KR100817660B1 - 외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 - Google Patents

외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환 생물체에서 외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터에 관한 것으로서, 상기 형질전환체는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 서열 및 그들의 기능적 절편 또는 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 프로모터의 특징을 갖는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 상기 유전자의 발현을 위하여 상기 외래 유전자와 관련하여 작용할 수 있게 위치하도록 적응되어 있다.

Description

외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터{Promoter for regulating expression of foreign genes}
본 발명은 형질전환 생물체에서, 보다 구체적으로는 형질전환 식물체에서 잎-특이적 방법으로 외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터에 관한 것이다.
유용한 재조합 분자를 생산하기 위하여 미생물의 유전자 형질전환이 15년 이상 사용되어 왔고, 최근에 의약품, 화장품 및 더마슈티컬(dermaceutical) 산업에서 응용되어 개발되고 있다. 이러한 기술은 지난 10년 동안 이러한 일반적인 개념을 복잡한 진핵생물체에 적합하도록 필요한 기술의 개발과 함께 미생물에서 식물 및 동물까지 확대되었다. 기본적으로 원하는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 원하는 분자를 이끄는 대사 경로의 변형을 담당하는 효소를 암호화하는 유전자가 시스(cis-) 및 트랜스(trans)-작용 조절 서열에 적정한 방법으로 연결되어 있고, 목적 세포 전달되어 분자 기계에서 (일시적 또는 안정한 방법으로) 삽입된다. 형질전환 세포로부터 재생된 형질전환 세포 또는 조직 또는 생물은 형질전환유전자의 전사 및 번역을 수행하고 목적 단백질을 축적할 수 있고, 원하는 효소의 활성을 통 하여 새로운 대사 작용을 수행할 수 있다.
분자 농업의 유망한 산업은 다가오는 세기에서 가장 유망한 산업중의 하나이다. 이의 유망성은 안전하고 재생가능한 산업용 분자 공장을 제공할 것이다. 최근 개발되어진 실용성 중에서는 치료 및 진단용 단일클론 항체의 저가 생산, 호르몬, 사이토카인 및 만성 또는 치명적인 질병의 치료를 위한 다른 생-활성 분자의 무한 생산, 여러 혈액 요소에 대한 안전한 대체체의 생산, 음식 및 펄프 산업에서 공정 효소의 무한적 생산, 쓰레기 처리를 위한 효소의 염가 생산 및 화장품 산업에 대한 생물학적으로 안정한 분자의 생산이 있다.
이러한 기술의 실용성의 한계는 재조합 산물을 충분한 양으로 축적하기 위하여 형질전환 생물체의 무능력으로 기인하고, 적은 전사 속도, 메신저의 부적합한 스플라이싱(splicing)의 결과, 외래 mRNA의 불안정, 낮은 번역 속도, 엔도지너스 프로타제의 작용에 대한 재조합 단백질의 과민반응 또는 외래 단백질에 대한 재조합 생물체의 과민반응은 부적합 및 제한된 성장 또는 최악의 상황을 초래하고, 호스트 생물체에 강력한 해를 끼친다. 이익 마진이 적거나 또는 잔여 물질의 치료 및/또는 폐기가 생물학적 안전 또는 환경 문제를 일으킬 때, 불충분한 생산 수준은 응용 개발에 직접적인 영향을 미친다. 원하는 재조합 산물의 축적 수준의 향상은 분자 농업의 많은 응용의 상용화를 보장하는 중요한 요소일 것이다.
광합성은 생물계에서 가장 중요한 대사 작용이다. 이것은 대부분의 육상 식물 및 조류(algae), 또한 몇몇 박테리아에 의해서 수행된다. 광합성의 전체적인 작용은 잎 세포의 클로로플라스트에 위치한 틸라코이드 막 시스템 안에 공간적으로 위치한 전자 전달 단백질의 복잡한 조합을 수반한다. 전자 전달 체인은 모든 광합성 생물체, 클로로필 및 다른 끝에 일반적인 한 분자를 포함하여, 여러 매크로분자를 포함하는 광합성 안테나를 갖는 한쪽 끝에서, NADPH 및 ATP 합성에 관여하는 효소 및 NADPH 및 ATP로 부터 에너지의 분출을 기체 이산화탄소를 유기 분자로의 고정과 연결시키는데 관여하는 칼빈 회로(Calvin cycle)와 연결되어 있다. 전체적인 광합성 작용에 관여하는 단백질 중에서 리불로스 비포스페이트 카르복실라제(Ribulose biphosphate carboxylase; Rubisco)가장 많은 단백질이다.
광합성은 잎세포에서 전용으로 수행할 수 있고, 식물 생명공학에서 응용을 위한 강력한 잎-특이 발현 카세트를 제조할 때 현저한 조직-특이적 대사 활성에 관여하는 유전자의 프로모터를 사용하려는 것은 명백히 관심이 있다.
광합성 기구의 많은 펩타이드 구성분은 클로로플라스트 게놈에 존재하는 유전자에 의해 암호화 되어 있다. 예를 들어, CO2 고정을 위한 촉매 위치를 갖는 루비스코의 대형 소단위체는 클로로플라스트 유전자에 의해 암호화되었다. 그러나, 상기 효소의 소형 소단위체는 핵 유전자에 의해 암호화되었고, 따라서 루비스코 전단백질은 다른 두 게놈에 의해 암호화되는 소단위체에 의해 만들어진다. 명백한 이유로, 형질전환 식물의 잎에서 형질전환유전자의 전사를 조절하기 위하여 루비스코 프로모터를 사용하려는 노력들이 있었다. 상기 프로모터는 잘 알려져 있고, 발현벡터에서의 그의 용도는 미국 특허 4,962,028에 의해 보호받는다.
본 발명에서는 형질전환 생물체, 특히 형질전환 식물에서 외래 유전자의 발 현을 조절하는 프로모터를 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 형질전환 생물체, 특히 형질전환 식물체에서 외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 형질전환 생물체에서 외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 제공하고, 이는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 서열 및 그들의 기능적 절편 또는 유도체로 구성되는 군으로 부터 선택되는 서열을 갖는 프로모터와 동일한 특징을 갖는 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터는 상기 유전자의 발현을 위하여 외래 유전자에 관련하여 작용할 수 있도록 적합하게 위치하여 있다.
본 발명의 바람직한 프로모터는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다.
바람직하게는 생물체는 식물이다.
바람직하게는 본 발명의 프로모터는 빛의 유무에 의해 조절되어진다.
바람직한 식물은 쌍자엽식물 (dicot), 단자엽식물 (monocot) 또는 나자식물 (gymnosperm)이다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면,
a) 하나 이상의 본 발명의 프로모터 및 유전자의 ORF로 구성되는 발현 컨스트럭트를 사용하여 형질전환 생물체를 제조하고, 상기 프로모터는 상기 유전자의 발현을 위하여 상기 유전자와 관련하여 작용할 수 있도록 위치하여 있는; 단계를 포함하는 형질전환 생물체에서 외래 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적을 위하여 하기 용어를 다음과 같이 정의한다.
"그들의 기능적 절편 또는 유도체"라는 표현은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 서열의 유도체 또는 절편을 의미하고, 이는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 본 발명의 프로모터가 발현하는 외래 단백질과 동일한 수준으로 발현시킬 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
하기에서는 리포터 유전자의 발현에서 조절될 수 있는 형질전환 앨팰퍼(alfalfa)를 생성하는데 사용되는 방법을 자세히 설명한다.
서열번호 1 내지 서열전호 3으로 기재되는 서열을 포함하는 프로모터를 리포터 유전자 및 터미네이터(terminator)에 연결하고, 앨팰퍼 잎에 DNA 충격을 위해, 그리고 데스가그네스 등(Desgagnes et al. 1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140)이 기술한 아그로박테리아 매개 DNA 전달을 위해 적합한 식물 발현벡터에 상기 컨스트럭트를 삽입하였다. 이러한 두가지 DNA 전달 방법은 리포터 유전자의 발현이 빛에 의해 조절될 수 있다는 것을 증명하는데 사용되어 진다.
실험 재료 및 방법
DNA 서열분석
DNA 서열분석은 생거의 방법에 따라 수행하였다(Sanger et al., 1977, P.N.A.S. USA, 74:5643-5647).
본 발명의 프로모터는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 서열을 포함한다.
발현 카세트 및 벡터의 제조
GUS 리포터 유전자를 이용한 발현 분석을 위한 카세트를 하기와 같이 조합하였다. pBl101으로부터 프로모터가 없는 GUS 카세트를 Hind III 및 EcoR I으로 잘라내고, 이를 pUC19 다클로닝 부위의 Hind III 및 EcoR I 위치에 삽입하였다. 그결과 생성된 플라스미드를 pBl201이라 명명하고, 이를 컨스트럭트 제조를 위하여 사용하였다. pGPlas3-2의 여러 결실 절편을 pBl201에서 GUS 리포터 유전자의 5' 말단에 전사적으로 및 과도적으로 연결하였고, 이를 DNA 충격을 사용하여 일시적 발현 연구에 사용하였다. 적당한 결실 절편을 확인하여 이를 pBl101(Clonetech)과 같은 이진(binary) 식물 발현벡터에 서브클로닝하였다. 이러한 재조합 플라스미드는 하기에 기재된 A. 투메파시엔스 감염을 통한 안정한 조립(integration)을 위하여 사용된다.
아그로박테리아-매개 DNA 전달 및 형질전환체의 재생
재조합 플라스미드를 하우디의 방법에 따라 전기 충격법에 의해 아그로박테리아 투메파시엔스 균주 LBA4404에 도입하였다(Khoudi et al., 1999, Biotechnol. Bioeng., 64:135-143). 선택된 아그로박테리아 균주를 유전형 C5-1의 잎 디스크(disks)와 함께 4일 동안 선택 강제(카나마이신) 없이 공동배양하였다. 이러한 배양 기간 다음에 잎 디스크를 세척하고 나서, B5H 배지에서 캘러스(calli)를 생성하게 하였다. 캘러스를 배아 유도를 위하여 SH 배지에 21일 동안 옮기 배양하고, 배지 발생을 위한 BOi2Y에 28일 동안 배양하였다. Boi2Y로부터 어뢰 모양의 배아를 절단하고, 재생을 위하여 MS 배지에 놓았다. MS에서 공동배양 및 재생을 위하여 배지를 제외하고는 모두 카나마이신이 존재하였다. 상기 방법은 데스카그네스 등에 기재되어 있다(Desgagnes et al., 1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140). 뿌리가 있는 묘목은 온실에서 성장하여 성숙하였다.
실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 더 이상의 변형이 가능하고, 이러한 응용은 여러 변화, 용도 또는 본 발명의 개작을 포함하고, 본 발명의 원리 및 본 명세서에 의해 당업자가 알 수 있는 모든 것을 포함한다.
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Claims (8)

  1. 형질전환 생물체에서 외래 유전자를 발현하는 프로모터로서, 상기 프로모터는 서열번호 1 내지 3 및 서열번호 2의 1 내지 700번째 핵산으로 구성된 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 가지며, 상기 외래 유전자의 발현을 위하여 상기 외래 유전자와 관련하여 작동가능하도록 위치하여 있는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 빛의 유무에 의해 상기 유전자의 전사적 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 기재되는 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 생물체는 식물인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽식물(dicot), 단자엽식물(monocot) 또는 나자식물(gymnosperm)인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  6. 청구항 1의 프로모터를 이용하여 외래유전자의 발현을 조절하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 생물체는 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽식물, 단자엽식물 또는 나자식물인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020027004323A 1999-10-04 2000-10-02 외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 KR100817660B1 (ko)

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