MXPA02003455A - Promotor para regular la expresion de genes foraneos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona a un promotor para regular la expresion de genes extranos en organismos transgenicos, el cual comprende un promotor que tiene las caracteristicas de identificacion de un promotor que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias indicadas en las SEQ ID NO:1 a 3 y fragmentos funcionales o derivados de las mismas, en donde el promotor esta adaptado para ser ubicado operacionalmente con respecto al gen extrano para expresion del gen.

Description

PROMOTOR PARA REGULAR LA EXPRESIÓN DE GENES FORNEOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a un promotor para regular la expresión de genes extraños en un organismo transgénico, más específicamente en una forma especifica a hojas en plantas transgénicas. La transformación genética de microbios ha sido usada por más de 15 años para producir moléculas recombinantes útiles, y están siendo explotadas actualmente las aplicaciones en las industrias farmacéuticas, cosmacéuticas y dermacéuticas . Esta tecnología se ha expandido de los microbios a las plantas y animales en los últimos diez años con el desarrollo de técnicas requeridas para adaptar este concepto general a organismos eucariótipos complejos. Básicamente un gen que codifica una proteina de interés o un gen que codifica una enzima responsable para una modificación de una trayectoria metabólica que lleva a una molécula de interés, se enlaza en una forma apropiada a secuencias regulatorias de actuación cis y trans, y se transfiere a una célula objetivo donde se incorpora en la maquinaria molecular (en una forma temporal o estable) . La célula transgénica, o un tejido u organismo regenerado de la célula transgénica realizará entonces la transcripción y traducción del transgen y por lo tanto permite acumular la proteina de interés o realizar la nueva reacción metabólica a través de la actividad de la enzima de interés. La industria emergente de labranza es una de las industrias más prometedoras del siglo nuevo. Es prometedor proporcionar industrias moleculares seguras y renovables para la industria. Entre las aplicaciones que están actualmente desarrolladas son la producción de anticuerpos monoclonales de bajo costo para usos terapéuticos y de diagnóstico, la producción de cantidades no limitadas de hormonas, citosinas y otras moléculas bioactivas para el tratamiento de enfermedades crónicas o letales, la producción de substitutos bioseguros para varios componentes de la sangre, la producción de Cantidades ilimitadas de enzimas de procesamiento para la industria de alimentos y de pulpa, la producción de enzimas de bajo costo para tratamientos de desecho, y la producción de moléculas bioactivas seguras para la industria de cosméticos. Las limitaciones para la aplicación de eßta tecnología han llegado con frecuencia a partir de la incapacidad de los organismos transgénicos para acumular cantidades adecuadas del producto recombinante, como un resultado de bajas relaciones de transcripción, inadecuado empalme del mensajero, inestabilidad del ARNm extraño, deficientes relaciones de traducción, hipersusceptibilidad de la proteina recombinante a la acción de proteasas endógenas o hipersusceptibilidad del organismo recombinante a la proteina extraña lo cual resulta en un crecimiento inapropiado y limitado o en los peores casos, en fuertes efectos dañinos para el organismo huésped. El nivel de producción inadecuado tiene un impacto directo en el desarrollo de aplicaciones cuando los márgenes de perfil son estrechos, o cuando el tratamiento y/o disposición de materia residual provoca los problemas de bioseguridad o ambientales. La mejora del nivel de acumulación del producto recombinante deseado parece de esta forma ser un factor critico que garantiza la comercialización de muchas aplicaciones de la labranza molecular. La fotosíntesis es una reacción metabólica de gran importancia en el mundo viviente. Se realiza por la mayoria de las plantas terrestres y algas, y por algunas bacterias. Esta reacción completa implica un ensamble complejo de proteínas de transferencia de electrones dispuestas espacialmente dentro del sistema de membrana tilakoide ubicado en el cloroplasto de células de hojas. Esta cade,na de transporte de electrones está acoplada en un extremo con la antena fotosintética, la cual comprende una variedad de macromoléculas, la cual incluye una molécula común para todo el organismo fotosintético, clorofila, y en el otro extremo, a las enzimas implicadas en la síntesis de NADPH y ATP, y al ciclo de Calvin, implicado en acoplar la liberación de energia a partir del NADPH y ATP con la fijación de bióxido de carbono gaseoso en las moléculas orgánicas. Entre las proteínas implicadas en la reacción fotosintética total, una, la ribulosa bifosfato carboxilasa (Rubisco) , es la proteina más abundante en la tierra. La fotosíntesis es de esta forma a lo que están dedicadas las células para hacer, y hay un interés obiyio para usar los promotores de genes implicados en tal actividad metabólica especifica a tejido prominente cuando se construyen casetes de expresión específicos a hojas fuertes para aplicaciones en la biotecnología de plantas. Muchos de los constituyentes peptidicos del aparato fotosintético están codificados por los genes presentes en el genoma cloroplástico; como un ejemplo, la subunidad pesada de Rubisco, la cual porta los sitios catalíticos para fijación de C02, está codificada por un gen cloroplástico. Sin embargo, la subunidad pequeña de esta enzima está codificada por un gen nuclear, y de esta forma se hace la holo-protéina de Rubisco de subunidades codificadas por dos genomas diferentes. Por obvias razones, hay un gran interés en tratar de usar los promotores Rubisco para controlar la transcripción de transgenes en hojas de plantas transgénicas. El promotor se ha caracterizado ampliamente y su uso en los vectores de expresión está protegido por la Patente de los Estados Unidos l¡o . 4,962,028.

Puede ser altamente deseable proporcionar un promotor para regular la expresión de genes extraños en un organismo transgénico, más específicamente en plantas transgénicas . Una meta de la presente invención es proporcionar un promotor para regular la expresión de genes extraños en un organismo transgénico, más específicamente en plantas transgénicas . De acuerdo con una modalidad de la prese?te invención, se proporciona un promotor para regular la expresión de genes extraños en organismos transgénicos, lo cual comprende un promotor que tiene las características de identificación de un promotor que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias indicadas en la SEQ ID NO: 1 a 3 y fragmentos funcionales o derivadlos de los mismos, en donde el promotor se adapta para ser localizado operacionalmente con respecto al gen extraño para expresión del gen. El promotor preferido de la presente invención tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias indicadas en la SEQ ID NO: 1 a 3. Preferentemente, el organismo es una planta. Preferentemente, el promotor de la presente invención puede ser modulado por la presencia o ausencia de luz.

La planta preferida es una dicotiledónea, µna monocotiledónea o una gimnosperma. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para regular la expresión de genes extraños en organismos transgénicos, el cual comprende las etapas de: a) preparar un organismo transgénico usando µna construcción de expresión que consiste de por lo menos un promotor de la presente invención, y b) un OFR de un gen, en donde el promotor está localizado operacionalmente con respecto al gen para expresión del gen. Para el propósito de la presente invención se definen a continuación los siguientes términos . La expresión "fragmentos funcionales o derivados de las mismas" se proponen para significar cualquier derivado o fragmento de las secuencias SEQ ID NO: 1-3 los cuales permiten el nivel equivalente de expresión de un gen extraño como el promotor de la presente invención indicado en las SEQ ID NO: 1-3. Lo siguiente es una descripción detallada del método usado para generar lineas transgénicas de alfalfa que pueden ser reguladas en su expresión de un gen reportador. En esta modalidad, un promotor que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 1-3 se liga entonces a un gen reportador y un terminador, y esta construcción se inserta en vectores de expresión de plantas adecuados para bombardeo de ADN en hojas de alfalfa y para transferencia de ADN mediada con Agrobacterium como se describe por Desgagnés et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140). Estos dos métodos de transferencia de ADN son usados para demostrar esa expresión del gen reportador y pueden ser modulados por luz . Materiales y métodos Secuenc±ación de ADN Se realiza la secuenciación de ADN como se describe por Sanger et al (1977, P.N.A.S USA, 74:5643-5647). Los promotores resultantes de la presente invención tiene la secuencia como se indica en las SEQ Id NO: 1 a 3. Construcción de casetes y vectores de expresión Se ensamblan los casetes para análisis de expresión usando el gen reportador GUS como sigue. Se digiere un cásete GUS sin promotor de pBllOl con HindIII y EcoRI, y se inserta en los sitios HindIII y EcoRI del sitio de polclonación pUC19. El plásmido resultante es nombrado pB1201 y se usa para construcciones adicionales. Varios fragmentos de eliminación de pGPlas3-2 son fusionados transcripcional y transicionalmente en la terminal 5' del gen reportador GUS en pB1201 y estos se usan para estudios de expresión temporal usando bombardeo de ADN. Después de la identificación del fragmento de eliminación adecuado, este se subclona en un vector de expresión de plantas binario fal como pBllOl (Clonetech) . Se usan estos plásmidos recombinantes para integración estable a través de la infección con A. tumefaciens como se describe posteriormente . Transferencia de AND mediada por Agrobacteriuitr,. y regeneración de lineas transgénicas . Se introducen los plásmidos recombinantes en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación como se describe por Khoudi et al (1999, Biotechnol. Bioeng., 64:135-143). Se cocultivan entonces las cepas seleccionadas de Agrobacterium con discos de hojas del genotipo C5-1 por 4 dia sen la ausencia de presión de selección (kanamicina). Después de este periodo de incubación, se lavan los discos de hojas y se humedecen, y después se permiten formar un callo en el medio B5H. Se transfieren entonces los callos por 21 dias en medio SH para inducción de embriones y por 28 dias en Boi2Y para el desarrollo embrionario. Se remueven los embriones de forina de torpedo de Boi2Y y se colocan en medio MS para regeneración. La kanamicina está presente en todo el medio de cultivo excepto para el cocultivo y regeneración en MS. Este método está descrito en amplitud en Desgagnés et al (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140). Se hacen crecer las plantillas de raiz para madurez en el invernadero. Mientras que la invención se ha descrito en conexión con modalidades especificas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y esta aplicación se propone para cubrir cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención que sigue, en general, los principios de la invención y que incluyen tales desviaciones de la presente descripción como que están dentro del conocimiento o práctica tradicionales dentro de la técnica a la cual pertenece la invención y como pueden ser aplicados a las características esenciales indicadas anteriormente en la presente, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES 1. Un promotor para regular la expresión de genes extraños en organismos transgénicos, caracterizado porque comprende un promotor que tiene las características de identificación de un promotor que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias indicadas en SEQ ID NO:l a 3 y fragmentos funcionales de una secuencia definida por los ácidos nucleicos 0 a 700 de la SEQ ID NO: 2, en donde el promotor está adaptado para estar ubicado operacionalmente con respecto al gen extraño para expresión del gen.
2. 2. El promotor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor está modulado por expresión transcripcional del gen por la presencia o ausencia de luz. 3. El promotor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor tiene µna secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias indicadas en las SEQ ID NO:l a
3. 3.
4. 4. El promotor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo es µna planta .
5. 5. El promotor de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la planta es una dicotiledónea, una monocotiledónea, o una gimnosperma.
6. 6. El uso de un promotor caracterizado porque tiene las características de identificación de un promotor que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias indicadas en las SEQ ID NO: 1 a 3 y fragmentos funcionales de una secuencia definida por los ácidos nucleicos 0 a 700 de la SEQ ID NO: 2 para regular la expresión de genes extraños en organismos transgénicos.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el organismo es una planta.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la planta es una dicotiledónea, monocotiledónea o una gimnosperma.