CN117683781A - OsCSLE6基因在调控水稻抗旱性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了OsCSLE6基因在调控水稻抗旱性中的应用，涉及基因工程技术领域，其技术要点为：所述OsCSLE6基因的序列如SEQ ID NO:1所示的DNA序列；或与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列；或功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段，本发明通过基因编辑产生的突变体植株可以显著提高水稻苗期和成株期抗旱性，表明该基因是一个负调控水稻抗旱性的基因，可以用于改良栽培稻抗旱性。

Description

OsCSLE6基因在调控水稻抗旱性中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及OsCSLE6基因在调控水稻抗旱性中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa.L)是中国重要的粮食作物之一，水稻产量对中国的粮食安全至关重要。水稻长期淹水生长，生长发育过程消耗了大量的水资源。但是，中国人均水资源仅为世界水平的四分之一，属于绝对缺水国家。中国水稻生产正面临着严重的水资源短缺的危机，发掘水稻抗旱基因，改良水稻抗旱性，对于确保水稻在面临干旱条件是稳产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供OsCSLE6基因在调控水稻抗旱性中的应用，目的在于改良水稻抗旱性。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种水稻OsCSLE6基因的应用，所述OsCSLE6基因的序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段；或
与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA片段；或
功能相当于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列亚片段。
在一些实施案例中，所述应用为OsCSLE6基因编码的蛋白在调控水稻抗旱性中的应用。
在一些实施案例中，所述OsCSLE6基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；或
所述OsCSLE6基因编码的蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:11的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体和诱导突变体中的一种。
本发明还提供了一种上述基因或蛋白相关的生物材料在水稻抗旱性中的应用，所述生物材料如下任一所示：
a)含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1的DNA片段的表达盒，或含有与SEQ ID NO:1的至少90％同源的DNA片段的表达盒；
b)含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段重组载体，或含有与SEQ ID NO:1的至少90％同源DNA片段的重组载体；优选地，所述重组载体为基因敲除载体、敲减载体、敲入载体或过表达载体；
c)含有b)所述的重组载体的重组微生物、重组细胞、转基因植物组织或转基因植株；
d)如c)所述的转基因植株的可再生细胞的组织培养物或原生质体。
在一些实施例中，构建所述的重组载体所使用的质粒为Ti质粒或植物病毒载体。
本发明还提供一种基于CRISPR/Cas9技术的OsCSLE6基因敲除突变体，所述的OsCSLE6基因敲除突变体由以下步骤制备得到：设计1个sgRNA和对应的靶点序列引物，所述sgRNA靶点核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；利用PCR扩增的方法构建所述的OsCSLE6基因应用于生产具有抗旱性转基因植物的引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；
将sgRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到含靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体；
将上述含有靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化农杆菌，然后转化水稻愈伤组织，得到水稻OsCSLE6基因突变体KO植株
本发明还提供了一种改良水稻抗旱性的育种方法，筛选包含权利要求1所含的OsCSLE6基因的水稻。
在一些实施例中，所述育种方法为：构建如上述的重组基因编辑载体，并培育OsCSLE6基因发生突变水稻植株。
以下是本发明涉及到的序列：
SEQ ID NO：1(OsCSLE6核苷酸序列)：
ATGGAGACGACGACGACGGAGAGGCGGCGGCTGTTCGCGACGGAGAAGGTGGGCGGCAGGGCGGTGTACAGGCTGCAGGCGGCGACGGTGGCCGCCGGGATACTGCTGGTGCTCTACTACAGGGCGACGCGCGTGCCGGCCGCCGGCGAAGGGCGGGCGGCGTGGCTGGGGATGGCGGCGGCGGAGCTCTGGTTCGCCGTCTACTGGGTCATCACGCAGTCCGTCCGGTGGTGCCCCGTCCGCCGCCGCACCTTCAAGAACAGGCTCGCCGAGAGATACAAAGAAAATCTACCTGGTGTGGATGTTTTTGTATGCACTGCAGACCCACACGCAGAGCCACCAAGCCTTGTCATCTCTACCATCCTATCAGTCATGGCATACAATTACCCATCAGAAAAAATAAGTGTGTATCTTTCTGATGATGGTGGTTCAATTCTTACTTTCTACGCTCTATGGGAGGCATCCATGTTTGCAAAGAAATGGCTACCATTCTGCAGAAGATATAACATTGAGCCAAGGTCCCCAGCTGCTTACTTCTCGGAATCAGAAGGGCATCACAATCTGTGCTCCCCAAAAGAATGGTCATTTATCAAGAACCTGTATGAAGAAATGAGAGAGAGAATTGATTCGGCTGTCATGTCAGGAAAAATTCCTGAAGAAATTAAACTAAAGCATAAAGGATTTGATGAATGGAACTCGGAAATGACCTCAAAAAATCACCAGCCAATTGTTCAGGTTCTGATAGATGGGAAAAGCCAAAATGCAGTTGATGACGACGGAAATGTGCTACCAACACTGGTATACATGGCGCGCGAGAAGAGCCCTCAGTATCACCATAACTTCAAAGCCGGGGCATTGAACGCTTTGATAAGGGTATCAGCACTGATAAGTGACAGCCCTGTTATCTTGAATGTGGACTGTGACATGTATTCCAACAATAGTGATTCAATCAGAGATGCGTTGTGCTTCTTCCTTGATGAAGAAATGAGCCACAAAATTGGATTTGTCCAGTATCCTCAGAACTACAACAATATGACCAAAAATAATATATATGGGAACTCTCTCAATGTTATCAATCATGTGGAGATGCGTGGTTTGGACAGTGCTGGTGGATGTCTCTATATTGGCACAGGATGCTTCCATAGAAGAGAGATCCTTTGTGGTAAGAAATTCAGCAAAGATTACAAGGAAGACTGGGGCAGAGGAATAAAGGAAAGAGGACATGAGAACATAGATGAGATTGAAGAGAAGGCAAAATCTTTAGCAACCTGCACTTATGAACTTAGGACACAATGGGGCAATGAGATTGGAGTGAAATATGGTTGCCCAGTAGAGGATGTCATCACTGGATTGGCAATACATTGCCGAGGATGGGAGTCAGTCTACATGGAACCTCAAAGGGCAGCATTTGTGGGTGTAGCTCCAGCAACACTTGCCCAGACAATACTGCAACACAAGAGATGGAGTGAGGGCAATTTCACAATTTTTCTTTCAAAGCACAACACCTTCCTGTTTGGACATGGAAAAATCAGCTTGCAGTTACAGATGGGCTACTGCATATATGGATTATGGGCAGCCAATTCACTGCCTACAATCTACTATGTTATGATTCCAGCACTAGGTCTTGTCAAAGGCACTCCCCTATTTCCAGAGATTATGAGTCCATGGGCTACACCCTTCATATATGTATTTTGTGTGAAGACCCTCTACAGTCTTTATGAGGCATTATTATCTGGGGATACATTGAAAGGATGGTGGAATGGACAAAGGATGTGGATGGTGAAAAGAATTACCTCATATCTATATGGCTTCATTGACACCATCCGAAAATTGTTAGGATTGTCAAAGATGTCATTTGAAATTACAGCAAAGGTAAGTGATGGCGATGAAGCAAAGAGGTATGAGCAAGAAATCCTTGAGTTTGGGTCATCATCTCCTGAATTTGTGATCATCGCAACTGTCGCATTACTGAACTTCGTCTGCCTAGTTGCAGGGCTAAGCAAAATAATGGCAGGTGTGTGGAATGTGTTTTTACCCCAGGTCATTCTATGTGGACTGATAGTGATCACTAATATCCCAATTTATGAGGCAATGTTTGTGAGAAAGGATAAGGGGAGAATACCATTACCAGTCACACTAGCTTCAATTGGCTTTGTAATGTTGGCATTCCTGTTACCAATAGTTTGA
SEQ ID NO：2(sgRNA靶点序列)：
5’-GATTCCGAGAAGTAAGCAGCTGG-3’
SEQ ID NO：3(casOsCSLE6-F引物序列)：
5’-CCACCAAGCCTTGTCATCTC-3’
SEQ ID NO：4(casOsCSLE6-R引物序列)：
5’-TACCGAAACCTAGGGGAACC-3’
SEQ ID NO：5(OsCSLE6ko1核苷酸序列)：
ATGGAGACGACGACGACGGAGAGGCGGCGGCTGTTCGCGACGGAGAAGGTGGGCGGCAGGGCGGTGTACAGGCTGCAGGCGGCGACGGTGGCCGCCGGGATACTGCTGGTGCTCTACTACAGGGCGACGCGCGTGCCGGCCGCCGGCGAAGGGCGGGCGGCGTGGCTGGGGATGGCGGCGGCGGAGCTCTGGTTCGCCGTCTACTGGGTCATCACGCAGTCCGTCCGGTGGTGCCCCGTCCGCCGCCGCACCTTCAAGAACAGGCTCGCCGAGAGATACAAAGAAAATCTACCTGGTGTGGATGTTTTTGTATGCACTGCAGACCCACACGCAGAGCCACCAAGCCTTGTCATCTCTACCATCCTATCAGTCATGGCATACAATTACCCATCAGAAAAAATAAGTGTGTATCTTTCTGATGATGGTGGTTCAATTCTTACTTTCTACGCTCTATGGGAGGCATCCATGTTTGCAAAGAAATGGCTACCATTCTGCAGAAGATATAACATTGAGCCAAGGTCCCCAGCTAGCTTACTTCTCGGAATCAGAAGGGCATCACAATCTGTGCTCCCCAAAAGAATGGTCATTTATCAAGAACCTGTATGA
SEQ ID NO：6(OsCSLE6ko1截断的氨基酸序列)：
METTTTERRRLFATEKVGGRAVYRLQAATVAAGILLVLYYRATRVPAAGEGRAAWLGMAAAELWF AVYWVITQSVRWCPVRRRTFKNRLAERYKENLPGVDVFVCTADPHAEPPSLVISTILSVMAYNYPSEKI SVYLSDDGGSILTFYALWEASMFAKKWLPFCRRYNIEPRSPASLLLGIRRASQSVLPKRMVIYQEPV*
SEQ ID NO：7(OsCSLE6ko2核苷酸序列)：
ATGGAGACGACGACGACGGAGAGGCGGCGGCTGTTCGCGACGGAGAAGGTGGGCGGCAGGGCGGTGTACAGGCTGCAGGCGGCGACGGTGGCCGCCGGGATACTGCTGGTGCTCTACTACAGGGCGACGCGCGTGCCGGCCGCCGGCGAAGGGCGGGCGGCGTGGCTGGGGATGGCGGCGGCGGAGCTCTGGTTCGCCGTCTACTGGGTCATCACGCAGTCCGTCCGGTGGTGCCCCGTCCGCCGCCGCACCTTCAAGAACAGGCTCGCCGAGAGATACAAAGAAAATCTACCTGGTGTGGATGTTTTTGTATGCACTGCAGACCCACACGCAGAGCCACCAAGCCTTGTCATCTCTACCATCCTATCAGTCATGGCATACAATTACCCATCAGAAAAAATAAGTGTGTATCTTTCTGATGATGGTGGTTCAATTCTTACTTTCTACGCTCTATGGGAGGCATCCATGTTTGCAAAGAAATGGCTACCATTCTGCAGAAGATATAACATTGAGCCAAGGTCCCCAGCTTGCTTACTTCTCGGAATCAGAAGGGCATCACAATCTGTGCTCCCCAAAAGAATGGTCATTTATCAAGAACCTGTATGA
SEQ ID NO：8(OsCSLE6ko2截断的氨基酸序列)：
METTTTERRRLFATEKVGGRAVYRLQAATVAAGILLVLYYRATRVPAAGEGRAAWLGMAAAELWF AVYWVITQSVRWCPVRRRTFKNRLAERYKENLPGVDVFVCTADPHAEPPSLVISTILSVMAYNYPSEKI SVYLSDDGGSILTFYALWEASMFAKKWLPFCRRYNIEPRSPACLLLGIRRASQSVLPKRMVIYQEPV*
SEQ ID NO：9(OsCSLE6ko3核苷酸序列)：
ATGGAGACGACGACGACGGAGAGGCGGCGGCTGTTCGCGACGGAGAAGGTGGGCGGCAGGGCGGTGTACAGGCTGCAGGCGGCGACGGTGGCCGCCGGGATACTGCTGGTGCTCTACTACAGGGCGACGCGCGTGCCGGCCGCCGGCGAAGGGCGGGCGGCGTGGCTGGGGATGGCGGCGGCGGAGCTCTGGTTCGCCGTCTACTGGGTCATCACGCAGTCCGTCCGGTGGTGCCCCGTCCGCCGCCGCACCTTCAAGAACAGGCTCGCCGAGAGATACAAAGAAAATCTACCTGGTGTGGATGTTTTTGTATGCACTGCAGACCCACACGCAGAGCCACCAAGCCTTGTCATCTCTACCATCCTATCAGTCATGGCATACAATTACCCATCAGAAAAAATAAGTGTGTATCTTTCTGATGATGGTGGTTCAATTCTTACTTTCTACGCTCTATGGGAGGCATCCATGTTTGCAAAGAAATGGCTACCATTCTGCAGAAGATATAACATTGAGCCAAGGTCCCCAGCTGGCTTACTTCTCGGAATCAGAAGGGCATCACAATCTGTGCTCCCCAAAAGAATGGTCATTTATCAAGAACCTGTATGA
SEQ ID NO：10(OsCSLE6ko3截断的氨基酸序列)：
METTTTERRRLFATEKVGGRAVYRLQAATVAAGILLVLYYRATRVPAAGEGRAAWLGMAAAELWF AVYWVITQSVRWCPVRRRTFKNRLAERYKENLPGVDVFVCTADPHAEPPSLVISTILSVMAYNYPSEKI SVYLSDDGGSILTFYALWEASMFAKKWLPFCRRYNIEPRSPAGLLLGIRRASQSVLPKRMVIYQEPV*
SEQ ID NO：11(OsCSLE6正常表达的氨基酸序列)：
METTTTERRRLFATEKVGGRAVYRLQAATVAAGILLVLYYRATRVPAAGEGRAAWLGMAAAELWFAVYWVITQSVRWCPVRRRTFKNRLAERYKENLPGVDVFVCTADPHAEPPSLVISTILSVMAYNYPSEKISVYLSDDGGSILTFYALWEASMFAKKWLPFCRRYNIEPRSPAAYFSESEGHHNLCSPKEWSFIKNLYEEMRERIDSAVMSGKIPEEIKLKHKGFDEWNSEMTSKNHQPIVQVLIDGKSQNAVDDDGNVLPTLVYMAREKSPQYHHNFKAGALNALIRVSALISDSPVILNVDCDMYSNNSDSIRDALCFFLDEEMSHKIGFVQYPQNYNNMTKNNIYGNSLNVINHVEMRGLDSAGGCLYIGTGCFHRREILCGKKFSKDYKEDWGRGIKERGHENIDEIEEKAKSLATCTYELRTQWGNEIGVKYGCPVEDVITGLAIHCRGWESVYMEPQRAAFVGVAPATLAQTILQHKRWSEGNFTIFLSKHNTFLFGHGKISLQLQMGYCIYGLWAANSLPTIYYVMIPALGLVKGTPLFPEIMSPWATPFIYVFCVKTLYSLYEALLSGDTLKGWWNGQRMWMVKRITSYLYGFIDTIRKLLGLSKMSFEITAKVSDGDEAKRYEQEILEFGSSSPEFVIIATVALLNFVCLVAGLSKIMAGVWNVFLPQVILCGLIVITNIPIYEAMFVRKDKGRIPLPVTLASIGFVMLAFLLPIV*
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明利用CRISPR/Cas9技术创制的OsCSLE6功能缺失突变体植株，可以提高转基因植株在干旱胁迫条件下的苗期存活率，提高成株期抗旱性。可以应用于改良栽培稻的抗旱性。
附图说明
图1是本发明实施例中OsCSLE6基因基于CRISPR/Cas9技术创制的敲除突变体基因序列；
图2是本发明实施例中OsCSLE6基因敲除突变体与野生型在20％PEG6000模拟干旱胁迫的表现；
图3是本发明实施例中OsCSLE6基因敲除突变体与野生型抗旱大棚里成株期抗旱表现。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
在本文中，术语“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明还包括能编码具有OsCSLE6相同功能的蛋白的SEQ ID NO:1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5和/或3端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，还包括具有与OsCSLE6相同功能的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh,1970)分析(GCG程序)确定，其中参数gap creationpenalty＝5，gap extension penalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。
通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
本发明所分离出的多核苷酸，包括但不限于：SEQ ID NO:1编码OsCSLE6基因的核苷酸序列；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO:1中从核苷酸第1-2187位的核苷酸序列杂交；或者其功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的OsCSLE6基因作为探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因，也可以直接采用基因合成的方法合成。同样也可以采用PCR(polymerase chainreaction)技术，从基因组、cDNA中扩增得到本方面的OsCSLE6基因以及任何一段DNA或其同源的一段DNA。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，携带本发明的核酸序列的重组表达载体可以使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'、5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段，然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段，然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
其它新发展的技术利用同源重组方法，将携带有特定序列接头或同源序列接头的多核苷酸与载体进行同源重组，将欲插入载体DNA内的DNA区段与同样携带有特定序列或同源序列的载体通过重组酶的作用形成重组DNA分子。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上，启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子；其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA,UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括编码抗生素的抗性基因，例如：新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphotransferase)基因nptⅡ、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因hpt和二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase)基因dhfr；另一类是编码除草剂抗性基因，例如，草丁膦乙酰转移酶(Phosphinothricin acetyltransferase)基因Bar、5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶(5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因epsps。适当宿主的代表性例子包括但不限于：原生质体细胞和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
目的基因或目的多核苷酸的转化方法：一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。
本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞或生物体。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明所述核苷酸序列的重组载体的细胞或生物体。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面通过实施例对本发明进行详细介绍：
实施例1水稻基因OsCSLE6的基因编辑载体构建和遗传转化
1)靶基因编辑载体的构建：
对于利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的OsCSLE6基因载体的构建，利用CRISPR-P 2.0工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计sgRNA靶点为：5’-GATTCCGAGAAGTAAGCAGCTGG-3’(SEQ ID NO:2)，然后参照已发表的CRISPR/Cas9基因编辑系统提供的方法进行基因编辑载体的构建，最后将U6启动子和sgRNA表达盒装载入表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H中。构建好的质粒转化农杆菌EHA105，进行水稻愈伤组织转化实验。
2)水稻遗传转化
2.1种子消毒
成熟的日本晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75％酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗2次；再用3％NaClO消毒30min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(NB+2,4-D 3.0mg/L)上，每皿约30粒，于28℃暗培养。
2.2继代培养
经过近1月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(NB+2,4-D 2.0mg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
2.3农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，acetosringone，终浓度100uM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基(含AS100uM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600＝0.5-1，此时可用来转化愈伤组织。
2.4共培养
将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+AS100uM)上，28℃暗培养三天。
2.5洗菌
共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3-5遍，再浸泡在含Cef400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
2.6筛选培养
将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(NB+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef400 mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(NB+2,4-D 2.0mg/L+Hyg50mg/L+Cef250 mg/L)上，再选择2周。
2.7分化培养
将经2次筛选得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef200mg/L+琼脂9g/L+蔗糖45g/L)上暗培养10天左右，再转到分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA2.0 mg/L+Hyg30mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。
2.8生根培养
约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS+Hyg15mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。
2.9转基因苗的移栽
当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
实施例2OsCSLE6基因编辑突变体的筛选
对于CRISPR/Cas9编辑的OsCSLE6基因T0代单株利用一代测序进行鉴定。利用快速提取DNA方法对T0代单株基因组DNA进行抽提，针对sgRNA编辑位点两侧设计引物casOsCSLE6-F:5’-CCACCAAGCCTTGTCATCTC-3’(SEQ ID NO:3)；casOsCSLE6-R:5’-TACCGAAACCTAGGGGAACC-3’(SEQ ID NO:4)，扩增片段覆盖编辑位点区域，对PCR产物进行测序。以日本晴靶位点序列为参考序列与所有的扩增编辑位点区域进行多序列比对，确定发生基因组编辑的纯合单株。根据测序结果，如图1所示多序列比对结果，突变类型分别为sgRNA作用的靶位点处插入1个碱基A(OsCSLE6ko1，SEQ ID NO:5)，导致移码突变，引起转录本提前终止，形成201个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:6)；插入1个碱基T(OsCSLE6ko2，SEQ IDNO:7)，导致移码突变，引起转录本提前终止，形成201个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:8)；插入1个碱基G(OsCSLE6ko3，SEQ ID NO:9)，导致移码突变，引起转录本提前终止，形成201个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:10)；三者突变产生的氨基酸序列相互间存在一个氨基酸差异。其与OsCSLE6基因(SEQ ID NO.1)正常表达得到的蛋白序列(SEQ ID NO:11)不一致。
实施例3OsCSLE6基因调控水稻苗期抗旱性
选取了实施例2中OsCSLE6基因编辑纯合突变体T2代株系OsCSLE6ko1，OsCSLE6ko2，OsCSLE6ko3，利用PEG-6000(聚乙二醇)模拟干旱胁迫，鉴定突变体与野生型材料的苗期抗旱性。具体步骤如下，将水稻种子浸种、催芽，种植于培养架上，使用水稻营养液进行水培至三叶一心期，加入含有20％PEG-6000水稻营养液处理10天，然后复水2天后统计存活率。结果显示，经历干旱胁迫处理后(图2)，野生型植株存活率为：49.9％；三个突变体株系存活率分别为：85.4％，89.6％，85.4％.OsCSLE6突变体植株的存活率极显著高于野生型植株，表明敲除OsCSLE6基因可以显著提高水稻苗期抗旱性。
实施例4OsCSLE6基因调控水稻成株期抗旱性
选取了实施例2中OsCSLE6基因编辑纯合突变体T2代株系OsCSLE6ko1，OsCSLE6ko2，OsCSLE6ko3种植于海南陵水转基因基地。分别设置水、旱两种处理。育秧1个月后开始插秧，插秧20天后旱处理材料开始干旱胁迫处理。成熟后收种测定水、旱条件下的产量，评价其抗旱性。研究发现在正常水田条件下OsCSLE6的突变体植株的单株产量与野生型植株的单株产量无差异；但是干旱条件下OsCSLE6的突变体植株的单株产量极显著高于野生型植株的单株产量，表明OsCSLE6负调控水稻抗旱性(图3)。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.OsCSLE6基因在调控水稻抗旱性中的应用，其特征在于：所述OsCSLE6基因的序列选自：
SEQ ID NO:1所示的DNA序列；或
与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列；或
功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。
2.OsCSLE6基因编码的蛋白在调控作物抗逆性中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或者所述蛋白为由权利要求1所述的OsCSLE6基因编码得到。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述水稻OsCSLE6基因为SEQ ID NO:1所示的DNA序列基于CRISPR/Cas9技术的敲除突变体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述敲除突变体为突变体转录本1、突变体转录本2或突变体转录本3；
所述突变体转录本1基因序列如SEQ ID NO:5所示，所述突变体转录本2基因序列如SEQID NO:7所示，所述突变体转录本3基因序列如SEQ ID NO:9所示。
5.OsCSLE6基因编码的蛋白在调控水稻抗旱中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或者为所述SEQ ID NO:11序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体中的一种，或所述蛋白由权利要求1-4任一项所述水稻OsCSLE6基因编码得到。
6.一种调控水稻OsCSLE6基因的基因编辑系统，其特征在于：包括sgRNA靶点序列和重组载体：所述sgRNA靶点序列如SEQ ID NO:2所示。
7.根据权利要求6所述的水稻OsCSLE6基因的定点编辑系统，其特征在于：所述重组载体为线性化pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体。
8.根据权利要求6所述的水稻OsCSLE6基因的定点编辑系统，其特征在于：所述重组载体为Ti质粒载体或植物病毒载体。
9.一种工程菌，其特征在于：所述工程菌为含有权利要求6-8任一项所述的水稻OsCSLE6基因的定点编辑系统。
10.一种抗旱性水稻，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的水稻OsCSLE6基因或权利要求5所述的OsCSLE6基因编码的蛋白。
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