用。
终止区可以选自胭脂碱合酶(nos)、营养贮藏蛋白(vsp)或蛋白酶抑制物-2(pin2)终止区。
信号肽
在植物细胞中有功能的并且可以在本发明方法中使用的植物表达载体、尤其双元载体，并且特别是根据如本文所述的前面实施方案任一者的最小尺寸双元载体，还可以包含编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽使新表达的蛋白质靶向亚细胞位置。可以在这类载体分子内部使用的信号肽例如是选自以下的那些：液泡靶向序列、叶绿体靶向序列、线粒体靶向序列、诱导植物细胞中蛋白体形成的序列或诱导植物细胞中油体形成的序列。
在本发明的一个实施方案中，靶向序列是将蛋白质输出至内质网的信号肽。信号肽是位于蛋白质N末端尽头并且在跨内质网膜转位期间以共翻译方式切去的转运肽。可以在本发明的载体分子中使用的信号肽是以下信号肽，而不限于此：在IgG的轻链或重链序列的N末端天然存在的信号肽或如EP2002807566和WO2007EP1606中所述的patatin信号肽，尤其如实施例9中所述的pC148的patatin信号肽。可以使用可编码patatin信号肽序列的任何核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码由MATTKSFLILFFMILATTSSTCA(SEQ ID NO:15)组成的patatin信号肽的核苷酸序列可以用于根据本发明和如本文在前面实施方案任一者中所述的载体内部。
其他信号肽可以例如由预测SignalP预测工具(Emanuelsson等人,2007,Nature Protocols2:953-971)。
在本发明的另一个实施方案中，靶向序列可以是内质网停留肽。内质网停留靶向序列存在于蛋白质的C-末端尽头并且可以是四氨基酸序列，如KDEL、HDEL或DDEL，其中K是赖氨酸、D是天冬氨酸、E是谷氨酸、L是亮氨酸和H是组氨酸。
在本发明的又一个实施方案中，靶向序列可以是与蛋白质融合时导致内质网中非分泌性贮藏细胞器形成的序列，如但不限于在WO07/096192、WO06/056483和WO06/056484中描述的那些，所述专利通过引用方式完整并入本文。在本发明的某些实施方案中，靶向序列可以是液泡靶向序列、叶绿体靶向序列、线粒体靶向序列或任何其他序列，其中所述其他序列的添加导致与之融合的蛋白质特异性靶向植物或植物细胞内部的特定细胞器。
在一个实施方案中，根据本发明和如任一个前述实施方案中定义的载体分子还在T-DNA区域内包含用于位点特异性重组的位点特异性重组位点。在一个实施方案中，位点特异性重组位点位于植物调节元件下游。在另一个实施方案中，位点特异性重组位点是位于植物调节元件上游。在本发明的一个具体实施方案中，重组位点是LoxP位点和Cre-Lox位点特异性重组系统的部分。Cre-Lox位点特异性重组系统使用环状重组酶(Cre)，所述环状重组酶催化含有Cre的特异性结合位点的特定位点(LoxP)之间的重组。
在另一个具体实施方案中，重组位点是Gateway目的位点。例如，首先将目的核酸克隆至中市售的“入门载体”和随后重组至“目的载体”中。目的载体可以用于分析给定核酸序列的启动子活性或序列数目、用于分析功能、用于蛋白质定位、用于蛋白质-蛋白质相互作用、用于沉默给定的基因或用于亲和纯化实验。Gateway克隆技术可以从Invitrogen Inc.,USA购买。
基因沉默阻抑因子
在多种实施方案中、在根据前面实施方案任一者的方法中使用的选定烟草品种包含基因沉默阻抑因子、尤其病毒来源的基因沉默阻抑因子、并且尤其是马铃薯Y病毒或选自黄瓜坏死病毒(CNV)、哈维尔河(HaRV)、梨潜隐病毒(PeLV)、洋桔梗坏死病毒、葡萄阿尔及利亚潜隐病毒、天竺葵坏死斑点病毒(PeNSV)、兰花环斑病毒(CymRSV)、菊芋斑驳皱缩病毒(AMCV)、康乃馨意大利环斑病毒(CIRV)、莴苣缬草坏死性矮缩病毒、稻黄斑驳病毒(RYMV)、马铃薯病毒X(PVX)、马铃薯病毒Y(PVY)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)或番茄丛矮病毒(TBSV)的病毒的基因沉默阻抑因子。
在另一个实施方案中，所述基因沉默阻抑因子选自以下项：黄瓜坏死性病毒(CNV)的p19蛋白、稻黄斑驳病毒(RYMV)的p1蛋白、马铃薯病毒X(PVX)的p25蛋白、非洲木薯花叶病毒(ACMV)的AC2蛋白、黄瓜花叶病毒(CMV)的2b蛋白和烟草蚀纹病毒(TEV)的辅助组分蛋白酶(HcPro)。
在通过引用方式完整并入本文的WO98/44097、WO01/38512和WO01/34822中提供对基因沉默阻抑因子(包括HcPro)的详细描述。在本文中提供编码HcPro的核苷酸序列的例子，如SEQ ID NO:5中所述，并且还称作P1-HcPro-P3。可以将这种序列插入本领域已知的双元载体或本发明的最小尺寸双元载体中。因此，在一个非限制性实例中，可表达性HcPro基因序列包含发挥增强烟草植物中异源蛋白产量的作用的以下序列或其片段。
P1-HcPro-P3(SEQ ID NO:5)
atggcactcatctttggcacagtcaacgctaacatcctgaaggaagtgttcggtggagctcgtatggcttgcgttaccagcgcacatatggctggagcgaatggaagcattttgaagaaggcagaagagacctctcgtgcaatcatgcacaaaccagtgatcttcggagaagactacattaccgaggcagacttgccttacacaccactccatttagaggtcgatgctgaaatggagcggatgtattatcttggtcgtcgcgcgctcacccatggcaagagacgcaaagtttctgtgaataacaagaggaacaggagaaggaaagtggccaaaacgtacgtggggcgtgattccattgttgagaagattgtagtgccccacaccgagagaaaggttgataccacagcagcagtggaagacatttgcaatgaagctaccactcaacttgtgcataatagtatgccaaagcgtaagaagcagaaaaacttcttgcccgccacttcactaagtaacgtgtatgcccaaacttggagcatagtgcgcaaacgccatatgcaggtggagatcattagcaagaagagcgtccgagcgagggtcaagagatttgagggctcggtgcaattgttcgcaagtgtgcgtcacatgtatggcgagaggaaaagggtggacttacgtattgacaactggcagcaagagacacttctagaccttgctaaaagatttaagaatgagagagtggatcaatcgaagctcacttttggttcaagtggcctagttttgaggcaaggctcgtacggacctgcgcattggtatcgacatggtatgttcattgtacgcggtcggtcggatgggatgttggtggatgctcgtgcgaaggtaacgttcgctgtttgtcactcaatgacacattatagcgaccatcaccatcaccatcacgcgtccgacaaatcaatctctgaggcattcttcataccatactctaagaaattcttggagttgagaccagatggaatctcccatgagtgtacaagaggagtatcagttgagcggtgcggtgaggtggctgcaatcctgacacaagcactttcaccgtgtggtaagatcacatgcaaacgttgcatggttgaaacacctgacattgttgagggtgagtcgggaggaagtgtcaccaaccaaggtaagctcctagcaatgctgaaagaacagtatccagatttcccaatggccgagaaactactcacaaggtttttgcaacagaaatcactagtaaatacaaatttgacagcctgcgtgagcgtcaaacaactcattggtgaccgcaaacaagctccattcacacacgtactggctgtcagcgaaattctgtttaaaggcaataaactaacaggggccgatctcgaagaggcaagcacacatatgcttgaaatagcaaggttcttgaacaatcgcactgaaaatatgcgcattggccaccttggttctttcagaaataaaatctcatcgaaggcccatgtgaataacgcactcatgtgtgataatcaacttgatcagaatgggaattttatttggggactaaggggtgcacacgcaaagaggtttcttaaaggatttttcactgagattgacccaaatgaaggatacgataagtatgttatcaggaaacatatcaggggtagcagaaagctagcaattggcaatttgataatgtcaactgacttccagacgctcaggcaacaaattcaaggcgaaactattgagcgtaaagaaattgggaatcactgcatttcaatgcggaatggtaattacgtgtacccatgttgttgtgttactcttgaagatggtaaggctcaatattcggatctaaagcatccaacgaagagacatctggtcattggcaactctggcgattcaaagtacctagaccttccagttctcaatgaagagaaaatgtatatagctaatgaaggttattgctacatgaacattttctttgctctactagtgaatgtcaaggaagaggatgcaaaggacttcaccaagtttataagggacacaattgttccaaagcttggagcgtggccaacaatgcaagatgttgcaactgcatgctacttactttccattctttacccagatgtcctgagtgctgaattacccagaattttggttgatcatgacaacaaaacaatgcatgttttggattcgtatgggtctagaacgacaggataccacatgttgaaaatgaacacaacatcccagctaattgaattcgttcattcaggtttggaatccgaaatgaaaacttacaatgttggagggatgaaccgagatatggtcacacaaggtgcaattgagatgttgatcaagtccatatacaaaccacatctcatgaagcagttacttgaggaggagccatacataattgtcctggcaatagtctccccttcaattttaattgccatgtacaactctggaacttttgagcaggcgttacaaatgtggttgccaaatacaatgaggttagctaacctcgctgccatcttgtcagccttggcgcaaaagttaactttggcagacttgttcgtccagcagcgtaatttgattaatgagtatgcgcaggtaattttggacaatctgattgacggtgtcagggttaaccattcgctatccctagcaatggaaattgttactattaagctggccacccaagagatggacatggcgttgagggaaggtggctatgctgtgacctctgcagatcgttcaaacatttggcaataa
异源蛋白
在多种实施方案中，在根据前面实施方案任一者的方法中浸润普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种可以用包含可表达核苷酸序列的农杆菌属物种的选定菌株进行，所述可表达核苷酸序列编码选自以下的异源蛋白或多肽：生长因子、受体、配体、信号传导分子；激酶、酶、激素、瘤抑制因子、凝血蛋白、细胞周期蛋白、代谢蛋白、神经元蛋白、心肌蛋白、特定疾病状态中缺乏的蛋白质、抗体或其片段、免疫球蛋白、抗原、提供疾病抗性的蛋白质、抗微生物蛋白、干扰素和细胞因子。在多种实施方案中，异源蛋白或多肽是人蛋白质或多肽，修饰的人蛋白质或多肽、嵌合蛋白或多肽。在多种实施方案中，异源蛋白或多肽不是植物病原体的蛋白质或多肽，或更具体地，不是真菌性植物病原体、病毒性植物病原体、细菌性植物病原体、茄科(Solanaceae)物种的病原体、烟草属(Nicotiana)植物病原体或烟草病原体的蛋白质或多肽。
可表达核苷酸序列可以包含已经为了在植物细胞、尤其在烟草属植物、特别是普通烟草的植物细胞中表达而优化的序列。虽然可表达核苷酸序列可以与天然的人编码序列不同，但翻译产物的氨基酸相同。可表达核苷酸序列中的一个或多个密码子已经根据植物、尤其烟草属植物、尤其普通烟草的已知密码子选择而替换为优选的密码子，导致编码可表达核苷酸序列中相同氨基酸的优选密码子的样式，所述样式使得植物或烟草植物增加的表达成为可能(相对于使用天然编码序列)。为这类目的而修饰核苷酸序列的技术是熟知的，见例如US5,786,464和US6,114,148。
在一个方面，在如本文于前面实施方案任一者中所述的本发明方法内使用抗原编码序列，其包括用于诱导保护性免疫反应的序列(例如，如疫苗制剂中)。这类合适抗原包括但不限于微生物抗原(包括病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生体抗原等)；来自多细胞生物(如多细胞寄生体)的抗原；变应原；和与人或动物病理(例如，如癌症、自身免疫疾病等)相关的抗原。在一个优选的方面，病毒抗原包括但不限于：HIV抗原；针对流感赋予保护性免疫反应的抗原；轮状病毒抗原；炭疽抗原；狂犬病抗原；等。可以将疫苗抗原作为多价肽或多肽编码，例如，包括在表达构建体中重复的不同或相同的抗原编码序列，并且任选地由一个或多个接头序列分隔。
在一个实施方案中，可表达核苷酸序列编码抗体轻链、抗体重链或抗体的轻链和重链。在一个具体实施方案中，重链或轻链是结合人CD20的抗体的重链或轻链。在另一个具体实施方案中，重链或轻链是结合人CD20的抗体的重链或轻链，其具有利妥昔单抗的抗体结合位点。
在多种实施方案中，可表达核苷酸序列编码选自流感病毒抗原、尤其血凝素(HA)的异源蛋白或多肽。流感病毒是从受感染的哺乳动物细胞的质膜出芽的包膜病毒。基于存在的核蛋白和基质蛋白抗原，将它们划分成A、B、或C型。根据呈现的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的组合，可以将A型流感病毒进一步再划分成15个亚型。HA决定病毒结合于并穿透宿主细胞的能力。
目前，识别了16个HA(H1-H16)亚型。每种A型流感病毒呈现一个类型HA和一个类型NA糖蛋白。可以由本发明方法产生的HA蛋白包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16或其片段或部分。包含这类HA蛋白的亚型的例子包括A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/印度尼西亚/512006(H5N1)、A/鸡/纽约/1995、A/鲱鱼鸥/DE/677/88(H2N8)、A/德克萨斯/32/2003、A/绿头鸭/MN/33/00、A/鸭/上海/1/2000、A/针尾鸭/TXl828189/02、A/火鸡/Ontario/6118/68(H8N4)、A/琵嘴鸭/伊朗/G54/03、A/鸡/德国/N/1949(H10N7)、A/鸭/英格兰/56(H11N6)、A/鸭/阿尔伯塔/60176(H12N5)、A/鸥/马里兰/704/77(H13N6)、A/绿头鸭/Gurjev/263/82、A/鸭/澳大利亚/341/83(H15N8)、A/红嘴鸥/瑞典/5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/约翰内斯堡/66、A/波多黎哥/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/Brisbane10/2007(H3N2)、A/威斯康辛/67/2005(H3N2)、B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1I2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/马/布拉格/56(H7N7)、A/香港/1073/99(H9N2)。构思具有上文提到的H亚型之一的一些流感病毒可能在人类中造成感染，并且因为其来源，可能导致大流行。这些亚型(H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H1、H12、H13、H14、H15、H16)的许多种抗原可以因此用于大流行流感疫苗中。亚型H1、H2、H3是参与人类流感感染的主要亚型，并且构思这类亚型的抗原用于季节性流感疫苗中。
构思可以在本发明的方法中使用编码流感血凝素或其免疫原性片段的任何核苷酸序列，从而在宿主普通烟草品种中产生血凝素多肽或其片段。例如，可以根据本发明使用公共数据库中报道的流感血凝素的任何生物序列，如Genbank(Nucleic Acids Research2004Jan1;32(1):23-6)，或流感研究数据库(IRD；见www.fludb.org或Squires等人,BioHealthBase:informatics support in the elucidation ofinfluenza virus host pathogen interactions and virulence.Nucleic Acids Research(2008)vol.36(数据库专刊)第D497页)。
下文提供并且在SEQ ID NO:8中描述编码目的异源蛋白的核苷酸序列。这种核苷酸序列编码成熟流感血凝素5(H5)，并且密码子已经为序列在植物中表达进行优化。因此，本发明构思根据前面实施方案中任一者如上文所述的载体包含在T-DNA区域内且与植物调节元件有效连接的编码成熟流感血凝素5的核苷酸序列，所述成熟流感血凝素5显示与SEQ ID NO:8至少90%、92%、94%、96%、98%、99%或99.5%的序列同一性。
成熟优化的HEI(H5)
atggagaaaatagtgcttcttcttgcaatagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaattcaacagagcaggttgacacaatcatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaagacacacaacgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttaagagattgtagtgtagctggatggctcctcgggaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtaccggaatggtcttacatagtggagaaggccaatccaaccaatgacctctgttacccagggagtttcaacgactatgaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcaaatcatccccaaaagttcttggtccgatcatgaagcctcatcaggagttagctcagcatgtccatacctgggaagtccctccttttttagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtacatacccaacaataaagaaaagctacaataataccaaccaagaggatcttttggtactgtggggaattcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaggctatatcaaaacccaaccacctatatttccattgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaaaaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaaacctaatgatgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcagcaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattccacaacatacaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcaacagggctcagaaatagccctcaaagagagagcagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaatgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcaatcattgacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagggaatttaataacttagaaaggagaatagagaatttaaacaagaagatggaagacgggtttctagatgtctggacttataatgccgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactctagactttcatgactcaaatgttaagaacctctacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaacggttgtttcgagttctatcacaaatgtgataatgaatgtatggaaagtataagaaacggaacgtacaactatccgcagtattcagaagaagcaagattaaaaagagaggaaataagtggggtaaaattggaatcaataggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaatcatgatggctggtctatctttatggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaa(SEQ ID NO:8)
接种物制备和细胞密度
在本发明的一个实施方案中，不同的农杆菌菌株如根癌农杆菌或发根农杆菌细菌可以用于制备接种物，如实施例1中例举。农杆菌菌株可以包含双元载体，所述双元载体含有目的基因处于植物调节元件控制下的T-DNA，所述农杆菌菌株培养至多到OD600>1.6。可以将农杆菌菌株通过离心收集并以至少2.1、至少2.4、至少2.7、至少3.0、至少3.3、至少3.6、至少3.8、至少3.9、至少4.0的细胞密度(OD600)重悬于浸润溶液中。在一个具体实施方案中，浸润溶液的OD600是>2。
在本发明的另一个实施方案中，可以将农杆菌菌株进一步稀释于浸润溶液中，并且作为任选的措施，可以添加乙酰丁香酮以诱导毒力。
在本发明的其他实施方案中，两种或更多种农杆菌悬液可以根据本发明和如本文所述制备。所述两种或更多种悬液随后可以分别用于相容性普通烟草品种、育种系或栽培品种的浸润，或者在替代性方案中，可以在浸润之前首先混合。尤其，可以是如本文所述制备携带第一双元载体的第一农杆菌悬液，所述第一双元载体具有第一可表达基因，例如编码蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽如先前部分中提到的那些的编码序列，并且将所述悬液与制备携带第二双元载体的第二农杆菌悬液混合，所述第二双元载体具有第二可表达基因，例如编码基因沉默阻抑因子的编码序列。
在本发明的另一个实施方案中，如本文所述的制备的接种物可以在使用之前于4-6℃贮存至多到1周。
如实施例11、12和14中分别例举，本发明也对上述接种物制备方法提供进一步改善，所述改善进一步增强异源多肽的总产量。
在本发明的一个实施方案中，将农杆菌培育，然后通过离心收获并且重悬于溶液，优选地浸润溶液中，优选地达到OD600>2.0，以产生浓缩的接种物。可选地，将农杆菌保持在培养基中，不进行离心和重悬。在一个具体实施方案中，在不进行抗生素选择的情况下，将培养用于浸润的农杆菌细胞培养至所需光密度，接种物可以立即使用或贮存稍后使用。在浸润当日，不同的浓缩接种物可以按不同比率或比率组合(例如按3:1、1.67:1、1:3、1:1的比率)混合在一起并且随后在浸润溶液中稀释至待确定的最终OD600，其中所述浓缩接种物包含如本文所述的不同农杆菌菌株或包含双元载体的相同农杆菌菌株，所述双元载体具有不同的蛋白质编码序列。例如，在一个实施方案中，细菌液可以具有0.32或0.85的最终OD600。可以将接种物平衡至室温持续预定时间，例如30分钟。接种物可以随后在浸润溶液中稀释至获得较低细菌密度的OD600。
在本发明的一个优选实施方案中，农杆菌菌株，如AGL1，可以携带基因或基因构建体，例如报道基因，例如tGFP，或沉默阻抑因子，例如HcPro。
在本发明的一个优选实施方案中，农杆菌菌株是AGL1，接种物的最终OD是0.7，接种物中包含可表达目的基因的AGL1细胞与包含HcPro可表达序列的AGL1细胞的比率是2.5至1，并且普通烟草品种是PM132。
植物浸润
如上文所述，已经鉴定到普通烟草品种、育种系或栽培品种和农杆菌菌株的相容性组合。可以在本发明方法中使用任何已知的植物浸润方法，如但不限于包含以可表达方式编码所需蛋白质的基因的核酸分子的粒子枪递送、农杆菌递送包含可表达基因的双元载体、原生质体的电穿孔，和聚乙二醇递送裸DNA至植物原生质体中。粒子轰击法通常仅达到少数细胞并且DNA必须抵达细胞胞核以便实现转录，并且因此对于瞬时表达而言并不十分高效。
使用通过浸润法递送的农杆菌(农杆菌浸润法)可以递送外来基因至显著更高数目的细胞。农杆菌浸润用于瞬时表达的原初体系由Kapila等人,Plant Sci.122:101-108(1997)描述并且经开发以便快速测试据信用于植物组织抗病性的蛋白质的功能性。
在本发明的多种实施方案中，提供多个系统，通过暴露于低大气压或真空，所述系统处理完好的完整植株、尤其已经与农杆菌细胞接触过的完整和完好植株或植物部分如植物器官或植物组织。本发明方法中使用的系统可以包含用于接收完整植株、尤其完整且完好的植株或植物部分如植物器官或植物组织或者多个这类完整植株或植物部分的腔室，和用于产生低流体压力环境和任选地递送负流体压力或正流体压力、或负流体压力与正流体压力组合的手段。
在本发明的一个实施方案中，提供多个系统，一旦暴露于低大气压或真空，所述系统处理完好的完整植株、尤其已经与农杆菌细胞接触过的完整和完好植株或植物部分如植物器官或植物组织。本发明方法中使用的系统可以包含用于接收完整植株、尤其完整且完好的植株或植物部分如植物器官或植物组织或者多个这类完整植株或植物部分的腔室，和用于产生低流体压力环境和任选地递送正流体压力的手段。
在另一个实施方案中，本发明构思了使用将农杆菌细胞导入完整植株，尤其完整且完好植株或植物部分如植物器官或植物组织的改进方法，如2010年7月16日提交的共同待决申请号EP10169888.4中公开，所述申请的公开内容完整并入本文。不同于使用真空或负压的本领域已知方法，该方法提供正流体压力或正流体压力与负流体压力的组合，以促进农杆菌细胞浸润完整植株、尤其完整且完好的植株或植物部分如植物器官或植物组织。本发明也提供在本发明方法中使用的系统和手段，它们用于递送正流体压力至完整植株、尤其正在或已经与农杆菌细胞接触过的完整且完好的植株或植物部分如植物器官或植物组织。
当完整植株、尤其完整且完好的植株或植物部分和细菌在封闭条件下经历一个或多个压力循环处理时，递送正流体压力。流体压力是在某种程度上流体(如水或空气)内部的压力。例如，在封闭条件下，流体所占的体积是恒定的。在本发明的多种实施方案中，流体压力是体积固定的腔室内部的空气压力。
可用于本发明中的正压值可以按环境空气压力的百分比值表述，例如并且不限于110%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、350%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%、1000%、1050%、1110%、1150%、1200%或任何中间值，或大于前者的任何值。相似习惯可以用于描述作为低于环境空气压力的压力值的负压。
或者，正压可以按绝对值表述，例如并且不限于1.1atm、1.5atm、2atm、2.5atm、3atm、3.5atm、4atm、4.5atm、5atm、5.5atm、6atm、6.5atm、7atm、7.5atm、8atm、8.5atm、9atm、9.5atm、10atm、10.5atm、11atm、11.5atm、12atm等；或1.1巴、1.5巴、2巴、2.5巴、3巴、3.5巴、4巴、4.5巴、5巴、5.5巴、6巴、6.5巴、7巴、7.5巴、8巴、8.5巴、9巴、9.5巴、10巴、10.5巴、11巴、11.5巴、12巴、或任何中间值，或大于前者的任何值。在本文描述中不提供环境空气压力以便比较的情况下，环境空气压力意指地球上海平面处的标准大气压。
本文所用的术语“压力循环”指一段时间范围内一系列压力变化。在一个实施方案中，压力循环包括靶压力，即，在给定的时间段内意在达到的压力。例如，在压力循环期间，浸润室中的所需压力从与环境空气压力平衡开始，变动至靶压力，并返回环境空气压力。因此，本发明中所用的浸润室可以通过升高压力高于大气压而启动压力循环并且通过与大气压平衡而结束一个压力循环。
在本发明的方法中，可以应用多个不同的压力循环并且每个循环可以应用1次或多次，例如但不限于2、3、4、5、6、7、8、9或10次。因此，在本发明的方法中或甚至在压力循环中，压力随时间推移的变动可以通过曲线或波形图表述，如正弦波、方波、三角波或锯齿波，或接近于前述任一者的任何波形图。
具体而言，压力循环可以包括作为正压的靶压力。在某些实施方案中，本发明的方法不包括使用作为负压的靶压力。在其他实施方案中，构思使用作为正压的第一靶压力以及作为负压的第二靶压力。在其他实施方案中，第一靶压力是负压，并且第二靶压力是正压。可以在压力循环之间包括休息期。
在某些实施方案中，将包含表达构建体的农杆菌细胞浸润至完整植株、尤其完整且完好的植株或完整且完好植株的部分，如植物器官或植物组织中。在一个实施方案中，浸润在表面活性剂存在下实施，所述表面活性剂包括阴离子型、阳离子型、非离子型和两性离子表面活性剂。可以使用的表面活性剂的非限制性例子是Triton X-100或Silwet L-77，一种对植物显示相对低毒性的强力表面活性剂。
在一个实施方案中，将完整和完好植株在浸润室内颠倒放置并且将其叶完全浸没在包含农杆菌细胞的液体中。该腔室经入口阀连接于低气压源。例如，为了产生低气压(约50毫巴)。
除以上设备之外，在本发明的方法中使用的系统可以任选地还包括用于从一个位置转运多个完整植株或植物部分如植物器官或植物组织至浸润室的装置、用于促进多个完整植株或植物组织与农杆菌细胞接触的装置、用于该室中接收多个完整植株或植物组织的装置、用于在该室中定位和再定位多个完整植株或植物部分如植物器官或植物组织的装置、用于从该室取回多个完整植株或植物部分的装置。优选地，一个或多个前述装置是自动化电子-机械系统，并且包括但不限于电动转运系统、工厂自动化系统、安全系统、过程控制系统、数据通讯系统、数据储存系统和计算系统。
在多种实施方案中，携带具有一个基因或多个基因、尤其一个或多个异源基因的表达构建体的农杆菌细胞用来递送所述基因至完整且完好的植株或植物部分如植物器官或植物组织，以便在植株或植物部分的细胞和/或胞外空间内瞬时表达。通常，合适的表达构建体包含：至少一个T-DNA边界序列、表达调节序列(例如，可以为诱导型或组成型的启动子、其活性具有组织特异性或组织偏性的启动子)，和与该表达调节序列有效连接的基因。在某些实施方案中，表达构建体是包含一个或多个复制起点的载体的部分，至少一个复制起点适合于在农杆菌属物种中复制包含该表达构建体的载体。
正压浸润方法可以用于获得许多植物物种的瞬时表达，所述植物物种包括但不限于：烟草(烟草属物种)、莴苣缬草、苜蓿、绿豆、菠菜、蒲公英、红菊苣(radicchio)、芝麻菜(arugula)、苣荬菜(endive)、阔叶菊苣(escarole)、菊苣、球蓟(artichoke)、玉米、马铃薯、稻、大豆、棉花、小颖果禾谷植物、小麦、大麦、高粱属、糖料甜菜、卡诺拉油菜、十字花科植物(例如，芸苔属(Brassica)、拟南芥属)浮萍和番茄。
合适的植物器官或组织通常可以是植物的任何部分。在一个优选的方面，植物组织是叶组织。在一个方面，植物组织是来自植株的叶组织，所述植株包含在至少一个维度上至少约7-8cm的叶。
温室实施
以倒转位置温育
在本发明的另一个方面，提供了用于温育细菌悬液浸润后的植株的一般方法，所述细菌悬液包含蛋白质或多肽、尤其异源蛋白质或多肽的可表达核苷酸序列，所述方法包括以倒转的位置温育植株。优选地，以倒转的位置温育的植株是用农杆菌细胞的悬液浸润的完整植株，所述农杆菌细胞包含蛋白质或多肽，尤其异源蛋白或多肽的可表达核苷酸序列。
在另一个实施方案中，以倒转位置温育的植物是转基因植物。
在某些实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述温育步骤包括以倒转的位置温育浸润的植株。还提供一种温室，其适应于支持以倒转位置温育浸润植株持续任何时间长度，尤其5日至10日之间的时间，其中倒转的浸润植株从上方光照。在本发明的一个方面，对植物每24小时光照7至9小时、尤其每24小时光照8小时。
这种方法导致增加的重组蛋白表达，如实施例13中所显示。
在本发明的一个实施方案中，包括以倒转位置温育植物的方法可以在根据前述方面或实施方案任一者的方法中、尤其在如本文所述的温育步骤(iii)中使用。
在本发明的一个实施方案中，考虑到前述方面或实施方案的任一者，尤其在如本文所述的温育步骤(iii)的背景下，对以倒转位置温育植物的修改可以适用于本发明的方法。
光照
在本发明的又一个方面，提供了用于温育细菌悬液浸润后的植株的一般方法，所述细菌悬液包含蛋白质或多肽、尤其异源蛋白质或多肽的可表达核苷酸序列，所述方法包括将植株在日光条件下温育每日(24小时)5小时至15小时、5小时至10小时、7至9小时、优选地每日(24小时)8小时。该方法特别可用于改善异源蛋白的瞬时表达水平，如实施例15中例举。
一个实施方案中，浸润的植株是用农杆菌细胞的悬液浸润并且在日光条件下温育每日7至9小时、优选每日8小时的完整植株，所述农杆菌细胞包含蛋白质或多肽，尤其异源蛋白或多肽的可表达核苷酸序列。在某些实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述温育步骤包括以倒转的位置温育浸润的植株。
在本发明的一个实施方案中，考虑到前述方面或实施方案的任一者，尤其在如本文所述的温育步骤(iii)的背景下，对于将植物在日光条件下温育每日7至9小时、优选每日8小时的修改可以适用于本发明的方法。
种植密度
在本发明的又一个方面，提供一般方法，所述一般方法包括在用细菌悬液浸润多个植株之前，在限定区域内以高密度培育所述植株，所述细菌悬液包含蛋白质或多肽、尤其异源蛋白质或多肽的可表达核苷酸序列。还构思在浸润后，将浸润的植株在限定区域内以高密度温育。还包括一种方法，其中在浸润之前和之后均将多个植物以高密度种植。
尤其，该方法包括以每平方米至少25至500个植株、至少每平方米50至400个植株、每平方米至少100至300个植株、每平方米至少150至250个植株、每平方米至少100至900个植株的密度培育多个植株。在一个实施方案中，将植株以每平方米至少100个植株的密度培育。在另一个实施方案中，将植株以每平方米至少500个植株的密度培育。在已经按上述条件在播种后培育30日至50日之间、尤其在播种后培育40日至50日、但是尤其在播种后培育46日的时间后，将多个植株用农杆菌细胞的悬液按先前段落中确定的OD600浸润，所述农杆菌细胞包含蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的可表达核苷酸序列。
在一个实施方案中，浸润后，植株以直立位置温育。
在另一个实施方案中，浸润后，植株以倒转位置温育。具体而言，将浸润的植株以倒转位置温育任何时间长度，尤其5日至10日之间的时间，其中倒转的浸润植株从上方光照。在本发明的一个方面，对植物每24小时光照7至9小时、尤其每24小时光照8小时。
这种方法导致增加的重组蛋白表达，如实施例14中所显示。
该方法特别可用于降低产生异源蛋白的成本。还提供一种温室，其适应于以每平方米至少25至500个植株，或每平方米至少100个植株的密度培育植物。
在一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项的方法，其中修改所述方法以包括以下步骤：在用细菌悬液浸润多个普通烟草植株之前，在限定区域内以高密度培育所述植株，所述细菌悬液包含蛋白质或多肽、尤其异源蛋白质或多肽的可表达核苷酸序列。具体而言，将多个普通烟草植株以每平方米至少25至500个植株、至少每平方米50至400个植株、每平方米至少100至300个植株、每平方米至少150至250个植株、但是尤其每平方米至少100个植株的密度培育。
在本发明的一个实施方案中，在限定区域内温育多个浸润植株的方法可以在根据前述方面或实施方案任一者的方法中、尤其在如本文所述的温育步骤(iii)中使用。
在本发明的一个实施方案中，考虑到前述方面或实施方案的任一者，对浸润之前以高密度在限定区域内培育多个植株的修改可以适用于本发明的方法。
酶降解浸润的植株的细胞壁
在本发明的又一个方面，提供了一般方法，其包括用降解或消化植物细胞壁的一种或多种酶处理农杆菌浸润的完整、完好植株以辅助异源蛋白的提取。在一个实施方案中，该方法包括通过本领域已知的技术，用一种或多种酶浸润经农杆菌浸润的植株，所述技术包括但不限于注射器浸润、真空浸润和正流体压力下浸润。浸润技术允许在机械破坏农杆菌浸润的植株之前，递送消化酶质外体间隙，这导致降解细胞壁而不释放大部分细胞内容物。这个浸润步骤可以使用相似设备进行，所述相似设备使得用农杆菌细胞悬液浸润完整完好植株成为可能。可以使用这种方法作为产生如前面实施方案任一者中所述的目的异源蛋白的各种方法中的任选步骤。实施例17描述一项实验，所述实验用农杆菌浸润的产生流感血凝素5(H5)的烟草植株展示本发明的这个方面的用途。
可以使用在工业过程中用来分解植物细胞壁的许多酶，包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和多聚半乳糖醛酸酶。可以使用的纤维素酶包括葡聚糖内切酶(E.C.3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(也称作葡聚糖外切酶，E.C.3.2.1.91)，或β-葡糖苷酶(还称作纤维二糖酶，E.C.3.2.1.21)。葡聚糖内切酶沿着纤维素链在内部并随机地水解β-糖苷键，而纤维二糖水解酶从纤维素链的还原性和非还原性末端除去纤维二糖分子。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成两分子的葡萄糖，并且因此消除纤维二糖对纤维二糖水解酶和葡聚糖内切酶的抑制。具有多聚半乳糖醛酸酶活性的酶水解聚半乳糖醛酸链中的糖苷键，其中所述聚半乳糖醛酸链作为1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸和甲氧基化衍生物的链常存在于植物细胞壁中。木聚糖酶(EC3.2.1.8)切割D-木糖之间的β,1-4键，所述D-木糖形成聚合物-木聚糖(植物半纤维素的主要组分)。这些酶中许多从真菌(木霉属(Trichoderma)物种、根霉属(Rhizopus)物种和曲霉属(Aspergillus)物种)和微生物获得，并且可以作为混合物商业地购买，例如，MacerozymeTM(纤维素0.1U/mg、半纤维素酶0.25U/mg、果胶酶0.5U/mg，bioWORLD，Dublin，Ohio，USA)；和DriselaseTM(昆布多糖酶，木聚糖酶和纤维素，Sigma-Aldrich，USA)。
用酶浸润后，可以将植物温育范围从至少1、2、5、10、12、18至24小时的一段时间。
产量
在一个实施方案中，本发明涉及一种根据前述方面或实施方案在普通烟草中产生蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的方法，条件是当可表达核苷酸序列编码蛋白质如Turbo绿色荧光蛋白(tGFP)或血凝素H5时，该蛋白质的积累量是浸润植株的可溶性总蛋白的至少1%、至少2%、至少5%、至少10%、至少15%或至少20%；或所述多肽或蛋白质的积累处于这样的水平，所述水平是在包含相同的可表达核苷酸序列的选定农杆菌菌株如步骤ii)和步骤iii)中所述使用时在本生烟草中可获得的水平的至少25%、至少50%、至少75%、至少110%、至少125%、至少200%、至少250%、至少300%、至少400%、或至少500%，如实施例14和15中分别例举。本领域已知的方法可以用来测量和比较该方法和对照的产量。
用于在植物中商业规模生产蛋白质的系统
在一个实施方案中，本发明涉及一个在普通烟草植物中产生蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽的系统，所述系统包括以下要素：(a)根据前述实施方案中任一项的选定普通烟草品种、育种系或栽培品种的完整植株，(b)根据前述实施方案中任一项的包含农杆菌菌株细胞的细菌悬液，所述农杆菌菌株与要素(a)的普通烟草品种、育种系或栽培品种的选定植株相容，从而所述植株在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌菌株注射后5日显示出少于20%坏死、少于10%坏死、少于5%坏死、少于2%坏死、少于1%坏死，(c)用根据前述实施方案中任一项的农杆菌细胞浸润完整植株的手段，和(d)任选地，以高密度培育植物并温育浸润植株的温室，所述温室适应于支持(i)以根据前述任意方面和如实施例14中例举的每平方米至少25至500个植株或每平方米至少100个植株的密度，培育多个植株；(ii)以根据前述任意方面和如实施例13中例举的倒转位置，根据前述任意方面和如实施例15中例举的采用每日7至9小时来自上方的光照，温育浸润的植株。
药物组合物
在允许表达构建体在多个植物细胞中表达肽或蛋白质的合适条件下温育植物或植物组织后，可以在植物或植物部分如植物器官或植物组织中或在其细胞中检出并定量蛋白质。在收获后，可以使用本领域常规的方法进行肽或蛋白质分离。例如，可以均化至少一部分生物质，并且提取和进一步纯化重组肽或蛋白质。提取可以包括将匀浆浸泡或浸没于合适的溶剂中。纯化方法包括但不限于，免疫亲和纯化方法和基于肽、蛋白质或蛋白质复合物的特定大小、待分离肽或蛋白质的电泳迁移率、生物活性和/或净电荷或基于蛋白质中存在标签分子的纯化方法。可以通过免疫测定法或通过本领域已知的其他方法实施已分离的肽或蛋白质的表征。例如，肽或蛋白质可以在SDS-PAGE凝胶上通过蛋白质印迹法，或当肽或蛋白质基本上纯化时通过马斯蓝染色进行分析。
可以将借助本发明方法产生的重组蛋白用作药物，并且可以因它们用作营养药和化妆品的用途而表达，因为这些产物用于直接摄入、注射或施加(例如，局部施用)至人。也可以表达重组蛋白，所述重组蛋白可用于生产类似受管制的兽用产品。
本发明的方法也可以用来表达一个或多个基因以复制用于化学合成或工业过程的酶促途径。
本发明的药物组合物优选地包含可药用载体。“可药用载体”意指任何类型的无毒固体、半固体、液体填料、稀释剂、包囊材料或配制辅料。如本文中所用的术语“肠胃外”指包括静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、皮下和关节内注射及输注的施用模式。载体可以是肠胃外载体，更具体地是与接受者血液等渗的溶液。此类载体溶媒的例子包括水、盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。非水溶媒如固定油和油酸乙酯以及脂质体也可用于本文中。载体适当地含有少量的添加物，如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类材料在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其他有机酸或它们的盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)(多)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；反离子如钠；非离子表面活性剂如聚山梨醇酯类、泊洛沙姆或PEG；或全部。
附图、表和序列的简述
本发明参考以下非限制性图、表和实施例进一步描述。
图1显示(A)最小植物可选的双元载体pC100和(B)最小双元载体pPMP1的示意图。
图2显示使用各种基因沉默阻抑因子就绿色荧光蛋白表达测试各种普通烟草品种PM67、PM81、PM92、PM128、PM132、PM133和PM204的结果。植物用A91(含有pC91基因构建体(其含有植物可表达tGFP盒)的AGL1菌株)和含有基因沉默阻抑因子p1(A18)、p25(A19)、AC1(A20)、2b(A21)、来自CNV的p19(A32)和HcPro(A120)的AGL1的细菌悬液浸润。在浸润后6日时的表达以mg/每kg冷冻叶鲜重显示。
图3显示用pBINPLUS双元载体中携带tGFP表达盒的各种农杆菌菌株浸润的烟草品种Simmaba、PM132、Burley21、PM16、PM21，K149，PO1和PO2(A)和PM92、Yaka JB125/3和PM204(B)。全部悬液均与含有HcPro基因沉默阻抑因子的AGL1(pC120)组合测试。植物用农杆菌菌株AGL1(A91)、EHA105(E91)、GV2260(G91)、LBA4404(L91)、GV3101(V91)和Cry-5(Y91)和AGL1(pC120)真空浸润。TurboGFP浓度在浸润后6日测定并且以mg/每kg冷冻叶重显示。
图4显示瞬时表达H5的普通烟草PM132和本生烟草的粗提物中H5的蛋白质印迹分析。在瞬时表达H5的普通烟草PM132和本生烟草中检测到预期大小(75kDa)的条带，并且在模拟或野生型对照中没有检测到该条带。在Dubelco's PBS 1x中从冷冻粉碎叶的材料以1g冷冻重量对2ml提取缓冲液的比率提取可溶性总蛋白。将等体积的提取物(对应于每孔45至55μg总蛋白)和H5对照蛋白在含SDS的上样缓冲液+还原剂中变性并且上样到4-12%Bis-Tris NuPAGE凝胶上。使用iBlot仪(Invitrogen)，将蛋白质转移至PVDF膜。H5的检测：1)与1/1,000稀释O/N的第一抗体[兔抗H5，Immunetech#IT-003-005V，1mg/0.5ml]在4℃温育；2)与1/10,000稀释度的第二抗体[HRP缀合的山羊抗兔，Jackson目录号11-035-046，0.4mg/ml]在室温温育1小时；与HRP底物ECL-Plus(GE#RPN2132)在室温温育5分钟，4)用Chemismart检测化学发光(曝光2分钟，光圈8)。
图5显示接种物中农杆菌密度(OD接种物)和A91/A120(COI:SoS)比率对6DPI时三个烟草品种：ABurley21、BPM132和CPM204的TurboGFP表达水平(以mg/kg冷冻重量为单位；值以白色框表示)的预测影响的2D等值线图。
图6显示接种物制备中移除离心步骤对烟草瞬时表达的影响。烟草品种Burley21、PM132和PM204的植株用A91和A120共浸润，所述A91和A120从离心并重悬于浸润溶液中或直接稀释于浸润溶液中的培养物制备。在6DPI时进行tGFP表达的荧光测量。棒指示均数标准误。
图7显示浸润后4日至6日在保持直立或颠倒的PM132烟草植株中以mg/kg叶生物量鲜重计的tGFP表达。
图8显示浸润后，与20小时长时光照相比，8小时短时光照下温育的烟草植株中以mg tGFP/kg新鲜叶生物量计的tGFP表达时程。
表1列出测试的全部普通烟草品种。
表2列出了表达C5-1单克隆抗体超过对照本生烟草25%的二十六个(26)普通烟草品种，如免疫斑点印迹法所测定。++：在对照本生烟草的25%和50%之间的信号；+++：等于或高于对照本生烟草50%的信号。给出浸润植株的表型并且与相同品种的未浸润植株比较。
表3显示以每平方米25或100个植株所培育的普通烟草PM132和PM217的植株特征。高度以cm计，气孔导度以μmol/m2s计，叶绿素含量指数（CCI)如从CCM-200叶绿素计(Opti-Science，USA)的传感器读取，叶厚度以mm计并且含水量以%计。
表4显示以直立或颠倒位置温育5日时，在浸润之前和浸润后，以每平方米25或100个植株所培育的普通烟草PM132和PM217植株的叶内的tGFP和H5表达。
表5显示以每平方米75个植株所培育的普通烟草PM132的植株特征，所述普通烟草PM132用来确定浸润后短日照和长日照温育的作用。高度以cm计，气孔导度以μmol/m2s计，叶绿素含量指数CCI)如从CCM-200叶绿素计(Opti-Science，USA)的传感器读取，叶厚度以mm计并且含水量以%计。
在说明书和实施例中，提到序列表中表述的以下序列：
SEQ ID NO:1描述载体pPMP1的核苷酸序列
SEQ ID NO:2描述最小35S-CaMV启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO:3描述5'UTR HT-CPMV的核苷酸序列
SEQ ID NO:4描述3'UTR HT-CPMV的核苷酸序列
SEQ ID NO:5描述P1-HcPro-P3的核苷酸序列
SEQ ID NO:6描述正向引物PC201F的核苷酸序列
SEQ ID NO:7描述反向引物PC202R的核苷酸序列
SEQ ID NO:8描述优化的流感血凝素5的核苷酸序列
SEQ ID NO:9:描述在EcoR1和Hind3位点之间的pMMV单增强的启动子片段的核苷酸序列
SEQ ID NO:10:描述在EcoR1和Hind3位点之间的pMMV双增强的启动子片段的核苷酸序列
SEQ ID NO:11:描述在EcoR1和Hind3位点之间的pFMV单增强的启动子片段的核苷酸序列
SEQ ID NO：12:描述在EcoR1和Hind3位点之间的pFMV双增强的启动子片段的核苷酸序列
SEQ ID NO:13:描述在EcoR1和Hind3位点之间的pPClSV单增强的启动子片段的核苷酸序列
SEQ ID NO:14:描述在EcoR1和Hind3位点之间的pPClSV双增强的启动子片段的核苷酸序列
SEQ ID NO:15:描述patatin信号肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:16:描述如C148中的patatin烟草未优化序列(略微修饰)(在重链之前)
SEQ ID NO:17:描述如C148中的patatin烟草优化序列(在轻链之前)
SEQ ID NO:18:描述如C148中的利妥昔单抗成熟重链(烟草优化)序列的核苷酸序列
SEQ ID NO:19:描述利妥昔单抗成熟重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:20:描述如C148中的利妥昔单抗成熟轻链(烟草优化)序列的核苷酸序列
SEQ ID NO:21:描述利妥昔单抗成熟轻链的氨基酸序列
实施例
提供以下实施例作为说明并且不作为限制。除非另外说明，否则本发明采用分子生物学、细胞生物学、重组DNA技术、植物生物学、植物育种和蛋白质生产的常规技术和方法。
实施例1：农杆菌浸润烟草植株
本实施例描述了用农杆菌细胞浸润普通烟草选择定品种、育种系或栽培品种的各种方法。完整植株或植物组织可以用农杆菌浸润，通过真空、通过高压或通过无针头注射器辅助。在浸润之前，将烟草植株在温室中在岩棉块内培育，20小时光照时间和4小时黑暗时间，26℃/20℃昼/夜和70%/50%相对湿度(昼/夜)。通过地下渗灌给予植物肥料。
接种物的制备
将包含双元载体(其含有T-DNA，其中目的基因在植物调节元件控制下)的根癌农杆菌或发根农杆菌细菌在回转摇床上的锥形烧瓶中包含2g/L牛肉提取物、0.4g/L酵母提取物、2g/L Bacto-蛋白胨、2g/L蔗糖，0.1g/L MgSO4和用于选择相应农杆菌菌株及双元载体的合适抗生素的YEB-培养基内在28℃和250转/分钟培育直至OD600>1.6。随后将培养物在含有10mM2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)和合适抗生素的新鲜LB培养液Miller培养基中1:100稀释并且进一步在回转摇床上在28℃和250转/分钟培育直至OD600>2。通过在8,000g和4℃离心15分钟收集细菌。将沉淀的细菌重悬于终末pH为5.6并且OD600>2的含有10mM MgCl2和5mM MES的浸润溶液(在本文中称作浸润溶液)中。任选地，可以将细菌进一步稀释于浸润溶液中，并且可以添加乙酰丁香酮以诱导毒力。任选地，如上文所述制备的第一农杆菌细菌悬液与携带具有第二可表达基因的第二双元载体的第二农杆菌悬液混合。这种第二基因的非限制性例子是编码基因沉默阻抑因子的编码序列。任选地，接种物可以在使用之前于4-6℃贮存至多到1周。
注射器浸润
将具有标准2-ml注射器尺度的注射器填充细菌浸润溶液和在没有针头的情况下抵住叶的背轴面压紧。压下活塞以迫使细菌悬液进入叶组织中。重复这个过程直至大多数叶表面被浸润。在浸润后，保持植株处于低光照最低8小时并且在第一日期间保护免受充分光照。次日，将植株置于正常光照条件下直至收获。
真空浸润
通过以下方式浸润植株：在填充有细菌接种物的10L烧杯中浸没地上部分并且使整个感染的植株或感染的植物部分暴露于大大降低的大气压(本文中通常称作真空)。使用与V-855调节器连接的V-710Büchi泵，在玻璃钟型罩(Schott-Duran Mobilex300mm)内进行真空浸润，和压力在3至4分钟内从大气压(1巴)降至50毫巴。一旦达到，将钟型罩中的真空保持1分钟，随后在大约2秒内返回大气压。在整个浸润过程期间保持人工光照(80-100μmol光子/cm2)以确保一致性光照条件。在浸润后，将植物连同未浸润的对照植物一起置于温室中直至收获。生长条件如施肥、光周期和温度与浸润之前所用相同。使用滴灌系统将水和肥料施加至植物。
收获和材料采样
采样可以在16小时后开始，但是一般，在温室中温育6日后收获浸润的叶或浸润的叶区域。将叶材料置于可热密封的小袋内，密封并置于干冰层之间至少10分钟。在收获后，将全部叶样品贮存在-80℃直至进一步加工。使用咖啡研磨机，将收获的叶子在干冰上均化成细粉末并且通过以下方式提取：(i)2个步骤在含有50mM Tris碱、100mM NaCl、1mM EDTA、0.2%Triton X-100、终末pH7.5的3vol/wt提取缓冲液中涡旋混合，每次20秒，并且(ii)通过在20,000g离心15分钟。将可溶性提取物保持在冰上直至分析。
实施例2：用于瞬时表达的双元载体
本实施例描述了设计和开发含有卡那霉素抗性基因以便选择转化植物细胞和用于本申请中的pPMP1载体和最小pC100双元载体。
T-DNA区域和骨架片段的构建
对多拷贝双元载体pBIN61(Bendahmane等人,2000.PlantJournal21:73-81)的约13,500碱基对长度的核苷酸序列分析在转基因细胞复制、维持、选择和转移T-DNA方面具有功能的核酸。形成仅包含具有如上所述功能的核酸的新核苷酸序列。将所得到的核苷酸序列以两部分化学地合成。化学地合成第一片段，所述第一片段含有由T-DNA右边界(RB)和T-DNA左边界(LB)界定的T-DNA区域、在胭脂碱合酶(pNOS)启动子和tNOS终止子控制下的pBIN61的植物可选性卡那霉素抗性(nptII)基因和单一StuI、AscI和EcoRI限制性位点，带有侧翼PvuII限制性位点，并且将其克隆在pUC衍生的pMK载体(Geneart，雷根斯堡，德国)的PvuII位点中，所述pMK载体还含有ColE1复制起点(Col E1ori)和细菌性卡那霉素抗性基因(KmR)，从而产生pGA13。化学地合成第二片段，所述第二片段含有带ColE1ori的骨架区域和最小RK2 oriV复制起点以及编码源自pBIN61的TrfA复制启动蛋白的RK2的基因，带有单一AscI、StuI和PvuII限制性位点，并且将其克隆在pUC衍生的pMA载体(Geneart，雷根斯堡，德国)的PvuII位点中，所述pMA载体还含有氨苄青霉素(ApR)抗性基因，从而产生pGA14。
pC100的设计和形成
通过合并从头合成的两个片段-第一片段和第二片段，产生植物可选择最小双元载体pC100(图1A)。第一片段含有1：在大肠杆菌和农杆菌中有功能并包含新霉素磷酸转移酶III基因的卡那霉素耐药基因；2：ColE1复制起点；3：最小oriV复制起点(Kowalczyk L.等人,Molecular Microbiology,2005,57(5):1439-1449)；4：IncP质粒的激活oriV的trfA1基因(Kongsuwan K.等人,J.Bacteriology,2006,188(15):5501-5509)；和5：在所述片段最末端的单一AscI和StuI限制性核酸内切酶识别位点，用于合并所述片段1和片段2以产生最小双元载体pC100。第二片段含有T-DNA区域，所述T-DNA区域含有6：农杆菌T-DNA左边界序列；7：农杆菌T-DNA右边界序列；8：任选地，用于选择转基因植物细胞并且包含在根癌农杆菌胭脂碱质粒的胭脂碱合酶启动子和胭脂碱合酶终止子序列控制下的新霉素磷酸转移酶II基因的选择标记基因；9：用于克隆外来基因并且位于7(T-DNA右边界)和8(选择标记基因)之间的单一EcoRI限制性核酸内切酶识别位点，和10，在所述片段最末端的单一AscI和StuI限制性核酸内切酶识别位点，用于组合所述片段2和片段1以产生最小双元载体pC100。
构建pPMP1最小双元载体
通过以下方式构建pPMP1(5139bp；图1B)：从pC100缺失植物可选性nptII基因，产生具有SEQ ID NO:1的最小双元载体pPMP1。pPMP1含有在位置+1的单一EcoRI限制性位点；在位置+69至+94处的LB；250bp的第一间隔序列其中该间隔序列在复制pPMP1、细菌细胞中维持或转移T-DNA区域至植物细胞方面没有功能；大约1100bp的第一序列，其含有从+653至+1454的KmR基因编码序列和该编码序列上游和下游的大约300bp调节序列；大约150bp的第二间隔序列；含有从+1602至+2269的ColE1 ori的第二序列；大约150bp的第三间隔序列；大约1500bp的第三序列，其含有从+3662至+2517的TrfA编码序列和该编码序列上游和下游的大约350bp的调节序列；大约450bp的第四间隔序列；含有从+4932至4303的RK2 oriV的第四序列；109bp的第五间隔序列；在位置5041至5066的RB和在位置+5139处的单一EcoRI限制性位点。
实施例3：用于可视化烟草中瞬时表达的报道分子测定法
本实施例描述了用于在植物细胞内确定异源基因在所述植物细胞中的转化效率和表达的各种报道分子测定法。
β-葡糖醛酸糖苷酶测定法
将β-葡糖醛酸糖苷酶用作报道分子并且根据Jefferson等人,EMBOJ,1987,6:3901-3907中描述的方法进行分析。
绿色荧光蛋白测定法
烟草植物用根癌农杆菌菌株AGL1的细胞共浸润，所述细胞含有(i)基因沉默阻抑因子p19并且单独地(ii)含有桡足类羽小角水蚤(Pontellina plumata)绿色荧光蛋白的改进变体，其作为TurboGFP市售(Evrogen，USA，目录号FP552)。p19的表达受双重花椰菜花叶病毒35S启动子驱动。TurboGFP的表达受最小花椰菜花叶病毒35S启动子和豇豆花叶病毒(HT-CPMV)的5'UTR驱动。对于两种细菌悬液的每一者(一种包含TurboGFP的编码序列并且另一种包含基因沉默p19阻抑因子)，将浸润混合物中的细菌浓度调节至OD600=0.16。将用于浸润的植株在温室中在岩棉块内培育，20小时光照时间和4小时黑暗时间，26℃/20℃昼间温度/夜间温度和70%/50%相对湿度(昼/夜)。通过地下渗灌给予植物肥料。遵循标准浸润操作方案或如实施例1中所述通过注射器浸润法，将植物在50毫巴浸润1分钟。
真空浸润后立即将植物在支架上颠倒悬挂2分钟以减少留在叶上的过量浸润溶液，然后在实验的剩余部分置于温室台面上。浸润后的肥料制剂保持与浸润前相同，并且通过滴灌系统每日两次45秒供应施肥灌溉(ferti-irrigation)。定性和定量分析植株中的GFP表达。在蓝光灯(HL32T Hand Lamp,Clare Chemical Research,USA)下进行GFP的定量估计，所述蓝光灯发射在激发TurboGFP的范围内的光线(激发波长=482nm和发射波长=502nm)。在Modulus微量平板读数仪(Turner Biosystems)上按荧光模式用蓝色光学套件((激发波长=490nm和发射波长=510-570nm)，通过荧光测量确定叶中GFP的定量性分析。在任何给定的收获时点，从三个植株/处理，用叶盘打孔器从每个植株5片叶(来自位置1-5的充分膨大叶，0代表苗顶端分生组织，并且1是第一叶)采集大约80mg叶盘。将样品在液氮中快速冷冻并贮存在-80℃，然后在TissueLyser(Qiagen)中在1ml提取缓冲液存在下研磨大约2.5分钟，所述提取缓冲液包含50mM Tris，2mM DTT，150mM NaCl，1%Triton X-100和4M脲，pH7.4。碾磨后，将样品在微量离心机中以全速度离心10分钟，并且收集500μl上清液并贮存在-20℃直至分析。通过从单个微量离心管的每种提取物中收集200ul上清液汇集来自单个植株的5片叶的样品。将汇集的提取物在4℃再次离心10分钟，并将700μl上清液转移至一个新管。为了定量荧光，将5μl上清液稀释于195μl提取缓冲液中并且在微量平板读数仪中测量。使用以商业重组TurboGFP蛋白产生的标准曲线计算GFP的浓度。通过添加不同量的重组TurboGFP蛋白至1:40稀释于提取缓冲液中的对照烟草植株提取物，制备标准曲线。
实施例4：通过瞬时表达比较普通烟草品种
本实施例描述了比较(i)农杆菌浸润后多于90个普通烟草品种中单克隆抗体C5-1的表达和(ii)浸润之前和之后植株的表型特征。
普通烟草品种
测试了如表1中列出的超过九十个(>90)普通烟草品种，目的在于鉴定适于瞬时表达重组蛋白的烟草品系。选定烟草品系，从而它们包括世界范围培育的烟草类型的最大可能多样性，包括烤烟(flue curedtobacco)、白肋烟草(burley)、东方烟草(oriental)、半东方烟草和雪茄烟外包烟草品系。测试以下烟草品种：普通烟草AA37-1、普通烟草B13P、普通烟草Xanthi(Mitchell-Mor)、普通烟草KTRD#3Hybrid107、普通烟草Bel-W3、普通烟草79-615、普通烟草Samsun HolmesNN、来自杂交普通烟草BU21x普通烟草Hoja Parado的F4、品系97、普通烟草KTRDC#2Hybrid49、普通烟草KTRDC#4Hybrid110、普通烟草Burley21、普通烟草PM016、普通烟草KTRDC#5KY160SI、普通烟草KTRDC#7FCA、普通烟草KTRDC#6TN86SI、普通烟草PM021、普通烟草K149、普通烟草K326、普通烟草K346、普通烟草K358、普通烟草K394、普通烟草K399、普通烟草K730、普通烟草KY10、普通烟草KY14、普通烟草KY160、普通烟草KY17、普通烟草KY8959、普通烟草KY9、普通烟草KY907、普通烟草MD609、普通烟草McNair373、普通烟草NC2000、普通烟草PG01、普通烟草PG04、普通烟草PO1、普通烟草PO2、普通烟草PO3、普通烟草RG11、普通烟草RG17、普通烟草RG8、普通烟草Speight G-28、普通烟草TN86、普通烟草TN90、普通烟草VA509、普通烟草AS44、普通烟草Banket A1、普通烟草Basma Drama B84/31、普通烟草Basma I Zichna ZP4/B、普通烟草Basma Xanthi BX2A、普通烟草Batek、普通烟草BesukiJember、普通烟草C104、普通烟草Coker319、普通烟草Coker347、普通烟草Criollo Misionero、普通烟草PM092、普通烟草Delcrest、普通烟草Djebel81、普通烟草DVH405、普通烟草
Figure BDA0000369555190000701
Comum、普通烟草HB04P、普通烟草Hicks Broadleaf、普通烟草KabakulakElassona、普通烟草PM102、普通烟草Kutsage E1、普通烟草KY14xL8、普通烟草KY171、普通烟草LA BU21、普通烟草McNair944、普通烟草NC2326、普通烟草NC71、普通烟草NC297、普通烟草NC3、普通烟草PVH03、普通烟草PVH09、普通烟草PVH19、普通烟草PVH2110、普通烟草Red Russian、普通烟草Samsun、普通烟草Saplak、普通烟草Simmaba、普通烟草Talgar28、普通烟草PM132、普通烟草Wislica、普通烟草Yayaldag、普通烟草NC4、普通烟草TR Madole、普通烟草Prilep HC-72、普通烟草Prilep P23、普通烟草Prilep PB156/1、普通烟草Prilep P12-2/1、普通烟草Yaka JK-48、普通烟草Yaka JB125/3、普通烟草TI-1068、普通烟草KDH-960、普通烟草TI-1070、普通烟草TW136、普通烟草PM204、普通烟草PM205、普通烟草Basma、普通烟草TKF4028、普通烟草L8、普通烟草TKF2002、普通烟草TN90、普通烟草GR141、普通烟草Basma xanthi、普通烟草GR149、普通烟草PM216、普通烟草PM217、普通烟草GR153、普通烟草Petit Havana、普通烟草PM215。
烟草品种可以从北卡罗来纳州州立大学作物科学系烟草保藏中心(Oxford，北卡罗来纳州，USA)获得。对于全部品系，测量农艺参数(生物质、能育性、均一)和分析参数(可溶性总蛋白、总蛋白酶、总生物碱)。为此目的，将烟草植株分别在温室中的常规浮动床下在12cm钵中培育。在收获时测量农艺参数和分析参数。通过第一和第二根癌农杆菌悬液的注射器共浸润进行瞬时表达研究。第一根癌农杆菌悬液是携带下述双元载体的根癌农杆菌AGL1细菌，所述双元载体包含在植物调节元件控制下的单克隆抗体编码序列。第二根癌农杆菌悬液是这样的AGL1细菌，其携带在植物调节元件控制下的黄瓜坏死病毒的基因沉默p19阻抑因子的编码序列。全部浸润实验均一式三份各自在三个植株中进行。为每个烟草品系保留1个额外植株作为对照。
基因构建体
基因构建体C7是含有两个表达盒的pCambia衍生的双元载体，所述表达盒包含在质体蓝素pPC启动子和终止子序列控制下的单克隆抗体C5-1重链和轻链。基因构建体C32是含有下述表达盒的pKYLX7衍生的双元载体，所述表达盒包含在花椰菜花叶病毒35S启动子和终止子控制下的黄瓜坏死病毒(CNV)的基因沉默p19阻抑因子。全部双元载体均位于根癌农杆菌菌株AGL1中。
C5-1单克隆抗体的瞬时表达
将烟草植株分别在温室中的12cm钵内培育。使用注射器如实施例1中所述，将每个烟草品种的三个植物用细菌悬液浸润。在6日浸润后，在热封袋中收集来自1个植株的全部浸润叶，冷冻至-80℃，并且随后研磨成细粉末并充分均化。对于每个植株，从3ml提取缓冲液中的大约1g冷冻重量的研磨叶粉末提取可溶性总蛋白。提取缓冲液是50mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、0.1%TritonX-100、4M脲和2mMDTT。作为参考，制备了用相同农杆菌悬液同时浸润的本生烟草植物的相同提取物。为了分析C5-1的表达，将植物提取物稀释200倍，并使用Easy-滴度ELIFA印迹免疫测定法系统(Pierce)，将连续稀释物点在硝酸纤维素上膜。将硝酸纤维素膜与1:5,000稀释度的来自Jackson ImmunoResearch(目录号#115-0.5-205)的HRP-标记抗体温育。目视方式分析膜上的信号，并且与参考本生烟草提取物的连续稀释物的信号强度相比，基于信号强度的目视解读，对每个植株给予评分。评价如下：
+=点可检测，但是低于参比样品信号的25%，
++=在参比样品信号的25%和50%之间，
+++=在参比样品信号的50%和100%之间，
结果
在对照植物中没有检测到信号，并且90个测试的品种中，26个品种显示合理的表达并且获得++评分。64个品种不显示任何表达或仅具有少量表达。表2中给出显示表达单克隆抗体C5-1的26个品种的列表。
实施例5：基因沉默阻抑因子对普通烟草中绿色荧光蛋白的瞬时表达的影响
在这个实施例中，描述了使用农杆菌浸润时，比较各种基因沉默阻抑因子对众多烟草品种中报道基因构建体表达的影响。还描述了(i)驱动基因沉默阻抑因子表达的启动子和(ii)靶蛋白对基因沉默阻抑因子之比的影响。
报道分子构建体和基因沉默阻抑因子构建体
绿色荧光蛋白基因是Evrogen的TurboGFP(tGFP)基因(见实施例3)。将TurboGFP基因克隆处于pBINPLUS中的花椰菜花叶病毒35S启动子和HT-CPMV序列和NOS终止子序列控制下，从而产生基因构建体pC91。测试以下基因沉默阻抑因子：黄瓜坏死性病毒(CNV)的p19蛋白、稻黄斑驳病毒(RYMV)的p1蛋白、马铃薯病毒X(PVX)的p25蛋白、非洲木薯花叶病毒(ACMV)的AC2蛋白、黄瓜花叶病毒(CMV)的2b蛋白和烟草蚀纹病毒(TEV)的辅助组分蛋白酶(HcPro)。将基因沉默阻抑因子RYMV的p1、PVX的p25、ACMV的AC2、CMV的2b、PVY的HcPro和CNV的p19以有义方向平端克隆在pBIN61(Bendahmane等人,Plant J,2000,21:73-81)的SmaI位点中，处于花椰菜花叶病毒35S启动子和终止子序列的控制下，以便分别产生基因构建体pC18、pC19、pC20、pC21、pC120和pC32。全部序列是公众可获得的。
启动子基因构建体
为检验驱动基因沉默阻抑因子表达的各种启动子的作用，还将如基因构建体pC32中在花椰菜花叶病毒35S启动子和终止子控制下存在的CNV p19置于(i)胭脂碱合酶pNOS启动子(基因构建体pC224)和(ii)紫花苜蓿栽培品种WL357HQ质体蓝素启动子pPC(GenBankEF628506.1)的控制下，从而产生pBIN61相关的基因构建体pC226。
植物材料
如实施例4中所述，在温室中培育本生烟草和普通烟草PM67、PM81、PM92、PM128、PM132、PM133和PM204植株。
浸润和表达分析
如实施例1中所述，将6周龄和7周龄植株通过真空浸润法浸润。全部基因构建体均位于根癌农杆菌菌株AGL1中。A18是AGL1(pC18)，A19是AGL1(pC19)，A20是AGL1(pC20)，A21是AGL1(pC21)，A32是AGL1(pC32)，A120是AGL1(pC120)，A224是AGL1(pC224)，A226是AGL1(pC226)，A91是AGL1(pC91)。绿色荧光蛋白表达的分析如实施例3中所述。
测试各种普通烟草品种和基因沉默阻抑因子的结果
将各种基因沉默阻抑因子增强烟草中tGFP表达的效率与本生烟草植株中的效率比较。两个品种PM92和普通烟草
Figure BDA0000369555190000731
显示更显著的坏死和褪绿。所述基因沉默阻抑因子均没有在本生烟草中造成可见到的胁迫症状。在蓝光下在6DPI时检查本生烟草中tGFP的表达，并且最佳结果用pC120基因构建体共转染的植物获得，所述pC120基因构建体产生十分强烈的GFP荧光信号。当测试的全部7个品种的烟草植株采用如pC120中的HcPro基因沉默阻抑因子共转染时，普通烟草叶中的tGFP荧光最高(图2)。当普通烟草PM204用RYMV的p1基因沉默阻抑因子(A18中的pC18；图2)和ACMV的AC2基因沉默阻抑因子(A20中的pC20；图2)共浸润时，也存在合理的表达。就测试的3种基因沉默阻抑因子而言，对普通烟草PM204获得最佳结果，并且用HcPro(pC120)共浸润时，存在最高表达，随后是AC2(pC20)和p1(pC18)。
测试普通烟草PM132和204和基因沉默阻抑因子的结果
在6周龄植株中测试基因沉默阻抑因子TEV的HcPro、ACMV的AC2和CNV的p19对PM132和PM204中tGFP表达的影响。此外，测试了驱动CNV的基因沉默p19阻抑因子的3种不同植物表达启动子的作用。测试以下启动子：pC32中的花椰菜花叶病毒35S启动子及终止子、pC224中的胭脂碱合酶启动子及终止子和pC226中的pPC质体蓝素启动子及终止子。在浸润后6日对tGFP表达水平的定量显示，仅当HcPro沉默阻抑因子与携带tGFP基因构建体的A91组合使用时才获得高表达。PM132和PM204中的表达水平比其他基因沉默阻抑因子所获得的那些表达水平高3倍。值得注意地，与7周龄植株相比浸润6周龄烟草植物时，在PM132和PM204中观察到tGFP表达水平增加至多10倍。
实施例6：比较多种烟草品种的生物量生产率、生物碱、可溶性总蛋白和总蛋白酶活性
该实施例提供众多普通烟草品种的生物量生产率、可溶性总蛋白含量、蛋白酶含量和生物碱的含量的比较。
植物材料
使用常规浮动床系统，将表1中列出并且在实施例5中描述的全部烟草品种在288个细胞Styrofoam托盘(0.25m2/托盘)中培育。在温室中使用随机区组设计，一式两份培育烟草品种。在各个时期收获叶以测定叶的可溶性总蛋白含量、总蛋白酶和生物碱含量。在温室中收集温室培育的烟草植株的叶，将它们在液氮中快速冷冻并且研磨成细粉末，将所述细粉末转移至50ml管并且贮存在-80　C直至进行测定法。
提取叶材料用于酶测定法
将研磨的烟草叶粉末与4体积提取缓冲液混合，所述提取缓冲液含有50mM磷酸钾、1%不可溶性PVP和0.1%β-巯基乙醇，以NaOH缓冲至pH7.5。将匀浆以1,200g离心10分钟并且将上清液用来测定蛋白酶酶活性并用于测定可溶性总蛋白含量。
酶测定法
如Ragster和Chrispeels,Plant Physiology,1979,64:857-862所述，通过测量红色染料从Azocoll(Calbiochem)释放测定Azocoll消化活性(胶原酶)。将20mg Azocoll底物与50-100μl酶提取物在25mM Tris-HCl，pH9.0缓冲液中以2ml总体积混合并且在37℃的水浴中温育15分钟。通过冷却该管至2℃持续15分钟终止反应并随后以2,000g离心10分钟。将上清液置于分光光度计中，并且在520nm测量消光系数。
生物碱的测定
将0.1g研磨的烟草叶粉末转移至玻璃小瓶中，并且添加0.5ml氢氧化钠溶液(2N NaOH)。在15分钟后，添加含有0.4mg/ml喹啉的5ml甲基叔丁基醚溶液，并且将样品振摇2.5小时。将顶层流体转移至一只新的玻璃闪烁计数小瓶并且加载到Perkin Elmer AutosystemXL气相色谱自动采样器上用于测量。如Chen等人,Beitrage zurTabakforschung International,2005,21:369-379所述测量生物碱的量。
可溶性总蛋白
如Bradford,Analytical Biochemistry,1976,72:248-254中所述，使用Coomassie-Plus分析试剂(Pierce)，通过微量平板读数仪上在595nm测量吸光度，测定叶提取物中的可溶性总蛋白(TSP)含量。将提取物在超纯水中1:10稀释，将10μL一式三份加载在平底微量平板上。
结果
Coker347、PM132、PM092、PM204、PM102和Saplak的提取物的蛋白酶活性分别是145.6、118.4、116.6、109.8、39.7和15.1。以g/s qm计的F4(BU21xHojaParado)/97、PM102、PM132、PM204、PM092的叶生物量生产率分别是400938、318306、190506、187442和187422。以mg/g叶组织计的PM016、PM021、PM092、PM102、PM132和PM204的生物碱含量分别是3.57、1.79、0.41、3.2、0.79和0.66。以μg/mL计的PM016、PM021、PM092、PM102、PM132和PM204的蛋白质含量分别是525、374、317、288、261和311。
实施例7：农杆菌菌株对瞬时表达的影响
在该实施例中，描述了使用6种不同根癌农杆菌菌株用于农杆菌浸润烟草品种对靶蛋白表达的影响。
农杆菌菌株和双元载体
为测试农杆菌菌株对瞬时表达的影响，将烟草植株如实施例1中所述用各自携带基因构建体pC91的根癌农杆菌菌株AGL1、EHA105、GV2260、GV3101、Cry5和LBA4404真空浸润。pC91含有在pBINPLUS双元载体中处于花椰菜花叶病毒35S启动子和HT-CPMV前导序列和胭脂碱合酶终止子序列控制下的tGFP基因。全部植株用携带pC120的AGL1共浸润，所述pC120包含HcPro的可表达序列。A91是AGL1(pC91)，E91是EHA105(pC91)，G91是GV2260(pC91)，L91是LBA4404(pC91)，V91是GV3101(pC91)，Y91是Chry5(pC91)并且A120是AGL1(pC120)。
接种物的制备
将农杆菌培养物在补充有适宜抗生素的LB Miller MES pH5.6中培养，直至最终光密度(OD600)>2.0。将细菌通过离心收获并重悬于浸润溶液(10mM MgCl2，5mM MES，pH5.6)中。在每个实验中，将携带构建体pC91的农杆菌悬液以等体积与携带沉默阻抑因子基因的农杆菌悬液混合以产生6x浓缩接种物。在浸润当日，将浓缩的接种物在浸润溶液中稀释至1x终浓度(对应于OD600约0.3)并平衡至室温。
植物材料
将普通烟草Burly21、PM16、PM21、K149、PO1、PO2、PM92、Simmaba、PM132、Yaka JB125/3和PM204植株在温室中于12cm钵内，按20小时光照和4小时黑暗的光周期方案在温度26℃/20℃昼/夜和相对湿度70%/50%昼/夜培育。
植株的浸润
如实施例1中所述在真空下浸润植株。在整个浸润过程期间保持人工光照(80-100μmol光子/cm2)以确保一致性光照条件。在浸润后，将植株放回温室中直至收获。通过比较浸润的植株与未浸润的对照，肉眼观察胁迫症状如褪绿(叶黄化)和坏死性损害(“死”斑)的出现。生长条件如施肥、光周期和温度与浸润之前所用相同，不过现在使用滴灌系统向植株施加水和肥料。浸润后4至6日，将植物置于在蓝光下并收集显示荧光的全部浸润叶，置于拉链袋中并贮存在-80℃直至加工用于分析。
Turbo GFP成像和定量
在蓝光下暗室中监测收获的叶中tGFP的积累。将收获的叶子在干冰下均化成细粉末，并且将1.00g+/-0.05g冷冻重量的粉末的样品在3ml提取缓冲液中(50mM Tris碱；100mM NaCl；EDTA1mM；0.2%Triton X-100；pH7.5)通过以下两个步骤提取：涡旋混合20秒，随后以20,000g离心15分钟。将可溶性提取物保持在冰上用于分析。将普通烟草提取物在提取缓冲液中1:50稀释并且将200uL一式三份加载到黑色96孔板(Corning)上。在Modulus微量平板读数仪(TurnerBiosystems)上用Blue光学套件(激发波长：490nm/发射波长：510-570nm)，通过荧光测量确定提取物中的TurboGFP浓度。通过扣减未浸润的对照植株的提取物的自发荧光来校正样品荧光。通过添加浓度范围4000至125ng/ml的TurboGFP对照蛋白(rTurboGFP，Evrogen#FP552)至提取缓冲液中1:50最终稀释的未浸润的提取物，制备标准曲线。
结果
将植株以两个批次浸润。首先，将普通烟草Burley21、PM016、PM21、K149、PO1、PO2、Simmaba和PM132浸润并分析tGFP的表达。浸润后6日，可以观察到农杆菌菌株Cry5和GV2260造成严重胁迫反应，包括在大部分测试的烟草品种的叶上的褪绿和坏死性损害。此外，烟草品种PM016、PM21和K149表现出对农杆菌浸润高度敏感并且随许多测试的菌株观察到强烈坏死。测试的全部菌株的最高表达总是采用PM132时出现(图3A)。令人惊讶地，对携带pC91基因构建体的农杆菌菌株AGL1和EHA105获得超过两倍更高的表达，与GV2260的400mgtGFP/kg冷冻叶重量、GV3101的200mg tGFP/kg冷冻叶重量和Cry-5和LBA4404的少于100mg tGFP/kg冷冻叶重量相比，达到大约700mgtGFP/kg冷冻叶重量。烟草品种Burley21、PM016、PM21、K149、PO1、PO2和Simmaba产生少得多的tGFP，根据所用农杆菌菌株，从零变动至最高大约200mg tGFP/kg冷冻叶重量。当使用AGL1递送两种基因构建体时，烟草品种PM92和PM204产生至多到400mg tGFP/kg冷冻叶重量。值得注意地，当使用EHA105时，PM204也产生至多到400mgtGFP/kg冷冻叶重量，但是使用相同细菌用于递送时，其他烟草品种PM92和PM181仅产生这个量的一半(图3B)。
结论
由携带目的构建体(由基于HT-CPMV表达盒中的tGFP报道基因代表)的根癌农杆菌AGL1或EHA105和携带沉默阻抑因子(HcPro)的AGL1组成的组合在这个实验中导致tGFP的最高积累量。两个烟草品种PM132和PM204是积累最高水平tGFP的品种并且对PM132进一步测试流感血凝素H5多肽的重组生产(见实施例8)。
实施例8：普通烟草中血凝素H5的瞬时表达
在这个实施例中，描述了使用农杆菌浸润在普通烟草品种中瞬时表达血凝素H5。
农杆菌菌株、基因构建体和植株
基因构建体pC71是pBIN61衍生的双元载体，其包含置于最小花椰菜花叶病毒35S启动子和HT-CPMV的5'UTR控制下的流感H5N1毒株血凝素5(H5)基因的编码序列和在3'末端的胭脂碱合酶终止子和HT-CPMV的3'UTR。如上文所述共浸润pC120以提供Hc-Pro基因沉默阻抑因子。pC71和pC120均存在于相同的AGL1菌株中。培育14个PM132植株并且如实施例7中先前所述用AGL1(pC71)和AGL1(pC120)浸润。
提取和蛋白质印迹分析
收获全部叶，冷冻至-80℃，研磨成粉末并如先前所述均化。使用浸润的普通烟草PM132和用相同农杆菌浸润并瞬时表达H5蛋白的对照本生烟草植物的粗提物，通过蛋白质印迹法检测重组产生的H5蛋白。图4显示粗提物的蛋白质印迹分析的结果和具有H5预期分子量(75kDa)的条带。从图4中还显而易见，对于普通烟草PM132和本生烟草的提取物，H5的强度是相当的。在未浸润的野生型对照中没有检测到75kDa条带。
提取物的血凝素活性
血凝素具有与红细胞中红细胞表面上存在的单糖唾液酸结合的能力。血凝集可以用来确定血凝素蛋白的相对活性并且用来确定存在于如前所述瞬时表达H5的普通烟草PM132和本生烟草的粗提物中的重组H5的生物活性。制备植物提取物的1.5倍连续稀释物并且在96孔微量平板中与红细胞混合。不与血凝素结合的红细胞是将沉降并沉淀以形成紧密的扣状物。与血凝素结合的红细胞形成覆盖孔的网格。仅正确装配的同型三聚体血凝素将结合红细胞。对瞬时表达H5蛋白的前述烟草植物的提取物进行的血凝集测定法显示，PM132的提取物具有血凝活性，这表明正确折叠的三聚体H5在真空浸润的普通烟草PM132中产生。
实施例9：利妥昔单抗单克隆抗体的瞬时表达
利妥昔单抗单克隆抗体表达载体的构建
利妥昔单抗是结合人CD20的鼠嵌合单克隆IgG1抗体。利妥昔单抗用于治疗多种淋巴瘤、白血病、移植排斥和一些自身免疫紊乱。通过化学合成产生如CAS登记号174722-31-7或WO02/060955中那样的包含利妥昔单抗单克隆抗体轻链和重链的完整编码序列的表达盒，其密码子为烟草植物细胞中的表达而优化。
>如C148中的利妥昔单抗成熟重链(烟草优化)序列
caagttcaacttcaacaaccaggtgctgaacttgttaagcctggtgcttctgttaagatgtcttgcaaggcttctggatacactttcacatcctacaacatgcattgggttaagcaaactccaggacgtggacttgaatggattggagctatctaccctggaaacggtgatacttcctacaaccagaagttcaagggaaaggctactcttactgctgataagtcctcttccactgcttacatgcaactttcttcactcacttccgaggattctgctgtttattactgcgctaggtccacttattatggtggagattggtacttcaatgtttggggagctggaactactgttactgtgtctgctgcttctactaagggaccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttccggtggaactgctgctcttggatgccttgtgaaggattatttcccagagccagtgactgtttcttggaactctggtgctcttacttctggtgttcacactttcccagctgttcttcagtcatctggactttactccctttcttctgttgttactgtgccatcttcttcacttggaactcagacttacatctgcaacgttaaccacaagccatctaacacaaaagtggataagaaggcagagccaaagtcttgtgataagactcatacttgtccaccatgtccagctccagaacttcttggtggtccatctgttttcttgttcccaccaaagccaaaggatactctcatgatctctaggactccagaagttacttgcgttgttgtggatgtttctcatgaggacccagaggttaagttcaactggtacgtggatggtgttgaagttcacaacgctaagactaagccaagataggaacagtacaactctacttaccgtgttgtgtctgtgcttactgttcttcaccaggattggcttaacggaaaagagtacaaatgcaaggtttccaataaggctttgccagctccaattgaaaagactatctccaaggcaaaaggacagcctagagagccacaggtttacactcttccaccatctagagatgagcttactaagaaccaggtttcccttacttgtcttgtgaagggattctacccatctgatattgctgttgagtgggagtcaaacggacagcctgagaacaactacaagactactccaccagtgcttgattctgatggttccttcttcctctactccaaactcactgtggataagtctagatggcagcagggaaatgttttctcttgctccgttatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtccctttctttgtctcctggaaagtga(SEQ ID NO:17)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR*EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:18)
成熟重链序列随patatin信号肽一起合成并置于如专利WO09/087391中那样的HT-CPMV启动子和HT-CPMV非翻译5'和3'UTR序列以及花椰菜花叶病毒35S终止子序列的控制下。
SEQ ID NO:16:atggccactactaaatcttttttaattttattttttatgatattagcaactactagttcaacatgtgct是编码patatin信号肽的核苷酸序列的例子，所述核苷酸序列在pC148中的免疫球蛋白重链编码序列的5'末端处插入。
带patatin信号肽的轻链置于如专利WO01/25455中那样的质体蓝素启动子和终止子序列控制下。
>如C148中的利妥昔单抗成熟轻链(烟草优化)序列
cagattgtgctttctcagtctccagctattctttctgcttccccaggtgaaaaggttacaatgacttgccgtgcttcttcttctgtgtcctacattcattggttccaacagaagccaggatcttctccaaagccatggatctacgctacttctaaccttgcttctggtgttccagttaggttttctggatctggatctggtacttcttactcccttactatttctagagtggaggctgaagatgctgctacttactactgccaacagtggacttctaatccaccaactttcggaggtggaactaagcttgagatcaagaggactgttgctgctccatctgtgtttattttcccaccatctgatgagcaacttaagtctggaactgcttctgttgtgtgccttctcaacaatttctacccaagggaagctaaggttcagtggaaagtggataatgctctccagtctggaaattctcaagagtctgtgactgagcaggattctaaggattccacttactccctttcttctactcttactctctccaaggctgattatgagaagcacaaggtttacgcttgcgaagttactcatcagggactttcttcaccagtgacaaagtccttcaaccgtggagagtgttga(SEQ ID NO:20)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQ ID NO:21)
pC148中免疫球蛋白轻链编码序列的5'末端与编码patatin信号肽的SEQ ID NO:17的核苷酸序列连接，其中密码子选择已经为烟草中的表达进行优化。
atggccactactaagtccttccttatcctcttcttcatgatccttgctactacttcttctacatgtgct(SEQ ID NO:17)
两种表达盒均如实施例2中所述克隆在pC100的T-DNA部分中，产生pC148。使用产生单一StuI和AscI限制性核酸内切酶切割位点的引物PC201F(5'-AGAAGGCCTTCCGGGACGGCGTCAG-3'；SEQ ID NO:6)和PC202R(5'-ATGGCGCGCCCCCCTCGGGATCA-3'；SEQ ID NO:7)，通过PCR扩增pCambia-2300(GenBank：AF234315.1；Hajdukiewicz等人,1994.Plant.Mol.Biol.25:989-994)。将pCambia-2300片段连接至pC148的包含利妥昔单抗表达盒的StuI/AscI片段，以产生pCambia-利妥昔单抗。
本发明构思了根据前面实施方案的任一者和如上文所述的载体包含在T-DNA区域内且与植物调节元件有效连接的编码结合人CD20的免疫球蛋白的成熟重链的核苷酸序列，所述成熟重链显示与SEQ ID NO:18至少90%、92%、94%、96%、98%、99%或99.5%的序列同一性。
本发明还构思了根据前面实施方案的任一者和如上文所述的载体包含在T-DNA区域内且与植物调节元件有效连接的编码结合人CD20的免疫球蛋白的成熟轻链的核苷酸序列，所述成熟轻链显示与SEQ IDNO:2至少90%、92%、94%、96%、98%、99%或99.5%的序列同一性。
本生烟草植株的浸润
将这项研究中所用的全部双元载体均导入根癌农杆菌AGL1中。将细菌在回转摇床上的锥形瓶中包含2g/L牛肉提取物、0.4g/L酵母提取物、2g/LBacto-蛋白胨，2g/L蔗糖，0.1g/L MgSO4和用于选择相应农杆菌菌株及双元载体的适宜抗生素的YEB-培养基内在28℃和250转/分钟培育直至OD600>1.6。随后将培养物在含有10mM MES和合适抗生素的新鲜LB培养液Miller培养基中1:100稀释并且进一步在回转摇床上在28℃和250转/分钟培育直至OD600>2。在生长后，通过以8,000g并且在4℃离心15分钟收集细菌。将沉淀的细菌重悬于浸润溶液中至OD600>2。4周龄本生烟草植株用根癌农杆菌菌株AGL1的细胞以1:1比率和终末OD600=0.3共浸润，其中一种细胞含有(i)可表达的番茄丛矮病毒(TBSV)p19基因沉默阻抑因子(Swiss-ProtP50625)，并且另一种细胞含有(ii)pC148或pCambia-利妥昔单抗。TBSVp19基因沉默阻抑因子的编码序列在pBin19中处于双重花椰菜花叶病毒35S启动子和终止子序列的控制下(Bevan MW(1984)Nucleic Acids Res.12:8711-8721)。如实施例1中所述实施真空浸润、收获和材料采样，不同在于提取缓冲液含有50mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、0.1%Triton X-100、4M脲和2mM DTT。通过ELISA对可溶性提取物中利妥昔单抗单克隆抗体的表达定量。将微量滴定平板(Immulon2HB,Thermofisher)用浓度为2.5μg/mL的捕获抗体(山羊抗小鼠IgG1重链特异性，Sigma，#M8770)在4℃包被过夜。使用小鼠IgG1对照蛋白(Bethyl，#MI10-102)在模拟提取物(从仅用含有p19基因沉默阻抑制子的细菌悬液浸润的叶材料制备)中制备标准曲线(4-80ng/mL)。可溶性提取物在稀释缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，0.1%TritonX-100)中1:1000稀释，并且将标准和样品一式三份加载并且在37℃温育1小时。用于检测的抗体是来自Jackson ImmunoResearch(#115-035-205)的过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgGFc-特异性抗体，将所述抗体以稀释度1:40,000使用并且在37℃温育1小时。使用来自Pierce(#24236)Coomassie-Plus分析试剂测定提取物中的可溶性总蛋白。针对每种组合(pC148与基因沉默p19阻抑因子和pCambia-利妥昔单抗与基因沉默p19阻抑因子)的6个实验的结果表明，与pCambia-利妥昔单抗的122.60mg/kg FW相比，利妥昔单抗在本生烟草叶中的平均表达对于pC148是136.30mg/kg叶鲜重(FW)。
实施例10：烟草中流感H5病毒样颗粒的瞬时表达
基因构建体
将编码烟草蚀纹病毒(TEV)分离株TEV7DA的HcPro基因沉默阻抑因子的基因(GenBank：DQ986288.1)克隆在pC100的单一EcoRI位点中以产生pC120。该编码序列处于双重花椰菜花叶病毒35S启动子、TEV7DA的5'非翻译区和胭脂碱合酶终止子序列控制下。将包含成熟血凝素H5编码序列的H5N1病毒血凝素的区段4(GenBank：EF541394.1)克隆在pPMP1的单一EcoRI位点中，处于最小花椰菜花叶病毒35启动子、HT-CPMV的5'-和3'-非翻译区和胭脂碱合酶终止子序列的控制下(见实施例2)，产生pC229。
普通烟草植株和样品制品的浸润
将全部基因构建体均导入根癌农杆菌AGL1中。将普通烟草植株在温室中在岩棉块内培育，20小时光照时间，4小时黑暗时间，26℃/20℃昼间温度/夜间温度和70%/50%昼/夜相对湿度。如实施例9中所述培育细菌至最终OD600为3.5。将含有pC229基因构建体和pC120基因沉默阻抑因子构建体的农杆菌培养物以3:1比率混合并且在浸润溶液中稀释至OD600=0.8。通过以下方式浸润植物：在15秒内降低空气压力至大气压以下900毫巴，维持60秒时间，随后在2秒内返回至大气压。浸润植株的叶在浸润后5日从10个植株采集并且使用螺旋压机均化(Green Star Corrupad,GS1000,Korea Co.)。添加焦亚硫酸钠至10mM终浓度以减少样品氧化。将提取物的pH调节至pH5.3并且随后在室温温育20-30分钟，不进行搅拌。然后将CelpureP300(Sigma-Aldrich)10%添加至提取物并混合1分钟。将溶液经Whatman滤纸过滤，所述Whatman滤纸用Celpure P300(10mM焦亚硫酸钠中的10%Celpure P300浆液)预涂覆。为了超速离心，在超速离心管中如下制备三种蔗糖缓冲垫：1)3ml80%蔗糖；2)各1.5ml的60%和45%蔗糖；和3)各1ml60%、45%和35%蔗糖。将澄清和过滤的提取物样品(至多到13ml)柔和地置于蔗糖梯度的顶部并且在吊桶式转头(Sorvall Surespin630；Kendro)在4℃以24,000转/分钟进行超速离心1小时(最大相对离心力135,000)。将蔗糖浓缩的样品用0.45μm滤器预过滤并在等强度条件下在自动化AKTA层析系统上进行大小排阻层析(SEC)。运行缓冲液是TBS，pH7.5，并且样本容量是在HiLoad16/60Superdex200柱(GE Healthcare,17-1069-01)上流速1ml/分钟下4ml。将含有纯化H5的级分汇集并用30kDa截留值Centricon超滤膜装置(Millipore)浓缩至约0.3mg/ml并进一步分析。
凝胶电泳和蛋白质印迹
使用标准技术，将汇集级分的样品进行SDS-PAGE、蛋白质印迹和Blue Native-PAGE。SDS-PAGE在4-12%SDS-PAGE凝胶上进行。作为对照(Ctrl+)，使用市售的重组H5(Immune Technology Corp.,NewYork，目录号#IT-003-0052p)。在分离后，蛋白质用Imperial M蛋白质染液(Pierce#24615)染色。对于蛋白质印迹，第一抗体是兔抗HA抗体(H5N1VN1203/04#IT003-005V,Immune Technology Corp.,NewYork)。对于检测，使用HRP-标记的亲和纯山羊IgGFC-片段(JacksonLaboratories,#111-035-046)。使用Immuno-star HRP化学发光试剂盒(BIO-RAD Laboratory,170-5040)通过化学发光进行检测。使用Chimio-Capt3000捕获结果并且所述结果显示在用pC229基因构建体浸润的植物的提取物中存在H5。分子量与商业重组H5的分子量相似。Native-PAGE在4-16%Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Novex，Invitrogen，USA)上进行。为上样，将样品用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)样品缓冲液中的洋地黄皂苷处理并在4℃温育1小时。随后，将Native-PAGE G-250样品添加物(Novex，Invitrogen，USA)添加至终浓度0.5%，加载样品并且在4-16%Bis-Tris PAGE凝胶上运行。凝胶在4℃以150V恒压运行持续前60分钟。随后，增加电压至250V持续另外30分钟并且凝胶用Imperial M蛋白质染液染色。天然-PAGE和蛋白质印迹法的结果显示在烟草中瞬时表达后成功表达H5。
血凝作用
天然三聚体血凝素(HA)，如H5蛋白，具有与红细胞表面上存在的单糖唾液酸结合的能力。称作血凝作用的这种特性是快速测定法的基础并且在此用于确定重组蛋白的生物活性。通过在96孔板中将植物提取物的1.5倍连续稀释物以及借助大小排阻层析纯化的提取物与特定量的红细胞温育，测量烟草H5的血凝活性。不与H5结合的红细胞沉至孔底部并形成沉淀物。重要的是注意，仅正确装配为同型三聚体的H5才会结合红细胞。在用pC229基因构建体浸润的烟草植株的提取物以及通过大小排阻层析富集的pC229级分中观察到血凝活性。
实施例11：优化烟草转染的接种物密度
以下实验描述本发明方法的优化。分析了三个因素：(i)接种物中的细菌终浓度(范围从0.05至0.85)，(ii)目的构建体(COI)对沉默阻抑因子SoS的比率，即COI:SoS(范围从3.00至0.33)；(iii)和表达中使用的烟草品种(普通烟草Burley21、PM132和PM204)。在浸润后6日(DPI)测量浸润的叶中的TurboGFP表达水平。对于总计48个试验，本实验使用具有4个中心位置(OD600=0.45，比率COI:SoS=1.67:1)和3次重复的序贯中心复合设计。作为对照，在与浸润植株相同的区室和条件下培育每个品种的三个未浸润植株。
接种物制备
将携带报道基因tGFP(A91)表达盒作为COI和携带沉默阻抑因子HcPro(A120)作为SoS的AGL1的两种农杆菌培养物在补充有羧苄青霉素和卡那霉素的“无动物成分”LB Miller(10g/L NaCl+10g/L植物性胰蛋白胨+5g/L酵母提取物)中培育至最终光密度(OD600)2.0。如上文所述，将细菌通过离心收获并重悬于浸润溶液中。在浸润当日，A91和A120的浓缩接种物以三种不同比率3:1、1.67:1和1:3混合在一起，并且在浸润溶液中各自稀释至最终OD600为0.85。将三种接种物平衡至室温30分钟。在OD600=0.85的三种接种物随后在浸润溶液中进一步稀释至OD600=0.45和0.05，以便评估使用较低细菌密度的影响。
农杆菌浸润和生物质收获
如实施例1中所述，将烟草植株浸润、温育并收获。如实施例3中所述，进行tGFP的提取和定量。通过添加浓度范围4000至125ng/ml的TurboGFP对照蛋白(Evrogen)至提取缓冲液中1:50最终稀释的未浸润的提取物，制备标准曲线。
结果
为了确定农杆菌OD600和COI:SoS是否影响普通烟草品种中的tGFP表达水平，进行其中同时变动两种因素的有限组的实验。品种Burley21、PM132和PM204的烟草植株用OD600为0.85、0.45和0.05并且COI:SoS比率为3.00、1.67和0.33的A91和A120浸润。如从先前实验预期，在6DPI在测试的三个烟草品种中观察到针对农杆菌浸润的胁迫反应如叶黄化。症状随接种物中的细菌密度增加而增加。品种Burley21甚至在最低密度显示更明显的叶黄化。小的坏死性损害在用OD600=0.85的接种物浸润的PM132和PM204的叶上可见，但是大多限于叶基部。胁迫症状主要地归因于接种物密度并且没有观察到COI:SoS比率的明显影响。
接下来，使用对全部三个烟草品种可靠的回归模型以便将tGFP表达内插在实验空间内部。结果显示统计学相关。尽管观察到症状，但是TurboGFP的荧光测量定量显示在针对渐增光密度的植物胁迫反应与所测试范围内部的表达水平之间没有负相关。在高OD时显示强烈黄化或甚至坏死性损害的叶仍比低OD表现更高的tGFP水平。对于全部三个烟草品种，针对接种物密度和COI:SoS比率的预测的反应是相似的，并且对于全部三种最大表达，可以在接种物中的高农杆菌光密度和高COI:SoS比率时实现(图5)，从而证实这两种因素均影响瞬时重组蛋白表达。对PM132和PM204观察最高表达水平(图5B和C)。
对于三个品种的每一个所鉴定的最佳参数是：对于Burley21，OD600=0.69；COI:SoS=2.40；对于PM132，OD600=0.7428；COI:SoS=2.8058；和对于PM204，OD600=0.6729；COI:SoS=2.0805。这些参数分别产生215、698和603mg tGFP/kg冷冻重量。然而，PM132的预测最佳值几乎在为这个实验选择的条件之外(图5B)。因此，使用范围从0.6至1.2的接种物最终OD600和范围从2.0至4.5的COI:SoS比率，进行第二次实验。在这种情况下，该模型重现性低，意味着存在巨大的纯粹误差的，伴随高噪声，然而，表明在第一次实验中预测的最佳值附近存在平稳的状态（plateau）。
使用具有广义线性模型程序的ANOVA比较全部可能的水平均值对时，最佳模型包括相互作用并且该试验表明，PM132中的tGFP表达水平显著高于Burley21和PM204中的那些。
在优化之前，所用的标准条件是OD600=0.32和COI:SoS比率=1.00。通过增加接种物中的农杆菌细胞浓度和目的构建体对沉默阻抑因子的比率，实现了2.0-2.5倍更高的重组蛋白表达。
实施例12：改进用于农杆菌瞬时表达的接种物制品的可放大性。
植物材料
将常规批次的普通烟草植株Burley21、PM132和PM204以35植株/m2在温室区室A中在岩棉块内培育，20小时光照时间26℃/20℃昼间温度/夜间温度和70%/50%昼/夜相对湿度。通过地下渗灌对植物进行施肥灌溉。
农杆菌接种物制备
将携带报道基因tGFP(A91)表达盒或沉默阻抑因子HcPro(A120)的AGL1菌株的农杆菌培养物在补充有羧苄青霉素和卡那霉素的“无动物成分”LB Miller(10g/L NaCl+10g/L植物性胰蛋白胨+5g/L酵母提取物)中培育至最终OD600>2.0(如果不另外说明的话)。取决于如下文描述的测试的条件，将细菌通过离心收获并重悬于浸润溶液中至OD600>2.0，或使细菌保持在培养基中以产生浓缩的接种物。在浸润当日，将A91和A120的浓缩接种物以比率1:1混合在一起，并且在浸润溶液中稀释至最终OD600为0.32，并且平衡30分钟至室温。
农杆菌浸润和生物质收获
如实施例1中所述，将烟草植株浸润、温育并收获。如实施例3中所述，进行tGFP的提取和定量。通过添加浓度范围4000至125ng/ml的TurboGFP对照蛋白(Evrogen)至提取缓冲液中1:50最终稀释的未浸润的提取物，制备标准曲线。
溶性总蛋白含量的测定
使用Coomassie-Plus分析试剂(Pierce)，通过微量平板读数仪上在595nm测量吸光度，测定叶提取物中的可溶性总蛋白(TSP)含量。将提取物在超纯水中1:20稀释，将10μL一式三份加载在平底微量平板上。
结果
首先，研究通过在浸润溶液中直接稀释农杆菌培养物来制备最终接种物的可能性。如图6中所示，tGFP在浸润的烟草Burley21、PM132和PM204中的瞬时表达不受离心步骤的省略影响。另外，用直接从液体培养物制备的接种物浸润的PM132和PM204植株甚至导致显著更高的tGFP表达。值得注意地，PM132和PM204中的表达水平在两种条件下均相似,因此，仅用PM132进行进一步实验。
在离心和在非营养性浸润溶液中重悬后，通常将接种物在4℃贮存至多到6日，而转染效率和瞬时表达水平没有任何显著变化。然而，省略离心和重悬步骤提出了贮藏条件和贮藏时间长度问题。通常假定，LB培养基中贮存的农杆菌细胞基本上留在营养丰富的环境中，这种环境可能继续促进细菌生长并且因此导致培养物降解。在下一个步骤中，测试未离心的接种物的贮存稳定性。将OD600>2.0的A91(tGFP)和A120(SoS)的浓缩培养物在4℃贮存5至0日并且紧邻浸润之前稀释。使用从离心的培养物所制备的接种物作为阳性对照。在浸润后6日tGFP水平的定量显示，未离心的接种物在4℃稳定5日，与贮存1日的接种物相比，表达效率无任何变化。令人惊讶地，与已经贮存过的培养物相比时，从新鲜培养物制备接种物的使用导致tGFP表达较少，这表明对于诱导农杆菌毒力和最佳转染，需要在4℃短时间贮存。这些结果也证实未离心的接种物在产生更高水平重组蛋白方面比离心的接种物现住地和令人惊讶地更高效。
细菌在液体培养中生长以4个连续时期为特征：迟滞期、对数期、静止期和死亡期。在对数期期间，细菌代谢活跃并快速生长直至它们达到稳定期，其中培养基内的一种或多种养分耗尽并限制进一步生长。为成功转化，通常在对数早期至对数中期收集细菌。实施目的在于确定农杆菌菌株AGL1生长曲线的预试验。数据显示对数期在进入稳定期之前在OD600=0.3和OD600=3.8-4.0之间出现。为了减少制备最终接种物时所需要的培养物体积，测试在对数晚期(即以较高密度)培育的培养物的使用是否可能影响烟草中的表达水平。PM132烟草植物用下述接种物浸润，所述接种物从培育至通常OD6002.0或培养至OD6003.8培养物制备并直接稀释于浸润溶液中。值得注意地，在浸润后6日分析tGFP水平，显示瞬时表达不受使用处于对数期晚期的农杆菌培养物制备接种物的影响。
总之，这些数据表明当制备接种物时，通过使用处于高细胞密度(至多到OD600=3.8)的培养物以及通过省略离心和重悬步骤，可以大大便利用于农杆菌介导的烟草瞬时转化的接种物制备的放大，而不影响瞬时重组蛋白表达。
实施例13：通过以倒转位置温育浸润的烟草植株增加重组蛋白表达
本实施例描述令人惊讶地发现：以倒转位置温育浸润的烟草植株导致增加的重组蛋白表达。在寻找针对以下问题的解决方案时，获得这个发现：浸润的烟草植株，尤其在温室中以高密度温育时，倾向于倒伏，因为它不能支撑浸润叶的重量。提供的解决方案是将浸润的植株颠倒温育。值得注意地，与按正常直立位置温育的烟草植株相比，温育倒转的浸润植株导致重组蛋白生产的显著增加。
烟草植株用农杆菌菌株AGL1的细胞真空浸润，所述细胞携带了包含tGFP表达盒的质粒pC91或包含H5表达盒的pC71，如上文所述。全部烟草植株也用如上文所述的包含可表达HcPro基因沉默阻抑因子的pC120共浸润。
植株和浸润
岩棉中培育的并且高度均为大约28cm的5至6周龄普通烟草PM132植株如前所述用农杆菌菌株AGL1的细胞真空浸润，所述细胞携带了包含tGFP表达盒的质粒pC91或包含H5表达盒的pC71。全部烟草植株也用如上文所述的包含可表达HcPro基因沉默阻抑因子的pC120共浸润。
在浸润后立即将浸润的植株颠倒温育，同时从温室中植物上方的位置提供光照。在浸润后4日至6日，从每个处理组收获4个植株并且使用每个植株三个叶盘来测量tGFP表达。将叶盘在液氮下冷冻并在2ml微量离心管中研磨成细粉末，并且如上文所述进行tGFP的提取。为了tGFP表达的定量，将5μL每种提取物稀释至200μL并且荧光如所述测量。制备三个重复。
结果
植株没有显示水胁迫症状。将植株颠倒悬挂数日后，植株的茎向从上方较高位置照过来的光弯曲，形成钩样结构。从图7，可以见到，与按照直立位置培育的正常处理的植物相比，对于以倒转位置(即，颠倒)温育的植物，tGFP表达和荧光平均高两倍(图7)。
实施例14：通过在浸润之前增加烟草植株的生长密度增强tGFP和H5的表达
本实施例描述了在浸润之前以高密度培育烟草植株对tGFP和重组H5表达的令人惊讶的影响。这个实验显示，在正常直立条件下温育时，相对于以较低的密度培育的植株，基于浸润的生物质的重量，两个烟草品种PM132和PM217在浸润之前以高密度培育时明显地产生大约40%更多的tGFP和70%更多的重组H5。
植株和浸润
为了研究以不同植物密度培育烟草的影响，将普通烟草PM132和PM217植株以两个密度：每平方米25和100个植株培育。在播种后46日，如前文所述，将植株用包含pC91或pC71的根癌农杆菌菌株AGL1并且各自同时用包含pC120的根癌农杆菌菌株AGL1浸润，其中所述含pC91含有tGFP表达盒，所述pC71含有H5表达盒，所述pC120含有HcPro基因沉默阻抑因子。浸润所用的最终OD600是0.32。对于以两种密度培育的植株，在浸润之前测量平均植株高度、气孔直径，叶绿素含量、叶厚度和含水量。如可以从表3见到，以高密度培育的植物较大，具有较少叶绿素和较薄的叶，但是气孔直径相同。对于PM132，以低密度或高密度培育的植株的含水量相同，但是对于PM217，以低密度培育时，含水量低得多。在浸润后，将一半植株直立或倒转(颠倒)温育。对每个处理总计九(9)个植株进行测量，每3个植株三次重复。
结果
浸润后5日收获叶，制备提取物并且如上文所述，进行tGFP表达的分析。将提取物1:1稀释于GFP缓冲液中并且将5μL与200μL GFP缓冲液混合用于荧光定量。通过ELISA定量重组H5的表达。表4中汇总结果。
如可以从表4见到，对于两个品种而言，以正常直立位置温育时，与低密度培育的植株相比时，浸润之前以高密度培育的植株的以mg/kg鲜重叶生物量计的tGFP表达平均高41%。对于H5，获得相似结果，其中与以低密度培育并且在浸润后以正常直立位置温育的植物相比时，所述H5显示以高密度培育时平均表达增加21-40%之间。为研究倒转温育对tGFP和H5表达的影响，在浸润后，将一半的浸润植株以倒转位置温育。如可以从表4见到，对于以倒转位置温育并以低密度培育的植株，存在tGFP和H5的显著增加表达，但是对于浸润之前以高密度培育的植，表达增加少得多。对于以低密度按倒转位置培育的PM132植株，这导致tGFP增加40%和H5增加71%。对于浸润之前以高密度培育的植株，与按正常直立位置温育的植株相比，这种增加对于tGFP仅是3%并且对于H5仅是7%。确立可溶性总蛋白(TSP)并且相对于TSP估计tGFP和H5的表达。对于以高密度培育并以倒转位置温育的植株，tGFP和H5的表达总是较高。在直立位置中，以低密度培育的植株具有大约10.5%的tGFP表达增加。对于以高密度培育的植株，这种增加是大约13.6%。就H5而言，对于浸润之前以直立位置温育和以低密度培育的植株，产量增加是0.25%，而对于以高密度培育的植株，产量增加是0.37%。就tGFP和H5而言，以倒转位置温育导致表达增加(如按TSP的百分比测量)。对于以低密度培育的植株，以倒转位置温育导致生物量增加40-60%。对于以高密度培育的植株，以倒转位置温育导致增加20%。就tGFP而言，最高蛋白质产率是16.2%并且在植株在浸润之前以高密度培育并且以倒转位置温育时获得。这种表示就%TSP而言，与按低密度培育并以正常直立位置温育的植株相比(10.5%的TSP)相比，蛋白质产率增加54%。
为了评价抵达植株(其按高密度培育并且以倒转位置温育)的叶的表面上的减少的光是否可能造成增加的表达，在完全黑暗下温育用tGFP表达载体浸润的植株。值得注意地，数据显示在完全黑暗下的温育有损于tGFP表达。如可以从图18见到，与光照下培育的植株相比，在黑暗下温育的植株平均产生低45%的tGFP。
进行额外的实验以研究三种更高生长密度：122、529和961个植株/m2对PM132中生物量生产的影响。该实验以完全随机区组设计以5次重复实施。生长基质是30cm x30cm x7cm的岩棉块，并且根据植株密度制造木质点播器。将点播器压入岩棉块以产生大约5mm深的小凹穴。将籽苗手工移栽至岩棉块中。岩棉块的整个面积30cm x30cm含有经间隔以实现所需密度的植株，但是在浸润时，仅浸润位于15cmx15cm中央区域的植株。这种行为允许围绕中央区域形成边界，以便消除任何边界效应。在浸润之前，夹出并弃去边界植株。对处于两个发育阶段、植株高度为25cm和35cm的植株进行浸润。将浸润的植株在温室中以正常或倒转位置温育5日。
如上文所述制备接种物，不同之处是，携带TurboGFP表达盒的AGL1培养物对携带HcPro的AGL1培养物的比率是3:1并且最终OD600是0.8。将植株在50毫巴压力下浸润，所述压力在1分45秒内达到并且在1.5秒内迅速释放。
浸润后5日，进行总生物量、叶和茎鲜重、叶厚度和其他生物量测量。将包括茎的完整植株材料在干冰中快速冷冻并贮存在-80C。
以122、529和961个植株/m2栽种的烟草植株的生物量的特征表明，在这些植株密度范围内，没有观察到平均植株高度、%叶生物量和叶厚度的显著差异。然而，随着密度增加，个体植株重量存在下降，甚至%叶生物量保持相对恒定时也是如此。在两个时间点在密度为529个植株/m2时观察到每单位生长面积的生物量增加。当植株处于35cm至45cm高度并且以529个植株/m2栽种时浸润植株的情况下，获得大约5kg叶鲜重/m2或10kg总生物量/m2的最大产率。通过生物量中的TurboGFP浓度乘以每平方米的生物量计算产量，获得每单位面积的TurboGFP产量。以密度529个植株/m2获得每单位面积的最高TurboGFP产产量。植株密度进一步增加至961个植株/m2对重组蛋白的产生具有不利影响。
实施例15：通过浸润后在短日照条件下温育增强重组蛋白表达
本实施例描述了其中烟草植株在浸润后短日照(每日8小时光照)和长日照(20小时光照每日)条件下温育的实验的结果。本实验显示对于以正常直立位置以及颠倒位置温育的植株，当植株在浸润后短日照条件下温育时，tGFP的表达大大增强。
植株和浸润
普通烟草PM132植株以每平方米75个植株的密度培育。42日龄植株用比率1:1和最终OD600=0.32的含有pC91(tGFP双元表达载体)和pC120(HcPro基因沉默阻抑因子双元表达载体)的两种根癌农杆菌AGL1菌株的混合物浸润。植株平均高43.4cm并且具有平均气孔导度559.6μmolm-2s-1，表明足够气孔张开用于摄取接种物(表5)。在浸润后，植株按两种不同光照循环温育：每日8小时光照或每日20小时光照。将每种光照处理中的一半植株置于正常直立位置中并且将另一半置于倒转位置。总共，进行4种处理。在浸润后0、3、5、7和9日收获植株。对于每次测量，每种处理收获4个植株并且每个植株取得3个叶盘用于tGFP表达分析。对于tGFP定量，如前所述，将叶盘在1ml GFP缓冲液中研磨并且将5μL提取物与200μL GFP缓冲液混合用于荧光定量。
结果对两种浸润后光照方案下的tGFP表达的定量(mg tGFP/kg鲜重生物质)揭示了光照对重组蛋白生产的明显影响(图8)。无论植株的位置是怎样的(直立或倒转)，在短日照条件下温育的植株均产生显著更高量的tGFP，如可以从图8见到。在浸润后第7日，与浸润后20小时光照下温育的植株相比，以8小时光照温育的植株中，tGFP的表达的量加倍。
在浸润后第7日，8小时光照方案下的直立植株中的tGFP表达比20小时光照方案下温育的相似植株中的tGFP表达高104%。对于颠倒温育的植株，这种趋势是相似的，在8小时光照下的植株产生比20小时光照方案下温育的植株多50%的tGFP。以倒转位置温育也增强两种光照方案(8小时光照和20小时光照)下培育的植株中的tGFP表达。与8小时光照处理相比，增强的表达在20小时光照下更显著并且可以从以正常直立位置和20小时光照培育的植株的371.2mg tGFP/kg鲜重生物量增加至以颠倒位置按8小时光照温育的植株的857.5mgtGFP/kg鲜重生物量，这代表重组蛋白产生增加130%。
实施例16：借助农杆菌优化的植株浸润
本实施例描述了其中研究浸润之前的烟草植株气孔开度的实验的结果。该结果表明在浸润之前，烟草植株应当暴露于光，从而气孔导度处于作为烟草植株在充分光照条件下培育的特征的范围内。烟草植株以约9个植株/m2的密度培育，以避免对光照和空间的任何竞争。每日监测实验装置以确保均一和稳定的生长环境。灌溉溶液具有2.4电导率值(E.C)和等于206mg/L的氮含量，以确保充足的养分供应。根据植株需要调节浇水方案，以避免由浇水过度或不足引起的任何胁迫。
两个品种PM132和PM15的39日龄普通烟草植株用含有编码TurboGFP的表达盒(pC91)的农杆菌(Agl1)转化，所述农杆菌如上文所述与表达Hc-Pro的农杆菌(Agl1)组合。GFP的表达受最小CaMV35Splus启动子和豇豆花叶病毒(HT-CPMV)5'UTR驱动，而HC-Pro的表达受双重CaMV35S启动子驱动。对于单一构建体处理(GFP或沉默阻抑因子(SoS))，浸润混合物中的细菌浓度保持在0.16，并且对于双构建体处理(GFP+SoS)，保持在0.32。遵循标准浸润操作方案，将植物在50毫巴浸润1分钟。
在浸润之前，将一半植株置于暗区室内，而将另一半置于补充人工光照的具有天然光照的区室内。在这段时期，使用稳态气孔计SC-1(Decagon Devices,USA)记录气孔导度。在位置4、5和6(其中1是在顶端芽处垂直于茎的第一叶)处的三片充分膨大的连续叶中进行测量。生长基质(岩棉)的含水量用WET-2传感器(Delta-T devices,USA)测量。
对于两个烟草品种，气孔导度差异在光照处理和黑暗处理之间是高度显著的。保持于光照下的植株显示的导度值是保持于黑暗下的植株的导度值的4至8倍：光照下的PM132植株显示260.6μmol m-2s-1的平均值，而在黑暗下，显示70.4μmol m-2s-1的平均值。同样地，光照下的PM15植株显示440.1μmol m-2s-1的平均值，而在黑暗下，显示53.6μmol m-2s-1的平均值。这些结果表明可以通过给予植株的光照量调节烟草中的气孔开度：在良好光照条件下温育植株促进气孔开放，减少光照量显著地减少气孔开度(较低的气孔导度)。还值得指出的是，也观察到烟草品种之间气孔导度的差异，PM15在光照时显示比PM132高1.7倍的气孔导度。因此，优选的是在浸润之前，PM132气孔导度处在大于约70μmol m-2s-1、大于100μmol m-2s-1、大于150μmol m-2s-1、大于200μmol m-2s-1、大于250μmol m-2s-1、或大于300μmol m-2s-1的范围内。
将浸润的叶在干冰中冷冻并研磨成粉末。提取GFP并且测量荧光。对于两个烟草品种，光照下温育的植株的GFP含量显著高于黑暗下温育的植株。在PM132中，光照下温育的植株比黑暗下温育的植株显示多40%荧光。对于PM15，光照下温育的植株比黑暗下温育的植株显示多200%荧光。
数据显示烟草中的气孔快速地响应于光照条件的变化。置于低光照的植株比良好光照的植株显示气孔导度少4和8倍之间。由低光照引起的气孔关闭不利地影响真空浸润效率并且因此不利地减少烟草中的GFP表达。黑暗下温育的植株显示出巨大面积未浸润的叶组织和与正常光照条件下培育的植株相比，GFP表达减少超过50%。
实施例17：采用酶的烟草植株浸润
本实施例描述一项实验的结果，在所述实验中事先用农杆菌浸润的烟草植株用降解或消化植株细胞壁的酶处理以辅助异源蛋白的提取和分离。烟草植株已经由如上文所述的包含H5编码序列的基因构建体pC71浸润，并且在使得瞬时表达和生产H5成为可能的温室条件下温育。制备酶的含水混合物：0.05%Macerozyme、0.4%纤维素、0.066%Driselase、0.6M甘露醇、0.7g/l2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)，pH5.6。在这种酶混合物的一份样品中，将甘氨酸添加至浓度15g/l。
将酶混合物通过注射器，以每克叶0.3ml的体积注入烟草叶的底面中。为了比较，将叶的薄切条在相同的混合物中浸没并温育。在收获和提取H5之前，将叶温育12小时。采用抗H5抗体的蛋白质印迹显示，用酶混合物在具有或没有甘氨酸的情况下获得相似量的H5。借助注射器浸润和借助浸没切碎叶的提取效率也是相似的。结果显示，以细胞壁消化酶浸润烟草叶可以用来辅助从烟草植株提取异源蛋白。
尽管本发明已经以详细和之前的说明进行描述，但是认为这类描述是示意性或示例性的并且不是限制性的。应当理解可以由普通技术人员以下权利要求的范围和精神内作出改变和修改。在本说明书通篇范围内援引各种出版物和专利。出版物和专利的每一份的公开内容通过引用的方式完整并入。
表格
表1.
Figure BDA0000369555190000981
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表2.
Figure BDA0000369555190001012
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保藏：
以下种子样品在2011年1月6日依据布达佩斯条约的条款以菲利普莫里斯生产公司的名义保藏于NCIMB，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，阿伯丁AB219YA，苏格兰，英国：
直到专利授权，或者如果申请被驳回或撤回，则从申请日起20年，样品应仅发放给由请求人指定的独立专家（PCT实施细则第13条之二6）。
PM种子系名称 保藏日期 登录号
PM016 2011年1月6日 NCIMB41798
PM021 2011年1月6日 NCIMB41799
PM092 2011年1月6日 NCIMB41800
PM102 2011年1月6日 NCIMB41801
PM132 2011年1月6日 NCIMB41802
PM204 2011年1月6日 NCIMB41803
PM205 2011年1月6日 NCIMB41804
PM215 2011年1月6日 NCIMB41805
PM216 2011年1月6日 NCIMB41806
PM217 2011年1月6日 NCIMB41807
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Claims (26)

1.一种用于在普通烟草(Nicotiana tabacum)中产生异源多肽的方法，其包括步骤：
(i)提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD600为0.32的选定农杆菌属菌株注射后5日显示出少于10%的坏死；
(ii)用OD600为0.1和4.0之间的农杆菌属物种选定菌株的悬液浸润所述普通烟草的选定品种、育种系或栽培品种的完整植株，所述菌株包含编码该多肽的可表达核苷酸序列；
(iii)将浸润的植物在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下温育5日至10日的时期。
2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将编码该多肽的可表达核苷酸序列克隆在最小尺寸的双元载体中，所述双元载体包含对大肠杆菌(Escherichia coli)及农杆菌属(Agrobacterium)细胞中维持和复制质粒以及对转移T-DNA至烟草植物细胞所必需的序列元件以及任选地植物选择标记基因，其中所述必需的序列元件的比例占到不含编码多肽的可表达核苷酸序列的完整最小尺寸双元载体的至少70%的核苷酸。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用于浸润所述普通烟草品种、育种系或栽培品种的步骤(ii)中使用的农杆菌属细胞悬液具有0.3至0.9范围内的细胞密度(OD600)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当编码异源多肽的核苷酸序列表达时，基因沉默阻抑因子在普通烟草植物的所述选定品种、育种系或栽培品种中瞬时表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其中编码基因沉默阻抑因子的核苷酸序列位于第一双元载体上并且编码异源多肽的核苷酸序列位于第二双元载体上。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当编码异源多肽的核苷酸序列表达时，马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)在普通烟草植物的所述选定品种、育种系或栽培品种中瞬时表达。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中通过使用与包含编码异源多肽的核苷酸序列的第一双元载体分开的第二双元载体，马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)在普通烟草植物的所述选定品种、育种系或栽培品种中瞬时表达。
8.根据权利要求6或7中任一项所述的方法，其中马铃薯Y病毒的辅助组分蛋白酶(HcPro)由包含SEQ ID NO:5中所示核苷酸序列的核酸分子编码。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中将第一双元载体在第一农杆菌属菌株中提供并且将第二载体在第二农杆菌属菌株中提供，并且其中在步骤(ii)中，包含第一双元载体的第一农杆菌属菌株的细胞对包含第二双元载体的第二农杆菌属菌株的细胞的比率处于3:1至1.6:1范围内，所述第一双元载体包含编码异源蛋白的核苷酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤i)中提供的选定普通烟草品种、育种系或栽培品种是选自以下的普通烟草品种、育种系或栽培品种：普通烟草登录号DAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX 2A、Coker 319、Hicks、McNair 944(MN 944)、Burley 21、K149、Yaka JB125/3、KasturiMawar、NC 297、Coker 371Gold、PO2、
Figure FDA0000369555180000031
Simmaba、TurkishSamsun、AA37-1、B13P、来自杂交BU21xHoja Parado的F4、品系97、Samsun NN、Izmir、Xanthi NN、Karabalgar、Denizli、PO1、PM016，其种子以登录号NCIMB41798保藏；PM021，其种子以NCIMB41799登录号保藏；PM092，其种子以登录号NCIMB41800保藏；PM102，其种子以登录号NCIMB41801保藏；PM132，其种子以登录号NCIMB41802保藏；PM204，其种子以登录号NCIMB41803保藏；PM205，其种子以登录号NCIMB41804保藏；PM215，其种子以登录号NCIMB41805保藏；PM216，其种子以登录号NCIMB41806保藏；和PM217，其种子以登录号NCIMB41807保藏，并且其中种子保管机构是苏格兰阿伯丁的NCIMB。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤i)中提供的选定农杆菌属菌株是选自AGL1、EHA105、GV2260、GV3101和Chry5的菌株。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤i)中提供的选定普通烟草品种、育种系、或栽培品种和选定农杆菌属菌株的组合是选自以下的组合：普通烟草品系PM132与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1、普通烟草品系PM132与根癌农杆菌菌株EHA105、普通烟草品系PM132与根癌农杆菌菌株AGL1以及普通烟草品系PM204与农杆菌属菌株AGL1。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述异源多肽是生长因子、受体、配体、信号传导分子；激酶、酶、激素、瘤抑制因子、凝血蛋白、细胞周期蛋白、代谢蛋白、神经元蛋白、心肌蛋白、特定疾病状态中缺乏的蛋白质、抗体、免疫球蛋白、抗原、提供疾病抗性的蛋白质、用于人类遗传疾病替代疗法的蛋白质、抗微生物蛋白、干扰素和细胞因子。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述异源多肽是流感血凝素或其免疫原性片段。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将植物在浸润之前暴露于光，从而气孔导度处于70μmol m-2s-1至600μmol m-2s-1之间的范围内。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括在日光条件下温育植物每日7至9小时。
17.据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括以倒转的位置温育所述浸润的植株。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括(a)在浸润之前，将选定普通烟草品种、育种系或栽培品种的完整烟草植株以每平方米至少100个植株的密度培育，或(b)在浸润后，将浸润的完整植株以每平方米至少100个植株的密度温育，或(c)在浸润之前，将选定普通烟草品种、育种系或栽培品种的完整烟草植株以每平方米至少100个植株的密度培育，并且在浸润后，将浸润的完整植株以每平方米至少100个植株的密度温育。
19.根据权利要求18所述的方法，其中将植株以每平方米200至600个植株的之间的密度培育。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在步骤(iii)后，用降解植物细胞壁的一种或多种酶浸润农杆菌浸润的完整植株的步骤(iv)。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中普通烟草品种、育种系或栽培品种和农杆菌属物种菌株的选定组合是这样的组合，所述组合导致(a)异源蛋白积累至这样的水平，所述水平是使用相同的可表达核苷酸序列和相同的浸润及温育步骤时本生烟草中可获得的水平的至少25%、或(b)绿色荧光蛋白积累至使用编码绿色荧光蛋白的可表达核苷酸序列和相同的浸润及温育步骤时，浸润植株的可溶性总蛋白的至少1%。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括通过一个或多个压力循环浸润完整植株，其中至少一个所述压力循环包括相对于大气压增加压力。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将编码多肽的可表达核苷酸序列克隆在包含T-DNA区域的双元载体中，所述T-DNA区域包含FLt启动子或其功能性片段的一个或两个或更多拷贝，其中所述FLt启动子是MMV、FMV或PCISV的启动子。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述FLt启动子是SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中提供的FLt启动子。
25.组合物，其包含通过如前述权利要求的任一项中所述的方法在选定的普通烟草品种、育种系或栽培品种中产生的流感血凝素5多肽(H5)。
26.用于在完整普通烟草植株中产生异源多肽的系统，所述完整普通烟草植株包括根据前述实施方案中任一项的普通烟草品种的完整植株；悬液，其包含根据前述实施方案中任一项的农杆菌属物种的菌株的细胞；用农杆菌属细胞浸润完整植株的装置，和任选地，用于温育浸润植株的温室，所述温室适应于支持(a)以倒转位置温育浸润的植株，伴以每日从上方光照7至9小时，(b)以每平方米至少75个植株的密度培育或温育完整植株，或(c)前两者。
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