UA124253C2 - Промоторний елемент рослин та рослина, що містить його - Google Patents

Abstract

Винахід стосується ДНК-конструкції, яка містить промотор та гетерологічну молекулу полінуклеотиду, що транскрибується, функціонально пов'язану з промотором. Винахід також стосується трансгенної рослини або клітини рослини, стабільно трансформованої ДНК-конструкцією та насінини трансгенної рослини, яка містить вказану ДНК-конструкцію.

Description

сттасуєссктазззаєсаскасчскакссссзакоукостсткисачУсасссвівссвавкучоскаю

МПрАМ ТК 1330 п о. зогасвосвадстасвадавкх в сов с скасисяадавакноваасох сах здача звсачесчосваасссвоаєскосвававтсас доці тїаоавзсссрсава сват заазанчс ви

КгсазсосвнасвчсссазвзацанааУксссвксосусдавастасссече соусу стсаааовеча

ПОАМ ТКУ 904 п. о. МОДУ ТКЗ 885 п. о. сапассадаєдсваасаєсовсасодвадастсаєовакстрсасваззссдсввдаастрессаацах чзайточактссссаксуассаєсьсовісассвосоаовауазавайстаачоссссвовакксстогває чессзуасиозававссзсазавоавкчеосгагктослаастчзассзанасзасетасотаза состав сестра сЕсКссЕбссстазазасасазозазанасчїсавчетаткссвсасззазвасуса ие звазасссзвус ваза ссасьочааассстссвзсвссасксссазасзодовазазавцасозавс звучсссвстоачосзсассвосзтатазевахтчачіуессяукосозачавувзасвайвисвассткосач зсагаєсзуазузссасассідвочсговадасогссцвачавстачекУєссвааааасесвасесвко

ПОАМ ТКА 443 п, 0. заавадвсаєткзакссвасваюааоахтядеськккуксватсктсаєстадавкааааєьекчатяа стісвавахсісссвавссастовусасвавассвзі сечова зас кссзваазазаєсаав заахксатстаєсзастктузасоссвссакссастсатагосвавачсатвоавчававачесазєадвакас засодсстіслаоіЗгадеааасоаславалицосаазазачасовасасУкачаваасксвассасавосує

ОБАМА п. сесоабсаєссазссвакосвоткау сов пасссаксадовекоасосввнасв каса урок сапессстатогвівазачч заз гак сгкозааудасакесссувавстачдову каско осв сесзаззааї статок кава ство оо.

Фіг. 2

ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕНИЙ В ЕЛЕКТРОННОМУ

ВИГЛЯДІ

Перелік послідовностей з назвою файла "5970Р Зедиепсе І ізіпо.ТХТт", створений 18 липня 2014 року, та розміром 7,4 кілобайти подається у машиночитальній формі одночасно з даним описом. Перелік послідовностей є частиною даного опису та включений у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ

Дане розкриття відноситься до галузі молекулярної біології рослин, більш конкретно, до регуляції експресії генів у рослин.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Експресія гетерологічних послідовностей ДНК у рослині-хазяїні залежить від наявності функціонально пов'язаного регуляторного елемента, що є функціональним у рослині-хазяїні.

Вибір послідовності регуляторного елемента визначить, коли та де в організмі експресуватиметься гетерологічна послідовність ДНК. Якщо потрібною є експресія у визначених тканинах або органах, можна застосовувати регуляторні елементи, переважні для тканини.

Якщо потрібною є експресія генів у відповідь на стимул, індуцибельні регуляторні елементи є переважними регуляторними елементами. Навпаки, якщо потрібною є безперервна експресія у всіх клітинах рослини, використовують конститутивні промотори. Додаткові регуляторні послідовності, що розташовані вище та/або нижче від корової послідовності регуляторного елемента, можна включати в конструкції експресії у векторах для трансформації для забезпечення різних рівнів експресії гетерологічних нуклеотидних послідовностей у трансгенній рослині.

Часто потрібною є конститутивна експресія послідовності ДНК у рослині. Наприклад, підвищену стійкість рослини до інфекції, що спричиняють патогени, які передаються через грунт та переносяться повітрям, можна одержати шляхом генетичної маніпуляції з геномом рослини, щоб він містив конститутивний регуляторний елемент, функціонально пов'язаний з гетерологічним геном стійкості до патогену, внаслідок чого білки, які забезпечують стійкість до патогену, продукуються в бажаній рослинній тканині.

Альтернативно, може бути бажаним інгібування експресії нативної послідовності ДНК в

Зо рослинних тканинах для одержання потрібного фенотипу. У цьому випадку, таке інгібування можна здійснювати за допомогою трансформації рослини, щоб вона містила конститутивний промотор, функціонально пов'язаний з антисенсовою нуклеотидною послідовністю, внаслідок чого експресія антисенсової послідовності приводить до утворення РНК-транскрипту, який перешкоджає трансляції тЕМА нативної послідовності ДНК.

Для генетичної модифікації рослин за допомогою методик генної інженерії та створення, таким чином, рослини з корисними ознаками потрібна доступність різноманітних промоторів.

Створення сукупності промоторів надало б досліднику можливість конструювати рекомбінантні молекули ДНК, які можуть експресуватися на потрібних рівнях та за визначеної локалізації в клітині. Отже, колекція конститутивних промоторів дозволила б забезпечити експресію нової ознаки на потрібному рівні у потрібній тканині. Таким чином, для генетичної маніпуляції з рослинами потрібно виділення та дослідження конститутивних регуляторних елементів, здатних слугувати регуляторними ділянками для експресії гетерологічних нуклеотидних послідовностей, що становлять інтерес, у вимірюваний конститутивний спосіб.

КОРОТКИЙ ОПИС

Представлені композиції та способи регуляції експресії гетерологічної нуклеотидної послідовності, що становить інтерес, у рослині або рослинній клітині. Представлені молекули

ДНК, що містять нові нуклеотидні послідовності регуляторних елементів, які ініціюють транскрипцію. У деяких варіантах здійснення регуляторний елемент має промоторну активність, що ініціює транскрипцію в рослинній клітині. Варіанти здійснення даного розкриття

БО передбачають послідовність нуклеїнової кислоти, викладену в ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2, 5ЕО

ІО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 6, або комплементарну до неї послідовність, нуклеотидну послідовність, що містить щонайменше 20 суміжних нуклеотидів з «ЕО ІЮ МО: 1,

ЗБО ІЮ МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЗЕО ІО МО: 6, де вказана послідовність ініціює транскрипцію в рослинній клітині, та нуклеотидну послідовність, що містить послідовність, щонайменше на 85595 ідентичну послідовності, викладеній в 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО І

МО: 2, 5ЕБЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5, 5БЕО ІЮО МО: 6, де вказана послідовність ініціює транскрипцію в рослинній клітині.

Представлений спосіб експресії гетерологічної нуклеотидної послідовності в рослині або в рослинній клітині. Даний спосіб передбачає введення в рослину або рослинну клітину касети бо експресії, що містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, що становить інтерес,

функціонально пов'язану з одним з регуляторних елементів згідно з даним розкриттям. Таким чином, послідовності регуляторних елементів є корисними для регуляції експресії функціонально пов'язаної гетерологічної нуклеотидної послідовності.

Додатково представлений спосіб конститутивної експресії нуклеотидної послідовності, що становить інтерес, у рослині. Спосіб передбачає введення в рослинну клітину касети експресії, що містить регуляторний елемент згідно з даним розкриттям, функціонально пов'язаний з гетерологічною нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес.

Експресія нуклеотидної послідовності, що становить інтерес, може забезпечити модифікацію фенотипу рослини. Така модифікація передбачає модуляцію продукування ендогенного продукту з точки зору кількості, відносного розподілення тощо, або продукування екзогенного продукту експресії для забезпечення нової функції або продукту в рослині. У визначених способах і композиціях гетерологічна нуклеотидна послідовність, що становить інтерес, передбачає генний продукт, що надає стійкість до гербіцидів, стійкість до патогенів, стійкість до комах та/або змінену толерантність до засоленості, холоду або посухи.

Представлені касети експресії, що містять промоторні послідовності згідно з даним розкриттям, функціонально пов'язані з гетерологічною нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес. Додатково представлені трансформовані рослинні клітини, рослинні тканини, насіння та рослини.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

На фігурі 1 показана структура регуляторної ділянки вірусу, що викликає деформацію листя глухої кропиви (ГГОАМ), та усічення регуляторної ділянки. Регуляторна ділянка І ГОАМ (РЕ) із 1226 пар основ складається з частини довгої міжгенної ділянки (ІК) вище короткої ОКЕ і структури "стебло-петля". Послідовність простягається від 5'- до 3'-кінця останньої ОКЕ в геномі

ГГОАМ. Регуляторну ділянку усікали (ТК) з 5-кінця до сегментів, що складались з 1130 п. о., 904п.о., 885 п.о0., 443 п.о. та 113 п.о. Положення припустимого ТАТА-боксу зображено стрілкою.

На фігурі 2 показана послідовність нуклеїнової кислоти регуляторного елемента ГГОАМ повного розміру, що складає 1226 пар основ (ЗЕО ІО МО: 1). Припустимий ТАТА-бокс підкреслений. Також вставленими стрілками зазначено 5'-кінці усічених регуляторних елементів

Зо ГГ ОАМ, як представлено послідовністю нуклеїнової кислоти усіченого регуляторного елемента

ГСОСАМ ТК із 1130 пар основ (5ЗЕО ІО МО: 2), послідовністю нуклеїнової кислоти усіченого регуляторного елемента ГІ САМ ТК із 904 пар основ (5ЕО ІО МО: 3), послідовністю нуклеїнової кислоти усіченого регуляторного елемента ГІ ОАМ ТЕЗ із 885 пар основ (5ЕБЕО ІЮ МО: 4), послідовністю нуклеїнової кислоти усіченого регуляторного елемента ГГ САМ ТКА із 443 пар основ (5ЕО ІЮ МО: 5) та послідовністю нуклеїнової кислоти усіченого регуляторного елемента

ГСОАМ ТЕ із 113 пар основ (ЗЕО ІЮ МО: 6).

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Дане розкриття відноситься до композицій та способів, спрямованих на регуляторні елементи рослин, та способів їхнього застосування. Композиції містять нуклеотидні послідовності регуляторної ділянки вірусу, що викликає деформацію листя глухої кропиви (ГГОАМ). Композиції додатково містять ДНК-конструкції, що містять нуклеотидну послідовність регуляторної ділянки ГГОАМ, функціонально пов'язану з гетерологічною нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес. Зокрема, в даному розкритті представлені виділені молекули нуклеїнової кислоти, що містять нуклеотидну послідовність, викладену в 5ЕО ІЮ МО: 1, та їхні фрагменти, варіанти та комплементарні до них послідовності.

Послідовності регуляторних елементів ГОАМ згідно з даним розкриттям передбачають нуклеотидні конструкції, які забезпечують можливість ініціації транскрипції в рослині. У визначених варіантах здійснення послідовність регуляторного елемента ГГ ОАМ забезпечує можливість ініціації транскрипції в конститутивний спосіб. Такі конструкції згідно з даним розкриттям містять регульовані ділянки ініціації транскрипції, асоційовані з регуляцією розвитку рослини. Таким чином, композиції згідно з даним розкриттям передбачають ДНК-конструкції, що містять нуклеотидну послідовність, що становить інтерес, функціонально пов'язану з послідовністю регуляторного елемента ГГ ОАМ. Одне джерело послідовності регуляторної ділянки ГГ. ОАМ викладене в 5ЕО ІЮ МО: 1.

Композиції згідно з даним розкриттям передбачають нуклеотидні послідовності регуляторних елементів І ГГ ОАМ, їхні фрагменти та варіанти. У визначених варіантах здійснення послідовності регуляторних елементів згідно з даним розкриттям є корисними для конститутивної експресії послідовностей, що становлять інтерес. Нуклеотидні послідовності згідно з даним розкриттям також застосовують у конструюванні векторів експресії для бо подальшої експресії гетерологічної нуклеотидної послідовності в рослині, що становить інтерес,

або як зонди для виділення інших ГГ ЮАМ-подібних регуляторних елементів.

Регуляторні елементи

Регуляторний елемент являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, що має регуляторну активність щодо гена, тобто молекулу нуклеїнової кислоти, яка має здатність впливати на транскрипцію та/або трансляцію молекули функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується. Термін "регуляторна активність щодо гена", таким чином, відноситься до здатності впливати на експресію молекули функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується, шляхом впливу на транскрипцію та/або трансляцію цієї молекули функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується. Регуляторна активність щодо гена може бути позитивною та/або негативною, та при цьому ефект може характеризуватися за його часовими властивостями, просторовими властивостями, властивостями, пов'язаними з розвитком, властивостями, пов'язаними з тканинами, властивостями, пов'язаними з довкіллям, фізіологічними властивостями, патологічними властивостями, властивостями, пов'язаними з клітинним циклом та/або чутливістю до хімічних речовин, а також за кількісними або якісними показниками.

Регуляторні елементи, такі як промотори, лідерні послідовності, інтрони та ділянки термінації транскрипції являють собою молекули нуклеїнової кислоти, які мають регуляторну активність щодо гена та необхідні для загальної експресії генів у живих клітинах. Термін "регуляторний елемент" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що має регуляторну активність щодо гена, тобто молекули нуклеїнової кислоти, яка має здатність впливати на транскрипцію та/або трансляцію молекули функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується. Виділені регуляторні елементи, такі як промотори та лідерні послідовності, які функціонують в рослинах, отже, є корисними для модифікації фенотипів рослин за допомогою способів генної інженерії.

Регуляторні елементи можна характеризувати за їхнім профілем експресії, тобто як конститутивні, та/або за їхнім часовим профілем експресії, просторовим профілем експресії, профілем експресії, пов'язаним з розвитком, профілем експресії в тканинах, профілем експресії, пов'язаним з довкіллям, фізіологічним профілем експресії, профілем експресії при патології, профілем експресії, пов'язаним з клітинним циклом та/або чутливістю до хімічних речовин, а

Зо також за кількісними або якісними показниками. Промотор є придатним як регуляторний елемент для модулювання експресії молекули функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується.

Як застосовується в даному документі, термін "профіль експресії гена" являє собою будь- який профіль транскрипції функціонально пов'язаної молекули нуклеїнової кислоти в транскрибовану молекулу РНК. Експресія може характеризуватися за її часовими властивостями, просторовими властивостями, властивостями, пов'язаними з розвитком, властивостями, пов'язаними з тканинами, властивостями, пов'язаними з довкіллям, фізіологічними властивостями, патологічними властивостями, властивостями, пов'язаними з клітинним циклом та/або чутливістю до хімічних речовин, а також за кількісними або якісними показниками. Транскрибована молекула РНК може транслюватися з одержанням молекули білка або може являти собою антисенсову або іншу регуляторну молекулу РНК, таку як азКМА,

ІЕМА, "КМА, тікМА тощо.

Як застосовується в даному документі, термін "експресія білка" відноситься до будь-якого профілю трансляції транскрибованої молекули РНК у молекулу білка. Експресія білка може характеризуватися за її часовими властивостями, просторовими властивостями, властивостями, пов'язаними з розвитком, або за морфологічними властивостями, а також за кількісними або якісними показниками.

Як застосовується в даному документі, термін "промотор" загалом відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка залучена в розпізнавання РНК-полімеразою ІІ та іншими білками (транс-активувальними факторами транскрипції) та зв'язування з ними для ініціації транскрипції.

Промотор може бути первісно виділеним з 5'-ділянки, що не транслюється (5' ТК), геномної копії гена. Альтернативно, промотори можуть бути одержаними синтетично або являти собою молекули ДНК, з якими здійснювали маніпуляції. Промотори також можуть бути химерними, тобто промотор одержаний внаслідок злиття двох або більше гетерологічних молекул ДНК.

В одному варіанті здійснення представлені фрагменти промоторної послідовності, розкритої в даному документі. Фрагменти промотора можуть мати промоторну активність та можуть бути корисними окремо або в комбінації з іншими промоторами та фрагментами промотора, наприклад, при конструюванні химерних промоторів. У визначених варіантах здійснення представлені фрагменти промотора, що містять щонайменше приблизно 50, 95, 150, 250, 500 бо або приблизно 750 суміжних нуклеотидів з молекулою полінуклеотиду, що має промоторну активність, розкриту в даному документі. Такі фрагменти можуть бути щонайменше на приблизно 85 відсотків, на приблизно 90 відсотків, на приблизно 95 відсотків, на приблизно 98 відсотків або на приблизно 99 відсотків або більше ідентичними еталонній послідовності при оптимальному вирівнюванні з еталонною послідовністю.

Промотор або фрагмент промотора також можна аналізувати щодо наявності відомих елементів промотора, тобто характерних послідовностей ДНК, таких як ТАТА-бокс та інші відомі мотиви сайтів зв'язування факторів транскрипції. Ідентифікація таких відомих елементів промотора може застосовуватися фахівцем у даній галузі техніки для створення варіантів промотора, які характеризуються подібним профілем експресії порівняно з вихідним промотором.

Як застосовується в даному документі, термін "енхансер' або "енхансерний елемент" відноситься до транскрипційного регуляторного елемента, що діє у цис-положенні, також відомого як цис-елемент, який забезпечує певний аспект загального профілю експресії, але зазвичай є недостатнім окремо для запуску транскрипції функціонально пов'язаної полінуклеотидної послідовності. На відміну від промоторів, енхансерні елементи зазвичай не містять сайт ініціації транскрипції (755) або ТАТА-бокс. За природних умов промотор може містити один або декілька енхансерних елементів, які впливають на транскрипцію функціонально пов'язаної полінуклеотидної послідовності. Виділений енхансерний елемент також може бути злитий із промотором з одержанням химерного промотора з цис-елементом, що визначає характер загальної модуляції генної експресії. Промотор або фрагмент промотора може містити один або декілька енхансерних елементів, які впливають на транскрипцію функціонально пов'язаних генів. Припускають, що багато з промотор-енхансерних елементів зв'язуються з ДНК-зв'язувальними білками та/або впливають на топологію ДНК з утворенням локальних конформацій, що селективно забезпечують доступ РНК-полімерази до матриці ДНК, або обмежують його, або полегшують селективне розкриття подвійної спіралі в сайті ініціації транскрипції. Енхансерний елемент може мати функцію зв'язування з факторами транскрипції, що регулюють транскрипцію. Деякі енхансерні елементи зв'язуються більш ніж з одним фактором транскрипції, та при цьому фактори транскрипції можуть взаємодіяти більш ніж з одним енхансерним доменом з різними значеннями афінності. Енхансерні елементи можна ідентифікувати за допомогою різних методик, в тому числі за допомогою делеційного аналізу, тобто видалення одного або декількох нуклеотидів із 5'-кінця або із внутрішньої частини промотора; аналізу ДНК-зв'язувальних білків за допомогою футпринтингу з ДНКазою І, аналізу інтерференції метилюванням, аналізів з визначенням зміни електрофоретичної рухливості, іп мімо геномного футпринтингу за допомогою ПЛР, опосередкованої лігуванням, та інших традиційних аналізівх або за допомогою аналізу подібності послідовностей ДНК із застосуванням відомих мотивів цис-елементів або енхансерних елементів як послідовності- мішені або мотиву-мішені шляхом традиційних способів порівняння послідовностей ДНК, таких як ВГА5Т. Тонку структуру енхансерного домену можна додатково досліджувати за допомогою мутагенезу (або заміни) одного або декількох нуклеотидів або за допомогою інших традиційних способів. Енхансерні елементи можна одержувати за допомогою хімічного синтезу або виділення з регуляторних елементів, що містять такі елементи, та їх можна синтезувати з додатковими фланкуючими нуклеотидами, що містять сайти для рестрикційних ферментів, корисні для здійснення маніпуляцій з підпослідовностями. Таким чином, даним розкриттям охоплені створення, конструювання та застосування енхансерних елементів згідно зі способами, розкритими в даному документі, для модулювання експресії молекул функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується.

Як застосовується в даному документі, термін "5" фланкуюча ділянка, що не транслюється" відноситься до молекули ДНК, виділеної з 5'-ділянки, що не транслюється (5' ТК), геномної копії гена та зазвичай визначається як нуклеотидний сегмент між сайтом початку транскрипції (Т55) і сайтом початку послідовності, що кодує білок. Ці послідовності або лідерні послідовності можуть бути одержаними синтетично або являти собою ДНК-елементи, з якими здійснювали маніпуляції. Лідерну послідовність можна застосувати як 5'-регуляторний елемент для модулювання експресії молекули функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується. Молекули лідерної послідовності можна застосовувати з гетерологічним промотором або з їхнім нативним промотором. Промоторні молекули згідно з даним розкриттям, таким чином, можуть бути функціонально пов'язані з їхньою нативною лідерною послідовністю або можуть бути функціонально пов'язані з гетерологічною лідерною послідовністю.

Як застосовується в даному документі, термін "химерний" відноситься до єдиної молекули

ДНК, яка одержана шляхом злиття першої молекули ДНК з другою молекулою ДНК, при цьому бо ані перша, ані друга молекула ДНК зазвичай не зустрічаються в такій конфігурації, тобто злиті з іншою. Химерна молекула ДНК, таким чином, являє собою нову молекулу ДНК, що зазвичай не зустрічається в природі. Як застосовується в даному документі, термін "химерний промотор" відноситься до промотора, одержаного шляхом такої маніпуляції з молекулами ДНК. У химерному промоторі можна об'єднати два або більше фрагментів ДНК; прикладом слугувало б

Злиття промотора з енхансерним елементом. Таким чином, даним розкриттям охоплені створення, конструювання та застосування химерних промоторів згідно зі способами, розкритими в даному документі, для модулювання експресії молекул функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується.

Слід розуміти, що нуклеотидні послідовності, розташовані всередині інтронів або 3' відносно послідовності кодуючої ділянки, також можуть сприяти регуляції експресії кодуючої ділянки, що становить інтерес. Приклади придатних інтронів включають без обмеження інтрон маїсу ІМ56 або інтрон актину маїсу. Регуляторний елемент також може містити ті елементи, які розташовані нижче (3) відносно сайта ініціації транскрипції або всередині транскрибованих ділянок, або як ті, так й інші. У контексті даного розкриття посттранскрипційний регуляторний елемент може передбачати елементи, що функціонують після ініціації транскрипції, наприклад, трансляційні та транскрипційні енхансери, трансляційні та транскрипційні репресори та детермінанти стабільності тАМА.

Регуляторні елементи або їхні варіанти або фрагменти згідно з даним розкриттям можна функціонально зв'язувати з гетерологічними регуляторними елементами або промоторами для модулювання активності гетерологічного регуляторного елемента. Така модуляція передбачає підсилення або репресію транскрипційної активності гетерологічного регуляторного елемента, модулювання посттранскрипційних подій, або одне з підсилення або репресії транскрипційної активності гетерологічного регуляторного елемента та модулювання посттранскрипційних подій.

Наприклад, один або декілька регуляторних елементів або їхніх фрагментів згідно з даним розкриттям можна функціонально зв'язувати з конститутивними, індуцибельними або тканиноспецифічними промоторами або їхніми фрагментами для модулювання активності таких промоторів в рослинних клітинах у потрібних тканинах.

Дане розкриття охоплює композиції виділеної або рекомбінантної нуклеїнової кислоти. "Виділена" або "рекомбінантна" молекула нуклеїнової кислоти (або ДНК) застосовується в даному документі для позначення послідовності нуклеїнової кислоти (або ДНК), яка більше не перебуває в своєму природному середовищі, наприклад, перебуває в умовах іп міго або в гетерологічній рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. Виділена або рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти або її біологічно активна частина практично не містить інший клітинний матеріал або культуральне середовище при одержанні за допомогою рекомбінантних методик або практично не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин у разі хімічного синтезу. Виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота не містить послідовностей (в оптимальному випадку, послідовностей, що кодують білок), які за природних умов фланкують нуклеїнову кислоту (тобто послідовностей, розташованих на 5"- і 3'-кінцях нуклеїнової кислоти) в геномній ДНК організму, від якого одержана нуклеїнова кислота.

Наприклад, у різних варіантах здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти може містити менше ніж приблизно 5 т.о., 4т.0., Зт.0., 2т.0., 1т.0., 0,5 т.о. або 0,1 т.о. з нуклеотидних послідовностей, які за природних умов фланкують молекулу нуклеїнової кислоти в геномній

ДНК клітини, з якої одержана нуклеїнова кислота. Послідовності регуляторних елементів І ОАМ згідно з даним розкриттям можуть бути виділені з 5'-ділянки, що не транслюється, яка фланкує їхні відповідні сайти ініціації транскрипції.

Фрагменти та варіанти розкритих нуклеотидних послідовностей промотора також охоплені даним розкриттям. Зокрема, фрагменти та варіанти послідовності регуляторного елемента

ГСОАМ з ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮ МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5 та/або ЗЕО

ІО МО: 6 можна застосовувати в ДНК-конструкціях згідно з даним розкриттям. Як застосовується в даному документі, термін "фрагмент" відноситься до частини послідовності нуклеїнової кислоти. Фрагменти послідовності регуляторного елемента ГГОАМ можуть зберігати біологічну активність, пов'язану з ініціацією транскрипції, більш переважно, пов'язану з керуванням транскрипцією конститутивним шляхом. Альтернативно, фрагменти нуклеотидної послідовності, корисні як зонди для гібридизації, не обов'язково можуть зберігати біологічну активність.

Фрагменти нуклеотидної послідовності регуляторної ділянки ГГОАМ можуть варіювати в діапазоні від щонайменше приблизно 20 нуклеотидів, приблизно 50 нуклеотидів, приблизно 100 нуклеотидів та до повнорозмірної нуклеотидної послідовності згідно з даним розкриттям для промоторної ділянки гена.

Біологічно активну частину регуляторного елемента ГГОАМ можна одержувати за 60 допомогою виділення частини послідовності регуляторного елемента ГГОАМ згідно з даним розкриттям та оцінки промоторної активності цієї частини. Молекули нуклеїнової кислоти, що є фрагментами нуклеотидної послідовності регуляторного елемента ГІ БАМ, містять щонайменше приблизно 16, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900 або 1000 нуклеотидів або до кількості нуклеотидів, що присутні в повнорозмірній послідовності регуляторного елемента ГГ ОАМ, розкритій у даному документі (наприклад, 1226 нуклеотидів для ЗЕО ІО МО: 1).

У разі нуклеотидних послідовностей варіант передбачає делецію, та/або додавання одного або декількох нуклеотидів в одному або декількох внутрішніх сайтах у межах нативного полінуклеотиду, та/або заміну одного або декількох нуклеотидів в одному або декількох сайтах у нативному полінуклеотиді. Як застосовується в даному документі, "нативна" або "геномна" нуклеотидна послідовність передбачає нуклеотидну послідовність, що зустрічається в природі.

У разі нуклеотидних послідовностей варіанти, що зустрічаються в природі, можна ідентифікувати із застосуванням широко відомих методик молекулярної біології, як, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і методик гібридизації, викладених нижче.

Варіантні нуклеотидні послідовності також передбачають нуклеотидні послідовності, одержані шляхом синтезу, такі як послідовності, одержані, наприклад, із застосуванням сайт- спрямованого мутагенезу. Як правило, варіанти конкретної нуклеотидної послідовності згідно з даним розкриттям будуть щонайменше на приблизно 4095, 4595, 5095, 5595, 6095, 6595, 70905, 7595, 8095, 8595, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або більше ідентичні цій конкретній нуклеотидній послідовності, як визначено із застосуванням програм вирівнювання послідовностей і параметрів, описаних в інших частинах даного документа. Біологічно активний варіант нуклеотидної послідовності згідно з даним розкриттям може відрізнятися від цієї послідовності лише за 1-15 нуклеотидами, лише за 1-10, лише за 6-10, лише за 5, лише за 4, 3, 2 або навіть за 1 нуклеотидом.

У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти, що кодує регуляторну ділянку, являє собою "послідовність нуклеїнової кислоти, що відрізняється від геномної". Як застосовується в даному документі, "послідовність нуклеїнової кислоти, що відрізняється від геномної відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка має одну або декілька змін послідовності нуклеїнової кислоти порівняно з нативною або геномною послідовністю

Зо нуклеїнової кислоти.

Варіантні нуклеотидні послідовності також охоплюють послідовності, одержані внаслідок мутагенної та рекомбіногенної процедури, такої як ДНК-шафлінг. За такої процедури можна здійснювати маніпуляції з нуклеотидними послідовностями регуляторного елемента ГІ САМ для створення нових регуляторних елементів ГГ ОАМ. Таким чином, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів створюють з популяції споріднених за послідовностями полінуклеотидів, що містять ділянки послідовностей, які характеризуються суттєвою ідентичністю послідовності та можуть піддаватися гомологічній рекомбінації іп міго або іп мімо. Стратегії такого ДНК-шафлінгу відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Зіеттег (1994) Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 91:10747- 10751; біеттег (1994) Маїште 370:389-391; Статегі єї аї. (1997) Маїште Віоїесн. 15:436-438;

Мооге еї а!. (1997) 9. Мої. Віої. 272:336-347; 7папо еї а!. (1997) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 94:4504- 4509; Статеті вї а. (1998) Майте 391:288-291; та патенти США МоМо 5605793 і 5837458.

Нуклеотидні послідовності згідно з даним розкриттям можна застосовувати для виділення відповідних послідовностей з інших організмів, зокрема інших рослин, більш конкретно з інших однодольних рослин. Таким чином, способи, такі як ПЛР, гібридизація тощо, можна застосовувати для ідентифікації таких послідовностей на основі їхньої гомології з послідовностями, викладеними в даному документі. Послідовності, виділені на основі ідентичності їхньої послідовності з повною послідовністю регуляторного елемента ГГОАМ, викладеною в даному документі, або її фрагментами, охоплені даним розкриттям.

У разі підходу, що базується на ПЛР, олігонуклеотидні праймери можна конструювати для застосування в ПЛР-реакціях для ампліфікації відповідних послідовностей ДНК на основі геномної ДНК, яку виділяють з будь-якої рослини, що становить інтерес. Способи конструювання ПЛР-праймерів і ПЛР-клонування загалом відомі з рівня техніки та розкриті в затргоок еї аї. (1989) МоїІесшіаг Сіопіпд: І арогаюгу Мапцпаї! (24 єд., Сода 5ргіпд Нагбог І арогаюгу

Ргезв, Ріаіпмієм, Мем/ Могк), у подальшому ЗатбгооК. Див. також Іппів єї а. Ед5. (1990) РСВ

Ргоїосої!в: А Сціде ю Меїйпосдз апа Арріїсайопзв (Асадетіс Ргезв, Мем/ МогКк); Іппів апа СеїГгапа, едв. (1995) РСВ Зпггаіедієз (Асадетіс Ргезв, Мем Мої); та Іппіз апа Сеїгапа, ев. (1999) РСВ Меїнодзь

Мапиаї (Асадетіс Рге55, Мем/ Хогк). Відомі способи ПЛР включають без обмеження способи із застосуванням парних праймерів, гніздових праймерів, одиночних специфічних праймерів, вироджених праймерів, ген-специфічних праймерів, вектор-специфічних праймерів, праймерів, 60 в яких частина нуклеотидів піддається помилковому спарюванню тощо.

В гібридизаційних методиках всю відому нуклеотидну послідовність або її частину застосовують як зонд, що селективно гібридизується з іншими відповідними нуклеотидними послідовностями, які присутні в популяції клонованих фрагментів геномної ДНК з вибраного організму. Зонди для гібридизації можна мітити за допомогою групи, яку можна детектувати, такої як Р-32, або за допомогою будь-якого іншого маркера, який можна детектувати. Таким чином, наприклад, зонди для гібридизації можна одержати шляхом мічення синтетичних олігонуклеотидів на основі послідовності регуляторного елемента ГГОАМ згідно з даним розкриттям. Способи одержання зондів для гібридизації та для створення геномних бібліотек, як правило, відомі з рівня техніки та розкриті в зхатрьгоок.

Наприклад, повну послідовність регуляторного елемента ГГОАМ, розкриту в даному документі, або одну або декілька її частин можна застосовувати як зонд, що здатний специфічно гібридизуватися з відповідними послідовностями регуляторного елемента І І БАМ і матричними РНК. Для досягнення специфічної гібридизації за різних умов, такі зонди включають послідовності, які є унікальними в послідовностях регуляторного елемента ГГ ОАМ та мають довжину щонайменше приблизно 10 нуклеотидів або довжину щонайменше приблизно 20 нуклеотидів. Такі зонди можна застосовувати для ампліфікації за допомогою ПЛР відповідних послідовностей регуляторного елемента РМСМ з вибраної рослини. Цю методику можна застосовувати для виділення додаткових кодуючих послідовностей з потрібного організму або як діагностичний аналіз для визначення наявності кодуючих послідовностей в організмі.

Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг висіяних на чашки Петрі бібліотек

ДНК (бляшок або колоній; див., наприклад, Затюогоок).

Гібридизацію таких послідовностей можна проводити у жорстких умовах. Передбачається, що терміни "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" позначають умови, за яких зонд буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю з вищим ступенем детекції, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше в 2 рази вищим порівняно з фоновим). Жорсткі умови залежать від послідовності і будуть відрізнятися за різних обставин. Шляхом регулювання жорсткості умов гібридизації талабо відмивання можна ідентифікувати цільові послідовності, які на 10095 комплементарні зонду (гібридизація з гомологічним зондом).

Альтернативно, умови жорсткості можна регулювати для забезпечення деякого помилкового

Зо спарювання в послідовностях, щоб виявляти більш низькі ступені подібності (гібридизація з гетерологічним зондом). Зазвичай зонд має довжину менше ніж приблизно 1000 нуклеотидів, в оптимальному випадку він має довжину менше ніж 500 нуклеотидів.

Як правило, жорсткі умови будуть такими, за яких концентрація солі становить менше приблизно 1,5 М іонів Ма, як правило, концентрація іонів Ма (або інших солей) становить від приблизно 0,01 до 1,0 М при рН 7,0-8,3, а температура становить щонайменше приблизно 307 для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60"С для довгих зондів (наприклад, що перевищують 50 нуклеотидів). Жорстких умов також можна досягати за допомогою додавання засобів для дестабілізації, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості передбачають гібридизацію у буферному розчині з 30-3595 формаміду, 1 М масі, 190 505 (додецилсульфат натрію) при 37"С і відмивання в 1Х-2хХ 55(С (20Х 550-300 М

МасСі/0,3 М тринатрію цитрат) при 50-557С. Ілюстративні умови помірної жорсткості передбачають гібридизацію в 40-4595 формаміді, 1,0 М масі, 195 505 при 37"С і відмивання в 0,5хХ-1Х 55 при 55-60"С. Ілюстративні умови високої жорсткості передбачають гібридизацію у 5096 формаміді, 1 М масі, 195 505 при 37"С і остаточне відмивання в 0,1Х 55С при 60-65" протягом щонайменше 30 хвилин. Тривалість гібридизації, в цілому, становить менше приблизно 24 годин, зазвичай від приблизно 4 до приблизно 12 годин. Тривалість часу відмивання становитиме щонайменше період часу, достатній для досягнення рівноваги.

Специфічність, як правило, залежить від відмивань після гібридизації, причому ключовими факторами є іонна сила та температура розчину для остаточного відмивання. Для гібридів ДНК-

ДНК Тт (температуру плавлення) можна приблизно розраховувати на основі рівняння в

МеїпКоїй апа Умані! (1984) Апа!ї. Віоспет. 138:267-284: Тт - 81,57С ж 16,6 (09 М) «ж 0,41 (90554) - 0,61 (95 форм.) - 500/Л; де М являє собою молярність одновалентних катіонів, 96 (С являє собою відсотковий вміст гуанозинових і цитозинових нуклеотидів у ДНК, 95 форм. являє собою відсотковий вміст формаміду в гібридизаційному розчині, та Ї являє собою довжину гібрида в парах основ. Тт являє собою температуру (за визначеної іонної сили та рН), за якої 5095 комплементарної цільової послідовності гібридизується з зондом, що ідеально збігається.

Знижують Тт на приблизно 17С для кожного 195 помилкового спарювання; таким чином, Тт, умови гібридизації та/або відмивання можна відрегулювати для гібридизації з послідовностями з потрібною ідентичністю. Наприклад, якщо здійснюють пошук послідовностей з ідентичністю бо »9095, Тт можна знижувати на 10"С. Зазвичай, жорсткі умови вибирають так, щоб температура була на приблизно 5"С нижча за Тт для визначеної послідовності та комплементарної до неї послідовності за визначеної іонної сили та рН. Проте в умовах високої жорсткості можна проводити гібридизацію та/або відмивання при температурі на 1, 2, З або 4"С нижчій за Тт; в умовах помірної жорсткості можна проводити гібридизацію та/або відмивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10"С нижчій за Тт; в умовах низької жорсткості можна проводити гібридизацію та/або відмивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20"С нижчій за Тт. Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що варіації жорсткості розчинів для гібридизації та/або відмивання по суті описані за допомогою рівняння, складів розчинів для гібридизації та відмивання та потрібної Тт. Якщо потрібний ступінь помилкового спарювання призводить до

Тт менше 45"С (водний розчин) або 327"С (розчин формаміду), переважним є збільшення концентрації 55С, щоб можна було застосовувати більш високу температуру. Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведений у Ті)55еп (1993) І арогаюгу ТесНпідцевз іп

Віоспетівнту апа Моїіесшіаг Віоіоду--Нубргіаігайоп м/йй Мисієїс Асій Ргобев, Рай І, Спарієї 2 (Еіземівг, Мем Хогк) та Аизибеї еї аї. єдв. (1995) Ситепі Ргоїосоїв іп Моїесшціаг Віоіоду, СНарієї 2 (Сгеєпе Рибіїзпіпа апа М іІеу-Іпіегзсіепсе, Мем МогКк). Див. також Затогоок.

Таким чином, виділені послідовності, що мають активність конститутивного промотора та гібридизуються за жорстких умов з послідовностями регуляторних елементів ГГ БАМ, розкритими в даному документі, або їхніми фрагментами, охоплені даним розкриттям.

Наступні терміни застосовують для опису спорідненості послідовностей у двох або більше нуклеїнових кислот або полінуклеотидів: (а) "еталонна послідовність", (Б) "вікно порівняння", (с) "ідентичність послідовності", (4) "відсоткова ідентичність послідовності" та (е) "значна ідентичність". (а)Як застосовується в даному документі, "еталонна послідовність" являє собою визначену послідовність, яку застосовують як основу для порівняння послідовностей. Еталонна послідовність може являти собою скорочену версію або повну форму визначеної послідовності; наприклад, являти собою сегмент повнорозмірної КкДНК або послідовності гена або всю кКДНК або послідовність гена. (р)Як застосовується в даному документі, "вікно порівняння" відноситься до безперервного та визначеного сегмента в послідовності полінуклеотиду, при цьому послідовність

Зо полінуклеотиду у вікні порівняння може містити додавання або делеції (тобто гепи) порівняно з еталонною послідовністю (яка не містить додавань або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Як правило, довжина вікна порівнянна становить щонайменше 20 суміжних нуклеотидів і необов'язково може становити 30, 40, 50, 100 або більше. Фахівці в даній галузі техніки зрозуміють, що аби уникнути високої подібності з еталонною послідовністю внаслідок включення гепів в послідовність полінуклеотиду, як правило, вводиться штраф за геп, та його віднімають від кількості збігів.

Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі з рівня техніки. Таким чином, визначення відсоткової ідентичності послідовностей між будь-якими двома послідовностями можна виконувати із застосуванням математичного алгоритму.

Необмежувальними прикладами подібних математичних алгоритмів є алгоритм за Муег5 апа

МіПег (1988) САВІОБЗ 4211-17; алгоритм локального вирівнювання за Зтійй еї аї. (1981) Аду. Аррі.

Май. 2:482; алгоритм глобального вирівнювання за Меедіетап апа УУип5сп (1970) 9. Мої. Віої. 48:443-453; спосіб пошуку локального вирівнювання за Реагзоп апа І іртап (1988) Ргос. Маї!.

Асад. 5сі. 85:2444-2448; алгоритм за Каїпіп апа Айвениї! (1990) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 872264, модифікований за Каїїп апа Аїївспиї! (1993) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 90:5873-5877.

Для порівняння послідовностей можна застосовувати комп'ютерні впровадження цих математичних алгоритмів з метою визначення ідентичності послідовностей. Такі впровадження включають без обмеження СІ ОЗТАЇ. в програмі РС/сзепе (доступна від ІпіеїЇїдепеїїс5, Маунтін-

В'ю, Каліфорнія); програму АГІСМ (версія 2.0) та САР, ВЕЗТРІТ, ВІ А5Т, РА5ТА та ТЕАЗТА в осо Му/і5сопбіп Сепеїіс5 5оїймаге РасКаде, версія 10 (доступні від Ассеїгуз5 Іпс., 9685 Зстгапіоп

Коаад, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Вирівнювання за допомогою цих програм можна виконувати із застосуванням параметрів за замовчуванням. Програма СІ О5ЗТАЇ добре описана в Ніддіпв єї аІ. (1988) Сепе 73:237-244 (1988); Нідадіпв єї аІ. (1989) САВІО5 5:151-153; Согреї еї а!. (1988)

Мисієїс Асід5 Невз. 16:10881-90; Ниапо еї аї. (1992) САВІО5 8:155-65; та Реагзоп еї аї. (1994)

Меїйй. Мої. Віо!. 24:307-331. Програма АГІСМ базується на алгоритмі з Муег5 апа МіШег (1988), Що згаданий вище. При порівнянні амінокислотних послідовностей у програмі АГІОМ можна застосовувати таблицю ваги замін залишків РАМ120, штраф за подовження гепу 12 і штраф за відкриття гепу 4. Програми ВГА5Т за Айбспиї еї аїЇ. (1990) У. Мої. ВіоІ. 215:403 засновані на алгоритмі з Кагіїп апа Аїй5спи! (1990), що згаданий вище. Пошуки нуклеотидних послідовностей бо в ВГА5Т можна виконувати за допомогою програми ВІГА5ТМ з параметрами: вага вирівнювання

- 100, довжина слова - 12 з одержанням нуклеотидних послідовностей, гомологічних нуклеотидній послідовності, що кодує білок згідно з даним розкриттям. Пошуки білкових послідовностей в ВГАБТ можна виконувати за допомогою програми ВІГА5ТХ з параметрами: вага вирівнювання - 50, довжина слова - З з одержанням амінокислотних послідовностей, гомологічних білку або поліпептиду згідно з даним розкриттям. Для одержання вирівнювань з гепами з метою порівняння можна використовувати Сарреа ВІ А5Т (в ВГ А5Т 2.0), як описано в

Айбспи! еї аІ. (1997) Мисіеіїс Асід5 Ке5. 25:3389. Альтернативно, можна застосовувати РБІ-

ВГ А5Т (в ВІ А5Т 2.0) для здійснення ітераційного пошуку, який виявляє віддалені зв'язки між молекулами. Див. Ай5зепиї! еї а. (1997) вище. При використанні ВГ А5Т, Саррей ВГ А5Т, РБІ-

ВГА5БТ можна застосовувати параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад,

ВГА5ТМ для нуклеотидних послідовностей, ВІ А5ТХ для білків). Див. веб-сайт Національного центра біотехнологічної інформації. Вирівнювання можна здійснювати вручну за допомогою проглядання.

Якщо не вказане інше, значення ідентичності/подібності послідовностей, наведені в даному документі, відносяться до значення, одержаного за допомогою САР версії 10 із застосуванням наступних параметрів: 95 ідентичності та 95 подібності для нуклеотидної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепу 50, та штрафу за подовження гепу 3, та матриці замін пм/уздарапа.стр; 95 ідентичності та 95 подібності для амінокислотної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепу 8, та штрафу за подовження гепу 2, та матриці замін

ВГОЗИМб2; або будь-якої еквівалентної до неї програми. Під "еквівалентною програмою" мають на увазі будь-яку програму для порівняння послідовностей, в якій для будь-яких двох послідовностей, що розглядаються, здійснюють вирівнювання з ідентичними збігами нуклеотидних або амінокислотних залишків та ідентичною відсотковою ідентичністю послідовності порівняно з відповідним вирівнюванням, яке здійснюється за допомогою сАР версії 10.

У САР застосовується алгоритм з Меедіетап апа Ууип5сй (1970) 9. Мої. Віої. 48:443-453, щоб відшукати вирівнювання двох повних послідовностей, яке максимізує число збігів і мінімізує число гепів. (АР розглядає усі можливі варіанти вирівнювання та положення гепів і створює вирівнювання з найбільшим числом основ, що збігаються, та найменшою кількістю гепів. Вона

Зо передбачає можливість призначення штрафу за відкриття гепу та штрафу за подовження гепу в одиницях основ, що збігаються. САР має враховувати кількість збігів від штрафу за відкриття гепу для кожного гепу, який він уводить. Якщо вибраний штраф за подовження гепу більший за нуль, САР має додатково враховувати кожний введений геп з конкретною довжиною гепу, що помножена на штраф за подовження гепу. Значення за замовчуванням для штрафу за відкриття гепу та значення за замовчуванням для штрафу за подовження гепу в Са Муізсопвзіп Сепеїїс5

Боймжаге РасКаде версії 10 для білкових послідовностей становлять 8 та 2, відповідно. Для нуклеотидних послідовностей штраф за відкриття гепу за замовчуванням становить 50, у той час як штраф за подовження гепу за замовчуванням становить 3. Штрафи за відкриття гепу та за подовження гепу можуть бути виражені у вигляді цілого числа, вибраного з групи, що складається з цілих чисел від 0 до 200. Таким чином, наприклад, штрафи за відкриття гепу та за подовження гепу можуть становити 0,1,2,3,4,5,6, 7,8, 9,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 або більше.

САР є одним представником родини найкращих засобів вирівнювання. Існує багато представників цієї родини, але жоден інший представник не має кращої якості. ЗАР відображує чотири числові показники для вирівнювань: якість, співвідношення, ідентичність і подібність.

Якість являє собою показник, який максимально збільшують для вирівнювання послідовностей.

Співвідношення являє собою якість, поділену на число основ у більш короткому сегменті.

Відсоткова ідентичність являє собою відсоток символів, які фактично збігаються. Відсоткова подібність являє собою відсоток символів, які є подібними. Символи, які знаходяться навпроти гепів, ігнорують. Подібність враховують, якщо значення за матрицею замін для пари символів є більшим або дорівнює 0,50, що є пороговим значення подібності. Матриця замін, що застосовується в версії 10 пакету програмного забезпечення СО УМізсопвіп Сепеїїс5 Зоймаге

РасКаде, являє собою ВІ О5ОМБб2 (див. Непікой апа Непікоїї (1989) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 89:10915). (с)Як застосовується в даному документі, "ідентичність послідовностей" або "ідентичність" в контексті двох послідовностей нуклеїнової кислоти або поліпептидних послідовностей відноситься до залишків у двох послідовностях, які є однаковими при вирівнюванні для максимальної відповідності в межах визначеного вікна порівняння. Якщо відсоткову ідентичність послідовностей застосовують щодо білків, розуміють, що положення залишків, які не є бо ідентичними, часто відрізняються за консервативними амінокислотними замінами, при цьому амінокислотні залишки замінені на інші амінокислотні залишки з аналогічними хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю) та, внаслідок цього, не змінюють функціональні властивості молекули. Якщо послідовності відрізняються за консервативними замінами, то відсоткову ідентичність послідовностей можна коригувати з внесенням поправки на консервативну природу заміни. Кажуть, що послідовності, які відрізняються за такими консервативними замінами, характеризуються "подібністю послідовностей" або "подібністю".

Засоби для здійснення такого коригування добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Як правило, це передбачає оцінку в балах консервативної заміни як часткового, а не повного незбігу, що, таким чином, збільшує відсоткову ідентичність послідовностей. Таким чином, наприклад, якщо ідентичній амінокислоті присвоюють бал 1, а неконсервативній заміні присвоюють бал нуль, то консервативній заміні присвоюють бал від нуля до 1. Оцінку в балах консервативних замін розраховують, наприклад, як впроваджено в програмі РС/ЗЕМЕ (ІпіеПдепеїіс5, Маунтін-В'ю, Каліфорнія). (4)Як застосовується в даному документі, "відсоткова ідентичність послідовностей" означає значення, визначене шляхом порівняння двох послідовностей з оптимальним вирівнюванням в межах вікна порівняння, де частина послідовності полінуклеотиду у вікні порівняння може містити додавання або делеції (тобто гепи) порівняно з еталонною послідовністю (яка не містить додавань або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток розраховують шляхом визначення числа положень, в яких ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок зустрічаються в обох послідовностях, з одержанням числа положень, що збігаються, ділення числа положень, що збігаються, на загальне число положень у вікні порівняння та множення результату на 100 з одержанням відсоткової ідентичності послідовностей. (е)Гермін "значна ідентичність" полінуклеотидних послідовностей означає, що полінуклеотид містить послідовність, щонайменше на 7095, щонайменше на 8095, щонайменше на 9095 та щонайменше на 9595 ідентичну у порівнянні до еталонної послідовності за допомогою однієї з описаних програм вирівнювання із застосуванням стандартних параметрів.

Іншим показником того, що нуклеотидні послідовності мають значний ступінь ідентичності, є те, що дві молекули гібридизуються одна до одної за жорстких умов. Зазвичай жорсткі умови

Зо вибирають так, щоб температура була на приблизно 5"С нижчою за Тт для визначеної послідовності за визначеної іонної сили та рН. Проте жорсткі умови охоплюють значення температури в діапазоні від на приблизно 1"С до на приблизно 207С нижче за Тт залежно від потрібного ступеня жорсткості, як іншим чином зазначено в даному документі.

Як застосовується в даному документі, термін "рослина" включає рослинні клітини, протопласти рослинних клітин, тканинні культури рослинних клітин, з яких можна регенерувати рослини, рослинні калюси, скупчення рослинних клітин і рослинні клітини, які Є інтактними в рослинах або частинах рослин, таких як зародки, пилок, насіннєві зачатки, насіння, листки, квітки, гілки, плоди, зерна, колоски, качани, листяні обгортки, стебла, корені, кінчики коренів, пиляки тощо. Передбачається, що зерно означає зріле насіння, одержане промисловими рослинниками для цілей, відмінних від вирощування або відтворення видів. Потомство, варіанти та мутанти регенерованих рослин також включені в обсяг даного розкриття, за умови, що ці частини містять введені полінуклеотиди.

Дане розкриття можна застосовувати для трансформації будь-яких видів рослин, у тому числі без обмежень однодольних та дводольних рослин. Приклади видів рослин включають кукурудзу (7еа тауз), Вгаззіса 5р. (наприклад, В. пари5, В. гара, В. |ипсеа), зокрема види

Вгазвзіса, придатні як джерело олії з насіння рослин, люцерну (Медісадо заїїма), рис (Огуа заїїма), жито (Зесаїе сегеаїє), сорго (Зогоапит бБісоїог, Зогапит мцїдаге), просо (наприклад, просо африканське (Реппізейшт діайсит), просо звичайне (Рапісцт птійасеит), мишій італійській (Зеїагіа йаїїса), просо пальчасте (ЕІеизіпе согасапа)), соняшник (Неїїапіпи5 аппии5), сафлор (Саппатив (псіогіи5), пшеницю (Тгйісцит аевзіїмит), сою (Сіусіпе тах), тютюн (Місойапа

Іїабасит), картоплю (Зоїапит ішБрего5ит), різновиди арахісу (Агаспіє Ппуродаєа), бавовник (Соззурішт бБаградепзе, (бо55урішт Піг5шит), солодку картоплю (Іротоеа Баїайш5), маніок (Мапіпої езсшепіа), кавове дерево (СоПеа 5рр.), кокосову пальму (Сосо5 писіїега), ананас (Апапа5 сотозивз), цитрусові дерева (Сіїги5 5рр.), шоколадне дерево (ТПеобгота сасаобс), чайний кущ (Сатеїйіа 5іпепві5), банан (Миза 5рр.), авокадо (Регзеа атегісапа), інжир (Ріси5 сабіса), гуаву (Рзідішт диазама), манго (Мапоіїега іпдіса), маслину (ОІєа еигораєа), папайю (Сагіса рарауа), кеш'ю (Апасагаіїшт оссідепіаіе), макадамію (Масадатіа іпіедгієоїйа), мигдаль (Ргипив5 атудаа|йв5), різновиди цукрового буряку (Веїа мпцїдагіб), цукрову тростину (Засспагит 5рр.), різновиди вівса, ячмінь, овочі, декоративні рослини та хвойні дерева. бо Овочі включають томати (Іусорегзісоп езсшепійт), латук (наприклад, Гасійса заїма),

квасолю звичайну (РпазеоїЇи5 миЇдагі5), лімську квасолю (Ріазеоїиз5 Іпепві5), різновиди гороху (Гашуги5 5рр.) і представників роду Сиситів5, таких як огірок (С. з5аїїми5), канталупа (С. сапіаішрепзвів) і диня мускусна (С. теї!о). Декоративні рослини включають азалію (Кпододепагоп 5рр.), гортензію (Масгорпуїа пуагапдеа), гібіскус (Ніріхси5 гозазапепвів), різновиди троянд (Коза 5рр.), різновиди тюльпанів (Тиїра 5рр.), різновиди нарцисів (Магсіз5и5 5зрр.), різновиди посконнику (Еираїогішт пургіда), гвоздику (Оіапійиз сагуорпуПи5), пуансетію (Еирпогбріа риїспегїтіта) та хризантему.

Хвойні дерева, які можна використовувати при здійсненні даного розкриття на практиці, включають, наприклад, види сосни, такі як сосна ладанна (Ріпих5 їаєеда), сосна Еліота (Ріпи5 еїйПоїйї), сосна жовта (Ріпиз ропдегоза), широкохвойна сосна (Ріпи5 сопіогіа) та сосна промениста (Ріпих гадіага); псевдотсугу Мензіса (Рзецйдоїзида теп?ліевії); тсугу канадську (Т5уда сападепвів); ялину біла (Рісеа діайса); секвойю вічнозелену (Зедиоіа зетрегмігеп5); справжні ялиці, такі як ялиця миловидна (Абіех атаріїї5) та ялиця бальзамічна (Абіе5 Браізатеа); та кедри, такі як туя (Тпшіа ріїсаїа) та кипарис аляскінський (Спатаесурагі5 пооїКаїепвіз). У визначених варіантах здійснення рослини згідно з даним розкриттям являють собою культурні рослини (наприклад, кукурудзу, люцерну, соняшник, Вгах5іса, сою, бавовник, сафлор, арахіс, сорго, пшеницю, просо, тютюн тощо). В інших варіантах здійснення рослини кукурудзи та сої є оптимальними, а ще у декількох інших варіантах здійснення оптимальними є рослини кукурудзи.

Інші рослини, що становлять інтерес, включають зернові рослини, які дають насіння, що становить інтерес, олійні рослини та бобові рослини. Насіння, що становить інтерес, включає насіння зернових культур, таких як кукурудза, пшениця, ячмінь, рис, сорго, жито тощо. Олійні рослини включають бавовник, сою, сафлор, соняшник, представників Вгаз5іса, маїс, люцерну, пальму, кокосову пальму тощо. Бобові рослини включають різновиди бобів та різновиди гороху.

Різновиди бобів включають гуар, ріжкове дерево, гуньбу, сою, різновиди квасолі звичайної, вігну китайську, золотисту квасолю, лімську квасолю, стручкову квасолю, різновиди сочевиці, турецький горох тощо.

Як застосовується в даному документі, термін "молекула полінуклеотиду, що транскрибується" відноситься до будь-якої молекули ДНК, яка може транскрибуватися в молекулу РНК, в тому числі без обмежень таких, які мають послідовності, що кодують білок, і таких, які мають послідовності, корисні для супресії генів. "Трансген" відноситься до молекули полінуклеотиду, що транскрибується, гетерологічної відносно клітини-хазяїна та/або молекули полінуклеотиду, що транскрибується, штучно введеної в геном клітини-хазяїна.

Регуляторний елемент за даним винаходом може бути функціонально пов'язаним з молекулою полінуклеотиду, що транскрибується, яка є гетерологічною відносно регуляторної молекули. Як застосовується в даному документі, термін "тгетерологічна" стосується комбінації двох або більше молекул полінуклеотиду, які зазвичай не перебувають у такій комбінації в природі. Наприклад, дві молекули можуть походити від різних видів та/або дві молекули можуть походити з різних генів, наприклад, різних генів одного виду або однакових генів різних видів.

Регуляторний елемент, таким чином, є гетерологічним відносно молекули функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що транскрибується, якщо така комбінація зазвичай не зустрічається в природі, тобто ця молекула полінуклеотиду, що транскрибується, в природі зазвичай не є функціонально пов'язаною в комбінації з цією молекулою регуляторного елемента.

Молекула полінуклеотиду, що транскрибується, як правило, може являти собою будь-яку молекулу ДНК, експресія РНК-транскрипту якої є потрібною. Така експресія РНК-транскрипту може привести до трансляції одержаної молекули тКМА і, таким чином, до експресії білка.

Альтернативно, молекулу полінуклеотиду, що транскрибується, можна конструювати так, щоб, у підсумку, спричиняти знижену експресію визначеного гена або білка. Цього можна досяїти із застосуванням молекули полінуклеотиду, що транскрибується, що орієнтована в антисенсовому напрямку. Фахівцю в даній галузі техніки добре відоме застосування такої антисенсової технології. Коротко, в ході транскрипції антисенсової молекули полінуклеотиду, що транскрибується, РНК-продукт гібридизується з комплементарною молекулою РНК всередині клітини та блокує її. Ця дуплексна молекула РНК не може транслюватися клітинним апаратом трансляції з утворенням білка, та вона піддається деградації в клітині. Будь-який ген може піддаватися негативній регуляції в такий спосіб.

Таким чином, один варіант здійснення даного винаходу являє собою регуляторний елемент згідно з даним винаходом, такий як представлений в ЗЕО І МО: 1-6, функціонально пов'язаний з молекулою полінуклеотиду, що транскрибується, щоб модулювати транскрипцію молекули полінуклеотиду, що транскрибується, на потрібному рівні або з потрібним профілем після бо введення вказаної конструкції в рослинну клітину. В одному варіанті здійснення молекула полінуклеотиду, що транскрибується, містить ділянку гена, що кодує білок, і промотор впливає на транскрипцію молекули РНК, яка транслюється та експресується у вигляді білкового продукту. В іншому варіанті здійснення молекула полінуклеотиду, що транскрибується, містить антисенсову ділянку гена, та промотор впливає на транскрипцію молекули антисенсової РНК або іншої подібної інгібіторної молекули РНК для інгібування експресії визначеної молекули

РНК, що становить інтерес, у цільовій клітині-хазяїні.

Молекули полінуклеотидів, що транскрибуються, які експресуються завдяки регуляторним елементам ГГОАМ згідно з даним розкриттям, можна застосовувати для зміни фенотипу рослини. Різні зміни фенотипу, що становлять інтерес, включають модифікацію експресії гена, зміну механізму захисту рослини від патогену або комах, збільшення толерантності рослини до гербіцидів, що потрапляють у рослину, зміну розвитку коренів у відповідь на стресові фактори довкілля, модуляцію відповіді рослини на засоленість, температуру (високу та низьку), посуху тощо. Цих результатів можна досягти за допомогою експресії гетерологічної нуклеотидної послідовності, що становить інтерес, що містить прийнятний генний продукт. У визначених варіантах здійснення гетерологічна нуклеотидна послідовність, що становить інтерес, являє собою ендогенну послідовність рослини, рівень експресії якої є підвищеним у рослині або частині рослини. Альтернативно, результатів можна досягти за допомогою забезпечення зниження експресії одного або декількох ендогенних генних продуктів, зокрема ферментів, транспортерів або кофакторів, або шляхом впливу на поглинання поживних речовин у рослині.

Ці зміни приводять у результаті до зміни у фенотипі трансформованої рослини.

Гени, що становлять агрономічний інтерес

Молекули полінуклеотидів, що транскрибуються, можуть являти собою гени, що становлять агрономічний інтерес. Як застосовується в даному документі, термін "ен, що становить агрономічний інтерес" відноситься до молекули полінуклеотиду, що транскрибується, яка у разі експресії в конкретній рослинній тканині, рослинній клітині або типі рослинних клітин, забезпечує потрібну характеристику, пов'язану з морфологією, фізіологією, ростом, розвитком, врожайністю, продуктивністю, харчовою цінністю, стійкістю до захворювань або шкідників та/або толерантністю до впливів довкілля або хімічних речовин. Гени, що становлять агрономічний інтерес, включають без обмежень такі гени, що кодують білок, пов'язаний з урожайністю, білок,

Зо пов'язаний зі стійкістю до стресового фактора, білок, пов'язаний з регуляцією розвитку, білок, пов'язаний з диференціюванням тканин, білок меристеми, білок, пов'язаний з відповіддю на вплив довкілля, білок, пов'язаний зі старінням, білок, чутливий до дії гормону, білок, пов'язаний з опаданням листків, білок донорної тканини, білок акцепторної тканини, білок, пов'язаний з регуляцією розвитку квіток, білок насіння, білок, пов'язаний зі стійкістю до гербіцидів, білок, пов'язаний зі стійкістю до захворювань, фермент біосинтезу жирних кислот, фермент біосинтезу токоферолу, фермент біосинтезу амінокислот, пестицидний білок або будь-яку іншу речовину, як, наприклад, антисенсову молекулу або молекулу для ЕМАЇ, що здійснює цілеспрямований вплив на конкретний ген із забезпеченням його супресії. Продукт гена, що становить агрономічний інтерес, може проявляти активність в межах рослини із забезпеченням ефекту щодо фізіологічних властивостей або метаболізму рослини або може проявляти активність як пестицидна речовина в їжі шкідника, який живиться рослиною.

В одному варіанті здійснення регуляторний елемент згідно з даним розкриттям є вбудованим в конструкцію, внаслідок чого регуляторна молекула функціонально пов'язана з молекулою полінуклеотиду, що транскрибується, тобто геном, що становить агрономічний інтерес. Експресія гена, що становить агрономічний інтерес, є бажаною для забезпечення агрономічно корисної ознаки. Агрономічно корисна ознака може являти собою, наприклад, без обмежень, толерантність до гербіцидів, контроль комах, модифіковану врожайність, стійкість до грибкових захворювань, стійкість до вірусів, стійкість до нематод, стійкість до бактеріальних захворювань, ріст і розвиток рослини, продукування крохмалю, модифіковане продукування олій, високий рівень продукування олій, модифікований вміст жирних кислот, високий рівень продукування білка, достигання плодів, поліпшені поживні властивості для тварин і людини, біополімери, стійкість до стресових факторів довкілля, пептиди для фармацевтичного застосування та секретовні пептиди, поліпшену переробку, поліпшену засвоюваність, продукування ферментів, запах, фіксацію азоту, одержання гібридного насіння, одержання волокон і одержання біопалива.

Гени стійкості до комах можуть кодувати стійкість до шкідників, які пошкоджують врожай та є перешкодою для його одержання, таких як кукурудзяний жук, совка, кукурудзяний метелик тощо.

Такі гени включають, наприклад, гени токсичного білка Васіїйи5 ІПигіпдіепзі5 (патенти США МоМо 5366892; 5747450; 5736514; 5723756; 5593881; та Сеїзег еї а. (1986) Сепе 48:109); тощо. 60 Гени, що кодують ознаки, пов'язані зі стійкістю до захворювань, включають гени детоксикації, такі як гени, що забезпечують детоксикацію фумонозину (патент США Мо 5792931); гени авірулентності (амг) та стійкості до захворювань (К) (допез еї аїЇ. (1994) Зсієпсе 266:789;

Мапітп еї аї. (1993) сіепсе 262:1432; та Міпагіпоз еї а. (1994) СеїІ 78:1089) тощо.

Ознаки, пов'язані зі стійкістю до гербіцидів, можуть передбачати гени, що кодують стійкість до гербіцидів, які спричиняють інгібувальний вплив на ацетолактатсинтазу (А 5), зокрема гербіцидів типу сульфонілсечовини (наприклад, ген ацетолактатсинтази (А 5), що містить мутації, що ведуть до такої стійкості, зокрема мутації 54 та/або Нга), гени, що кодують стійкість до гербіцидів, які спричиняють інгібувальний вплив на глутамінсинтазу, таких як фосфінотрицин або равіа (наприклад, ген баї); гліфосату (наприклад, ген ЕРБ5Р5Б і ген САТ; див., наприклад, публікацію патентного документа США Мо 20040082770 ії МО 03/092360); або інші такі гени, відомі з рівня техніки. Ген Баг кодує стійкість до гербіциду Бавзіа, ген прі кодує стійкість до антибіотиків канаміцину та генетицину, а мутанти АЇ 5-гена кодують стійкість до гербіциду хлорсульфурону.

Стійкість до гліфосфату надає мутантна 5-енолпіруват-шикімат-3-фосфатсинтаза (ЕРБ5Р) і гени агоА. Див., наприклад, патент США Мо 4940835, виданий 5пап еї аї., в якому розкрита нуклеотидна послідовність форми ЕРБР5, яка може надавати стійкість до гліфосату. У патенті

США Мо 5627061, виданому Ваїггту еї аї., також описані гени, що кодують ферменти ЕРБР5. Див. також патенти США МеМо 6248876 В1; 6040497; 5804425; 5633435; 5145783; 4971908; 5312910; 5188642; 4940835; 5866775; 6225114 В1; 6130366; 5310667; 4535060; 4769061; 5633448; 5510471; Ке. 36449; КЕ 37287 Е та 5491288; і публікації міжнародних заявок МО 97/04103;

МО 97/04114; МО 00/66746; УМО 01/66704; МО 00/66747 і УМО 00/66748, які включені в даний документ шляхом посилання з цією метою. Стійкість до гліфосату також надається рослинам, які експресують ген, що кодує фермент гліфосат-оксидоредуктазу, як докладніше описано в патентах США МоМо 5776760 і 5463175, які включені в даний документ шляхом посилання з цією метою. Крім того, стійкість до гліфосату може надаватися рослинам шляхом надекспресії генів, що кодують гліфосат-М-ацетилтрансферазу. Див., наприклад, патент США МоМо 7714188 і 7462481.

Гени, що становлять агрономічний інтерес і дозволені регуляторними органами, добре відомі фахівцю в даній галузі техніки та їх можна знайти на сайті Центра оцінки ризику для

Зо довкілля (сега-дтс.огд/?аснпоп-дт сгор даїаразе, доступ до якого можна одержати із застосуванням префіксу млум/) і на сайті Міжнародної служби зі збирання агробіотехнологічних застосунків (ізааа.огу/дтарргомаідагаразе/деташйавр, доступ до якого можна одержати із застосуванням префіксу млум/).

Екзогенні продукти включають рослинні ферменти та продукти, а також продукти з інших джерел, у тому числі прокаріотів та інших еукаріотів. Такі продукти включають ферменти, кофактори, гормони тощо.

Приклади інших застосовних генів і пов'язаного з ними фенотипу передбачають ген, що кодує білок вірусної оболонки та/або РНК, або інші гени вірусів або рослин, які надають стійкість до вірусів; гени, які надають стійкість до грибів; гени, що сприяють поліпшенню врожайності; та гени, що сприяють стійкості до стресових факторів, таких як холод, дегідратація, спричинена посухою, підвищена температура та засоленість, токсичні метали або слідові елементи тощо.

Як зазначено, гетерологічна нуклеотидна послідовність, функціонально пов'язана з регуляторним елементом ГГОАМ, розкритим у даному документі може являти собою антисенсову послідовність цільового гена. Таким чином, промоторні послідовності, розкриті в даному документі, можуть бути функціонально пов'язані з антисенсовими послідовностями ДНК для зниження або інгібування експресії нативного білка в корені рослини. "КМАЇ" відноситься до низки споріднених методик для зниження експресії генів (див., наприклад, патент США Мо 6506559). Нині вважають, що більш давні методики, що мають інші назви, засновані на тому ж механізмі, але в літературі вони називаються по-іншому. Вони включають "антисенсове інгібування", одержання транскриптів антисенсової РНК, які здатні супресувати експресію цільового білка, та "косупресію" або "сенсову супресію", що відноситься до одержання транскриптів сенсової РНК, які здатні супресувати експресію ідентичних або значною мірою подібних чужорідних або ендогенних генів (патент США Мо 5231020, який включено в даний документ шляхом посилання). Такі методики залежать від застосування конструкцій, що спричиняють накопичення дволанцюгової РНК, де один ланцюг є комплементарним цільовому гену, що піддається сайленсингу. Регуляторний елемент ГГ ОАМ згідно з варіантами здійснення можна застосовувати для запуску експресії конструкцій, що буде приводити до РНК-інтерференції за участі тістокКМА та тівМА.

Послідовності регуляторних елементів згідно з даним розкриттям або їхні варіанти або бо фрагменти, якщо функціонально пов'язані з гетерологічною нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес, можуть запускати конститутивну експресію гетерологічної нуклеотидної послідовності в рослині, що експресує цю конструкцію. "Гетерологічна нуклеотидна послідовність" являє собою послідовність, яка зазвичай не трапляється в природі разом з послідовністю регуляторного елемента згідно з даним розкриттям. Хоча ця нуклеотидна послідовність є гетерологічною щодо послідовності регуляторного елемента, вона може бути гомологічною, або нативною, або гетерологічною, або чужорідною щодо рослини-хазяїна.

Виділені послідовності регуляторного елемента згідно з даним розкриттям можна модифікувати із забезпеченням діапазону рівнів експресії гетерологічної нуклеотидної послідовності. Таким чином, можна використовувати ділянку, меншу ніж ціла ділянка регуляторного елемента, та при цьому зберігається здатність запускати експресію нуклеотидної послідовності, що становить інтерес. Вважається, що рівні експресії тЕМА можна змінювати різними шляхами за допомогою делецій частин послідовностей регуляторних елементів. Рівні експресії тЕМА можуть знижуватися, або, альтернативно, експресія може підвищуватися внаслідок делецій регуляторного елемента, наприклад, якщо існує негативний регуляторний елемент (для репресора), що видаляється під час процесу усікання. Як правило, щонайменше приблизно 20 нуклеотидів виділеної послідовності регуляторного елемента застосовуватимуться для запуску експресії нуклеотидної послідовності.

Вважається, що для збільшення рівнів транскрипції, в комбінації з ділянками регуляторних елементів згідно з даним розкриттям можна використовувати енхансери. Енхансери являють собою нуклеотидні послідовності, які ведуть до підвищення рівня експресії, що забезпечується ділянкою регуляторного елемента. Енхансери відомі з рівня техніки та включають енхансерну ділянку 5М40, енхансерний елемент 355 тощо. Також відомо, що деякі енхансери змінюють нормальні профілі експресії під контролем регуляторного елемента, наприклад, обумовлюючи керування регуляторним елементом конститутивної експресії при відсутності енхансера, тоді як цей же регуляторний елемент керує експресією тільки в одній певній тканині або декількох певних тканинах.

Модифікації виділених послідовностей регуляторних елементів згідно з даним розкриттям можуть забезпечувати діапазон експресії гетерологічної нуклеотидної послідовності. Таким чином, їх можна модифікувати так, аби вони були слабкими промоторами або сильними

Зо промоторами. Як правило, "слабкий промотор' означає, що промотор запускає експресію кодуючої послідовності на низькому рівні. Передбачається, що "низький рівень" експресії означає експресію на рівнях від приблизно 1/10000 транскриптів до приблизно 1/100000 транскриптів, до приблизно 1/500000 транскриптів. Навпаки, сильний промотор запускає експресію кодуючої послідовності на високому рівні, або від приблизно 1/10 транскриптів до приблизно 1/100 транскриптів, або до приблизно 1/1000 транскриптів.

Вважається, що регуляторні елементи ІЇОАМ згідно з даним розкриттям можна застосовувати для підвищення або зменшення експресії, що, таким чином, веде до зміни фенотипу трансформованої рослини. Ця фенотипічна зміна може в подальшому впливати на збільшення або зменшення рівнів іонів металів у тканинах трансформованої рослини.

Нуклеотидні послідовності, розкриті в даному розкритті, а також їхні варіанти та фрагменти, є придатними для генетичної маніпуляції з рослиною. Послідовність регуляторного елемента

ГСООАМ є придатною в даному аспекті, якщо вона функціонально пов'язана з гетерологічною нуклеотидною послідовністю, експресію якої мають регулювати для досягнення потрібної фенотипічної відповіді Термін "функціонально пов'язаний' означає, що послідовність регуляторного елемента впливає на транскрипцію або трансляцію гетерологічної нуклеотидної послідовності. Таким чином, нуклеотидні послідовності регуляторних елементів згідно з даним розкриттям можуть бути забезпечені в касетах експресії разом з гетерологічними нуклеотидними послідовностями, що становлять інтерес, для експресії в рослині, що становить інтерес, більш конкретно для експресії в корені рослини.

Регуляторні послідовності згідно з варіантами здійснення забезпечені в ДНК-конструкціях для експресії в організмі, що становить інтерес. "Касета експресії", як застосовується в даному документі, означає ДНК-конструкцію, що містить регуляторну послідовність згідно з варіантами здійснення, функціонально пов'язану з гетерологічним полінуклеотидом, що кодує поліпептид, який становить інтерес. Такі касети експресії будуть містити ділянку ініціації транскрипції, що містить одну з нуклеотидних послідовностей регуляторного елемента згідно з даним розкриттям або його варіанти або фрагменти, функціонально пов'язані з гетерологічною нуклеотидною послідовністю. Таку касету експресії можна забезпечувати різними сайтами рестрикції для вставки нуклеотидної послідовності, щоб вона перебувала під транскрипційною регуляцією, що забезпечують регуляторні ділянки. Касета експресії може додатково містити гени селективних бо маркерів, а також 3'-ділянки термінації.

Касета експресії може містити, в 5-3 напрямку транскрипції, ділянку ініціації транскрипції (тобто промотор або його варіант або фрагмент згідно з даним розкриттям), ділянку ініціації трансляції, гетерологічну нуклеотидну послідовність, що становить інтерес, ділянку термінації трансляції та необов'язково ділянку термінації транскрипції, які функціонують в організмі хазяїна

Регуляторні ділянки (тобто промотори, транскрипційні регуляторні ділянки та ділянки термінації трансляції) та/або полінуклеотид згідно з варіантами здійснення можуть бути нативними/аналогічними щодо клітини-хазяїна або одна до одної. Альтернативно, регуляторні ділянки та/або полінуклеотид згідно з варіантами здійснення можуть бути гетерологічними щодо клітини-хазяїна або одна до одної. Як застосовується в даному документі, термін "гетерологічна" щодо послідовності означає, що послідовність походить з чужорідного виду або, якщо вона походить з того самого виду, значною мірою модифікована за складом та/або місцерозташуванням у геномі порівняно з її нативною формою внаслідок навмисного втручання людини. Наприклад, промотор, функціонально пов'язаний з гетерологічним полінуклеотидом, походить від виду, відмінного від виду, з якого одержаний полінуклеотид, або, якщо він походить 3 того самого/аналогічного виду, то один або обидва з них є значною мірою модифікованими порівняно з їхньою вихідною формою та/або місцерозташуванням у геномі, або промотор не є нативним промотором для функціонально пов'язаного полінуклеотиду.

Ділянка термінації може бути нативною щодо ділянки ініціації транскрипції, може бути нативною щодо функціонально пов'язаної послідовності ДНК, що становить інтерес, може бути нативною щодо рослини-хазяїна або може бути одержана з іншого джерела (тобто чужорідного або гетерологічного щодо промотора, послідовності ДНК, що експресується, рослини-хазяїна або будь-якої їхньої комбінації). Придатні ділянки термінації доступні від Ті-плазміди А.

Імтегїасієп5, такі як ділянки термінації генів октопінсинтази та нопалінсинтази. Див. також

Сиегіпеаи еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Ззапіасоп еї аі. (1991) Сепе5 Ювєу. 5:141-149; Модеп вї а). (1990) Ріапі Сеї! 2:1261-1272; Мипговє 6вї аї. (1990)

Сепе 91:151-158; ВаїІаз евї а!. (1989) Мисівїс Асіаз Нев. 17:7891-7903; та удов5пі еї аї. (1987) Мисівїс

Асіа Нез. 15:9627-9639.

Касета експресії, що містить послідовності згідно з даним розкриттям, може також містити щонайменше одну додаткову нуклеотидну послідовність гена, який підлягає котрансформації в організм. Альтернативно, додаткова послідовність(послідовності) може бути представлена в іншій касеті експресії.

За необхідності, нуклеотидні послідовності, експресія яких має перебувати під керуванням послідовності конститутивного промотора згідно з даним розкриттям, та будь-яка додаткова нуклеотидна послідовність(послідовності) можуть бути оптимізовані для підвищеної експресії в трансформованій рослині. Тобто ці нуклеотидні послідовності можна синтезувати із застосуванням кодонів, переважних для рослини, для поліпшення експресії. Див., наприклад,

СатрбреїЇ апа Сомті (1990) Ріапі РНузіої. 92:1-141 для обговорення переважної для хазяїна частоти застосування кодонів. З рівня техніки доступні способи синтезу генів, переважних для рослин. Див., наприклад, патенти США МоМо 5380831, 5436391 та Мигау еї аї. (1989) Мисіеїс

Асіа5 Рез. 17:477-498, включені в даний документ шляхом посилання.

Відомі додаткові модифікації послідовності для посилення експресії гена в клітині-хазяїні.

Вони включають вилучення послідовностей, що кодують хибні сигнали поліаденілювання, сигнали сайту екзон-інтронного сплайсингу, транспозоноподібні повтори та інші такі добре вивчені послідовності, які можуть здійснювати шкідливий вплив на експресію гена. Вміст -С в гетерологічній нуклеотидній послідовності можна коригувати до рівнів, середніх для даної клітини-хазяїна, як розраховано відносно відомих генів, що експресуються в клітині-хазяїні.

Якщо можливо, послідовність модифікують для запобігання утворенню передбачених шпилькових вторинних структур тАМА.

Касети експресії можуть додатково містити 5'-лідерні послідовності. Такі лідерні послідовності можуть сприяти підсиленню трансляції. Лідерні послідовності трансляції відомі з рівня техніки та передбачають лідерні послідовності пікорнавірусів, наприклад, лідерну послідовність ЕМСМ (5'-чсекодуюча ділянка вірусу енцефаломіокардиту) (ЕІгоу 5іеїп, еї аї. (1989)

Ргос. Маї. Асад. сі. ОБА 86:6126-6130); лідерні послідовності потивірусов, наприклад, лідерну послідовність ТЕМ (вірусу гравіювання тютюну) (Аїі5оп еї аї. (1986) Мігоіїоду 154:9 20); лідерну послідовність МОММУ (вірусу карликової мозаїки кукурудзи); білка, який зв'язує важкий ланцюг імуноглобуліну людини (ВіР) (Масе)ак, еї аІ. (1991) Маїшге 353:90 94); лідерну послідовність з

ТЕМА білка оболонки вірусу мозаїки люцерни, що не транслюється (АММ КМА 4) (Чобіїпо еї аї. (1987) Маїшге 325:622 625); лідерну послідовність вірусу тютюнової мозаїки (ТММ) (Сайіе еї аї. (1989) МоїІесшаг Віоюду ої КМА, раде5 237 256) і лідерну послідовність вірусу хлорозної бо мозаїчності маїсу (МСММУ) (Готтеї еї аї. (1991) Мігоїоду 81:382 385). Див. також ОеїІа Сіорра єї а!. (1987) Ріапі Рпузіоіоду 84:965 968. Також можна використовувати відомі способи підсилення стабільності ТЕМА, наприклад, інтрони, такі як убіквітиновий інтрон маїсу (Спгістепзеп апа Опаїї (1996) Тгтапздепіс Нев. 5:213-218; СНгівтепзеп еї аї. (1992) Ріапі МоіІесшцаг Віоіоду 18:675-689) або інтрон маїсу АсНІ (Куогика еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 228:40-48; КуогикКа вї а!. (1990) Мауаїса 35:353-357) тощо.

Під час одержання касети експресії різними фрагментами ДНК можна маніпулювати так, щоб одержати послідовності ДНК у належній орієнтації та, за необхідності, в належній рамці зчитування. З цією метою для з'єднання фрагментів ДНК можна використовувати адаптери або лінкери або можна залучати інші маніпуляції для забезпечення прийнятних сайтів рестрикції, видалення надлишкової ДНК, видалення сайтів рестрикції тощо. Для цього можна залучати мутагенез іп міто, репарацію за допомогою праймерів, рестрикцію, гібридизацію, повторні заміщення, наприклад, транзиції та трансверсії.

До касет експресії можна вводити репортерні гени або гени селективного маркера.

Приклади придатних репортерних генів, відомих з рівня техніки, можна знайти, наприклад, у

УемМегзоп єї аі. (1991) в Ріапі Моїесшціаг Віоїоду МапиаїЇ, ей. Сеїміп єї аїЇ. (Кіпмег Асадетіс

РибріїзНегв), рр. 1-33; ЮОемуУеї єї аІ. (1987) Мої. СеїІ. Віої. 7:725-737; СОМ еї аІ. (1990) ЕМВО .. 9:2517-2522; Каїп єї а. (1995) ВіоТесппіднез 19:650-655; та Спіми єї аІ. (1996) Ситепі Віоіоду 6:325-330.

Гени селективного маркера для відбору трансформованих клітин або тканин можуть включати гени, які надають стійкість до антибіотиків або стійкість до гербіцидів. Приклади придатних генів селективних маркерів включають без обмеження гени, що кодують стійкість до хлорамфеніколу (Не!їтега ЕвігеїЇа сеї а!. (1983) ЕМВО 3. 2:987-992); метотрексату (Не!тега Евігейа еї аі. (1983) Маїште 303:209-213; Меї|ег еї аІ. (1991) Ріапі Мої. ВіоІ. 16:807-820); гігроміцину (Уаідюгп еї аї. (1985) Ріапі Мої. Віо!. 5:103-108 та 7 Ні|іап еї а!. (1995) Ріапі бсіепсе 108:219-227); стрептоміцину (Чопеб5 еї а). (1987) Мої. Сеп. Сепеї 210:86-91); спектиноміцину (Вгеїадпе- зЗадпага еї аї. (1996) Ттапздепіс Вев. 5:131-137); блеоміцину (НіПе єї аї. (1990) Ріапі Мої. Віо1. 7:171-176); сульфонаміду (Сцегппеацй еї аї. (1990) Ріапі Мої. ВіоІ. 15:127-136); бромоксинілу (-гаїКег єї аї!. (1988) 5сієпсе 242:419-423); гліфосату (ЗНаму єї а!. (1986) 5сіеєпсе 233:478-481 та патентні заявки США з серійними номерами 10/004357 та 10/427692); фосфінотрицину (ЮОевВіоск

Коо) еї а). (1987) ЕМВО 3. 6:2513-2518).

Інші гени, які можна застосовувати в одержанні трансгенних об'єктів, але які можуть бути непотрібними в кінцевому продукті, будуть включати без обмеження такі приклади, як ОЗ (бета-глюкуронідаза; деїПег5оп (1987) Ріапі Мої. Віо!. Бер. 5:387), ЧЕР (зелений флуоресцентний білок; СНнаіе еї а!. (1994) бсієпсе 263:802), люцифераза (Відоз еї аї!. (1987) Мисієїс Асіаз Вев. 15(19):8115 та І реНгзеп еї а!ї. (1992) Меїнпод5 Епгутої. 216:397-414) та гени маїсу, що кодують продукування антоціаніну (І псм/д еї аї. (1990) Зсіепсе 247:449).

Касету експресії, що містить регуляторні елементи ГГ ОАМ згідно з даним розкриттям, функціонально пов'язані з нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес, можна застосовувати для трансформації будь-якої рослини. У такий спосіб можна одержувати генетично модифіковані рослини, рослинні клітини, рослинні тканини, насіння, корінь тощо.

Способи згідно з даним розкриттям передбачають введення поліпептиду або полінуклеотиду в рослину. Передбачається, що "введення" означає надання рослині полінуклеотиду або поліпептиду у такий спосіб, щоб послідовність потрапила всередину клітини рослини. Способи згідно з даним розкриттям не залежать від конкретного способу введення послідовності в рослину, за винятком того, що полінуклеотид або поліпептиди потрапляють всередину щонайменше однієї клітини рослини. З рівня техніки відомі способи введення полінуклеотиду та/або поліпептидів у рослини, в тому числі без обмежень способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації та способи трансформації, опосередкованої вірусами.

Передбачається, що "стабільна трансформація" означає, що нуклеотидна конструкція, що введена в рослину, інтегрується в геном рослини та може успадковуватися її потомством.

Передбачається, що "тимчасова трансформація" означає, що полінуклеотид вводиться в рослину та не інтегрується в геном рослини, або в рослину вводиться поліпептид.

Протоколи трансформації, а також протоколи для введення нуклеотидних послідовностей в рослини можна змінювати залежно від типу рослини або рослинної клітини, тобто однодольної або дводольної рослини, що призначена для трансформації. Придатні способи введення нуклеотидних послідовностей в рослинні клітини та подальшої вставки в геном рослини включають мікроін'єкцію (Стоз55улау еї аї. (1986) Віоїєснпіднев 4:320334), електропорацію (Віддв еї а). (1986) Ргос. Май. Асай. З5сі. ОБА 83:56025606), трансформацію, опосередковану 60 Адгобрасієтішт (патенти США МоеоМо 5563055 і 5981840), пряме перенесення генів (Раб2Кому5Кі єї аі. (1984) ЕМВО .). 3:27172722) та балістичне прискорення частинок (див., наприклад, патенти

США МоМо 4945050; 5879918; 5886244 і 5932782; Тотез еї аїЇ. (1995) в Ріапі Сеї, Тіввиє, апа

Огдап Сийшгте: Еипдатепіа! Меїнодв», еа. Сатрброга апа Рнїрв, (Зргіпдег-Мепаа, Вепіп); МеСабре еї а. (1988) Віоїєснппоіоду 6:923926) і трансформацію І ес1 (МО 00/28058). Див. також М/еіззіпдег еї а). (1988) Апп. Веу. Сіепеї. 22:421 477; Запіога єї а!. (1987) Рапісціаїе 5сіепсе апа Тесппоіоду 5:27 37 (цибуля); СНгівіои еї аї. (1988) Ріапі РНузіої. 87:671 674 (соя); МеСабе еї аї. (1988)

Віо/Гесппоіоду 6:923 926 (соя); Ріпег апа МеМийПеп (1991) Іпй Міо Сеї! Оєм. Вісі. 27Р:175-182 (соя); біпой єї аї. (1998) Тниєог Аррі. Сепеї. 96:319-324 (соя); Оайа єї аї. (1990) Віоїєсппоіоду 8:736 740 (рис); Кієїп єї аї. (1988) Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА 85:4305 4309 (маїс); КіІвїп еї аї. (1988) Віоїєсппоіоду 6:559 563 (маїс); патенти США МоМо 5240855; 5322783 і 5324646; Ківїп еї аї. (1988) Ріапі РПпузіоІ. 91:440 444 (маїс); Рготт еї аї. (1990) Віоїесппоіоду 8:833 839 (маїс);

Нооукааз-Мап біодієтеп єї а). (1984) Маїшге (Гопдоп) 311:763-764; патент США Мо 5736369 (злакові рослини); Вуїебієг єї а. (1987) Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 84:5345-5349 (І Іасеає); Ое

МУеї єї а. (1985) в Ехрептепіа! Мапіршіайоп ої Омшціе Тізвцез, єд. Спартап вї а!. (Гопдтап, Мем

Уок), рр. 197-209 (пилок); Каеррієг єї аї. (1990) Ріапі Сеї! Верогів 9:415-418 та Каеррівг еї аї. (1992) Тнєог Аррі. Сепеї. 84:560-566 (трансформація, опосередкована віскерами); О'Наїніп еї аї. (1992) Ріапі Сеї! 4:1495-1505 (електропорація); Гі єї а. (1993) Ріапі Сеї! Верогів 12:250-255 та

СНгівіюи апа Бога, (1995) Аппаіє ої Воїапу 75:407-413 (рис); Озіода єї аї. (1996) Майте

Віотесппоіоду 14:745-750 (трансформація маїсу за допомогою Адгобасієгійт їштегїасіеп5); усі з яких включено в даний документ шляхом посилання.

У визначених варіантах здійснення ДНК-конструкції, що містять послідовності регуляторних елементів згідно з даним розкриттям, можна вводити в рослину із застосуванням низки способів тимчасової трансформації. Такі способи тимчасової трансформації включають без обмеження системи на основі вірусних векторів та осадження полінуклеотиду в такий спосіб, що виключає подальше вивільнення ДНК. Таким чином, може відбуватися транскрипція ДНК, зв'язаної на частинках, але частота, з якою вона вивільнюється, щоб інтегруватися в геном, значно знижена.

Такі способи включають застосування частинок, вкритих полієтиленіміном (РЕЇ; Зідта-Аїагісп тм

Мо РЗ3143).

В інших варіантах здійснення полінуклеотид згідно з даним розкриттям можна вводити в рослини шляхом приведення рослин у контакт з вірусом або вірусними нуклеїновими кислотами. Загалом, такі способи передбачають вбудовування нуклеотидної конструкції згідно з даним розкриттям в молекулу вірусної ДНК або РНК. Способи введення в рослини полінуклеотидів, у тому числі молекул вірусної ДНК або РНК, та способи експресії білка, що закодований у них, відомі з рівня техніки. Див., наприклад, патенти США МоМо 5889191, 5889190, 5866785, 5589367, 5316931 та Ропа еї а. (1996) МоїІесшаг Віоїесппоіоду 5:209-221; включені в даний документ шляхом посилання.

З рівня техніки відомі способи цілеспрямованої вставки полінуклеотиду у визначене місцерозташування в геномі рослини. В одному варіанті здійснення вставку полінуклеотиду в потрібне місцерозташування в геномі здійснюють із застосуванням системи сайт-специфічної рекомбінації. Див., наприклад, УМО99/25821, УМО99/25854, УМО99/25840, УУО99/25855 і

УО99/25853, усі з яких включено в даний документ шляхом посилання. Коротко, полінуклеотид згідно з даним розкриттям може міститися в касеті для перенесення, фланкованій двома неідентичними сайтами рекомбінації. Касету для перенесення вводять у рослину, що має у своєму геномі стабільно вбудований цільовий сайт, рланкований двома неідентичними сайтами рекомбінації, які відповідають сайтам касети для перенесення. Забезпечують відповідну рекомбіназу, та касета для перенесення інтегрується в цільовий сайт. Полінуклеотид, що становить інтерес, таким чином, інтегрується у визначене хромосомне положення в геномі рослини.

З клітин, які були трансформовані, можна вирощувати рослини згідно з традиційними способами. Див., наприклад, МеСогтіск еї аї. (1986) Ріапі Сеї! Керогів 5:81-84. Потім ці рослини можна вирощувати, та піддавати запиленню або із застосуванням тієї самої трансформованої лінії або із застосуванням інших ліній, та ідентифікувати одержаний гібрид, що характеризується конститутивною експресією бажаної фенотипічної характеристики. Можна вирощувати два або більше поколінь, аби переконатися, що експресія бажаної фенотипічної характеристики стабільно підтримується та успадковується, а потім збирати насіння, аби переконатися, що була досягнута експресія бажаної фенотипічної характеристики. Таким чином, дане розкриття передбачає трансформоване насіння (що також називають "трансгенне насіння"), що містить нуклеотидну конструкцію згідно з даним розкриттям, наприклад, касету експресії згідно з даним розкриттям, стабільно вбудовану в його геном. 60 Форма однини застосовується в даному документі для позначення одного або декількох

(тобто щонайменше одного) граматичних об'єктів предмета. Наприклад, "елемент" означає один або декілька елементів.

Буде зрозумілим, що упродовж усієї заявки слово "що містить" або варіанти, такі як "містить" або "який містить", припускає включення наведеного елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, а не виключення будь-якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.

Усі публікації, патенти та заявки на патент, згадані в даному описі, орієнтовані на рівень фахівців в галузі техніки, до якої належить дане розкриття. Усі публікації, патенти та заявки на патент включені в даний документ шляхом посилання такою ж мірою, як якби кожна окрема публікація, патент або заявка на патент була спеціально та окремо включена шляхом посилання.

Передбачається, що вищенаведений опис різних ілюстративних варіантів здійснення даного розкриття не є вичерпним або обмежує обсяг точної форми, що розкрита. Хоча конкретні варіанти здійснення прикладів описані у даному документі для ілюстративних цілей, у межах обсягу даного розкриття можливі різні еквівалентні модифікації, як буде зрозуміло фахівцям у даній галузі. Представленні в даному документі ідеї можна застосовувати для інших цілей, відмінних від прикладів, описаних вище. У світлі вищенаведених ідей можливі численні модифікації та зміни, і тому вони входять у межі обсягу формули винаходу, що додається.

Ці та інші зміни можуть бути виконані у світлі вищенаведеного детального опису. Загалом, у нижченаведеній формулі винаходу, використовувані терміни не повинні тлумачитись як такі, що обмежують обсяг конкретних варіантів здійснення, розкритих в описі та формулі винаходу.

Були здійснені спроби забезпечення точності щодо застосовуваних чисел (наприклад, кількості, температури, концентрації тощо), проте можуть передбачатися деякі експериментальні помилки та відхилення. Якщо не вказано інакше, частини являють собою частини за вагою, молекулярна вага являє собою середню молекулярну вагу; температура наведена в градусах за Цельсієм та тиск є атмосферним або близьким до атмосферного.

Наступні приклади представлені для ілюстрування, а не для обмеження.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Приклад 1. Послідовності регуляторних елементів вірусу, що викликає деформацію листя

Зо глухої кропиви

Регуляторний елемент з ЗЕО ІЮ МО: 1 одержували шляхом пошуку серед геномів у сепВапк стосовно вірусних геномів, які були секвеновані та належали до родини вірусів Сацітомігідає.

Пошук розпочинали на основі добре відомого 355 промотора вірусу мозаїки цвітної капусти (Самм355). Він запускає конститутивну експресію гетерологічних генів у більшості тканин більшості рослин. Інші регуляторні елементи з цієї родини вірусів, такі як 345 промотор вірусу мозаїки ранника, також керують експресією, подібною до конститутивної, у рослинах. Отже, додаткові регуляторні елементи, що походять від родини вірусів Саційтомігічає, також можуть запускати конститутивну експресію в рослинах. Ділянка геному, що знайдена в так званій довгій міжгенній ділянці (ІК), зазвичай містить регуляторні послідовності, необхідні для функціонування промотора в рослинах.

Геном вірусу, що викликає деформацію листя глухої кропиви (ГГ ОАМ,), містить ГІК, отже на цю ділянку здійснювали цілеспрямований вплив задля функціонального аналізу регуляторних елементів. Одну повнорозмірну послідовність відбирали для тестування в рослинах.

Послідовність складалась із 1226 п. о. (викладена в 5ЕО ІЮ МО: 1) та містила припустимий

ТАТА-бокс, що розпочинався на приблизно 95 п. 0. вище від 3-кінця послідовності. Повна послідовність з 1226 п. о. відноситься до повнорозмірного регуляторного елемента ГІ САМ або

ГГОАМ Р. За допомогою делеції сегментів з 5'-кінця повнорозмірного регуляторного елемента можна змінити профіль експресії та отримати більш повне уявлення щодо важливих маркерів послідовності в регуляторній ділянці. Друга, третя, четверта, п'ята та шоста послідовності являють собою усічені варіанти повнорозмірного регуляторного елемента (див. фігуру 2; ЗЕО ІЮ

МО: 1). Регуляторні елементи ГІ САМ ТК1, ГП ОАМ ТК2, ГГ ОАМ ТЕЗ, ПІ ОАМ ТКА та І ОАМ ТК5 відповідно складаються з 1130 п. о., 904 п. о., 885 п. о., 443 п. о. та 113 п. о. та містять 3'-кінець повнорозмірного промотора (ЗЕО ІЮ МО: 2-6).

Приклад 2. Аналіз експресії та делеціний аналіз щодо регуляторного елемента ГГ ОАМ

ГСОАМ Р. функціонально пов'язували з першим інтроном гену алкогольдегідрогенази 1 (АСНІ інтрон 1) маїсу та геном р-глюкуронідази (505) у векторі експресії для дослідження, чи буде синтезований фрагмент ДНК керувати експресією (ЗЕО ІО МО: 1). Інтрон 1 АОНІ включали з метою підвищення рівня експресії, оскільки із застосуванням клітин злакових рослин було показано, що експресія трансгенів збільшується у разі наявності деяких 5'-проксимальних 60 інтронів (див. Саїйв єї аі. (1987) Сепе5 апа Оемеіортепі 1: 1183-1200; КуоикКа еї аї. (1990)

Мауаїса 35:353-357).

Промотор ШБІі-1 та інтрон із 7єа таух функціонально пов'язували з геном СИО5 так, щоб його можна було застосовувати для порівняння профілю експресії та рівнів експресії під контролем регуляторних елементів ГІ САМ. Промотор ШБі-1 являє собою сильний конститутивний промотор у більшості тканин 7еа таув.

Регуляторні елементи являють собою набір мотивів послідовності, які функціонують разом для зв'язування факторів транскрипції що обумовлює просторові, часові та кількісні характеристики експресії промотора. Розуміння структури та розміщення цих мотивів розширює інформацію щодо регуляторного елемента. Аналіз підданих делеції сегментів являє собою важливий інструмент, який можна застосовувати для початку ідентифікації ділянок регуляторного елемента, що містить функціонально важливі мотиви. Шляхом видалення сегментів з 5--кінця можна змінювати просторові, часові та/або кількісні профілі експресії, що керується регуляторним елементом. Ділянки, що приводять до зміни, можна далі вивчати більш детально для оцінки послідовностей та їх взаємодії з цис- і транс-активувальними факторами.

Усічення також можуть визначати мінімальну функціональну послідовність.

Сайти розпізнавання рестрикційної ендонуклеази 5їМміІ, АссіІ, засі, ЕсоКіІ та сСіаї застосовували для видалення п'яти ділянок послідовності ГГ. ОАМ ЕЕГ, розмір яких знаходився в діапазоні від «96 до 1113 п.о. ГГ ОАМ ТК1, ГП ОАМ ТК2, ГГ ОАМ ТЕЗ, ГГ ОАМ ТК4, ГГ ОАМ ТК5 функціонально пов'язували з інтрономі АНІ та геном СИ5 у векторі експресії для дослідження потенціалу експресії з використанням синтезованих фрагментів ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 2-6).

Стабільно трансформовані рослини маїсу створювали за допомогою протоколів із застосуванням Адгобасієгічт (детально в прикладі 3) для забезпечення можливості визначення характеристик активності промотора, у тому числі просторових та кількісних характеристик експресії, що керується різними регуляторними елементами. З рослин, що виросли до стадії

М5/6 в тепличних умовах, збирали матеріал у вигляді листя та коріння для оцінки змін профілю експресії за допомогою аналізу гістохімічного фарбування на активність ЗИ5 та кількісних флуорометричних аналізів. Стадії вегетативного росту маїсу визначали за числом листкових вузлів у рослини. Таким чином, рослина на стадії М5 мала 5 сформованих листкових вузлів.

Зо Тканини також збирали, коли рослини досягали стадії генеративного розвитку К1-Н2. В1 відзначали появою шовковистих ниткоподібних маточок поза листковою обгорткою, а К2 коли шовковисті ниткоподібні маточки починали висихати. Результати продемонстрували, що ГГ САМ

ЕІ. керував експресією в більшості тканин маїсу подібно до промотору ШБі-1 або трішки краще за нього (таблиця 1). Винятком був пилок, в якому експресія під керуванням ГГ ОАМ РІ. була набагато нижчою, ніж під керуванням Шрі-1. 5'-усічені промотори (ГОАМ ТК1-4) вели себе подібно до І І САМ РЇ. за винятком ГГ САМ ТК», який не функціонував ні в одній із досліджуваних тканин.

Таблиця 1

Результати експресії для промотора І І БАМ (з інтроном 1 АОНІ та 55) в рослині недо ІТТ: ПОН ПОЛО КЛ Є ОО оозменіеннснн вт ХДУ КЕОД пек

Листок | Корінь | Стебло | Волоть ниткоподібні Пилок обгортка маточки шШоАУтТА5 Її 0 | 0 0 | 0 | 0 | 0 | о

Без трансформації (негативний контроль)

Дані виражені за допомогою шкали від 0 до 6, при цьому промотор ШБі-1 маїсу, що керував експресією, був порівняльним зразком.

Регуляторний елемент ГГ ОАМ РІ. (5ЕО ІО МО: 1) функціонально пов'язували з інтроном 1

АРНІ та інсектицидним геном (скорочено І52) для дослідження експресії. Промотор ОБі-1 та інтрон, що керують експресією інсектицидного гена Іс2, застосовували в аналізі для порівняння.

Стабільно трансформовані рослини маїсу створювали за допомогою протоколів із застосуванням Адгобасієегішт (детально в прикладі 3) та залишали їх рости до стадії М5/6, під час якої збирали листя. Потім рослини залишали рости до стадій К1-К2, під час яких брали зразки стебла та пилку. Зерна відбирали для зразків після їх дозрівання.

Результати твердофазних імуноферментних аналізів (ЕГІЗА) щодо Іс52 продемонстрували, що регуляторний елемент ГГОАМ РІ. (5ЕО ІЮО МО: 1) керував експресією у тканинах листка, стебла та зерна (таблиця 2). Рівні експресії були порівнювані з промотором ШБі-1ї та його інтроном у тканинах листка та стебла. У зернах експресія, керована ГГ САМ РІ. (ЗЕО ІЮО МО: 1), була нижчою порівняно з ШБі-1, а у пилку експресія була дуже низькою.

Дані щодо експресії підкріплювались результатами аналізів щодо поїдання комахами.

Поїдання комахами нарізаних тканин рослини забезпечувало швидку оцінку експресії білка, так як для захисту тканини від комах необхідними були достатні її рівні. Недостатня експресія буде приводити до ушкодження від поїдання. Як рослини, що мали ГІ ОСАМ РІ (5ЕО ІЮ МО: 1), так і рослини, що мали ШБі-1, характеризувались рівнями експресії, що забезпечували захист тканини листка та шовковистих ниткоподібних маточок від пошкодження комахами. Тканини рослин негативного контролю, що не мали гена ІС2, були з'їдені.

Дані виражені за допомогою шкали від 0 до 6, при цьому промотор ШБі-1 маїсу представляє медіанне значення.

Таблиця 2

Результати експресії для регуляторного елемента ГІ САМ (з інтроном 1 АСНІ1 та ГГ ОАМ:ІС2) в рослині 11111111 М5М6 17717171 він | Стиглість.::- 1111111111111111111листоко 0 Стебло | Пилок | Зерна.:/: пошене 1217501 017 (негативний контроль)

Дані виражені за допомогою шкали від 0 до 6, при цьому промотор ШБі-1 маїсу представляє медіанне значення.

Приклад 3. Трансформація маїсу, опосередкована Адгобасієегішт, та регенерація трансгенних рослин

Для трансформації маїсу, опосередкованої Адгобасієегішт, із застосуванням послідовності регуляторного елемента згідно з даним розкриттям, застосовували спосіб за 7пао (патент США

Мо 5981840 та РСТ публікація патентної заявки М/О98/32326; вміст яких, цим включено в даний документ шляхом посилання). Коротко, незрілі зародки виділяли з маїсу та зародки приводили в контакт з суспензією Адгобрасієгіцшт в умовах, за яких бактерії були здатними переносити послідовність регуляторного елемента згідно з даним розкриттям щонайменше в одну клітину щонайменше одного з незрілих зародків (стадія 1: стадія інфікування). Зародки спільно культивували із суспензією Адгорасіегішт протягом певного періоду часу, потім спільно культивували на твердому середовищі (стадія 2: стадія спільного культивування). Після спільного культивування проводили необов'язкову стадію "спокою". На цій стадії спокою зародки інкубували в присутності щонайменше одного антибіотика, який, як відомо, інгібує ріст

Адгобасіегішт, без додавання селективного засобу для рослинних трансформантів (стадія 3: стадія спокою). Потім зародки переносили та культивували на середовищі, що містило селективний засіб, для виділення зростаючих трансформованих калюсів (стадія 4: стадія відбору). Проростки регенерували із калюсів (стадія 5: стадія регенерації), перед тим як перенести їх у теплицю.

Приклад 4. Аналіз експресії під контролем регуляторного елемента І І САМ в канолі

Промотор ГГОАМ досліджували у канолі із застосуванням гену 55 як репортерного.

Аналізи транзієнтної експресії, опосередкованої біолістичним бомбардуванням, застосовували для забезпечення початкової оцінки ефективності. Кількість пофарбованих осередків ЗОЗ та інтенсивність фарбування порівнювали з промотором убіквітину-10 Агарідорзіз (АШВОТ10), сильним промотором у тканинах каноли. Ефективність промотора І ГОАМ була подібною з ефективністю промотора АШВО10О щодо інтенсивності фарбування 505. Однак спостерігали невелике зниження кількості пофарбованих осередків (таблиця 3).

Трансгенні рослини каноли регенерували за допомогою обидвох векторів ГГ САМ: И5 та

АШВО10:505. За допомогою гістохімічного фарбування трансформантів ГП ОАМ:И5 було виявлено високі рівні експресії у листках та частинах квітки (таблиця 3). Експресію, що керувалась ГГОАМ, також спостерігали в пилку та стручках. У разі порівняння із гістохімічно пофарбованою тканиною рослин, трансформованих АШВО10:5И5, ГІ САМ був порівнюваним у листках та частинах квітки. У пилку експресія, що керувалась ГГ БАМ, була слабшою порівняно з

АШВО10, при цьому пофарбованими були приблизно 10-1595 пилкових зерен. Майже всі пилкові зерна АЛШЮВОТ10 фарбувались у темний колір.

Таблиця З

Результати експресії для промотора І ГОАМ у канолі

Аналіз транзієнтної Листок Частини квітки Пилок експресії

П-ОАМ Р

АШВвОТО

Дані виражені за допомогою шкали від 0 до 3, при цьому трійка означала сильну експресію.

при пет пово

МІХ: ЖБЖю ХО МИ ААУ Кі «их пре тиітІ» АКТИ Сб Ви «А ЕМ БИЗНІВ ХайсЕРВЕД ТЯТЕВНЕШНИ жо . 15 квт

УА, ОБ

Ії ик Арк

БАН ОАДЛЕН, Мінель ях Баки у

ЛУ, ВИСНВУ «ап Тут ща НО З и пк ту пащу т

ПАМ А кжштуликхкинло ЄпшМментм юсотКмйВв ож ім мими засолу пвання

М юх ІКТ

ДК ХМ КАК

Не її «ТЕХ Е

ННЯ ун но то В,

КН цик щита ха ЯКІ САТ ЯМА бю сю гух я

ДУ І я зх «А М АЛІ ке УКЛ люд ди РАТАТМ «о х точи цу дреди Кай і ж вм іжлЕнКУуХ зеучех ут ще ТАКУ. ЩО ми кншжКщ Меси МмІММю пе усм тату міх Емма МмиМ ооо и «АТ пото

Вокакея ухууєі ка мих «МІ МІМаМИЄВІМХ

ПА по Її ит ту. речи ПЧ хожи и КР я ги ху козі ітемУм св атрівзихм З АІ щу

ТИЖ УМІЛІ ХУ ГІПМОАСИТІУКМИ зда МО Ха,

Кая ч ев АХ чеки В цим В Всю фоуфсжв они го муж учихих фах возив ВО прик причи питав варки ся Я У Б Ка МеМО Бах пон ВІН В поту ту иих посух дви дюд ти Оу ук нич Б Ме дими прот дом ми аккасссшо ФефУасесесяма Зспзсзавзе зе сева чо їзово МОЗ з

АСК. повин Ве ож елмиІх рег СУБ ОК мрвте я гл ер охоту М пох

ВІ и садами: Зх Клея спав сира

ЗЕ ше «жу ую фі ефек ЛКК п ев Ук кто Меси иК и шиї их шив поеми файлом пгаомнамцИине сфмвісоса зеахааитоИ «ах ша лю есе ще прехезузореи ихК бек ис дульсвовов стук Бозі с вд шахиМмичесиа пово ссчки песо лома бен зіва зи рез ііі и сфе іти бе джу фе флзих іти Си в МО кіля уи асан шукисвеоаь зе саа схоче бек оЄ ша аккк шт

ММ фоузсу Кат тжірехияйу ЗМ и фирма пуер вит лу 0230 іль МЕ м фе В Кризи дує ема у поці панди пис моб поза пить йах мета ту хи ломи потрапив пази шести вико всих

ФМ ЯНА МАМ МВ рН Не шо Х Ко рю Кен ма еНиМАКХТеьИХ а сту в пейруже ух ос іх и очки паю жі фо ВЗ чим лу ри ач дулю вив дн ки тази исоскаа Секс соаа ЗОШ Кона в. а фФасашинерва Вас ро

ЕК я КОМ рольових пуд доки В ужив ле пуху М их тУЛІлІпУоЖУК УМ МО м скиду МОМ им ум ехо ук шеамосаеае аа ой пита. шахи пишна иа гонайа сосни й ши мим хх ета нн НН НК НК піч ес зЗішвтаианиа сб яватх ке ИН шИМ шо В. пок чай

За

Корі уки Вузи чив М Ву мини путем м им ем мом пуф ери о бета их ач ХІТ МАКІВ сроитеа ОХ ни ПУТІ ПМ Зп шия

ІБН їм презиу г одниви Мем Мотря ж прифи хе ї солУЛУМТУ МД Ко ис пух уми м оутим о жопу и

ІБ КД На иА ІК слати Во ОСА ст соч а

ХУрех

ЕЕ тоКІжд ЕВ Усівсу епоху фот мія богів ва січ ит почне: о (5 і феод п

ПОВ ОКА ІЧ КНМВОЕ Кана шипа хезатитлУ єю зла паса чик

Заг ха хи ств ки и Кг сзщщ ци и У оду еВ мим У т ГО мом Мом во мем М оМоюухІВ ІЗ Х. и и и С о о ЕМ У Б СТВ КА ІН ММ З де ек сло ше тут

КС тв Кох ур Во дупи фази схеми цик хи мим у йти ОІВ мі зіавзотавв пеФчеспаєУкак щити сміє есспслашавков: алимМмимианх сепія шо рвана ин о м а о в В І и ом а м ана з ке З МЕ Кам КЕ щиМмесав зе воютчи моз сдвеЕнел пива

НРКУ хи у вн в НН НН в в НН НК

ОЖИНУ ее ах Фронт иа ХМ ХЛ ШУ тав зчх Зо ПЕТ 1пне

Федик сем ЕуМ умовох Вк МосІ тс солити М КО с м оо іти

Мови семан мтЄ мала Мессі ми мих ше лили тай вк оку рази го фор ик і ууууІвлу гір у фу им Ви чую Коник імя о ем жу су

ЯМКИ СБ БдУКлЛИиЯЦМаМ фра уєУкаиму МАННУ Кеш МмАСЄКНИК Са НМУ їв ие и джек дере о кчук ен испКОюка Кт УК дою

КІ суку Ху

МІС її МУ

Тек АХ о ек касу страви ММ

Клея пт

А АТАК ши т хчтисх лит ІКТ ще теє пад жу у МтрзгНа для сЖМкя аву Є,. ВКР БИКИЕКаєс дДевоспмамаю пЕстка КлукоМ КЕН Ви пзуєугух

ЛИВІ

Те У их ке дтуптчеде хг утх

Божу МУЗА КО ЖАХ ке яя 1 «СРС ІХХ мЕшаи АБ КАК тику трі уд м зх ТО ТУувау ші «ш КИМ КІМН КК ПИСК ТОЮ молі Ка «ап х ем в шиї 0 тро щильсхех мг м и у мем фе УМ пити УЮ мое ирис жиму тки ХО ВОЮ сома иутую звела бала хм ирахео звощчесоє чек її кн В НН А НН

Піди Вк В КІ АХ ІЕЕ КН МИХ а ху вн ни иА а ул

УМ п НА и в НН псесеавчизасо уазечзчслпаазва скоса сома смс Ес сплав ЇЇ тех

БВ ен нн а НН У а НН а я сти ттаи пасив аск коет с ціиКтск сао парти тпратгу я тжцезих вачів о жерці фари пу і дети піз опо зи хІкман В Ва Вина ешиха бок оУ цик НАМ З Імла п

ЗУ допов УМ с НК НН І НН НН я папчшинлка пазли пай КЗ шо зак ва о сума НаХх Фе ик сюди «ЕХО тт КтшеВ о т доіКи Ж зусиль б ек ке щу у и фани вух йкчЧчахкчжх сша списи баси имх ставиш сила ші ипімІ Ва

Ух шк чи йпелуєтсу р Ів Е пе лУЄТсВ ОВ І ТІ Фе Ере щу их ги ИФЛЮДЖю У є г ОБО Ім фрити дже ліом УМ пу

ПМД МУЮ КІ ЕАХу МСЗІДІАХУКІ Ехо ЖЕ - ті МІХ ча пАВ «МАХ КО «кущ ТММ И са

БИ

ЗУЄ звадцвЕаимек свтмф ви вики нич іву ЕВ суму ву бух моло по муку В вач ксотаЕАх факти сови сспва ин вача и ша код шо пити Бика У фрахт фот ук тво ділове що С преч у дреиеЕ

Зитажлимаки состава міні нуио міом пса АОС шок

КУ поч міг свт ув КК туги юри гори сухе ім КВ Кох му

МІНИ УЮД ЕК, МКІВЕУ ТО СЮ МНК НК КУ С Я шу ВХ КУ ех пра с КО КМ Ко

ЖІХуМ пи ан и НН НН НН п НН Я кисвасниєх себе жо Ех лайк спадом а ачеааае Кс ерленту сітудх

Ку юку В щує КІМ суп оц М ов Ім оц печинки призи ее ми Ме ерИи мих ху

ОК МЕИ СЕБЕ Мами Кам ОКУ Лео Я лих тво

Фостер допов оту В подрузі щу их дуичих

ХНН МУ МИТИ КК сплав се паз пд МОВИ ЗОВ тех ше мими піч Кемер ще дае в Кох др Кия

ЗБЕ ТАУКХХХ. ФМХлАЛЕММО веомтраг ай Криса пз СТАС А тугу

Нам чи я НК Я Код іфрттвини ум ку ю ю чадо задания вано виш мІнвавв лету я шок Кхх

ЗЕ ку поточ ко суттево Корчака (рез це ву; пу мовив ВВ Берк вч х пазу цим лам ких п пса шу бром тнувимар дпа СМОПІреамоит 1пла

ВУАН нн нн НН в НН НН Я пами ПОПИ М ЛК пови пять па Є Ал МА пдв

НЕВІН нн нн ни Нв ко Нв в НН ня чис ше кіиаа Ваша Мох ад УК КАК Фут зал 1155 «иЗІУх З шум ща

МАЯ мя ст ут ме

ЕК дик кю -і оче с по згухууєіх ж пожуми. шщт» чМмЕнрурдає теми УйМмаціУ пис емо МеКиНЯвя кхій БУВус, що жикиеває дефостпмамик лиш БІБеМЯМЬ ККУ

БАК Оеи

ТУ, Уфухмез уми чуми ух ви ПЕПУХКРКОЗЮ козу ту Ах УТА

ШЕ ЛК її ап п АК ж МУ,

Кене тзрмехЯ пухку кА, ручок лекиіких ОТО Ст

Мк МЗС лож хм БОС КОЮх мух КК кову рт ре лупи З пен нн НК и НН На а нн пошле «смак о меча клею Мам кнаци Бас щі ит УВІ пово ср ОБ ИТуВІЖЯКОМО фе хе ту мом вуж им ув ечет ку іч Бо саден ван КУ КІН иМма У сша левами «мем канах

ЗЕ

Жим пюре тк В вус КІ Кепи о правки викрив ви без ф зи оранж ха Пк ПІЧ Зх Гевазаенс ааспасимМ еле вагаи ще ї КЕНЕ АХ, т

АВМ фени ит сн пущі міх опе цих тки Ми Ж сзлревиритежтМіІВМ мит сх ММ Колух

КЛАНУ ХХ Млжалнох по лютизонах др смайчьстх хол Мавн су соМме г Ст дІц сив пава шик уд КО жим щу чіт ц фути цех ду КЕя ВАЛАХ О ЗІ УМ Вол пен УМХ ВК сим чт

УМХ тут тів их КК лю ви зх схузлі ім МІВ милує си Межі ючи отже УВІ ашФчоанізаш сіло сов снехтяе баках щен сера лан

КН

«КУ руслу ьо лих си ост дльг софори еВ овуУтУх фс В из ст с овите льних В ти пує тив зиИиданесмМпяму шині сума хм соски па як нн нн ни НН и о НК как шати їі мира зе кЦ Ук два сУнеуєа фрак пише

АК ке н ом н н С о ЗК м о и пив мм мата Клум Фан ма МаЕмих сама ММА

ОМ ух.

НУ темі до цім онмадии вІЦ Киів тб уко іч ват Вт

ПНО хую пе К хижа КОТИК КУ Хі вему МК СЯ МК МЛ ЛИИ ЕХ шт

САЕКНУ

ТМ жерщечи сим Белл Ммрую ума ее ддпль тім бегщ м планок х смс сСат Ковка Мми: аплпишіниМиЗ папи мося ху а ОНА

ЩО о о А А А В НАННЯ «мн клсвВаВс Фовоапав сеанс зІанеанаьес лчавичееа зеафахл є ге при ве е и же а срет ввКтвю Кцдав сні ви ке пече анти вищим ких юри ом о мВ ЯКИХ шов чому ПП Кс Вип яку ша Мк гу

СІК чи о ОК оку у у им, шк им. «Тра кю АНА ЛМ їх Уж зво фу Моди уже мух модтзлдют ко м ми ИЮТВ М их пф их шюрося слід МО хз Мою х х 5 гугл

За МИ КИ кішку чих Ва хх ТД КЛЕМ ХА Зо и год

По домі тем зе лУт ма ф усе а. ук ниви ших пом жо ев хво Брови

Фах стАнА мапи свому лика ММ пу КлНЯ К АЕЕИИХ

БЕН діеичжи несе ща колу тя д

ЛОЖКИ З кл ом

ЕД Ах туту

ТІ ту: тп «ЕХ НН

Юм ЯМУ «СУ ча піт їмтх оміджо мат мИих ск умли и ИдІМ ах ФІ ЕК Фа кря

Бак ХМІЗУЄс., ЩО пили МІМ ЛИПИ МУМаЦцлЛК писк о Ку ЖЕО Не НЕ слух

М х ех

КО у ВАХ

ШК ДОМ ПЕОМ се з : кути, кі зпоОцх

Хоші хи капи

Кос НА КИ ьо

Усне ІММОМИБлЛеНВт Кс сіно мм ЕМО

КУТ а Я З «ау й

ФІ юю соту ую ехо учи БМ ик укус озкУщІ МАКИ що уд

ФдапллянмУХ ЕМ КУМ пали митно МОБТМОСММІСЕЮ му а КОН ша пи

Вау оМ о Б/в окМ умі Мох Імют мМ У лує тт що мужик х фе и ит и

Болена мо люк синахо Мисма Злом дисахеасех мае в Коха ут

А феєю мм У Ми им мир и м ем УМ охо ми ВОК Бичок цІх

Коса тосвиет сли лнлг ол Форт НЮХ УК г ПІ МКМ МЕ КАЖУ ЄАВВЕ з ще

АЮ г а цтщірютий лук віудии щі где ва пт в км Кот аскисашемне ахшмманемт вена шцЗ сла га спо Ззиєесяа пейлайавке тях «ТЕХ вади ех тмтаивевих ий Ж зичу веди Фауст гу сш отити тм В Кз ет песню МК В ие сте Каф плен и ЯКО ОНКО з

БНН м нн НН НА А ин ема хахмІ Уха ША У ПК сне вне сем

Зо утік сито ик ст Ку рівитев ст щити щук сем пед Ко нець пр ат ХО и У ам сукна я Ух ї ПМ сакВЗ Зх ах

ЯН тлу же зо стих гриих пух ря ГУК Морзе ФІЛЬМ СЮ пф луєт і КК у склу Я пр их шляхи си: скеалаааацх Тл МЛМ МЕН КО иЖАНУМКО НечеЯ вас сИАм

ЗВ впчадеаові МЕ Ера к Ккал Богом сет пара ШИК ЧЕ Хна ОНИ МТМО ХИТ» КІН сМалим СЛ КМЦМХ под ме зов УЮ іх ОБОБОЮОЮ пткулутіим глухі охо пили ца житі ща фути мчав вич

Міна и КХП сана суму овача ваша сх МОМ ОЕМ КК ко

СОН пе а о А НН ПК о нн о В Ка списи м: плаща деазчєнчесв коса сухо ишяи пери

Оч

ТМ и ни и НН В и В и НН

Дсоштнавии іно пма сщиовлМх раю МІНІ пЯМІЄ Фр ЧаИмо писуху ти нн нн НН В А НН КН а виж я К САЖКЕИ ЛУ ФК Матер ТЕРПІВ иа БУМ ІВ КОХ рю же жем пок чи мом ом лі наміе фуд вот ВО ее фе ц ції УВІ ит оду Моз вИипІМи Само снах СОКИ кв Ул щі паска вах КН Х, трат ща слией ух ниві ткож том фени В рі сво вкажи укр сп Іти педа хв та ТК ХК т

МІК шт ж в шо р гу

Ж МИ но

ОУК Ж мякі

ЯК Ки ТЕТ ХУ

ДИЧИНИ счце

ФК ех її

Мк Мик

СУ фски их п тів ль УУФУМИХУ ВВІМІ ДУХ МДУ ОКА ИУМ. МЕ КУТУД УМХ

ОН пІУс. НБУ БИК ККУ ФОКІНА 15описжи глум КиОСпМюеи «хх слон маже кат. сти

Тс тіж ддеукек

Жити КМЗ х х «ку її ках

ШТ Ж ме ТМ лі

ТОМ ТА (іх ту лютх ттириїуч зуйк емо тт ріка риму ОТ чи ЕХ ІК КК ПОМ» сл ЗИ АКА

ТУ « вика х сала виз гриви поч г КО В стро е ОК пКу и хтів тр ют деки Оті ту. тплуУклесвов шелак САМОК КІ ТРАК Ву ОМ ЧЕКУ 2 рин НН НН я НН Я слава хі сема пвифонмаахУо ем іхуцмаа в пан вах за уж промові ав стали Войцех цевих сій щу пути Кого

ІМТ ХИ шНО ХАНА МЕ КА Ех а нн ни ко в и НН Е О а Ме Те М щле зх п

КМ спос; луу току хУжоВІМ М пе их БачезкМіІтвіІхУЄУ бі овІхоМово і Ме УЗВІЗ ЦІЯ МІВ промиту ваедчаФеєяк сла Короста село сив в хвала м д

Уже песвосстаце едасесммихр асввочесие шаїсвіскво осавищчває сепецчиоа пісзксФуєсв асузосчовоас асамссеак сеабосоови сс алей «ака сткочазаза савоссзаве безос сскосібипа ваза а ме шетижавци секта сук «122 ДНК сей ВІПУсС.

Що викликає дешеормеацію лиштва риУухих Жжеопави «а 5 певссоссас сел чєсіа пававзсоас азів к скін нуяа сах кполая пгвоище мшхпскисиа ваазвеєскат сс пізавии Бека сх

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. ДНК-конструкція, яка містить: (а) промотор, вибраний із групи, що складається з () полінуклеотиду, послідовність якого щонайменше на 85 відсотків ідентична послідовності нуклеїнової кислоти з ЕС ІЮО МО: 1, де вказаний полінуклеотид має промоторну активність у клітині рослини, (і) полінуклеотиду, що містить послідовність нуклеїнової кислоти з БЕО ІЮО МО: 1, (ії) полінуклеотиду з ЗЕО ІЮ МО: 1, та (м) фрагмента з 5ЕО ІЮО МО: 1, де вказаний фрагмент має промоторну активність у клітині рослини; та (Б) гетерологічну молекулу полінуклеотиду, що транскрибується, функціонально пов'язану з промотором.

2. ДНК-конструкція за п. 1, де промотор має щонайменше 90 відсотків ідентичності послідовності з послідовністю нуклеїнової кислоти з ЗЕО ІЮ МО: 1.

З. ДНК-конструкція за п. 1, де промотор має щонайменше 95 відсотків ідентичності послідовності з послідовністю нуклеїнової кислоти з ЗЕО ІЮ МО: 1.

4. ДНК-конструкція за п. 1, яка містить: (а) промотор, вибраний із групи, що складається з () полінуклеотиду, послідовність якого щонайменше на 85 відсотків ідентична послідовності нуклеїнової кислоти з 5ЕО ІЮО МО: 2, де вказаний полінуклеотид має промоторну активність у клітині рослини, (і) полінуклеотиду, що містить послідовність нуклеїнової кислоти з БЕО ІЮО МО: 2, (ії) полінуклеотиду з ЗЕО ІЮ МО: 2, та (м) фрагмента з 5ЕО ІЮО МО: 2, де вказаний фрагмент має промоторну активність у клітині рослини; та (Б) гетерологічну молекулу полінуклеотиду, що транскрибується, функціонально пов'язану з Зо промотором.

5. ДНК-конструкція за п. 1, яка містить: (а) промотор, вибраний із групи, що складається з () полінуклеотиду, послідовність якого щонайменше на 85 відсотків ідентична послідовності нуклеїнової кислоти з 5ЕСО ІЮО МО: 3, де вказаний полінуклеотид має промоторну активність у клітині рослини, (і) полінуклеотиду, що містить послідовність нуклеїнової кислоти з БЕО ІЮО МО: 3, (ії) полінуклеотиду з ЗЕО ІЮ МО: 3, та

(м) фрагмента з 5ЕО ІЮО МО: 3, де вказаний фрагмент має промоторну активність у клітині рослини; та (Б) гетерологічну молекулу полінуклеотиду, що транскрибується, функціонально пов'язану з промотором.

6. ДНК-конструкція за п. 1, яка містить: (а) промотор, вибраний із групи, що складається з () полінуклеотиду, послідовність якого щонайменше на 85 відсотків ідентична послідовності нуклеїнової кислоти з 5ЕСО ІЮО МО: 4, де вказаний полінуклеотид має промоторну активність у клітині рослини, (і) полінуклеотиду, що містить послідовність нуклеїнової кислоти з БЕО ІЮО МО: 4, (ії) полінуклеотиду з ЗЕО ІЮ МО: 4, та (м) фрагмента з 5ЕО ІЮО МО: 4, де вказаний фрагмент має промоторну активність у клітині рослини; та (Б) гетерологічну молекулу полінуклеотиду, що транскрибується, функціонально пов'язану з промотором.

7. ДНК-конструкція за п. 1, яка містить: (а) промотор, вибраний із групи, що складається з () полінуклеотиду, послідовність якого щонайменше на 85 відсотків ідентична послідовності нуклеїнової кислоти з 5ЕСО ІЮО МО: 5, де вказаний полінуклеотид має промоторну активність у клітині рослини, (і) полінуклеотиду, що містить послідовність нуклеїнової кислоти з 5БЕО ІЮО МО: 5, (ії) полінуклеотиду з ЗЕО ІЮ МО: 5, та (м) фрагмента з 5ЕО ІЮО МО: 5, де вказаний фрагмент має промоторну активність у клітині рослини; та (5) гетерологічну молекулу полінуклеотиду, що транскрибується, функціонально пов'язану з промотором.

8. ДНК-конструкція за будь-яким із пп. 1-7, де гетерологічна молекула полінуклеотиду, що транскрибується, являє собою ген, що становить агрономічний інтерес.

9. ДНК-конструкція за п. 8, де гетерологічна молекула полінуклеотиду, що транскрибується, Зо являє собою ген, здатний забезпечувати у рослин стійкість до гербіцидів.

10. ДНК-конструкція за п. 8, де гетерологічна молекула полінуклеотиду, що транскрибується, являє собою ген, здатний забезпечувати у рослин контроль шкідників рослин.

11. Трансгенна рослина або клітина рослини, стабільно трансформована ДНК-конструкцією за будь-яким із пп. 1-10.

12. Трансгенна рослина або клітина рослини за п. 11, де трансгенна рослина або клітина рослини є дводольною рослиною або клітиною рослини.

13. Трансгенна рослина або клітина рослини за п. 11, де трансгенна рослина або клітина рослини є однодольною рослиною або клітиною рослини.

14. Насінина трансгенної рослини за п. 11, де насінина містить вказану ДНК-конструкцію.

її І ія Ку зл «уже т що ї 7 Я ХУ,

З. УК (Ще ГУ пд ; о и зви блоки ЖИ а ахужтини шия ем й З в

М. я "Стебле-петля" ин м З Регуляторний елемент ШОАМ НМ. коротка В Припуститмий ділянна ОЛЕ З Ї ТАТА бокс Щ- х й 7 ОКЕ 1 3326 ЛФ рн 34130 йх - пехеююютттттттттнкюттньттккнкнккнннчянннннннннкннннннння 904 по. нн 885 по. ооо овнннни 443 " 2. ТО М во -

Фіг. 1 сттасчусктксзаЗависассакусеуївВетеватоусосксвЕссаусьчестахзсизассозуссксю

ЦП.рАМТКІ1 1130 п, о. засасадовдстосдавдваєце т совок асасвяаза сват кс вдааеваа айпззсччсачасстатаскосвазазсові за сізаавносс сі севаксвассгзаазава саке ткозавсссвеацовчсссаззачанавцькосассстосзчазствосссвцурсоссссвазувазокца ЦПОАМ ТІ 904 п. о. ПОрАМ ТКЗ 885 п. 3. сасассадасосавасає косо ууввоасксас вва; касаздуссдсвададе раєсваовх, чзавсзвесусаксдвассасесеокесаєссассовадаузавва сс аачео пола савс скоса соваає чессвоассссзачассзснааазасасссврокксавосассозксвавасавоссасссавчаесобаа тстстсуачззуйа кс сесоссессівавозувсазозацазаїсісазоствессачасзавачсаса сх заазастссзвуїсввчвавакссвствовавссесвсоваовосаксссацабуучсазававовазусаа ве вач сатскозссвзсвхсассатвсзваєсасацогсасссозачаздайсоззсасоачесукссва асзззссадпавоуєссасассіпазастсавоаасстзавдаассвзсчсссазвазааєтоватсач иа ПОдДУ Та 444 п, о. овдкадасовттзаєссвасвацанацаккадастткковснавсткаєстодавкасаатхктоасяа стгсаваассссссзаассасісвуєсасзауссасзеуоваскЗвЕЕссссісссссаззазазастваг зааїссаттатчазсістузассссассакссасісабатсосазаацесаказачаазаваау сао чвавсас ацстдсстсазавстоаосанаоусаааауусстазсавазасоудвсзсосладвазастстосоасааосяє ШРАМ ТК5 113 п. о. сесовісвсковасквакахадссаотатссаг са садсавьсасованаасаєт сова авто састссскакостатааззучкозакевев етос дцнасдасатстьсоаваскачеова сосок ксадазазкстако кс каа Касове

Фіг. 2 ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601 Зо