CN106574274A - 植物调控元件及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于调节异源核苷酸序列在植物中的表达的组合物和方法。组合物包含来自野芝麻叶变形相关病毒的调控元件的新型核苷酸序列。本发明提供了使用本文所公开的调控元件序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。所述方法包括用可操作地连接至本公开的调控元件之一的核苷酸序列转化植物或植物细胞。
Description
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技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，更具体而言涉及植物中基因表达的调节。
背景技术
异源DNA序列在植物宿主中的表达取决于在该植物宿主中有功能的可操作地连接的调控元件的存在。调控元件序列的选择将决定在生物体内何时和何处表达异源DNA序列。在需要在特定组织或者器官中表达的情况下，可以使用组织优选的调控元件。在需要响应于刺激而表达基因的情况下，诱导型调控元件是首选的调控元件。相比之下，在需要在整个植物细胞中持续表达的情况下，采用组成型启动子。可以在转化载体的表达构建体中包括位于核心调控元件序列上游和/或下游的附加调控序列，以便引起异源核苷酸序列在转基因植物中不同水平的表达。
常常期望在植物中组成型表达DNA序列。例如，可以通过遗传操纵植物的基因组以包含可操作地连接至异源病原体抗性基因的组成型调控元件，从而使得在所需植物组织中产生病原体抗性蛋白质，实现植物对土源和空气源病原体感染的抗性增加。
另选地，可能期望抑制植物组织内天然DNA序列的表达以实现所需的表型。在这种情况中，可以如下实现这种抑制：将植物转化以使其包含可操作地连接至反义核苷酸序列的组成型启动子，从而该反义序列的表达产生了干扰天然DNA序列的mRNA翻译的RNA转录物。
通过使用基因工程技术遗传地改变植物并且因此产生具有有用性状的植物，这要求多种启动子的可获得性。启动子的积累将允许研究人员设计出能够按所需水平和细胞场所表达的重组DNA分子。因此，组成型启动子的集合将使得新性状以所需水平在所需组织中表达。因此，需要分离和表征组成型调控元件以进行植物的遗传操纵，所述组成型调控元件可以充当以实测组成型方式表达感兴趣异源核苷酸序列的调控区。
发明内容
本公开提供了用于调控感兴趣异源核苷酸序列在植物或植物细胞中表达的组合物和方法。提供了包含引发转录的调控元件的新型核苷酸序列的DNA分子。在一些实施方案中，调控元件具有在植物细胞中引发转录的启动子活性。本公开的实施方案包括SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6中所示的核酸序列，或其互补序列，包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6中至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录，以及包括以下序列的核苷酸序列，所述序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6中所示的序列具有至少85％序列同一性，其中所述序列在植物细胞中引发转录。
本公开提供了一种用于在植物或植物细胞中表达异源核苷酸序列的方法。该方法包括向植物或植物细胞中引入表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至本公开的调控元件之一的感兴趣异源核苷酸序列。这样，调控元件序列可用于控制可操作地连接的异源核苷酸序列的表达。
还提供了一种在植物中以组成型方式表达感兴趣核苷酸序列的方法。该方法包括向植物细胞中引入表达盒，该表达盒包含可操作地连接至感兴趣异源核苷酸序列的本公开调控元件。
感兴趣核苷酸序列的表达可以提供对植物表型的修饰。这种修饰包括调节内源产物的产生(数量、相对分布等)或者外源表达产物的产生，以在植物中提供新功能或者产物。在特定方法和组合物中，感兴趣异源核苷酸序列包含赋予除草剂抗性、病原抗性、昆虫抗性和/或对盐、寒冷或干旱改变的耐受性的基因产物。
本公开提供了表达盒，其包含可操作地连接至感兴趣异源核苷酸序列的本公开启动子序列。另外提供了转化的植物细胞、植物组织、种子和植物。
附图说明
图1示出野芝麻叶变形相关病毒(LLDAV)调控区的结构和调控区的截短形式。1226个碱基对LLDAV调控区(FL)由短ORFD和茎环结构上游的长基因区(LIR)的一部分组成。序列将LLDAV基因组的最后ORF的5’端延伸到3’端中。调控区从5’端截短(TR)成由1130bp、904bp、885bp、443bp和113bp组成的片段。推定的TATA框的位置由箭头描绘。
图2示出1226个碱基对全长LLDAV调控元件(SEQ ID NO：1)的核酸序列。推定的TATA框带下划线。另外，由插入的箭头指示截短的LLDAV调控元件的5’端，如由1130个碱基对截短的调控元件LLDAV TR1(SEQ ID NO：2)的核酸序列、904个碱基对截短的调控元件LLDAV TR2(SEQ ID NO：3)的核酸序列、885个碱基对截短的调控元件LLDAV TR3(SEQ IDNO：4)的核酸序列、443个碱基对截短的调控元件LLDAV TR4(SEQ ID NO：5)的核酸序列、以及113个碱基对截短的调控元件LLDAV TR5(SEQ ID NO：6)的核酸序列表示的。
具体实施方式
本公开涉及针对植物调控元件的组合物和方法以及它们的应用方法。所述组合物包含野芝麻叶变形相关病毒(LLDAV)的调控区的核苷酸序列。所述组合物还包含DNA构建体，该DNA构建体包含可操作地连接至感兴趣异源核苷酸序列的LLDAV调控区的核苷酸序列。具体地，本发明提供了分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列以及其片段、变体和互补序列。
本公开的LLDAV调控元件序列包括允许在植物中引发转录的核苷酸构建体。在具体的实施方案中，LLDAV调控元件序列允许以组成型方式引发转录。本公开的这种构建体包括与植物发育调节相关的受调节的转录起始区域。因此，本公开的组合物包括DNA构建体，所述构建体包含与LLDAV调控元件序列可操作地连接的感兴趣核苷酸序列。LLDAV调控区序列的一个来源如SEQ ID NO：1所示。
本公开的组合物包含LLDVA调控元件的核苷酸序列及其片段和变体。在具体的实施方案中，本公开的调控元件序列可用于以组成型方式表达感兴趣序列。本公开的核苷酸序列还可用于构建表达载体，所述表达载体用于异源核苷酸序列随后在感兴趣植物中的表达，或者作为探针用于分离其它LLDAV样调控元件。
调控元件
调控元件是具有基因调节活性的核酸分子，即，具有影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的核酸分子。因此，术语“基因调节活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，来影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的能力。基因调节活性可以为阳性和/或阴性并且所述影响可由其以下特征来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应特性以及定量或定性指示。
调控元件诸如启动子、前导序列、内含子和转录终止区是具有基因调节活性并在活细胞基因整体表达中扮演不可缺少的一部分的核酸分子。术语“调控元件”是指具有基因调节活性的核酸分子，即，具有影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的核酸分子。因此，通过基因工程的方法，在植物中起作用的分离的调控元件，诸如启动子和前导序列可用于修改植物表型。
调控元件可由其表达模式来表征，即，表征为组成型，和/或由以下特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、细胞周期、和/或化学响应表达模式以及它们的任何组合，以及通过定量指示或定性指示来表征。启动子可用作调控元件，其用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。
如本文所用，“基因表达模式”是可操作地连接的核酸分子转录成转录的RNA分子的任何模式。表达可由以下特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应特性，以及通过定量指示或定性指示来表征。转录的RNA分子可被翻译以产生蛋白质分子或可提供反义RNA分子或其它调节RNA分子，诸如dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA等。
如本文所用，术语“蛋白质表达”是转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可由其下列特性来表征：时间、空间、发育或形态学特性，以及通过定量指示或定性指示来表征。
如本文所用，术语“启动子”一般是指参与识别并结合RNA聚合酶II和其它蛋白质(反式作用转录因子)以引发转录的核酸分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5′非翻译区(5′UTR)分离。另选地，启动子可合成产生的或受操纵的DNA分子。启动子还可以为嵌合的，即通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的启动子。
在一个实施方案中，本公开提供了具有本文所公开的启动子序列的片段。启动子片段可表现出启动子活性并且可单独地或与其它启动子和启动子片段组合用于诸如构建嵌合启动子。在具体的实施方案中，本公开提供了启动子的片段，其包括本文所公开的具有启动子活性的多核苷酸分子的至少约50、95、150、250、500或约750个连续核苷酸。当与参考序列最佳比对时，此类片段可表现出与参考序列至少约85％，约90％，约95％，约98％，或约99％或更大的同一性。
还可分析启动子或启动子片段的已知启动子元件的存在，即DNA序列特性，诸如TATA框和其它已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可使用鉴定的此类已知启动子元件，来设计具有与原始启动子相似表达模式的启动子变体。
如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用转录调控元件，又称顺式元件，其赋予整体表达模式的一个方面，但通常不足以单独驱动可操作地连接的多核苷酸序列的转录。不同于启动子，增强子元件通常不包括转录起始位点(TTS)或TATA框。启动子天然可包括影响可操作地连接的多核苷酸序列的转录的一个或多个增强子元件。分离的增强子元件还可与启动子融合以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予整体操纵基因表达的一个方面。启动子或启动子片段可包括影响可操作地连接的基因转录的一个或多个增强子元件。据信，许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白和/或影响DNA拓扑结构，从而产生选择性地允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或者有利于在转录起始位点处选择性打开双螺旋的局部构象。增强子元件可用于结合调节转录的转录因子。一些增强子元件结合多于一个转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与多于一个增强子结构域相互作用。增强子元件可通过多种技术来鉴定，包括缺失分析，即，从启动子的5′端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNase I足印法、甲基化干扰、电泳迁移率改变测定、通过连接介导PCR执行的体内基因组足印法、以及其它常规测定进行DNA结合蛋白分析；或者使用已知顺式元件基序或增强子元件作为靶序列或靶基序，采用常规DNA序列比较法如BLAST来进行DNA序列相似性分析。增加子结构域的精细结构可通过一个或多个核苷酸的诱变(或置换)或者通过其它常规方法进一步研究。增强子元件可通过化学合成获得，或从包括此类元件的调控元件中分离获得，并且它们可与包含可用限制性酶位点的附加侧翼核苷酸合成以有利于后续操纵。因此，本公开涵盖根据本文所公开方法的增强子元件的设计、构建和使用，用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。
如本文所用，术语“5’非翻译侧翼区”是指从基因的基因组拷贝的5′非翻译区(5′UTR)分离的DNA分子，并且通常被定义为介于转录起始位点(TSS)和蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸片段。这些序列或前导序列可以是合成产生的或受操纵的DNA元件。前导序列可用作5′调控元件，其用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。前导序列分子可与异源启动子或其天然启动子一起使用。因此，本公开的启动子分子可以可操作地连接至其天然前导序列或可以可操作地连接至异源前导序列。
如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合而产生单个DNA分子，其中第一DNA分子和第二DNA分子通常均不以该构型存在，即与其它DNA分子融合。因此，嵌合DNA分子是否则通常不天然存在的新DNA分子。如本文所用，术语“嵌合启动子”是指通过DNA分子的此类操纵产生的启动子。嵌合启动子可将两个或更多个DNA片段组合；示例可以为启动子与增强子元件的融合。因此，本公开涵盖根据本文所公开方法的嵌合启动子的设计、构建和使用，用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。
应当理解，位于编码区序列的内含子内或者编码区序列3′的核苷酸序列也可有助于感兴趣编码区的表达的调控。合适的内含子的示例包括但不限于玉米IVS6内含子，或者玉米肌动蛋白内含子。调控元件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3′)的元件，或者位于被转录的区域内的元件，或者同时以上两种情况。在本公开的情形中，转录后调控元件可包括在转录起始之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子和mRNA稳定性决定子。
可将本公开的调控元件或其变体或片段与异源调控元件或启动子有效结合，以调控异源调控元件的活性。这种调控包括增强或抑制异源调控元件的转录活性、调节转录后事件、或者增强或抑制异源调控元件的转录活性并调节转录后事件。例如，可将本公开的一个或多个调控元件或其片段与组成型、诱导型或组织特异性启动子或其片段有效结合，以调节这种启动子在植物细胞中所需组织内的活性。
本公开涵盖分离的或重组的核酸组合物。“分离的”或“重组的”核酸分子(或DNA)在本文用来指不再处于其天然环境中，例如处于体外的或异源重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。分离的或重组的核酸分子或其生物活性部分，当通过重组技术产生时基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当用化学法合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。分离的或重组的核酸不含在衍生该核酸的生物体的基因组DNA中天然处于该核酸旁侧的序列(即位于该核酸5′和3′端的序列)(最佳地是蛋白质编码序列)。例如，在多个实施方案中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然处于该核酸分子旁侧的核苷酸序列。本公开的LLDAV调控元件序列可从处于它们各自的转录起始位点旁侧的5′非翻译区分离。
所公开的启动子核苷酸序列的片段和变体也为本发明所涵盖。具体地，SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6的LLDAV调控元件序列的片段和变体可用于本公开的DNA构建体中。如本文所用，术语“片段”是指核酸序列的一部分。LLDAV调控元件序列的片段可以保留引发转录的生物活性，更具体地，以组成型方式驱动转录。另选地，可用作杂交探针的核苷酸序列片段可以不必保留生物活性。LLDAV调控区的核苷酸序列的片段的范围可为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，并且对于该基因的启动子区最多本公开的全长核苷酸序列。
LLDAV调控元件的生物活性部分可通过分离本公开的LLDAV调控元件序列的一部分并评估该部分的启动子活性来制备。作为LLDAV调控元件核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900或1000个核苷酸或者直至本文所公开的全长LLDAV调控元件序列中存在的核苷酸数目(例如，对于SEQ ID NO：1而言的1226个核苷酸)。
对于核苷酸序列，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如本文所用，“天然”或“基因组”核苷酸序列包含自然出现的核苷酸序列。对于核苷酸序列，可以使用公知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，如那些例如采用定点诱变产生的核苷酸序列。一般来讲，本公开的特定核苷酸序列的变体将与这种特定核苷酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列同一性，这通过本文别处描述的序列比对程序和参数来确定。本公开的核苷酸序列的生物活性变体与该序列可以相差少至1-15个核酸残基，少至1-10个、少至6-10个、少至5个、少至4、3、2或甚至1个核酸残基。
在一些实施方案中，编码调控区的核酸分子是“非基因组核酸序列”。如本文所用，“非基因组核酸序列”是指与天然或基因组核酸序列相比在核酸序列中具有一个或多个改变的核酸分子。
变体核苷酸序列还涵盖从诱变和诱重组方法(诸如DNA改组)衍生的序列。利用此类程序，可操纵LLDAV调控元件核苷酸序列以形成新的LLDAV调控元件。这样，从一组相关的多核苷酸序列产生重组多核苷酸的文库，所述相关的多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区域。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利5,605,793和5,837,458。
本发明的核苷酸序列可用于分离来自其它生物体、特别是其它植物、更具体地其它单子叶植物的相应序列。这样，可使用诸如PCR、杂交等之类的方法，对这类序列基于其与本文给出的序列的序列同一性来进行鉴定。本公开涵盖基于其与本文所示的完整LLDAV调控元件序列或者与完整LLDAV调控元件序列的片段的序列同一性而分离的序列。
在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以便从提取自任何感兴趣植物的基因组DNA中扩增出相应DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，在以下文献中有公开：Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)，下文称“Sambrook”。还可参见Innis等人编辑(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand编辑，(1995)PCR Strategies(AcademicPress，New York)；以及Innis和Gelfand编辑，(1999)PCR Methods Manual(AcademicPress，New York)。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
在杂交技术中，将已知核苷酸序列的全部或一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的一组克隆的基因组DNA片段中存在的其它相应核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可以用可检测基团(如P-32)或任何其它可检测标记物标记。因此，例如，杂交用探针可通过基于本公开的LLDAV调控元件序列对合成的寡核苷酸进行标记来制备。制备杂交用探针和构建基因组文库的方法是本领域公知的，并且在Sambrook中有公开。
例如，本文所公开的完整LLDAV调控元件序列或其一个或多个部分，可用作能够与相应的LLDAV调控元件序列和信使RNA特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包括在LLDAV调控元件序列中独特的并且长度为至少约10个核苷酸或长度为至少约20个核苷酸的序列。这种探针可用于通过PCR从选定的植物扩增相应的LLDAV调控元件序列。这项技术可以用于来从所需生物体分离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括对平板接种的(plated)DNA文库(噬菌斑或菌落；参见例如，Sambrook)的杂交筛选。
这类序列的杂交可以在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶标序列杂交的程度比其与其它序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以识别与探针100％互补的靶标序列(同源探测)。另选地，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，最佳地长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括用30至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50-55℃下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交并在0.5倍至1倍SSC中在55-60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交并最后在0.1倍SSC中在60-65℃下洗涤并持续至少约30分钟的持续时间。杂交的持续时间通常少于约24小时，一般约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。
特异性通常随杂交后的洗涤而变化，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm(热熔点)可以根据Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284：的方程进行估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。对于每1％错配，Tm下降约1℃；因此，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有＞90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，极严格条件可以利用比Tm低1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比Tm低6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比Tm低11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。利用所述公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，内在地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(含水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。有关核酸杂交的详尽指导见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；以及Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York)。另外参见“Sambrook”。
因此，本公开涵盖具有组成型启动子活性并且在严格条件下与本文所公开的LLDAV调控元件序列或与其片段杂交的分离序列。
如下术语用来描述两条或更多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质上相同”。
(a)本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或者全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完整的cDNA或基因序列。
(b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续的且指定的区段，其中该比较窗口中的多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列进行最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，任何两条序列之间的序列同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。此类数学算法的非限制性示例是Myers和Miller，(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的搜索局部比对法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，其在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中修改；
可利用这些数学算法的计算机实现进行序列的比较以确定序列同一性。此类执行序包括、但不限于：PC/Gene程序(购自Intelligenetics，Mountain View，California)中的CLUSTAL；GCG Wisconsin GeneticsSoftware Package，版本10(购自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。CLUSTAL程序如下文献详细说明：Higgins等人(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS 8：155-65；以及Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与编码本公开蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTN程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本公开蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所描述采用Gapped BLAST(在BLAST2.0中)。另选地，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)，出处同上。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见美国国家生物技术信息中心的网站。还可以以人工方式通过检查来进行比对。
除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的同一性％和相似性％采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的同一性％和相似性％采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵。以及它们的任何等同程序。所谓“等同程序”意指任何序列比较程序，所述程序对于所考虑的任何两个序列，与GAP版本10所产生的相应比对结果相比时，产生具有相同核苷酸残基或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对结果。
GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大且使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它使得可以提供以匹配碱基数为单位的空位形成罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位形成罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics SoftwarePackage的版本10中的默认空位形成罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位形成罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位形成罚分和空位延伸罚分可以以选自0至200的整数来表示。因此，例如，空位形成罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其它成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了将序列进行比对而最大化的度量标准(metric)。比率是品质除以较短片段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似的符号的百分比。忽略空位上的符号。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
(c)如本文所用，在两条核酸或多肽序列的情形中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗口范围为获得最大对应而比对时这两条序列中相同的残基。当序列同一性百分比针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调序列同一性百分比以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这种调节的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0和1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中所实现那样进行计算。
(d)如本文所用，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口范围内比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分可包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比对两个序列。通过以下方式计算所述百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
(e)术语多核苷酸序列的“实质上同一性”意指多核苷酸与参考序列相比包含具有至少70％、至少80％、至少90％、和至少95％序列同一性的序列，所述百分比是用所述比对程序之一采用标准参数得到的。
核苷酸序列实质上相同的另一种指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，将严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。但是，严格条件涵盖在比Tm低约1℃至约20℃范围内的温度，取决于本文另外限定的所需严格程度。
如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。籽粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所培育的成熟种子。再生植物的子代、变体和突变体也包括在本公开的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。
本公开可用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)的转化。植物物种的示例包括玉米(玉蜀黍)；芸苔属物种(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghum vulgare)、小米(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))；向日葵(Helianthusannuus)；红花(Carthamus tinctorius)；小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))；甘薯(Ipomoeabatatus)；木薯(Manihot esculenta)；咖啡(Coffea spp.)；椰子(Cocos nucifera)；菠萝(Ananas comosus)；柑橘树(Citrus spp.)；可可(Theobroma cacao)；茶(Camelliasinensis)；香蕉(Musa spp.)；鳄梨(Persea americana)；无花果(Ficus casica)；番石榴(Psidium guajava)；芒果(Mangifera indica)；橄榄(Olea europaea)；木瓜(Caricapapaya)；腰果(Anacardium occidentale)；澳洲坚果(Macadamia integrifolia)；杏树(Prunus amygdalus)；糖用甜菜(Beta vulgaris)；甘蔗(Saccharum spp.)；燕麦；大麦；蔬菜；观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(西红柿)、莴苣(例如油麦菜)、青豆(菜豆)、利马豆(棉豆)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属(Cucumis)的成员比如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron)物种)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(木槿)、玫瑰(蔷薇属(Rosa)物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)物种)、水仙(水仙属(Narcissus)物种)、泽兰属(Eupatorium hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可用于实施本公开的针叶树包括(例如)松树诸如厚皮刺果松(火炬松)、湿地松(Pinus elliotii)、杰克松(西黄松)、黑松(扭叶松)和蒙特利松树(辐射松)；花旗松(黄杉)；西铁杉(部铁杉)；西加云杉(白云杉)；红杉(北美红杉)；枞树(true firs)诸如银枞(胶冷杉)和胶枞(香脂冷杉)；以及雪松如西岸红雪松(西部红松)和阿拉斯加黄雪松(黄扁柏)。在具体的实施方案中，本公开的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等等)。在其它实施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，并且在另外的其它实施方案中，玉米植物是最佳的。
其它感兴趣植物包括提供感兴趣种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。感兴趣种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
如本文所用，术语“可转录多核苷酸分子”是指能够转录成RNA分子的任何DNA分子，其包括但不限于具有蛋白质编码序列的那些，以及具有可用于基因抑制的序列的那些。“转基因”是指与宿主细胞异源的可转录多核苷酸分子和/或人工掺入宿主细胞基因组中的可转录多核苷酸分子。
本发明的调控元件可以可操作地连接至相对于调节分子为异源的可转录多核苷酸分子。如本文所用，术语“异源”是指两个或更多个多核苷酸分子的组合，此类组合通常将不是天然存在的。例如，两个分子可源自不同物种和/或两个分子可源于不同基因，例如来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，如果此类组合通常不是天然存在的，则调控元件相对于可操作地连接的可转录多核苷酸分子是异源的，即可转录多核苷酸分子不天然与所述调控元件分子组合地进行可操作连接。
可转录多核苷酸分子通常可以为表达RNA转录物所需的任何DNA分子。RNA转录物的此类表达可导致所得mRNA分子的翻译，并且因此导致蛋白质表达。另选地，可转录多核苷酸分子可被设计成最终造成特定基因或蛋白质的表达减少。这可通过使用以反义方向取向的可转录多核苷酸分子来实现。本领域的普通技术人员熟悉使用这样的反义技术。简而言之，在转录反义的可转录多核苷酸分子时，RNA产物在细胞内与互补RNA分子杂交，并隔离互补RNA分子。该双螺旋RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译为蛋白质并且在细胞中降解。任何基因均可以这种方式进行负调节。
因此，本发明的一个实施方案为本发明的调控元件，诸如作为SEQ ID NO：1-6提供的那些，其可操作地连接至可转录多核苷酸分子，以便在所述构建体引入植物细胞中时，以期望的水平或期望的模式调控可转录多核苷酸分子的转录。在一个实施方案中，可转录多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，并且启动子影响被翻译和表达为蛋白质产物的RNA分子的转录。在另一个实施方案中，可转录多核苷酸分子包含基因的反义区，并且启动子影响反义RNA分子或其它相似抑制RNA分子的转录以便抑制感兴趣的特定RNA分子在靶宿主细胞中的表达。
本公开的LLDAV调控元件所表达的可转录多核苷酸分子可用于改变植物的表型。表型的各种变化是值得关注的，包括调节基因的表达、改变植物对病原体或昆虫的防御机制、提高植物在植物中对除草剂的耐受性、改变根发育以应对环境胁迫、调节植物对盐、温度(热和寒冷)、干旱的响应等。这些结果可以通过表达包含适当基因产物的感兴趣异源核苷酸序列来获得。在具体的实施方案中，感兴趣异源核苷酸序列是在该植物或植物部分中增加其表达水平的内源植物序列。另选地，这些结果可以通过引起植物中一种或者多种内源基因产物、尤其酶、转运蛋白或者辅因子的表达降低或者通过影响植物中营养物摄取来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
农业感兴趣的基因
可转录多核苷酸分子可以为农业感兴趣的基因。如本文所用，术语“农业感兴趣的基因”是指当在特定植物组织、细胞、细胞类型中表达时，提供与植物形态、生理、生长、发育、产量、产物、营养分布、疾病或害虫抗性、和/或环境或化学耐受性相关联的期望特性的可转录多核苷酸分子。农业感兴趣的基因包括但不限于，编码产量蛋白、应激抗性蛋白、发育控制蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境响应蛋白、衰老蛋白、激素响应蛋白、脱落蛋白、来源蛋白、sink蛋白、花控制蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、杀虫蛋白或任何其它试剂(诸如靶向特定基因以进行抑制的反义或RNAi分子)的那些。农业感兴趣的基因的产物可在植物内起作用，以便造成对植物生理或代谢的影响或可充当以植物为食的害虫食物中的杀虫剂。
在一个实施方案中，将本公开的调控元件掺入构建体中，使得调控元件可操作地连接至作为农业感兴趣基因的可转录多核苷酸分子。期望农业感兴趣的基因的表达以便赋予农艺上有益的性状。有益的农业性状可以为例如但不限于：除草剂耐受性、害虫防治、改良产量、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、植物生长和发育、淀粉产量、改善的油产量、高油产量、改善的脂肪酸含量、高蛋白质产量、果实成熟、增强动物和人营养、生物聚合物、环境应激抗性、药用肽和可分泌肽、改善的加工形状、改善的可消化性、酶产量、香气、固氮性、杂交制种、纤维产量和生物燃料产量。
昆虫抗性基因可以编码针损害和导致影响产量的害虫的抗性，所述害虫诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等。这类基因包括例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；以及Geiser等人(1986)Gene 48：109)；等。
编码抗病性性状的基因包括解毒基因，例如对伏马菌素解毒的那些基因(美国专利5,792,931)；无毒力(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；以及Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)；等)。
除草剂抗性性状可以包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)之作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)；编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，例如草胺膦或basta(例如bar基因)；草甘磷(如，EPSPS基因和GAT基因；参见例如美国专利公开20040082770和WO 03/092360)或本领域已知的其它此类基因。所述bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且ALS基因突变编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
草甘膦抗性由突变的5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)基因和aroA基因赋予。参见例如Shah等人的美国专利4,940,835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还可参见美国专利6,248,876 B1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114 B1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36,449；RE 37,287 E；和5,491,288；以及国际公布WO 97/04103；WO 97/04114；WO 00/66746；WO 01/66704；WO 00/66747和WO 00/66748，这些专利以引用方式并入本文以用于所有目的。也向植物赋予草甘磷抗性，所述植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，如美国专利5,776,760和5,463,175中更充分地描述，这两个专利以引用方式并入本文以用于该目的。此外，可以通过过表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因向植物赋予草甘膦抗性。参见例如美国专利7,714,188和7,462,481。
监管批准的农业感兴趣的基因是本领域技术人员熟知的并且可见于环境风险评估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，可使用www前缀对其进行访问)和国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications)(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，可使用www前缀对其进行访问)。
外源产物包括植物酶和植物产物，以及来自包括原核生物和其它真核生物在内的其它来源的那些产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等。
其它适用基因及其相关表型的示例包括编码病毒外壳蛋白和/或RNA的基因或者赋予病毒抗性的其它病毒基因或者植物基因；赋予真菌抗性的基因；促进产量改善的基因；以及提供抗胁迫的基因，所述胁迫例如为寒冷、因干旱、热和盐度引起的脱水、有毒金属或者痕量元素等。
如上所述，与本文所公开的LLDAV调控元件可操作地连接的异源核苷酸序列可以是针对靶向基因的反义序列。因此，本文所公开的启动子序列可以可操作地连接至反义DNA序列，以降低或抑制植物根中天然蛋白的表达。
“RNAi”是指用于降低基因表达的一系列相关技术(参见例如美国专利6,506,559)。由其它名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同的名称。这些包括“反义抑制”，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义RNA转录物，以及“共抑制”或者“正义抑制”，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外来基因或者内源基因的表达的正义RNA转录物(美国专利5,231,020，以引用方式并入本文)。这种技术依赖于使用能导致积累这样的双链RNA的构建体，该双链RNA中的一条链与要沉默的靶标基因互补。各实施方案的LLDAV调控元件可用来驱动将会导致RNA干扰的构建体(包括microRNA和siRNA)的表达。
本公开的调控元件序列或其变体或片段当可操作地连接至感兴趣异源核苷酸序列时，可驱动该异源核苷酸序列在表达这个构建体的植物中的组成型表达。“异源核苷酸序列”是不与本公开的调控元件序列一起天然存在的序列。虽然这个核苷酸序列对于调控元件序列是异源的，但它对于植物宿主可以是同源的、或天然的、或异源的、或外来的。
可以修饰本公开的分离调控元件序列以提供所述异源核苷酸序列的一系列表达水平。因此，可以利用小于完整的调控元件区，并且驱动感兴趣核苷酸序列表达的能力得到保持。应认识到，可以按不同方式缺失调控元件序列的一部分，改变mRNA的表达水平。如果(例如)在截短过程中移除(阻遏蛋白的)负调控元件，则因调控元件缺失，可以降低mRNA表达水平，或者可以增加表达。通常，分离的调控元件序列的至少约20个核苷酸将用于驱动核苷酸序列的表达。
应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本公开的调控元件区组合使用。增强子是起到增加调控元件区的表达的作用的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。一些增强子还已知用来改变正常的调控元件表达模式，例如通过造成调控元件驱动组成型表达而改变正常的调控元件表达模式，若没有该增强子，则相同的调控元件仅在一个特定组织或一些特定组织中驱动表达。
本公开的分离调控元件序列的修饰可以提供该异源核苷酸序列的一系列表达。因此，它们可被修饰成弱启动子或强启动子。通常，“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达意指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反，强启动子以高水平或者说以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。
已经认识到，本公开的LLDAV调控元件可用于增加或减少表达，从而导致转化植物的表型的变化。这种表型变化可能进一步影响已转化植物的组织中金属离子水平的增加或减少。
本公开中公开的核苷酸序列及其变体和片段可以用于植物的遗传操纵。与待控制其表达以实现所需表型反应的异源核苷酸序列可操作地连接时，LLDAV调控元件序列可用于这个方面。术语“可操作地连接”意指该异源核苷酸序列的转录和翻译处于该调控元件序列的影响下。这样，可以将本公开的调控元件的核苷酸序列与感兴趣异源核苷酸序列一起在表达盒中提供，以便在感兴趣植物中、更具体地在植物的根中表达。
所述实施方案的调控序列在DNA构建体中提供以用于在感兴趣生物体中表达。如本文所用的“表达盒”意指包含实施方案的调控序列，所述调控序列可操作地连接至编码感兴趣多肽的异源多核苷酸。这种表达盒将包含转录起始区，所述转录起始区包含与该异源核苷酸序列可操作地连接的本公开的调控元件核苷酸序列之一或其变体或片段。这种表达盒可以配有多个限制位点用于插入该核苷酸序列以便处于调控区的转录调节之下。表达盒可以另外含有选择性标记基因以及3′终止区。
表达盒在转录的5′-3′方向上可包括转录起始区(即本公开的启动子或其变体或片段)、翻译起始区、感兴趣异源核苷酸序列、翻译终止区，和任选地在宿主生物体中有功能的转录终止区。各实施方案的调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞而言或者彼此之间可以是天然的/类似的。另选地，各实施方案的调控区和/或多核苷酸对于宿主细胞或者彼此之间可以是异源的。如本文所用，与序列有关的“异源”，是指该序列源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，则一方或双方大体上由它们的原来形式和/或基因组位点修饰得到，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。
终止区可以对转录起始区而言是天然的，可以对可操作地连接的感兴趣DNA序列而言是天然的，可以对植物宿主而言是天然的，或者可以源于另一来源(即对于启动子、被表达的DNA序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的)。易得的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Callis等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。
包含本公开的序列的表达盒还可含有要共转化到该生物体中的基因的至少一条另外的核苷酸序列。另选地，所述另外的一个或多个序列可以在另一表达盒上提供。
在适当情况下，可以优化其表达待处于本公开的组成型启动子序列控制下的核苷酸序列和任何另外的一个或多个核苷酸序列，以便在转化的植物中增加表达。即，可使用植物优选密码子来合成这些核苷酸序列以改进表达。有关宿主偏好的密码子用法的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。合成植物偏好基因的方法是本领域可找到的。参见例如美国专利5,380,831、5,436,391，以及Murray等人(1989)NucleicAcids Res.17：477-498，上述文献以引用方式并入本文。
已知另外的序列修饰用于增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，以及其它此类得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可以将异源核苷酸序列的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平，所述平均水平通过参考该宿主细胞中表达的已知基因来计算。当可能时，修饰序列以避免可预见的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：6126 6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison等人(1986)Virology 154：920)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353：90 94；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4)(Jobling等人(1987)Nature 325：622 625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)Molecular Biology of RNA，第237-256页)；以及玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lomme等人(1991)Virology 81：382 385)。另外参见Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiology 84：965 968)。也可以采用已知增强mRNA稳定性的方法，例如内含子，如玉米遍在蛋白内含子(Christensen和Quail(1996)Transgenic Res.5：213-218)；Christensen等人(1992)Plant Molecular Biology 18：675-689)或者玉米AdhI内含子(Kyozuka等人(1991)Mol.Gen.Genet.228：40-48；Kyozuka等人(1990)Maydica 35：353-357)等。
在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以便提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确阅读框中的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其它的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及到体外诱变、引物修复、限制、复性、再置换，例如转换和颠换。
可以在表达盒中包含报告基因或者选择性标记基因。本领域已知的合适报告基因的示例可以见于例如以下文献：Jefferson等人，(1991)，Plant Molecular BiologyManual，Gelvin等人编辑(Kluwer Academic出版社)，第1-33页；DeWet等人(1987)Mol.Cell.Biol.7：725-737；Goff等人(1990)EMBO J.9：2517-2522；Kain等人(1995)BioTechniques 19：650-655；以及Chiu等人(1996)Current Biology 6：325-330)。
用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因可以包括赋予抗生素抗性或者除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的示例包括但不限于编码对以下物质的抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人(1983)EMBO J.2：987-992)；甲氨喋呤(HerreraEstrella等人(1983)Nature 303：209-213；Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820)；潮霉素，(Waldron等人(1985)Plant Mol.Biol.5：103-108；以及Zhijian等人(1995)Plant Science 108：219-227)；链霉素(Jones等人(1987)Mol.Genet.210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.5：131-137；博来霉素(Hille等人(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176)；磺酰胺(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136)；溴苯腈(Stalker等人(1988)Science 242：419-423)；草甘膦(Shaw等人(1986)Science 233：478-481；以及美国专利申请10/004,357和10/427,692)；草胺膦(DeBlock等人(1987)EMBOJ.(《欧洲分子生物学组织杂志》)6：2513-2518)。
可以在回收转基因事件中发挥作用但在最终产物中可能不需要的其它基因将包括但不限于诸如以下示例：GUS(β-葡糖醛酸酶；Jefferson(1987)Plant Mol.Rep.5：387)、GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie等人(1994)Science 263：802)、萤光素酶(Riggs等人(1987)Nucleic Acids Res.15(19)：8115和Luehrsen等人(1992)Methods Enzymol.216：397-414)以及编码花青素生产的玉米基因(Ludwig等人(1990)Science 247：449)。
包含可操作地连接至感兴趣核苷酸序列的本公开LLDVA调控元件的表达盒可用于转化任何植物。这样，可以获得基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等。
本公开的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中。“引入”旨在意指以使得多核苷酸或多肽进入植物细胞内部的方式将这些序列呈送给植物。本公开的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定转化”意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可以根据转化所指向的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)变动。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法，包括微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques4：320 334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602 5606)、农杆菌介导的转化(Townsend等人，美国专利5,563,055和Zhao等人，美国专利5,981,840)、直接基因转化(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717 2722)和弹道粒子加速(参见例如美国专利4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等人(1995)，Plant Cell，Tissue，andOrgan Culture：Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923 926)；以及Lecl转化(WO 00/28058)。另外参见weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421 477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology 5：27 37(洋葱)；Christou等人(1988)PlantPhysiol.87：671 674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923 926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736 740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305 4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology 6：559 563(玉米)；美国专利5,240,855、5,322,783和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440 444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology8：833 839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)，The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，Chapman等人编辑(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports9：415-418以及Kaeppler等人(1992)Theor.App1.Genet.84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant CellReports 12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米，通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；所有这些专利以引用方式并入本文。
在具体的实施方案中，可用多种瞬时转化方法将包含本公开调控元件序列的DNA构建体提供给植物。这类瞬时转化方法包括但不限于病毒载体系统以及以阻止DNA后续释放的方式沉淀多核苷酸。因此，虽然仍可能从粒子结合的DNA开始转录，但这种DNA释出继而整合到基因组中的频率会大大降低。此类方法包括用聚乙基亚胺(PEI；Sigma-AldrichTM#P3143)涂覆的粒子。
在其它实施方案中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本公开的多核苷酸引入到植物中。通常，这类方法涉及将本公开的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内部。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，以及Porta等人(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221；该专利以引用方式并入本文。
用于在植物基因组中的特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，在期望的基因组位置插入多核苷酸是使用位点特异性重组系统实现的。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，这些专利全部以引用方式并入本文。简单而言，可以在转移盒中包含本公开的多核苷酸，所述转移盒侧面为两个不相同的重组位点。将转移盒引入植物中，该植物基因组中稳定掺入有靶位点，其中所述靶位点侧面为两个与该转移盒的所述位点相对应的不相同重组位点。提供适当的重组酶，并且将转移盒整合在该靶标位点处。感兴趣多核苷酸因此被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。
可依据常规方式将已转化的细胞培育成植物。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可以培育这些植物，用相同的转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代植物，以确保所需表型特征的表达得到稳定保持和遗传。然后收获种子，以确保已实现所需表型特征的表达。这样，本公开提供了使得本发明的核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)稳定掺入其基因组中的转化种子(也称为“转基因种子”)。
本文所用的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或多于一个(种)(即，指至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个或多个要素。
在本说明书通篇中，词语“包含”及其语法变体应被理解为暗示包括规定的元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组，但不排除任何其它元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请指示了本公开所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物、专利或者专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。
以上对本公开各种示例示性实施方案的描述并不是穷举的或者将本发明限制于所公开的精确形式。尽管实施例的具体实施方案出于说明性目的在本文进行了描述，但相关领域的技术人员将认识到，各种等同修改形式都可能在本公开的范围内。本文中提供的教导可以适用于除上述实施例之外的其它目的。因此，许多修改和变型根据上述教导是可能的并且因此在所附的权利要求的范围内。
根据以上具体描述可以进行这些变化和其它变化。一般来讲，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将范围限制为说明书和权利要求书中所公开的具体实施方案。
已作出努力来确保所使用的数据(例如，数量、温度、浓度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另外指明，份数为重量份分子量为平均分子量；温度以摄氏度计；并且压力为大气压或接近大气压。
以下实施例是以说明性而非限制性方式提供的。
实验
实施例1：野芝麻叶变形相关病毒调控元件序列
SEQ ID NO：1的调控元件是通过在GenBank Genomes中检索已测序并归属于花椰菜病毒科病毒家族的病毒基因组获得的。该检索基于公知的花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子开始。所述启动子驱动异源基因在大多数植物的大多数组织中的组成型表达。来自这个病毒家族的其它调控元件如玄参花叶病毒34S启动子也在植物中引导组成型样(constitutive-like)表达。因此，衍自花椰菜病毒科病毒家族的另外的调控元件也可在植物中驱动组成型表达。该基因组的存在于所谓长基因间区域(LIR)中的区域通常含有为使启动子在植物中起作用而必需的调控序列。
野芝麻叶变形相关病毒(LLDAV)基因组具有LIR，因此该区域针对于调控元件的功能分析。选择一个全长序列以在植物中进行测试。所述序列由1226bp组成(在SEQ ID NO：1示出)，并在该序列的3’端上游起始约95bp处具有推定的TATA框。整个1226bp序列称为LLDAV全长调控元件或LLDAV FL。缺失全长调控元件的5’端的片段可改变表达模式并提供对调控区中重要序列标记的认识。第二、第三、第四、第五和第六序列为全长调控元件的截短型式(参见图2；SEQ ID NO：1)。LLDAV TR1、LLDAV TR2、LLDAV TR3、LLDAV TR4、和LLDAVTR5调控元件相应地由1130bp、904bp、885bp、443bp和113bp组成，并且包含全长启动子的3’端(SEQ ID NO：2-6)。
实施例2：LLDVA调控元件的表达和缺失分析
在表达载体中，将LLDAV FL可操作地连接至玉米醇脱氢酶基因1的第一内含子(ADH1内含子1)和β-葡糖醛酸酶(GUS)基因，以测试合成的DNA片段是否可引导表达(SEQ IDNO：1)。为增加表达，包含Adh1内含子1，因为已证实在谷类植物细胞中，转基因的表达因一些5’近端内含子的存在而增强(参见Callis等人(1987)Genes and Development 1：1183-1200；Kyozuka等人(1990)Maydica 35：353-357)。
来自玉蜀黍的Ubi-1启动子和内含子可操作性地连接至GUS基因，使得其可用于比较LLDAV调控元件的表达模式和表达水平。Ubi-1启动子在玉蜀黍的大多数组织中是强组成型启动子。
调控元件是一起起作用以结合转录因子的序列基序的集合，其产生启动子的空间、时间和定量表达特性。理解这些基序的架构和定位增强了关于调控元件的了解。片段缺失分析是可用于开始鉴定包含功能上重要基序的调控元件区域的重要工具。从5’端移除片段可改变由调控元件引导的空间、时间和/或定量表达模式。然后可以更密切地研究导致改变的区域，以评价序列及其与顺式因子和反式因子的相互作用。截短物还可鉴定最小功能序列。
使用限制性内切核酸酶识别位点SfuI、AccI、SacI、EcoRI和ClaI以移除尺寸范围为～96至1113bp的LLDAV FL的五个序列区。在表达载体中，将LLDAV TR1、LLDAV TR2、LLDAVTR3、LLDAV TR4、LLDAV TR5可操作地连接至ADH1内含子1和GUS基因，以测试合成DNA片段(SEQ ID NO：2-6)的表达可能。
使用农杆菌方案产生稳定转化的玉米植物(在实施例3中详述)以允许表征启动子活性，包括由不同调控元件引导的空间和定量表达。对在温室条件下生长至V5/6期的植物获取叶和根材料样本，以经由组织化学GUS染色分析和定量荧光测定来评价表达模式变化。由植物上的围绕叶(collared leaves)数目确定玉米营养生长期。因此，V5期的植物具有5片完全围绕的叶子。当植物达到R1-R2的繁殖生长期时也收集组织。R1由壳外出现须表示，并且R2是须开始变干的时间。结果示出LLDAV FL驱动在玉米的大多数组织中的表达，其类似或略优于Ubi-1启动子(表1)。例外的是花粉，其中LLDAV FL表达远低于Ubi-1。5’截短的启动子(LLDAV TR1-4)类似于LLDAV FL表现，不同的是LLDAV TR5在测试的任何组织中不起作用。
表1：LLDVA启动子(有Adh1内含子1和GUS)的植物表达结果
数据以0-6标度表示，其中玉米Ubi-1启动子引导的表达作为比较物。
将LLDAV FL(SEQ ID NO：1)调控元件可操作地连接至ADH1内含子1和杀虫基因(缩写为IG2)以测试表达。驱动IG2杀虫基因表达的Ubi-1启动子和内含子用于在分析时比较。使用农杆菌方案(在实施例3中详述)产生稳定转化的玉米植物，并且当对叶取样时使其生长至V5/6期。在采集茎和花粉样品时，则使植物生长至R1-R2期。在其达到成熟时，对籽粒进行取样。
来自针对IG2的酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果显示LLDAV FL调控元件(SEQ IDNO：1)在叶、茎和籽粒组织中引导表达(表2)。叶和茎组织的表达水平相当于Ubi-1启动子及其内含子。在籽粒中，LLDAV FL(SEQ ID NO：1)引导的表达低于Ubi-1，并且在花粉中，表达非常低。
表达数据由来自昆虫消耗测定的结果支持。用切碎的植物组织提供对蛋白质表达情况的快速评估，因为需要充分的水平以保护植物免受昆虫侵害。不充分的表达将导致进食损害。LLDAV FL(SEQ ID NO：1)和Ubi-1植物两者均展示出保护叶和须组织免受昆虫侵害的表达水平。来自阴性对照植物的组织不具有被消耗的IG2基因。
表2：LLDVA调控元件(有Adh1内含子1和LLDAV：IG2)的植物表达结果
数据以0-6标度表示，其中玉米Ubi-1启动子代表中间值。
数据以0-6标度表示，其中玉米Ubi-1启动子代表中间值。
实施例3：农杆菌介导的玉米转化和转基因植物的再生
为用本公开的调控元件序列进行农杆菌介导的玉米转化，采用了Zhao的方法(美国专利5,981,840以及PCT专利公布WO98/32326；所述专利的内容以引用方式并入本文)。简而言之，从玉米分离出未成熟胚，在一定条件下使胚与农杆菌悬液接触，使得细菌能够将本公开的调控元件序列转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。将胚与农杆菌悬浮液共培养一段时间，然后在固体培养基上共培养(步骤2：共培养步骤)。在共培养之后进行任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：静息步骤)。接着，在含有选择剂的培养基上转移并培养胚，以回收生长的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在转移到温室之前，植物从愈伤组织再生(步骤5：再生步骤)。
实施例4：LLDAV调控元件在油菜中的表达分析
使用GUS基因作为报告基因在油菜中测试LLDAV启动子。基因枪轰击瞬时分析用于提供性能的初始评估。GUS染色灶数和染色强度与拟南芥泛素-10启动子(AtUBQ10)、油菜组织中的强启动子进行比较。关于GUS染色的强度，LLDAV启动子的性能类似于AtUBQ10启动子。然而，观察到染色灶数的略减少(表3)。
转基因油菜植物由LLDAV：GUS和AtUBQ10：GUS载体两者再生。LLDAV：GUS的组织化学染色事件示出在叶和花器官中的高表达水平(表3)。LLDAV引导的表达也在花粉和长角果中观察到。当与来自AtUBQ10：GUS植物的组织化学染色的组织进行比较时，LLDAV在叶和花器官中是比得上的。在花粉中，LLDAV引导的表达弱于AtUBQ10，其中约10-15％的花粉粒染色。几乎所有的AtUBQ10花粉粒染成深色。
表3：LLDAV启动子在油菜中的表达结果
| 瞬时测定 | 叶 | 花器官 | 花粉 | |
| LLDAV FL | 2 | 3 | 3 | 1 |
| AtUBQ10 | 3 | 3 | 3 | 3 |
数据以0-3标度表达，其中三者均指示强表达。
Claims (24)
1.一种重组多核苷酸，其选自：
(a)与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸或，
(b)包含SEQ ID NO:1的核酸序列的多核苷酸，
(c)SEQ ID NO:1的多核苷酸，以及
(d)SEQ ID NO:1的片段。
2.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少95％的序列同一性。
4.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
(a)与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸或，
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的多核苷酸，
(c)SEQ ID NO:2的多核苷酸，以及
(d)SEQ ID NO:2的片段。
5.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
(a)与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸或，
(b)包含SEQ ID NO:3的核酸序列的多核苷酸，
(c)SEQ ID NO:3的多核苷酸，以及
(d)SEQ ID NO:3的片段。
6.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
(a)与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸或，
(b)包含SEQ ID NO:4的核酸序列的多核苷酸，
(c)SEQ ID NO:4的多核苷酸，以及
(d)SEQ ID NO:4的片段。
7.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
(a)与SEQ ID NO:5的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸或，
(b)包含SEQ ID NO:5的核酸序列的多核苷酸，
(c)SEQ ID NO:5的多核苷酸，以及
(d)SEQ ID NO:5的片段。
8.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
(a)与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸或，
(b)包含SEQ ID NO:6的核酸序列的多核苷酸，
(c)SEQ ID NO:6的多核苷酸，以及
(d)SEQ ID NO:6的片段。
9.一种DNA构建体；其包含
(a)调控元件多核苷酸，其选自：
(i)与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，
(ii)包含SEQ ID NO:1的核酸序列的多核苷酸
(iii)SEQ ID NO:1的多核苷酸，以及
(iv)SEQ ID NO:1的片段；以及
(b)可操作性地连接至所述调控元件多核苷酸的异源可转录多核苷酸分子。
10.根据权利要求9所述的DNA构建体，其中所述调控元件多核苷酸与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％的序列同一性。
11.根据权利要求9所述的DNA构建体，其中所述调控元件多核苷酸与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少95％的序列同一性。
12.根据权利要求9所述的DNA构建体；其包含
(a)调控元件多核苷酸，其选自：
(i)与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，
(ii)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的多核苷酸
(iii)SEQ ID NO:2的多核苷酸，以及
(iv)SEQ ID NO:2的片段；以及
(b)可操作性地连接至所述调控元件多核苷酸的异源可转录多核苷酸分子。
13.根据权利要求9所述的DNA构建体；其包含
(a)调控元件多核苷酸，其选自：
(i)与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，
(ii)包含SEQ ID NO:3的核酸序列的多核苷酸
(iii)SEQ ID NO:3的多核苷酸，以及
(iv)SEQ ID NO:3的片段；以及
(b)可操作性地连接至所述调控元件多核苷酸的异源可转录多核苷酸分子。
14.根据权利要求9所述的DNA构建体；其包含
(a)调控元件多核苷酸，其选自：
(i)与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，
(ii)包含SEQ ID NO:4的核酸序列的多核苷酸
(iii)SEQ ID NO:4的多核苷酸，以及
(iv)SEQ ID NO:4的片段；以及
(b)可操作性地连接至调控元件多核苷酸的异源可转录多核苷酸分子。
15.根据权利要求9所述的DNA构建体；其包含
(a)调控元件多核苷酸，其选自：
(i)与SEQ ID NO:5的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，
(ii)包含SEQ ID NO:5的核酸序列的多核苷酸
(iii)SEQ ID NO:5的多核苷酸，以及
(iv)SEQ ID NO:5的片段；以及
(b)可操作性地连接至所述调控元件多核苷酸的异源可转录多核苷酸分子。
16.根据权利要求9所述的DNA构建体；其包含
(a)调控元件多核苷酸，其选自：
(i)与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，
(ii)包含SEQ ID NO:6的核酸序列的多核苷酸
(iii)SEQ ID NO:6的多核苷酸，以及
(iv)SEQ ID NO:6的片段；以及
(b)可操作性地连接至所述调控元件多核苷酸的异源可转录多核苷酸分子。
17.根据权利要求9、10、11、12、13、14、15或16所述的DNA构建体，其中所述异源可转录多核苷酸分子是农业感兴趣的基因。
18.根据权利要求17所述的DNA构建体，其中所述异源可转录多核苷酸分子是能够在植物中提供除草剂抗性的基因。
19.根据权利要求17所述的DNA构建体，其中所述异源可转录多核苷酸分子是能够在植物中提供植物病虫害防治的基因。
20.一种用根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的核酸分子稳定转化的异源细胞。
21.一种用根据权利要求9、10、11、12、13、14、15、17、18或19所述的DNA构建体稳定转化的转基因植物或植物细胞。
22.根据权利要求21所述的转基因植物或植物细胞，其中所述转基因植物是双子叶植物细胞。
23.根据权利要求21所述的转基因植物或植物细胞，其中所述转基因植物是单子叶植物细胞。
24.根据权利要求21所述的转基因植物的种子，其中所述种子包含所述DNA构建体。
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