CN108192920A - 一种利用ndr1基因提高植物抗病性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用NDR1基因提高植物抗病性的方法，所述方法是将表达控制区和NDR1基因转入植物，提高植物抗病性；所述表达控制区基因由免疫诱导型启动子和与病原相关的上游开放阅读框编码基因连接构成，且病原相关的上游开放阅读框受免疫诱导型启动子介导转录。从根本上解决了由于过表达NDR1诱发免疫反应导致植物启动细胞程序性死亡导致的植物损害和减产。

Description

一种利用NDR1基因提高植物抗病性的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种免疫诱导型启动子和病原相关的上游开放阅读框(uORF)构成的表达控制区以及一种植物的NDR1基因的可操作连接，以及利用这种表达控制区和NDR1基因的可操作连接获得抗病性提高的转基因植物的方法。

(二)背景技术

植物经常受到包括病毒、细菌、真菌和线虫在内的各种致病生物体的攻击。然而，大部分植物具有抵抗致病生物体的先天机制。植物育种家和病理学家已经鉴定了对植物病原体具有抗性的天然变化形式并将其培育成许多农作物植物。这些天然病害抗性基因通常提供了抵抗病原体的高水平抗性或免疫性。

当植物受病虫害侵犯时，受伤部位会立刻启动细胞程序性死亡，即发生所谓超敏反应(hypersensitive response：HR)。HR通常会启动未受伤部位产生次级防御反应，从而对一般的病虫害产生普遍抗性，这种现象称为系统获得性抗性(systemic acquiredresistance，SAR)(Lamb,Cell 76:419-422,1994；Lamb等，Cell 56:215-224,1989)。发生在感染部位的一种防御反应叫作超敏反应("HR")，该反应涉及感染植物细胞或组织或该二者的快速局限性坏死。人们认为感染细胞的快速死亡使侵入病原体得不到足够营养供给，从而抑制病原体生长。进行HR的细胞表现出核DNA断裂(例如DNA梯化(DNA laddering))，DNA断裂是首先在动物系统中描述的编程性细胞死亡，表明HR涉及主动编程性细胞死亡(Mittler等，Plant Physlo1.108:489-493,1995；Greenberg等，Cell 77:551-5fi3,1994；Ryerson和Heath,Plant Cell 8:393-402,1996；Wang等，Plant Cell 8:375-391,1996)。HR也伴随有膜相关的氧化爆发，从而导致NADPH依赖性产生O₂和H₂O₂。这些活性氧类物质对侵入病原体可以有直接毒性，或者可以参与损伤周围的植物细胞壁的交联作用，以便对感染形成屏障(Bradly等，Ce11 70:21-30,1992；Levine等，Cell 79:583-593，1994)。

HR不仅阻止感染病原体的局部生长，还认为它引发该植物非感染部分的其它防御反应，使该植物对多种通常有毒的病原体产生抗性(Enyedi等，Cell 70:879-886,1992；Malamy和Klessig,Plant J.2:643-654,1992))。后一种现象称为系统获得性抗性(SAR)，并且认为这是许多基因协同激活的结果，所述基因通常被称作病理相关(PR)基因。许多这类PR基因的生物学功能还不清楚；然而，大量生理、生化和分子证据提示，特定PR基因在赋予对病原体的抗性中起作直接作用。例如，某些PR因编码直接抑制病原体体外生长的壳多糖酶和β-1,3-葡聚糖酶(Mauch等，Plant Physlol.88：936-942,1988；Ponstein等，PlantPtrysio1.104:109-118,1994；Schlumbaum等，Nature 324:365-367,1986；Sela-Buurlage等，Plant Physiol.101:857-863,1993；Terms等，J.B1o1.Chew.267:15301-15309,1992；Woloshuk等，Plant Cell 3:619-628,1991)。此外，已表明在PR基因的转基因植物中的组成型表达，在少数情况下降低疾病易感性(Alexander等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7327-7331,1993；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1888-1892；1994；Terras等，Plant Cell7:573-588,1995；Zhu等，BioTechnology 12:807-812,1994)。

在理论上，SAR可以被分成两个阶段。在初始阶段中，识别病原体感染且释放通过韧皮部传输到远端组织的信号。这种系统性信号被因SAR基因和病害抗性的表达而起反应的靶细胞觉察。SAR的维持期是指从数周到植物的整个生命期的时间期限，在此过程中该植物是准稳态的且病害抗性得到控制(Ryals等,The plant cell,8(10):1809,1996)。

NDR1(Non-race-specific disease resistance 1)基因，编码一个质膜定位蛋白，在R基因介导的抗性中具有重要作用。NDR1能与CC-NB-LRR(卷曲螺旋核酸结合或富亮氨酸重复)类抗病蛋白相互作用(Century KS等,Science,278(5345):1963,1997)。

目前已从动物、植物、病毒及微生物中分离到许多适用于植物的启动子。根据作用方式及功能可将启动子分为3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。

烟草中SAR基因是一个至少包含十二个成员的家族，SAR也受一些诸如水杨酸(SA)，INA(dichloroisonicotinic acid)和BTH(benzothiadiazole)等化学物诱导。烟草Sat8.2b基因启动子-205/-201是as-1元件(TGACG)，-146/-141和-276/-271为两个GT-1结合序列(GGAAAT)，-97/-94、-322/-318和-761/-758分别是Dof结合基序(AAAG)，前两者被认为可以与SA应答的转录因子结合而起关键作用(Song,F.,& Goodman,R.M.,Gene,290(1):115-124,2002)。启动子缺失实验表明Sar8.2b启动子-927～-728和-351～-197分别包含有SAR高效诱导基因表达所需的顺式作用元件，缺少了这两个DNA片段，转基因烟草GUS表达活性明显降低(Song,F.,&Goodman,R.M.,Gene,290(1):115-124,2002)。拟南芥TBF1基因是负责生长-防御转换的关键基因。其本身的表达受到转录和翻译水平上的严格调控。TBF1基因翻译起始密码子5’端存在2个编码多芳香族氨基酸的上游开放阅读框在翻译水平上调控TBF1基因的表达。TBF1启动子上也含有多个上述病原体诱导表达相关元件(Karolina M等,Current Biology 22:103–112,2012)。

尽管作了大量研究且应用了包括植物的遗传转化在内的完善和深入细致的农作物保护措施，但是每年因病害导致的损失仍保持在10亿美元。因此，存在对开发基于植物中病害抗性的遗传基础不断增加的了解的新的农作物保护措施的持续需求。特别地，需要研究如果利用抗病基因，获得适合度代价(fitness costs)最低的抗病植物的方法。目前，已经有很多报道在植物中利用各种调控元件调控拟南芥中的NDR1基因的表达来提供植物抗性，但是利用特异的表达调控元件来介导植物中NDR1基因表达，进而提高植物抗病性，减小其适合度代价的研究还很少见。本发明首次披露利用病原菌诱导性启动子和调控元件从转录和翻译水平调控NDR1基因的表达来抵御病原菌侵害，并从最大程度上减小适合度代价。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能利用植物的NDR1基因提高植物抗病性，并降低植物适合度代价的方法。从根本上解决了由于过表达NDR1诱发免疫反应导致植物启动细胞程序性死亡导致的植物损害和减产。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用NDR1基因提高植物抗病性的方法，所述方法是将表达控制区介导NDR1基因在植物中表达，提高植物抗病性；所述表达控制区由免疫诱导型启动子和与病原相关的上游开放阅读框(uORF)编码基因连接构成，且病原相关的上游开放阅读框受免疫诱导型启动子介导转录。本发明提供的表达控制区中免疫诱导型启动子和上游开放阅读框(uORF)可以来源于同一个物种，也可以来源于不同物种。

进一步，所述表达控制区包含一个或多个病原相关的上游开放阅读框。

进一步，所述病原相关的上游开放阅读框表达的多肽富含芳香族氨基酸。

进一步，所述表达控制区的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

进一步，所述NDR1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示，其编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8。

进一步，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。更优选所述植物为拟南芥、大豆、油菜、水稻、玉米、小麦、高粱或二穗短柄草中的一种。

本发明同时还提供了另外一种精准控制NDR1基因表达来提高植物抗病性的方法，具体的说，通过基于基因编辑技术的DNA精准插入技术包括基于ZFN(zinc-fingernucleases)、TALEN(transcription activator-like effector nucleases)、CRISPR/Cas9和Argonaute/gDNA等把本发明中的表达控制区导入植物内源NDR1基因编码区上游，实现利用本发明中的表达控制区调控NDR1基因表达。

本发明还提供一种所述提高植物抗病性的NDR1基因的编码蛋白，以及编码蛋白在制备NDR1抗体中的应用。

与现有的发明相比，本发明首次对NDR1基因的表达同时进行转录和翻译水平调控，彻底解决了由于抗病基因的不当表达导致植物产量下降的问题，进而开发了一套高效的提高植物抗病性的方法。本发明研究利用表达控制区介导植物的NDR1基因在植物中表达，利用免疫诱导型启动子和病原相关的上游开放阅读框(uORF)分别在转录水平和翻译水平对NDR1基因进行精细且严格的调控，进而使得获得的转基因植物具有更强的抗病性和更低的适应代价。

(四)附图说明

图1：本发明中的表达控制区结构示意图。启动子为免疫诱导型启动子，uORF为病原相关的上游开放阅读框，在同一个表达控制区中可以有一个或多个uORFs。

图2：本发明中植物转化载体T-DNA结构示意图。该T-DNA中包括本发明中的表达控制区介导植物NDR1基因表达的表达框和其它靶标基因或标记基因表达框。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1载体构建

通过PCR的方法获得表达控制免疫诱导型启动子和病原相关的上游开放阅读框(uORF)构成表达控制区AtTBF1-D和OsTBF1-D(结构如图1所示)，具体操作如下：

1、表达控制区

(1)表达控制区AtTBF1-D

设计PCR引物AtTBF1-D-F(5’CAAGCTTCGACGACTAGTTTACAGAGAATTT)和AtTBF1-D-R(5’GGATCCCTTTTTTTATTTTACCACAGAAAAAT)，以拟南芥的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得AtTBF1-D。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃4分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约3.6Kb的PCR产物克隆到pCambia1300载体中。然后，用HindIII和BamHI双酶切得到表达控制区质粒AtTBF1-D，并且DNA序列测定表明核苷酸序列正确(SEQ ID NO：1)。

(2)表达控制区OsTBF1-D

设计PCR引物OsTBF1-D-F(5’GGTACCGATTTATAAATGCTGCTTTCACTGC)和OsTBF1-D-R(5’ATGGATCCCCTAACGCTATGATCTCTTTCTC)，以商业化水稻品种秀水134的基因组DNA(美国国立生物技术信息中心)为模板，通过PCR扩增获得pUBI。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃4分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约3.3Kb的PCR产物克隆到过渡载体pCambia1300中。然后，用KpnI和BamHI双酶切得到表达控制区质粒OsTBF1-D，并且DNA序列测定表明核苷酸序列正确(SEQ ID NO：2)。

2、含植物NDR1基因+终止子的质粒构建

(1)植物NDR1基因mRNA序列

人工合成玉米和水稻的NDR1基因的mRNA序列，其中玉米ZmNDR1基因的mRNA序列为SEQ ID NO：3，水稻OsNDR1基因的mRNA序列为SEQ ID NO：5，拟南芥AtNDR1基因的mRNA序列为SEQ ID NO：7。

(2)人工合成终止子35S-Ter序列(SEQ ID NO：9)。

(3)植物NDR1基因与终止子连接

1)ZmNDR1-ter

引物：

ZmNDR1-F1：GGGATCCAACAATGGAGCCCATGGACAGCCAGCTCAC，

ZmNDR1-R1：GATCTTTTATCACCTCCGAGGCCGGACGGCCCCGATC，

ZmNDR1-F2：CGGCCTCGGAGGTGATAAAAGATCTGTTCTGCACAAAGT，

ZmNDR1-R2：GGGTACCCCTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTT。

以玉米ZmNDR1基因的mRNA(SEQ ID NO：3)为模板，通过引物ZmNDR1-F1和ZmNDR1-R1进行PCR扩增获得ZmNDR1-A。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃2分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。获得大约0.7Kb的PCR产物。

以人工合成终止子(SEQ ID NO：9)为模板，通过引物ZmNDR1-F2和ZmNDR1-R2进行PCR扩增获得ZmNDR1-B。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃30秒，重复32个循环；然后72℃10分钟。获得大约0.2Kb的PCR产物。

最终，以ZmNDR1-A和ZmNDR1-B为模板，通过引物ZmNDR1-F1和ZmNDR1-R2进行PCR扩增获得ZmNDR1-ter。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃2分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。获得大约0.9Kb的PCR产物。将获得的PCR产物克隆到载体pCambia1300中。然后，用KpnI和BamHI双酶切得到质粒ZmNDR1-ter。

2)OsNDR1-ter

引物：

OsNDR1-F1：GGATCCATCGATGGAGCCGCCGACCAGCCACGTC，

OsNDR1-R1：AACAGATCTTATCATCTCCTTGGTCGAATGGCCCCGATC，

OsNDR1-F2：TTCGACCAAGGAGATGATAAGATCTGTTCTGCACAAAGT，

ZmNDR1-R2：CGGTACCCCTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTT。

以水稻OsNDR1基因的mRNA(SEQ ID NO：5)为模板，通过引物OsNDR1-F1和OsNDR1-R1进行PCR扩增获得OsNDR1-A。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃2分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。获得大约0.7Kb的PCR产物。

以人工合成终止子(SEQ ID NO：9)为模板，通过引物OsNDR1-F2和ZmNDR1-R2进行PCR扩增获得OsNDR1-B。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃30秒，重复32个循环；然后72℃10分钟。获得大约0.2Kb的PCR产物。

最终，以OsNDR1-A和OsNDR1-B为模板，通过引物OsNDR1-F1和OsNDR1-R2进行PCR扩增获得OsNDR1-ter。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃2分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。获得大约0.8Kb的PCR产物。将获得的PCR产物克隆到载体pCambia1300中。然后，用KpnI和BamHI双酶切得到质粒OsNDR1-ter。

3、农杆菌T-DNA载体的构建

1)G10EPSPS为抗草甘膦基因(中国专利：201110009329.0)。通过人工合成G10EPSPS基因(SEQ ID NO：6)，合成的基因5’端连接有玉米乙酰乳酸合成酶AHAS叶绿体转运信号肽且设置有XhoI酶切位点，3’端连接有终止子且设置有XhoI酶切位点。

2)双元载体pCambia1300-p35S-G10的构建：双元载体pCambia1300-p35S-G10由载体pCambia1300修改而来，简单的说就是把pCambia1300载体中的抗潮霉素基因置换为抗草甘膦基因G10EPSPS。具体把pCambia1300载体经过XhoI酶切以后，去磷酸化处理，然后与经过XhoI酶切后获得的人工合成的含有叶绿体转运信号肽和终止子的G10EPSPS基因片段进行两端连接，转化，获得的载体即为pCambia1300-p35S-G10。

3)ZmNDR1基因表达载体

用HindIII和KpnI对所述构建好的pCambia1300-p35S-G10进行双酶切，回收获得载体；用HindIII和BamHI酶切步骤1获得的表达控制区质粒AtTBF1-D，获得AtTBF1-D片段；用BamHI和KpnI酶切步骤2获得的质粒ZmNDR1-ter，回收得到ZmNDR1-ter片段。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-ZmNDR1-终止子-启动子-G10EPSPS-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-AtTBF1-D-ZmNDR1-p35S-G10(图2)。

4)OsNDR1基因表达载体

用KpnI对上述构建好的pCambia1300-p35S-G10进行单酶切，并且进行去磷酸化处理，回收获得载体；用KpnI和BamHI酶切步骤(2)获得的表达控制区质粒OsTBF1-D，获得OsTBF1-D片段；用BamHI和KpnI酶切OsNPR1-ter质粒，回收得到OsNPR1-ter片段。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-OsNDR1-终止子-启动子-G10EPSPS-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-OsTBF1-D-OsNDR1-p35S-G10(图2)。

5)对照载体构建

作为对照，构建启动子为p35S的NDR1基因过表达载体。p35S启动子为花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子，由上海生工合成，序列如SEQ ID NO：10，5’端和3’端分别设置有HindIII和BamHI位点。用HindIII和KpnI对所述构建好的pCambia1300-p35S-G10进行双酶切，回收获得载体；用HindIII和BamHI酶切含有上述p35S的质粒，获得p35S；用BamHI和KpnI酶切步骤2获得的质粒ZmNDR1-ter，回收得到ZmNDR1-ter片段。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-ZmNDR1-终止子-启动子-G10EPSPS-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-p35S-ZmNDR1-p35S-G10。

最后，通过电转的方法把上述3个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。

实施例2玉米转化

玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformation of maize.Nature Protocols 2:1614-1622。基本方法如下：取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将实施例1中制备的含有T-DNA载体pCambia1300-AtTBF1-D-ZmNDR1-p35S-G10和pCambia1300-p35S-ZmNDR1-p35S-G10的农杆菌与未成熟胚在共培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite+5mg/L AgNO₃+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin+2.5g/Lgelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。获得含转化载体pCambia1300-AtTBF1-D-ZmNDR1–p35S-G10和pCambia1300-p35S-ZmNDR1-p35S-G10的转基因玉米植株。

实施例3、水稻的转化

转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取实施例1中构建的载体pCambia1300-OsTBF1-D-OsNDR1-p35S-G10的农杆菌划板。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6左右的农杆菌菌液中(农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种至培养基，培养至OD为0.6左右；培养基组成：3g/L K₂HPO₄、1g/LNaH₂PO₄、1g/LNH₄Cl、0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl₂、0.0025g/L FeSO₄·7H₂O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含上述转化载体和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株。

实施例4大豆转化

这里使用的获得转基因大豆的步骤来自于已有的技术(Deng et al.,1998,PlantPhysiology Communications 34:381-387；Ma et al.,2008,ScientiaAgriculturaSinica 41:661-668；Zhou et al.,2001,Journal of NortheastAgricultural University 32:313-319)。选取健康、饱满、成熟的大豆，用80％乙醇消毒2分钟，再用无菌水清洗，然后放置在充满氯气(由50mlNaClO与2ml浓HCl反应生成)的干燥器中灭菌4-6个小时。灭菌后的大豆在超净工作台里被播撒到B5培养基中，25℃条件下培养5天，同时光密度在90-150μmol光子/m²·s水平。当子叶变绿并顶破种皮，无菌的豆芽就会长出。去掉了下胚轴的豆芽在长度上被切成五五开，使得两片外植体都具有子叶和上胚轴。在子叶和上胚轴的节点处切外植体大约7-8处，即可用作被侵染的目标组织。

含有载体pCambia1300-AtTBF1-D-AtNDR1-p35S-G10的单克隆农杆菌被分开培养待用。准备好的外植体浸没在农杆菌悬浮液中共培养30分钟左右。然后，将侵染的组织上多余的细胞悬浮液用吸水纸吸收干净，再转移到1/10B5共培养培养基里25℃暗培养3-5天。

共培养的植物组织用B5液体培养基清洗，以除去多余的农杆菌，然后放置到B5固体培养基中25℃下培养5天，待其发芽。诱导发生的胚芽组织转移到含有0.1-0.5mM草甘膦的B5筛选培养基中，25℃光照培养4周，期间每两周更换一次培养基。筛选出来的胚芽组织再转移到固体培养基中，25℃培养，待其长成小苗。随后，将转基因植株苗转移到1/2B5培养基中进行生根诱导。最后，长成的小植株经清洗去除琼脂后栽种在温室中。

实施例5转基因玉米的抗病性增强

将实施例2制备的转基因玉米植株的T0代植株移栽到温室中，用商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)的花粉进行授粉，收获T0代种子。然后将这些品系与商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)进行回交转育，获得Z58近等位基因系。再对这些近等位基因系的抗病性进行比较分析。

我们对获得的87个转pCambia1300-AtTBF1-D-ZmNDR1-p35S-G10载体的转基因株系(命名为AZNDR1)和56个pCambia1300-p35S-ZmNDR1-p35S-G10载体的转基因植株(命名为35SNDR1)进行对不同病原菌的抗性效果鉴定，抗性效果如表1所示：

表1：

注：玉米小斑病、灰斑病、纹枯病的抗病性根据病斑长度确定，分别对每个品系的30棵以上转基因植株进行接菌测试，统计病斑长度，与非转基因对照植株进行统计分析，确定转基因品系的抗病性。玉米茎腐病的抗性根据植株成活率确定，分别对每个品系的40棵以上转基因玉米植株进行接菌测试，统计成活株数，与非转基因对照植株进行统计分析，确定转基因品系的抗病性。

最终，我们分别对上述转基因植株进行了产量测定。与非转基因对照相比，AZNDR1的产量基本相同，而大多数35SNDR1转基因植株和非转基因对照相比，产量显著降低(表2)。

表2：

	产量显著降低的品系数目
		AZNDR1	9
35SNDR1	46

注：玉米产量根据小区产量测定，密度为60*25cm，面积为3.33m²。每个品系测量3个小区。

上述结果表明，本发明使用表达控制区阶段NDR1基因过表达，在提高植物抗病性的同时，有效解决了由于NDR1基因的不当表达导致植株受害，产量降低的问题。

实施例6转基因水稻的抗病性增强

将实施例3制备的转基因水稻植株的T0代植株移栽到温室中，收获T0代种子。再对这些品系的T2代植株的抗病性进行比较分析。

我们获得143个转pCambia1300-OsTBF1-D-OsNDR1-p35S-G10载体的转基因株系(命名为OONDR1)进行不同病原菌的抗性效果鉴定，抗性效果如表3所示：

表3：

注：表中抗病性根据病斑长度确定，分别对每个品系的30个以上转基因植株进行接菌测试，统计病斑长度，与非转基因对照植株进行统计分析，确定转基因品系的抗病性。

实施例7转基因大豆的抗病性增强

将实施例4制备的转基因大豆植株的T0代植株移栽到温室中，收获T0代种子。再对这些品系的T2代植株的抗病性进行比较分析。

我们对获得的72个转pCambia1300-AtTBF1-D-AtNDR1-p35S-G10载体的转基因株系(命名为AANDR1)进行对不同病原菌的抗性效果鉴定，抗性效果如表4所示：

表4：

注：大豆灰斑病的抗病性根据病斑长度确定，分别对每个品系的30棵以上转基因植株进行接菌测试，统计病斑长度，与非转基因对照植株进行统计分析，确定转基因品系的抗病性。大豆紫斑病的抗性根据豆荚和豆粒的发病比例决定，分别对每个品系的20棵以上转基因玉米植株进行接菌测试，统计豆荚和豆粒的危害数量，与非转基因对照植株进行统计分析，确定转基因品系的抗病性。

实施例8NDR1蛋白质的表达和纯化

合成引物ZmNDR1-BDF：GCGGATCCATGCACCAAGGGCAAGGCACTCC，ZmNDR1-BDR：GCAAGCTTTCAGATGTATCTGTCACAGGCGA。以玉米ZmNDR1基因的mRNA(SEQ ID NO：3)为模板，通过引物ZmNDR1-F1和ZmNDR1-R1进行PCR扩增获得ZmNDR1-BD。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃1分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约0.7Kb的PCR产物；将上述产物连接到Pet28a的BamHI和HindIII位点之间(质粒：Pet28a-ZmNDR1)。

利用通用的标准方法将含有上述基因的表达载体Pet28a-ZmNDR1转入大肠杆菌BL21star并获得含有Pet28a-ZmNDR1质粒的菌落。单个菌落接种到100ml LB细菌培养液，在37℃下震动培养至OD₆₀₀＝0.6，加IPTG到0.5mM，并继续在同样条件下培养4小时。培养液经过5000g离心10min，沉淀大肠杆菌细胞，然后弃上清收集沉淀。沉淀中加30ml、pH7.4、20mMTris-HCl缓冲液，超声粉碎后即可用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。割胶回收分子量约为23.5kd的蛋白质条带，用于抗体制备。

实施例9NDR蛋白质的抗体制备

利用通用的标准方法将实施例8中回收的蛋白作为抗原，对2只新西兰白兔进行3到4次免疫，收取血清。获得效价为1:500到1:50000的兔抗ZmNDR1血清，用于后续的ELISA或者WB(western blot)试验。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种利用NDR1蛋白提高植物抗病性的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3558

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

caagcttcga cgactagttt acagagaatt tggaccgtcc gatgtaaagc gaaaatagat 60

ctaggttttc cacgtgtccc ctattttaat gaaaccttct gattcatgta gaagttttac 120

tcaatttaat attttttagt atgtagtttt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ttttatggct 180

ccacaccaac ttttaaaatg gtagaagcat gttgcatgtg atcgagtaaa aagccaataa 240

tgagattcag aaaaataaaa attacttata tagtttttta gagaaaaaat tgtattttgt 300

ttaaagcctt aatccggttg ttgaaagagc tgtgtcacga gttaaaaata ttttcttttc 360

attttttaag taattagttt ataatgcaaa aatggttttt atttatttgt cttcgcttat 420

agaactgcaa attgagagag aaaaaaatga attagtggtg gtgaccaaac attcaggaag 480

ctgtgattga tcatttgttt ttgaggtgag tgtagtggca acgtatgacg ttaacatatg 540

gcgtacataa taattacatg aacttaatca taataatcat attgcattta attcatatat 600

catatcccat tagttggacc acttgatttg aggtcatgag aagaacattt atgttttttt 660

tagtttgaat cggagtgatc actaaaaact agatactgaa aattttcaaa ctaaaatcat 720

attaatcttc aaaaaatgtg aaatctaaaa aaaaaaaaaa ttttaacgcg ttcattgtag 780

ccaagtagcc aagtattgtt aaagtagtag taaaagaagt ttagctttaa gtgatataat 840

ttgacacaaa tcctacttag atatggataa taggatatag cttcatgtat atttttatcg 900

ttgcttctgt aaccccaaaa tgtgttgata taagcatttg aatattcgta tgtataatgt 960

tttcttttca ccgtaaaaca tattacaatg ttagtttata ttggattttg aatgtgttta 1020

tgaacagttt ttgtcgactc aaaagttaag atgagaatat ggaagaaagt aaagtttaaa 1080

agtcatgatg ggaacaagga atggaactca aacattctaa tactcaacaa acgcaattat 1140

attattacca tgactcatct ttcaagttcc atcaaaaaga ttcgtggaaa ataatagact 1200

tacgtttcaa atccatgttt ctttctttat aacaaaaaaa atggatgttt cttgacgcgt 1260

gtcgagagta ctcaccatta ctctgacttc agtgagtttg gtcaagtggt cttttttttt 1320

ctcatgtcac caaaggtcca aaccctagaa attagttcga actttccata gaagaactga 1380

ataaatggtc caaaattgtt ttaaaaagga cctaagccat tagttcattg aattcgagtt 1440

aatgggtgaa gatttttatg ataacgaaag tcggagtaat tatgcttttg gtccgatagt 1500

tttctaattt gttttctttc catttttttt ttttcaaata ctacatacta tataagatag 1560

tggtttgtgt taatgtcatc gatgtgttac catccgcatt atattaatta tttatcccaa 1620

cataaagtca gaatctgtaa tttctttgtt ataaaataca gtaaatggtt ccgtttaagc 1680

tgttagatga tttttgagta aaaactaatg taaaaaaaac aaaaaaaaaa caatgtagtt 1740

cataatacat gcatgtttta aagaagtttc ttgtttacta tcaacttgaa tagtatttca 1800

cgaagtcaaa attgttcatt ccgacttttc tatgtggaga aaaaaaattc tatcattgtg 1860

cacaatttaa cagaatgtaa tttcttgtaa aagaagagga aacaattcgc tgttagtaaa 1920

tgtgaagtat agaagtctaa aatgagatac ctcaactagc ttgaattaag aaaaaaaaca 1980

aaaactctat cgacatgaaa aaggtcgcaa atatttatca tttatcaatg ccaaaggagt 2040

atttggttca caaaatactg aatcatttat atagatatat aattagctct aaattctact 2100

ataacttgca aaataagtat actgactcaa ttatatagcg tttaaaaata gacgatttgt 2160

atgatgaggt ccatatatat ggagatgtgc atgcaactat cgacattttc acacgttgat 2220

atcgtctttc tccaatggag acttgaattt gtgtaaacta tgaatactcg tctctctaag 2280

accttttttc ttcaaccatg ccaactattt aggtaagatt ttactgtctt tgattgatat 2340

taaatactta gccgtggcgt tatcaatgaa tgataataaa aatgcggata aaagccaaag 2400

gtgttggaaa taaatccaag aatgaagacg tagatgtcga tgggtatttt aagaacttga 2460

atttgtcacg actcacacgt taaaatatat tatccgaatt gtttagtcta aagacacaca 2520

tatattgaaa aagaaaaggt aaatgaagct cattggtgcc taaatgtgaa atgaagccga 2580

aatgtgttag gtgaacacat ttaaatatac aaaaagaaat ataatagaaa caaaactaat 2640

taacaaagtc gcaatttgta ttgtataaaa tatctttccg tctcccgtca tatttgaaaa 2700

aaaaaaaatt acaaatctgt taattttaaa actttctaga aaaacacaag tatataattt 2760

tctcttttcg tgcgtgtttg ttttaaaata acattgtttt gattggcgac tcaacatatt 2820

ttagcattta catatttctg catatattaa atgatttata aactcaacta tagattaaaa 2880

tataatttga catctaataa ttttaacaat aatataaaat atgagattta taaattacga 2940

atataaatat tcaagggaga gaaaaagtag aacataattc aaaagataag actttttaga 3000

cttttttaac aatatttttg atggataaaa attattcaaa agagaagaaa gtaagaagaa 3060

aagatgtttc tgagaatttc tagaaacagc atccgttttt ataatttaat tttcttacaa 3120

aggtaggacc aacatttgtg atctataaat cttcctacta cgttatatag agacccttcg 3180

acataacact taactcgttt atatatttgt tttacttgtt ttgcacatac acacaaaaat 3240

aaaaaagact ttatatttat ttacttttta atcacacgga ttagctccgg cgaagtatgg 3300

tcgtcgtctt catcttcttc ctccatcatc agatttttcc ttaaatggaa gaaaccaaac 3360

gaaactccga tcttctccgt tctcgtgttt tcctctctgg cttttattgc tgggattggg 3420

aatttctcac cgctctcttg ctttttagtt gctgattctt tttccttcga ctttctattt 3480

ccaatctttc ttcttctctt tgtgtattag attattttta gttttatttt tctgtggtaa 3540

aataaaaaaa gggatcca 3558

<210> 2

<211> 3314

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ggtaccgatt tataaatgct gctttcactg caaatgtcct atgagccaat tttttgatta 60

tccttgcatt ataccttccc cttgatatga cttgttgagt acatcggttg tactcagtct 120

tgctttattt tttccaatcc cccagaagta gagaatttat tggatggtga gttctatgaa 180

gattaggctt ttgccagacg tcgaggtttt gcctgtggat tatggaggaa gcttcggttt 240

gctgagaaga ttaaatttag atggtcttta gtttttctgt tgcttttctg agtttatttt 300

atatttttgt aagacgtgga attgtatcag attatcgtct gtgtactctg gttgatgtct 360

ggacagaggt ttaatgcaca gatagccggt gattcgggtt gtcgaatccc tgggcgcgac 420

aggtcctgta tttatactgt agattatctt ggtctccaag cagaactcgg agatatctcc 480

ctatgtatga gatcacatat cccctatctc ctccgaatag gtctctaaca ccttccattt 540

gaggagacgg tttccttacg cattgacctt tttcttaatt tgtatgtaat gaccgtattc 600

gtatacttca caagtccaaa gatatgactt attcgtaaca ctgacagagc tatatatacc 660

tggttgccca cgttgataga tttctttttt gtttttagat aatacgttga tagatttcta 720

tccctatgtt atgtaaacta cattcttttc atattcagta tttctgaaag aggtgtattt 780

aaataagacc ttaattaatt gttcatgact gatccaaatt ctcgaatcta aaattcagca 840

aagccttaac ccagccacaa acacacacac aaaaagctat acgtgtctgt gtctctgtta 900

aaaaggaaga agctcagcac taatataata tgaactggtc agcaatcagc acaggcagga 960

tatggacgac atctttccag ctaaggtgtt agaccgtcag agagattaag caacaatcag 1020

aaccttctcc atcagaccat caccctttgt gtcgcatcgg cgtccgcgga tgaaatcagc 1080

aaagttgcag ctggctatgg catttattaa ggccctgctt agttccaaac aaaacttttc 1140

ccaaaaatat catattaaat ctttatatat atatatatgg agtataaaat atagataaaa 1200

attaaaacta attgcacagt ttgcatataa atcacgagac gaatcttttg agcctaatta 1260

cgccatgatt agtcataagt gctacagtaa tccacatgtg ataatgacgg attaattagg 1320

ctcaaaatat tcgtctcgcg gttttcaggc gagttatgta attagttttt tcattcgtgt 1380

ccgaaaatcc cttccaacat ccggtcaaac gtccgatgtg atacccaaaa attttcattt 1440

gagccctaac taagctccga tctttctctc cgcccagccc cggagccagt ttgccacaca 1500

atgcagacgc aaacatgtaa ctgaccggag aaatgaagtg gattttggca caaaagtcag 1560

gtttctacca cgcacccatc ggtcagcagg aactccctct tagacggcct catttttctc 1620

cagccttttg ttcaggttgg tgaggcgttt acttgcaaac accgagttgg acaagcaacc 1680

aaccccaaaa gccaaagggc agggaaaaaa aagaaagaaa gaaaaacgct agtccaaaat 1740

cacacggggt ccgggtctat cgttggattg acgattggct tgcgtcgttc gccgtctgct 1800

ccggggggtg tcacgttgag taggatgcag tgcaactagt tatactagaa aggggatcat 1860

gcagtgcagc cagtgatgtg tgagcatcgg gtggaacata tgtatccatg ggagatggga 1920

cagtgggatc aagaaaatga ggtaatgtac ttatgcctaa ttatgatgta gaatcatctt 1980

cttgttggtg tgattcgtgt gaagagcgat agaaacaact ccgcgggact atgggagttg 2040

gtgtaacagt acgtgctgta ccggagacat gctagctcca gaatgacatc aaggggaaaa 2100

accggtactt tgttatcaaa gctttcatat tggacgcagt gatccccggc ccgtttcagg 2160

agcagatatc tatatagtac tacacagtat acatgactac tacgactacg agtagtatac 2220

tacgagtagt cgttgaagta acatggttaa agtagcaatt acgagaaaaa agaaaaggtt 2280

gctgctactg tacgtgctgg gagccgggga ggccgtcctt gatagccaga tgattcccgt 2340

taataagatt gcagcagggc ttgtacatga atattcccaa gtacatatgg tctacgtacg 2400

ccgtcgagtt gggtgggaag aggaaggcgt atcatctcga ttagctcgtg ttggtcgatg 2460

tggacgactt tggacaaatc ggcaacggat ggaaacaagc gagccattaa agcaaaaccc 2520

gctttctcgc ccttcctttt tccacgcgcc tttggtttta ctttctttcg catctcgccc 2580

cggccccgcc cgggatgaca aggacgcatc gtagattacg gcgacgagag agaaaaattc 2640

cgctcccctc aagttttctg gaagcggcga agaagaagaa gaaccggaga gcggtgacgc 2700

ggacgtgcct gcccaacgca aattccgtcg gtcctcccta cgcccgttcc accgcacacc 2760

gtaacgggag ccccgtatta ttcctcgccg attcgtgcag tgatttggac ccggtgcacg 2820

gtgggagcgt ggtgcggcgc cacacgactc cctttgggga ggaagcttct tatttggacc 2880

ggacgggggc ctgacccacg cagacgtaaa cgccaggagg gccaacccgc cgctggctcg 2940

ctttatatcc cgcgtgagct ccacaccgag cgaagcggag gtccggagga ggaagcggcg 3000

agagaagctc agctaggcag ggcgacgggc agaaacgcga ccacggcaac aaaccccgcc 3060

gcgcgcgccc accgtgccgg ttacatggga gtagaggcgg gcggcggctg cggtgggagg 3120

gcggtagtca ccggattcta cgtctggggc tgggagttcc tcaccgccct cctgctcttc 3180

tcggccacca cctcctacta gctatacaca cccatctcac cataacacac atacatagat 3240

agatagatag atagatacat acacacaaac ataagtagct aggtagagaa agagatcata 3300

gcgttagggg atcc 3314

<210> 3

<211> 656

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

tgcaccaagg gcaaggcact cctgctcctc ctaccaccgc cagccacgcc cgccgcatcg 60

cccgccgcac ccgggacagc tgcgccgcag ccctcgccaa cactctatgc tccctcctcc 120

tgggcctcct cctcatcgcc gccgtcgtcg tcttcgttat ctggctcggc ctgcgcccac 180

accgcccgcg cttcaacatg gcctccttct ctgtggccgg cggcctcgac ccggactata 240

gcccggccgg cgccagcctc tccttcaacg tcaccgaccg caaccccaac cggcacattg 300

gcatctacta cgacgccatg cacgcatccg tccacttcta cgacgcgctc gtcgcctccg 360

gcccggcctt cgccgacggt tggtatcagc ccaacaggac caccacctca atcacgggac 420

tcctcgactt cctcggcccc gtcaccaccg acgcctcctg gccctccttt tccgccgcgg 480

ttcgggccgg ccgcctgccg ctgcgcctgc agctcaccac ggccatccgc ttcagggttg 540

ccaacgcctt ccactcaggc cgccaaaaga tgcatgtcag ctgcaacctg ttcgtcggcg 600

ccaacggcca cctgctgccg gactccgtcg gggtcgcctg tgacagatac atctga 656

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met His Gln Gly Gln Gly Thr Pro Ala Pro Pro Thr Thr Ala Ser His

1 5 10 15

Ala Arg Arg Ile Ala Arg Arg Thr Arg Asp Ser Cys Ala Ala Ala Leu

20 25 30

Ala Asn Thr Leu Cys Ser Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Ile Ala Ala

35 40 45

Val Val Val Phe Val Ile Trp Leu Gly Leu Arg Pro His Arg Pro Arg

50 55 60

Phe Asn Met Ala Ser Phe Ser Val Ala Gly Gly Leu Asp Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Ser Pro Ala Gly Ala Ser Leu Ser Phe Asn Val Thr Asp Arg Asn Pro

85 90 95

Asn Arg His Ile Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Met His Ala Ser Val His

100 105 110

Phe Tyr Asp Ala Leu Val Ala Ser Gly Pro Ala Phe Ala Asp Gly Trp

115 120 125

Tyr Gln Pro Asn Arg Thr Thr Thr Ser Ile Thr Gly Leu Leu Asp Phe

130 135 140

Leu Gly Pro Val Thr Thr Asp Ala Ser Trp Pro Ser Phe Ser Ala Ala

145 150 155 160

Val Arg Ala Gly Arg Leu Pro Leu Arg Leu Gln Leu Thr Thr Ala Ile

165 170 175

Arg Phe Arg Val Ala Asn Ala Phe His Ser Gly Arg Gln Lys Met His

180 185 190

Val Ser Cys Asn Leu Phe Val Gly Ala Asn Gly His Leu Leu Pro Asp

195 200 205

Ser Val Gly Val Ala Cys Asp Arg Tyr Ile

210 215

<210> 6

<211> 563

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

gccgccggag gagcgaacga cgacggcgcc gccgccgccg ccggcgagcg gccgacgcgc 60

gaggggcgcg cgcggagcac acccgcgcca gcgcaccacc gggggcgaac acgccgcacg 120

ccccccgccc ccccgcgccg gcgcgccccg cgcggccagc cccgcccgca ccgcccgcgc 180

cgccgcgccc caccgcgccg ccgccggcca ccggcggcgg cgggcaccag aaggcgccca 240

acgcccgacc gcaacccgaa ccgccacacg gcaccacacg acgcgacgcg cgccgccggc 300

cacggcggcg acgacccgaa caagacgacg acgcacgccg gcggcggacg cgcggcccga 360

ggcccgccgc cgagcggcgg gccggcgcgc cgcgggcccc gcgcggggcg ccgccgcgcg 420

gcgcggccac cacggccacc ggccggccac caccggccgg cgccgcgggc cagccggccg 480

ccggaggagc acggacgcca cacgcgcgac ccggcggcaa ccgcgccgga gccgcggcgc 540

cgccgcgaga gaacccggag aga 563

<210> 6

<211> 216

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

Met Pro Pro Glu Glu Arg Thr Thr Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala

1 5 10 15

Ser Gly Arg Arg Ala Arg Trp Arg Val Ala Glu His Thr Arg Ala Ser

20 25 30

Cys Thr Thr Val Val Ala Asn Thr Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Leu

35 40 45

Leu Leu Val Ala Gly Val Val Leu Phe Val Val Trp Leu Ser Leu Arg

50 55 60

Pro His Arg Pro Arg Phe Ala Val Val Ser Phe Thr Val Val Ser Pro

65 70 75 80

Pro Ala Thr Gly Gly Gly Gly His Gln Lys Val Ala Phe Asn Val Ser

85 90 95

Asp Arg Asn Pro Asn Arg His Ile Gly Ile His Tyr Asp Ala Thr Arg

100 105 110

Ala Ala Val Leu Tyr Gly Gly Asp Asp Pro Asn Lys Thr Thr Thr Phe

115 120 125

Ile Ala Gly Val Leu Asp Val Val Gly Pro Arg Pro Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Ala Trp Pro Ala Phe Ala Ala Gly Leu Arg Ala Gly Arg Leu Pro Leu

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Thr Thr Ala Ile Arg Phe Arg Leu Thr Thr Gly Phe

165 170 175

Gly Ala Val Gly Phe Gln Ser Gly Arg Arg Arg Met His Val Asp Cys

180 185 190

His Ile Val Val Asp Ser Gly Gly Asn Leu Leu Pro Glu Ser Val Gly

195 200 205

Ala Ala Cys Glu Arg Tyr Phe Ser

210 215

<210> 8

<211> 462

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

gaaaacaaaa gaagacacag aaggggcgaa acggacgcgc aagccaccac agcggccacc 60

cccaggcagc ccggcggaca aacccaaagc caaccaaaac caccgccccg gaaaagaccc 120

aaacacgaga caaaccacca aacaggcggg acaaccaaaa gagaccaagg aacacacgac 180

gagccaccaa ccaccacaac acgaccaaga caacacgccg cagggaacac acaggccaag 240

cacaaggaca caagaagaag gccaagaagg gggcaagaaa gccgcaaaca accagacgga 300

cgagcgggcc aaggacggcg caggggacca agaccaagag acaagaggga aaacaagagg 360

agggggaagg gagcgaggaa gcaacgggag gagaaagcca aagaaaggaa aagagaagaa 420

acgaccccaa agaagccccg aagggagaaa ccgacgcacg aa 462

<210> 8

<211> 219

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

Met Asn Asn Gln Asn Glu Asp Thr Glu Gly Gly Arg Asn Cys Cys Thr

1 5 10 15

Cys Cys Leu Ser Phe Ile Phe Thr Ala Gly Leu Thr Ser Leu Phe Leu

20 25 30

Trp Leu Ser Leu Arg Ala Asp Lys Pro Lys Cys Ser Ile Gln Asn Phe

35 40 45

Phe Ile Pro Ala Leu Gly Lys Asp Pro Asn Ser Arg Asp Asn Thr Thr

50 55 60

Leu Asn Phe Met Val Arg Cys Asp Asn Pro Asn Arg Asp Gln Gly Ile

65 70 75 80

Tyr Tyr Asp Asp Val His Leu Asn Phe Ser Thr Ile Asn Thr Thr Lys

85 90 95

Ile Asn Ser Ser Ala Leu Val Leu Val Gly Asn Tyr Thr Val Pro Lys

100 105 110

Phe Tyr Gln Gly His Lys Lys Lys Ala Lys Lys Trp Gly Gln Val Lys

115 120 125

Pro Leu Asn Asn Gln Thr Val Leu Arg Ala Val Leu Pro Asn Gly Ser

130 135 140

Ala Val Phe Arg Leu Asp Leu Lys Thr Gln Val Arg Phe Lys Ile Val

145 150 155 160

Phe Trp Lys Thr Lys Arg Tyr Gly Val Glu Val Gly Ala Asp Val Glu

165 170 175

Val Asn Gly Asp Gly Val Lys Ala His Lys Lys Gly Ile Lys Met Lys

180 185 190

Lys Ser Asp Ser Ser Phe Pro Leu Arg Ser Ser Phe Pro Ile Ser Val

195 200 205

Leu Met Asn Leu Leu Val Phe Phe Ala Ile Arg

210 215

<210> 9

<211> 203

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

gagctcaaga tctgttctgc acaaagtgga gtagtcagtc atcgatcagg aaccagacac 60

cagactttta ttcatacagt gaagtgaagt gaagtgcagt gcagtgagtt gctggttttt 120

gtacaactta gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc 180

taaaaccaaa atccaggggt acc 203

Claims (9)

1.一种利用NDR1基因提高植物抗病性的方法，其特征在于所述方法是将表达控制区介导NDR1基因在植物中表达，提高植物抗病性；所述表达控制区由免疫诱导型启动子和与病原相关的上游开放阅读框构成。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述表达控制区包含一个或多个病原相关的上游开放阅读框。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述病原相关的上游开放阅读框表达的多肽富含芳香族氨基酸。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述表达控制区的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述NDR1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述植物为拟南芥、大豆、油菜、水稻、玉米、小麦、高粱或二穗短柄草中的一种。

8.一种权利要求1所述提高植物抗病性的NDR1基因的编码蛋白。

9.如权利要求8所述的编码蛋白在制备NDR1抗体中的应用。