CN101503690A

CN101503690A - 用rdl1基因促进植物种子增大和棉纤维增长的方法

Info

Publication number: CN101503690A
Application number: CNA2008100335372A
Authority: CN
Inventors: 陈晓亚; 徐冰; 缑金营; 上官小霞; 毛颖波; 林芝萍; 王凌健
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2008-02-04
Filing date: 2008-02-04
Publication date: 2009-08-12
Anticipated expiration: 2028-02-04
Also published as: WO2009100674A1; BRPI0907472B1; BRPI0907472A8; BRPI0907472A2; CN101503690B

Abstract

本发明提供了一种植物RDL1基因或RDL1蛋白在改良作物种子性状中的用途和改良作物种子性状的方法。具体而言，本发明提供了一种利用植物RDL1基因促进作物种子增大和棉纤维增长的基因工程方法。本发明还提供了含有RDL1基因的载体和宿主细胞，以及制备转基因植物的方法和利用该转基因植物获得具有改良性状种子的方法。本发明的方法可使得种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、和/或种子纤维强度增大，对于提高农作物产量和性状具有积极作用，具有广泛的应用前景。

Description

用RDL1基因促进植物种子增大和棉纤维增长的方法

技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及棉纤维特异表达基因RDL1 cDNA的分离以及过量表达载体的构建，以及通过转入RDL1基因来促进转基因作物的种子增大和纤维增长等优良性状的方法。

背景技术

作物种子是粮、棉、油等农业和工业中重要的原料，其性状直接关系到种子的品质及其后加工产品的质量。这些性状主要包括种子体积的大小、种子的重量、种子纤维的长度(对于利用种子纤维)和/或种子纤维的强度。

棉花是一种重要的经济作物，棉纤维是纺织工业重要的原材料。2006年全年世界共生产2522万吨棉花，其中我国的产量为673万吨。棉纺织工业对棉纤维的品质要求越来越高，如纤维更长、硬度更强、纤维更细并且更整齐，因此提高棉花的质量和产量至关重要。棉纤维发育是一个高度程序化的调控过程，提高棉纤维的品质是棉花育种研究的一个主要目标。

棉纤维是由胚珠表皮细胞经分化、发育形成的单细胞纤维，其发育过程可分为4个时期：纤维发育的起始期、伸长期、次生壁增厚期和成熟期，其中伸长期与次生壁增厚期具有相互重叠的时域。在这4个时期中，纤维细胞形态结构改变，伴随着重要生理生化过程，其间有大量基因参与纤维发育过程的调控。研究这些基因的表达以及调控具有重要的意义。

目前已在多种棉花品种中发现了与拟南芥RD22具有高度同源性的基因，例如GhRDL1(Gossypium hirsutum RD22-likel)是一个在棉纤维伸长期特异高表达的基因，其编码一个含有335个氨基酸残基的蛋白，与拟南芥的RD22蛋白高度同源。GhRDL1蛋白C端含一个植物特有的BURP结构域的蛋白，对此功能研究较少。

本领域迫切需要找到有效的手段，对作物种子的性状进行改良，以实现粮、棉、油等作物种子产量和品质的提高。

发明内容

本发明的目的就在于利用植物RDL1基因，尤其是棉花RDL1基因来改良作物种子的性状，从而提高作物种子的品质。

在本发明的第一方面提供了一种植物RDL1基因或其编码的RDL1蛋白在改良作物种子性状中的用途。

在一个实施方式中，所述植物RDL1基因为棉花RDL1基因。

在一个实施方式中，所述植物RDL1基因的序列选自：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5；或

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交且具有改良作物种子性状的活性的分子。

在另一个实施方式中，所述RDL1蛋白的序列选自：

(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6；或

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有改良作物种子性状的活性的由(a)衍生的蛋白质。

在另一个实施方式中，所述作物种子性状的改良包括：种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、和/或种子纤维强度增大。

在另一个实施方式中，所述作物为双子叶植物或单子叶植物。

在一个优选例中，所述作物选自：禾本科作物、锦葵科棉属作物、十字花科芸苔属作物，优选棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱，更优选棉花或油菜，最优选为棉花。

在本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体含有植物RDL1基因。

在一个优选例中，所述载体中含有棉花RDL1基因。

在一个优选例中，所述RDL1基因的序列选自：(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5；或(b)在严格条件下与(a)限定的DNA序列杂交且具有改良作物种子性状的活性的DNA分子。

在一个优选例中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、或哺乳动物细胞病毒，优选pEGFP-1、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301、或pBI121。

在本发明的第三方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的载体。

在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，更优选大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母菌，最优选农杆菌。

在本发明的第四方面，提供了一种制备转基因作物的方法，所述方法包括：

(1)提供含有RDL1基因的载体；

(2)提供携带步骤(1)中的载体的宿主细胞；

(3)将植物细胞或组织与步骤(2)中的宿主细胞接触，从而使RDL1基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(4)选择转入RDL1基因的植物细胞、组织或器官；和

(5)将步骤(4)中的植物细胞、组织或器官再生成植株，

其中所述转基因作物的种子具有改良的性状。

在一个优选例中，所述RDL1基因为棉花RDL1基因。

在一个优选例中，所述宿主细胞为农杆菌。

在另一个优选例中，所述作物选自：禾本科作物、锦葵科棉属作物、十字花科芸苔属作物，优选棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱，更优选棉花或油菜，最优选为棉花。

在本发明的第五方面中，提供了用本发明方法制得的转基因作物的用途，所述转基因作物用于产生具有改良的性状的作物种子。

在一个优选例中，所述改良的性状包括：种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、和/或种子纤维强度增大。

在另一优选例中，所述作物为棉花。

在本发明的第六方面中，提供了一种生产具有改良性状的作物种子的方法，所述方法包括：提高所述作物中RDL1基因的表达水平。

在一个优选例中，通过将RDL1基因的转入所述作物并使该基因表达来提高所述作物中RDL1基因的表达水平。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)将RDL1基因通过转基因的方法转入所述作物并且使所述基因整合到作物细胞的染色体上；

(ii)选择转入RDL1基因的植物细胞、组织或器官；和

(iii)将步骤(ii)中的植物细胞、组织或器官再生成植株，并利用该植株产生具有改良性状的作物种子。

在另一优选例中，所述改良的性状包括：使得种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、和/或种子纤维强度增大。

在另一优选例中，所述作物选自：禾本科作物、锦葵科棉属作物、十字花科芸苔属作物，优选棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱，更优选棉花或油菜，最优选为棉花。

在本发明的优选实施方式中采用了棉花RDL1基因或尤其编码的RDL1蛋白。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：GFP-GhRDL1转基因载体的构建。

图2：GFP-GhRDL1转基因棉花的分子鉴定。

图3：GFP-GhRDL1融合蛋白显示的GhRDL1亚细胞定位。其中，A为35S::GFP/GhRDL1，2DPA纤维；B为R15，2DPA纤维；C为35S::GFP/GhRDL1，叶片表皮毛。

图4：GFP-GhRDL1转基因棉花种子(T₂代)的百粒重(含纤维)分析。其中，A为种子的形态比较；B为种子百粒重的比较。

图5：GhRDL1转基因拟南芥的种子大小分析。图5A为种子的形态比较；图5B为种子长度和宽度的比较(Bar＝500μm)。

具体实施方式

本发明人对RDL1基因的结构、定位和功能等进行了长期而深入的研究，并构建了含RDL1基因的转基因载体，通过植物转基因技术获得了种子性状得到改良的植物，例如百粒重增加和纤维增长的转基因棉花，以及种子体积增大的转基因拟南芥。由此证明了RDL1基因与作物种子的性状有关，高表达该基因的植物的种子的性状可得到改良，诸如体积增大、重量提高、纤维增长、纤维强度提高等。在此基础上，本发明人完成了本发明。

具体而言，本发明人通过RDL1-GFP融合蛋白的亚细胞定位，明确了GhRDL1蛋白定位在细胞壁某些区域，且具有一定的极性分布。绿色荧光信号所在的细胞壁棱角处填充着富含果胶的多糖，而棉纤维迅速伸长阶段初生细胞壁的主要成分也是果胶，这一结果暗示GhRDL1的定位可能与细胞壁的果胶有关；此外，BURP与GFP的融合蛋白表现出类似的定位特征。

然后，发明人利用酵母双杂交的方法，筛选到GhEXPA1(Gossypiumhirsutum α-expansinl)蛋白可与GhRDL1蛋白相互结合。通过将GFP-GhRDL1和RFP-GhEXPA1融合蛋白共转化到拟南芥中，利用共聚焦显微镜观察拟南芥根部细胞，发现荧光信号集中在细胞壁上并且共定位。进一步通过Co-IP实验验证了这两个蛋白之间存在相互作用。

为了研究GhRDL1功能，发明人利用农杆菌介导的方法将35S::GFP-GhRDL1转化棉花，发现转基因棉花的种子体积较对照明显扩大。利用T₃代6d的棉花幼苗下胚轴，分析了转基因前后该组织的力学特征，结果表明拉断转基因植物下胚轴所需的平均作用力显著大于对照。田间种植的T₃代植物统计结果表明，大部分株系的单铃重量高于对照，百粒重增加，纤维长度高于对照。以上结果表明在棉花中过量表达GFP-GhRDL1融合蛋白可促进了棉花纤维和胚珠的发育，对于棉花改良具有重要价值。

RDL1编码基因及蛋白

如本文所用，“植物RDL1基因”或“RDL1基因”可互换使用，是指一种与编码棉花RDL1蛋白序列高度同源的基因、或在严格条件下与所述基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对作物种子性状具有一定的改善作用，例如使种子体积增大、重量增加、纤维增长和/或纤维强度增大等。该定义中还包含在严格条件下与棉花RDL1基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。

如本文所用，术语“棉花RDL1基因”是指与编码拟南芥RD22蛋白的序列高度同源，该定义中包含在严格条件下与棉花RDL1基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，且优选所述基因在棉纤维伸长期特异性高表达。例如，陆地棉RDL1编码基因(GhRDL1)编码一个含有335个氨基酸残基、C末端含一个植物特有的BURP结构域的蛋白。

NCBI已公开了RDL1及其同源基因的序列，例如AY072821[(Li C-H，Gossypium hirsutum dehydration-induced protein RD22-like protein(RDL)mRNA，complete cds。“陆地棉脱水诱导蛋白RD22样蛋白(RDL1)”mRNA、全长cds]；AY641990[Wang S，Gossypium arboreum dehydration-induced proteinRD22-like protein 1(RDL1)mRNA，RDL1-1allele，complete cds。“亚洲棉脱水诱导蛋白RD22样蛋白1(RDL1)”mRNA、RDL1-1等位基因、全长cds]；AY641991[Wang S Gossypium arboreum dehydration-induced protein RD22-likeprotein2(RDL2)mRNA，RDL2-2allele，complete cds，“亚洲棉脱水诱导蛋白RD22样蛋白2(RDL2)”mRNA、RDL1-1同源基因、全长cds]。这些基因均包括在本发明中。

本发明的RDL1基因可选自：(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5(其分别对应于AY072821、AY641990和AY641991)；或(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交且具有改良作物种子性状的活性的分子。如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的RDL1基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的RDL1基因优选获自棉花，获自其它植物的与棉花RDL1基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

在本发明中，术语“RDL1蛋白”指具有由本发明RDL1基因编码的的多肽，该定义中也包括具有改良植物种子性状功能的上述多肽的变异形式。本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明中RDL1蛋白优选由棉花RDL1基因或其同源基因或家族基因编码。本发明中RDL1蛋白的序列可选自：(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有改良作物种子性状的活性的由(a)衍生的蛋白质。

所述变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能，例如本发明的RDL1蛋白质可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有改良作物种子性状的活性。

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质。可利用编码所述蛋白质的编码序列来构建转基因植物，并观察该转基因植物中种子性状是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋白质(例如参照本发明实施例中的方法)。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括RDL1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RDL1蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗RDL1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含RDL1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了RDL1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有RDL1蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

作物种子及其性状

如本文所用，所述的“作物”是指在粮、棉、油等农业和工业中具有经济价值的植物，其经济价值主要体现在该植物的种子上。作物包括但不限于：双子叶植物或单子叶植物。优选的单子叶植物为禾本科植物，更优选水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。优选的双子叶植物包括但不限于：锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物等，更优选棉花、油菜等，最优选棉花。

在本发明中，种子的性状包括但不限于：种子体积、种子重量、种子纤维长度、和/或种子纤维的强度等。种子性状的改良是指与未改良前植株所产生的种子相比，经本发明改良的种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、和/或种子纤维强度增大等。本发明中，术语“籽指”或“百粒重”可互换使用，均指每百粒种子的重量，该数据反映了种子的籽粒大小和饱满程度。

本发明中还提供了一种生产具有改良性状的作物种子的方法，所述方法包括：提高所述作物中RDL1基因(优选棉花RDL1基因)的表达水平，即所述改良是通过提高作物中RDL1基因表达水平或RDL1蛋白含量来实现的。本领域技术人员可根据所要达到的目的，选择适当的改良方法。例如可采用转基因的方法，该方法通常包括构建转入RDL1基因的载体、转入作物和育种等步骤。

载体、宿主及转基因植物

本发明还涉及包含RDL1基因的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞，以及通过转基因获得高表达RDL1的转基因植物。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的RDL1蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码RDL1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RDL1编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用pEGFP-1、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301、或pBI121等。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用农杆菌作为宿主细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明中术语“转基因作物”、“转化子”或“转化植物”可互换使用，均指通过常规转基因的方法获得的转入本发明RDL1基因并稳定高表达RDL1蛋白的细胞、器官或植株。

转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗病性提高的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的优点

本发明的优点在于：

(1)提供了RDL1基因及蛋白的新用途，其可用于有效提高作物种子的品质；

(2)提供了具有改良性状的转基因植物，其具有改善的种子大小、重量、纤维长度、纤维强度等，为粮、棉、油等生产和加工提供了优良原料；

(3)提供了改良植物种子性状的新途径，因而具有巨大的应用前景。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.RDL1cDNA的分离

采用冷酚法提取棉花RNA：

将2g材料(陆地棉开花后9天的胚珠表面的纤维)，在液氮中磨成粉末，转移到50ml离心管中，加入8ml提取缓冲液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％ SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，震荡混匀，冰上放置1h，每隔10分钟混匀一次。4℃，13000g离心20分钟。重复酚∶氯仿∶异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。取上清夜，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1h。4℃，13000g离心20分钟，去上清液，沉淀溶于1ml DEPC处理水，4℃，13000g离心10分钟。将上清液转入1.5ml Enppendorf管，加入1/3体积的8M LiCl和体积的NaAC，-20℃放置过夜。4℃，13000g离心20分钟。去上清液，用1ml70％乙醇清洗沉淀2次，将所得沉淀在室温下吹干后，溶于100～200μL DEPC处理水中。

根据AY641990的序列，合成一对专一引物(含酶切位点和保护碱基)，并利用该引物以RDL1 cDNA为模板进行PCR反应：

RDL1-S-BamHI：

5′-CGGGATCCATGAAGGTTCTCTCCCCAATTCTTGCT-3′(SEQ ID NO：7)；RDL1-A-SacI：

5′-CCGGAGCTCTTACTTAGGGACCCAAACAATGTG-3′(SEQ ID NO：8)。

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒钟，56℃复性30秒钟，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。亚克隆后经测序确认序列是否正确。结果显示所得序列与AY641990序列一致。

实施例2.RDL1与GFP融合载体的构建和农杆菌转化

所用的GFP基因来源于pEGFP-1(Clontech，Palo Alto，USA)。通过PCR的方法引入合适的酶切位点。GFP的终止密码子被去掉，同时加上一段6个氨基酸(GPGGGG)的非折叠顺序。

以GS1：5′-CTAGTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′(SEQ IDNO：9)和GA1：5′-GTCCCCCGGGCGTCCTCCTCCTCCTGGTCCCTGGTACAGCTCGTCCATGCC-3′(SEQ ID NO：10)为引物，pEGFP-1载体为模板，用PyrobestDNA聚合酶(购自TAKARA公司)扩增GFP编码区，割胶回收后，用SmaI和NcoI双酶切，连到pET32c的EcoRV与NcoI位点之间，构建GFP-32c中间载体。

用Pyrobest DNA聚合酶扩增出目的片段，同时引入相应酶切位点BamHI和SacI(见实施例1)，核对读码框后经过双酶切连到GFP-32c中间载体的相应位点中，构建GFP-靶标中间载体，再用Pyrobest DNA聚合酶扩增出融合片段，同时引入XbaI和KpnI酶切位点，双酶切连到经改装的pCAMBIA2301的35S启动子之后产生35S：GFP-RDL1转基因载体(简称RG，载体图见图1)，测序验证。

采用冻融法对根癌农杆菌进行转化。

取一个单菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，在3ml LB培养基(25μg/ml利福霉素Rif和50μg/ml卡那霉素Kan或庆大霉素Gen)，28℃，220rpm，过夜培养。将2ml菌液加入50ml LB培养基(25μg/ml Rif和50μg/ml Gen)，28℃，220rpm，培养到OD₆₀₀＝0.5(约6小时)。在冰上放置30分钟后，4℃，5000g离心5分钟。将沉淀重悬于10ml 0.15M NaCl中，4℃，5000g离心5分钟。再将该沉淀重悬于1ml 20mM CaCl₂中，分装为50μl/管，液氮速冻，-70℃保存感受态细胞。混合含目的基因双元载体和50μl/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟。在37℃水浴中5分钟使菌液融化，加1ml LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4小时。取50～100μl涂LB培养基平板(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml卡那霉素Kan或潮霉素Hyg)，2天后挑单菌落进行PCR鉴定。

实施例3.植物转化以及转基因后代的筛选

a.棉花的转基因

将含载体质粒的农杆菌在添加卡那霉素50mg/L、利福平100mg/L、链霉素300mg/L的YEB细菌培养基上培养2～3d后，挑单菌落接种于含相同抗生素的YEB液体培养基中，于28℃、200rpm/min的摇床上悬浮培养过夜。菌液于4000rpm/min离心10分钟，沉淀用含葡萄糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS液体培养基重新悬浮，调OD₆₀₀值为0.4～0.6左右，作为感染液备用。

将棉花R15(一种四倍体的野生型陆地棉，作为转基因的母本)种子经常规消毒后置于1/2MS0培养基[1/2MS盐(购自DUCHEFA M0221)+5g/L葡萄糖+7g/L琼脂粉，pH 6.0]，在黑暗中萌发培养，5～7天后将无菌苗下胚轴切成1.0cm左右的切段作为转化外植体备用。

将外植体在农杆菌菌液中浸泡感染15～20分钟，转移到共培养培养基MSB1(MS盐+B5有机(一种有机混合物，其中含肌醇、烟酸、V_B1和V_B6)+30g/L葡萄糖+0.1mg/L KT(细胞激动素)+0.1mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)+2.2g/L Gelrite(一种固化剂)，pH 6.0)上，22℃暗培养2天后，将外植体转移到培养基MSB2(MSB1+500mg/L头孢霉素+80mg/L卡那霉素)上进行愈伤组织的诱导。外植体经过抗性愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖及胚性愈伤的诱导(培养基MSB3：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+2.5g/L Gelrite，pH 6.0)、体细胞胚胎发生(培养基MSB4：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+1.0g/L天门冬酰氨胺+2.0g/L谷氨酰胺+3.0g/L Gelrite，pH 6.0；MS盐中KNO₃加倍，去除NH₄NO₃)，再生抗性试管苗。待试管苗长到3-4片真叶时，移栽到花盆中，放入人工气候室生长。

b.拟南芥的转基因

拟南芥植物的转化采用花芽浸泡法(floral dip)(Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743)。农杆菌培养方法同上，将菌液于4000rpm/min离心10分钟后，将菌体重悬于500ml含0.02％ Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。将植株地上部分在菌液中浸泡5秒，平放于塑料盆内，保湿，避光，16～24小时。T₀代种子在4℃春化2～4天，用20％漂水处理15分钟，无菌水清洗3～4遍。悬于0.5％的琼脂糖(55℃)，铺在0.6％琼脂的LB培养基(50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，连续光照，约一周后，将绿色抗性苗移栽到营养土(泥炭:蛭石:珍珠岩＝1:1:1)中生长。

实施例4.转基因植物的分子生物学鉴定

a.PCR

DNA提取采用冷酚法。取2g棉花幼嫩叶片(以R15为受体的转基因棉花)，在液氮中磨成粉末，转移到50ml离心管中，加入8ml提取缓冲液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％ SDS，pH 9.0)和等体积的水饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，震荡混匀，冰上放置1h，每隔10分钟混匀一次。4℃，13000g离心20分钟。重复酚:氯仿:异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。取上清夜，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1h。4℃，13000g离心20分钟，去上清液，用1ml 70％乙醇清洗沉淀2次，将沉淀在室温下吹干后，溶于1ml无菌水。4℃，13000g离心10分钟。取上清液，加5～10μl RNase(10mg/ml)，37℃，30分钟。

PCR鉴定采用GFP特异的引物(同实施例2)，模板为pEGFP-1质粒。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒钟，56℃复性30秒钟，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。

b.GUS染色分析

用GUS染色液(100mM pH7.0磷酸缓冲液，50mM K₃[Fe(CN)₆]，50mMK₄[Fe(CN)₆]，10mM EDTA，1mM X-gluc，0.1％ Triton X-100)浸泡植物材料，37℃，12～24小时。70％乙醇脱色，将样品保存在70％乙醇中。

实施例5.转基因植物的性状分析

a.转基因棉花的性状分析

将RDL1转基因棉花和转基因母本R15分别在两个地方种植：105号植株和117号植株在上海农场种植，115号植株和119号植株在海南农场种植。所有转基因株系的T₂代植物分别单株收取成熟棉桃，尽量保持收取部位的一致性，分别随机地从单株收取的成熟棉桃中取出100粒种子，取10粒以上种子将其纤维梳平并测量其纤维长度，然后称重这100粒种子(含或不含纤维)。将以上数据统计作图。在海南农场种植的115号植株和119号植株的T₃代数据为5株统计结果。如图4所示，105号植株和117号植株T₂代种子的百粒重(含纤维)为19g，R15为16g，两者具有极显著差异(p<0.01)；如表1所示，115号植株和119号植株T₂和T₃代的纤维长度和籽指相对于R15也至少表现为统计学上的显著差异。

表1.GFP-GhRDL1转基因棉花纤维长度和籽指分析

b.转基因拟南芥的性状分析

将同时构建的GhRDL1转基因载体(不含GUS基因)也通过农杆菌介导的方法转入拟南芥，通过抗性筛选和RT-PCR的方法得到纯合的转基因阳性植株。取其下一代种子和同时收取的WT种子在放大20倍的解剖镜下测量长度和宽度(n>50)，并做统计分析。如图5所示，GhRDL1转基因拟南芥种子的长度和宽度分别与WT种子的长度和宽度在统计学上具有极显著性差异(p<0.01)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>用RDL1基因促进植物种子增大和棉纤维增长的方法

<130>080301

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1298

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)

<220>

<221>CDS

<222>(32)..(1039)

<400>1

<210>2

<211>335

<212>PRT

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400>2

<210>3

<211>1309

<212>DNA

<213>亚洲棉(Gossypium arboreum)

<220>

<221>CDS

<222>(84)..(1091)

<400>3

<210>4

<211>335

<212>PRT

<213>亚洲棉(Gossypium arboreum)

<400>4

<210>5

<211>1432

<212>DNA

<213>亚洲棉(Gossypium arboreum)

<220>

<221>CDS

<222>(84)..(1214)

<400>5

<210>6

<211>376

<212>PRT

<213>亚洲棉(Gossypium arboreum)

<400>6

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

<210>9

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

<210>10

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

Claims

1.植物RDL1基因或其编码的RDL1蛋白在改良作物种子性状中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物RDL1基因的序列选自：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5；或

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述RDL1蛋白的序列选自：

(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6；或

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述作物种子性状的改良包括：种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、和/或种子纤维强度增大。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述作物为双子叶植物或单子叶植物。

6.一种载体，其特征在于，所述载体含有植物RDL1基因。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体。

8.一种制备转基因作物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供含有RDL1基因的载体；

(2)提供携带步骤(1)中的载体的宿主细胞；

(4)选择转入RDL1基因的植物细胞、组织或器官；和

(5)将步骤(4)中的植物细胞、组织或器官再生成植株，

其中所述转基因作物的种子具有改良的性状。

9.用权利要求8所述的方法制得的转基因作物的用途，其特征在于，所述转基因作物用于产生具有改良的性状的作物种子。

10.一种生产具有改良性状的作物种子的方法，所述方法包括：提高所述作物中RDL1基因的表达水平。