CN109182370B

CN109182370B - 一种植物多基因表达载体、转化子及其应用

Info

Publication number: CN109182370B
Application number: CN201810875919.3A
Authority: CN
Inventors: 郑挺; 沈志成
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2038-08-03
Also published as: CN109182370A

Abstract

本发明提供一种植物多基因表达载体、含有该载体的转化体及其应用。该载体含有抗虫基因CAL以及抗草甘膦基因G10。本发明的植物多基因表达载体转化大肠杆菌可得到含有该质粒的大肠杆菌转化子；转化农杆菌可得到含有该质粒的农杆菌转化子。该农杆菌转化子可用于转化植物，获得抗虫抗除草剂的转基因植物。

Description

一种植物多基因表达载体、转化子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效植物多基因表达载体、含有该载体的转化体及其应用。

技术背景

大豆是重要的粮食经济作物。杂草的侵害和害虫的危害是影响大豆产量的重要因素。虽然使用杀虫剂防治害虫能在短期内起到一定的效果，但这种方法并不环保并且效率有限。

通过转基因的方法可以使植物获得外源基因，从而使植物获得所需的性状，如导入抗除草剂草甘膦的EPSPS基因可以大大简化田间杂草管理，降低成本；导入来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因，可以使作物获得对一些靶标害虫的抗性，从而减少虫害造成的损失。

导入外源基因可能会对作物的农艺性状造成一些影响，因此需要优化载体的结构，如选择合适的启动子和终止子等元件，调节基因在时空上的适量表达，从而在获得需要的性状的同时又减少对作物农艺性状的影响。

发明内容

本发明的目的是为培育抗虫抗草甘膦的作物提供一种新型高效植物多基因表达载体和含有该载体的转化子及其应用。用携带该载体的工程菌转化植物，并通过筛选可获得抗草甘膦抗虫的转基因植物。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种植物多基因表达载体，所述表达载体是在基本载体pCAMBIA1300的Xho I位点插入抗草甘膦基因G10表达框，同时在MCS位点插入抗虫基因CAL表达框而构成。

进一步，所述抗草甘膦基因G10核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示(氨基酸序列为SEQID NO:2所示)，所述抗虫基因CAL核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示(氨基酸序列为SEQ IDNO:4所示)。

进一步，抗草甘膦基因G10表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQ ID NO:5所示转录调控区的启动子CaMV 35s promoter，SEQ ID NO:6所示TEV5’UTR以及SEQ ID NO:7所示转导肽序列CTP，SEQ ID NO:1所示抗草甘膦基因G10和SEQ ID NO:8所示3’端的CaMV35s终止子片段。

进一步，抗虫基因CAL表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQ ID NO:9所示转录调控区的启动子CSV，SEQ ID NO:3所示抗虫基因CAL和SEQ ID NO:10所示3’端的NOS终止子。

本发明还提供一种含有所述植物多基因表达载体的转化子。

本发明还提供一种所述植物多基因表达载体在制备转基因植物细胞中的应用，所述植物细胞中植物为大豆、玉米或油菜。

本发明的植物多基因表达载体可以是在基本载体pCAMBIA1300(NCBI accession:AF234296.1)的XhoI位点插入草甘膦抗性基因G10表达框，同时在MCS位点插入抗虫基因CAL表达框构成。所用的基本载体pCAMBIA1300中含有Ti质粒中T-DNA的左右边界序列(LB和RB)，在该片段中含有两端为XhoI酶切位点的hygromycine抗性基因表达框，在该处用根据双子叶植物密码子偏好人工合成的草甘膦抗性基因G10(SEQ ID NO：1)的表达框替换hygromycine抗性基因表达框，同时，该基本载体含有多克隆位点(MCS)，在MCS位点处插入抗虫基因CAL表达框。所得到的植物多基因表达载体之一命名为p1300-CSV/CAL-35s/G10，其所携带的抗草甘膦基因为G10，抗虫基因为CAL，这些基因位于载体的T-DNA左右边界序列LB和RB区域之中。

由本发明的植物多表达载体转化大肠杆菌得到含有该质粒载体的大肠杆菌转化子。

由本发明的植物多基因表达载体转化农杆菌LBA4404可得到含有该质粒的农杆菌转化子。该农杆菌转化子可用于转化植物，获得同时抗草甘膦和抗棉铃虫、黏虫、斜纹夜蛾、豆荚螟等多种害虫的大豆。

本发明的植物多基因表达载体转化农杆菌得到的含有该质粒载体的农杆菌转化子用于转化大豆，并以草甘膦为筛选标记进行筛选，可获得同时抗草甘膦，抗棉铃虫、黏虫、斜纹夜蛾、豆荚螟等多种害虫的大豆。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

利用本发明提供的优化设计的植物转化载体得到的转基因植物具有良好的草甘膦抗性，同时具有良好棉铃虫、黏虫、斜纹夜蛾、豆荚螟抗性。

附图说明

图1是含有G10基因和CAL的p1300-CSV/CAL-35S/G10植物多价基因表达质粒示意图。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1植物多价表达载体的构建

按照表1所示的酶切反应及电泳体系将pCAMBIA1300质粒用XhoI酶切去除hygromycine抗性基因，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段1300-35s，FastAP进行去磷酸化。同时按照表1所示的酶切反应及电泳体系将人工合成的含有G10的TEV 5’UTR-CTP-G10(SEQID NO:11)克隆至pUC57的质粒用XhoI酶切后回收。然后用T4连接酶将片段TEV 5’UTR-CTP-G10和载体1300-35s进行连接(连接反应体系见表2)，得到含有G10表达框的p1300-35s/G10质粒。

按照表1所示的双酶切反应及电泳条件将人工合成的CAL-NOSter(SEQ ID NO:12)从pUC57载体中用BamHI、KpnI切下，琼脂糖凝胶电泳回收片段CAL；按照表1所示的双酶切反应及电泳条件将人工合成的CSV启动子(SEQ ID NO:9)从pUC57载体中用HindIII、BamHI切下，琼脂糖凝胶电泳回收片段CSV启动子；按照表1所示的双酶切反应及电泳条件将p1300-35s/G10质粒用HindIII、KpnI酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段p1300-35s/G10，然后用T4连接酶将片段CAL-NOSter、CSV启动子、载体片段p1300-35s/G10进行连接(连接反应体系见表3)，得到载体p1300-CSV/CAL-35s/G10(图1)。

表1 酶切反应及电泳体系

在37℃恒温箱中保温1-1.5小时，然后用1×TAE(0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA)电泳缓冲液配置1.0％的琼脂糖凝胶电泳，在琼脂糖凝胶电泳里加入EB(溴化乙锭)至终浓度为0.5μg/ml，在3-5V/cm的电压下电泳。

表2 两片段连接反应体系

在16℃条件下连接过夜。

表3 三片段连接反应体系

在16℃条件下连接过夜。

实施例2大肠杆菌转化子的获得

大肠杆菌转化：①取实施例1中的连接产物(多价质粒载体p1300-CSV/CAL-35s/G10)10ul加入大肠杆菌TG1感受态细胞中，轻轻混匀，再于冰上静置约30min；②42℃热击90s，然后迅速置于冰上冷却2min；③加入1ml无抗生素的灭菌的LB液体培养基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，1L蒸馏水，高温高压灭菌)，放入37℃培养箱中培养约1h；④4000rpm离心3min，弃上清，用枪头混匀离心管底残留LB培养液与大肠杆菌；⑤将菌液均匀涂布在含50ug/L卡那霉素的LB固体培养基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g琼脂，1L蒸馏水，高温高压灭菌)上，先正面向上放置于37℃培养箱中1h至菌液完全吸收，再倒置培养约8-10h至出现白色菌落。

挑取单菌落，摇菌过夜，采用Axygene Miniprep质粒小量制备试剂盒抽提质粒，经PCR和酶切检测后，挑选出阳性质粒，保存相应的菌落，即转化子。该转化子用于抽提多价质粒载体p1300-CSV/CAL-35S/G10。

实施例3农杆菌LBA4404的转化

农杆菌的电击转化：①取实施例1中的连接产物(多价质粒载体p1300-CSV/CAL-35S/G10)1ul加入农杆菌LBA4404感受态细胞中混匀加入电击杯(Eppendorf)中；②将电击杯放入电击仪的样品槽中，按照电击杯电极间距尺寸选择合适的电压电击(1.8mm 1800V，2.0mm 2500V)，电击转化；③向已电击的农杆菌LBA4404细胞中加入1ml不含抗生素的YEP液体培养基(10g蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl，1L蒸馏水，高温高压灭菌)，混匀再转入已灭菌的1.5ml离心管中，28℃培养约3h；④将菌液4000rpm离心3min，弃上清。混匀残余YEP液体培养基与沉淀菌体，均匀涂布到含有12mg/L四环素和50mg/L卡那霉素的YEP固体培养基平板上(10g蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl，15g琼脂，1L蒸馏水，高温高压灭菌)，正面向上放于28℃培养箱中1h至菌液完全吸收，然后倒置培养约36-48h至菌落出现。

挑取单菌落(经酶切和PCR检测，确认为含有多价质粒载体p1300-CSV/CAL-35S/G10，摇菌24h，即为农杆菌LBA4404侵染液。所得菌液保存于以1:1体积比与50％甘油混合保存于-80℃。

实施例4转基因大豆的获得

转基因植物的获得采取的是现有技术(参考美国Iowa State University,Planttransformation facility的大豆子叶节转化法)。取饱满的大豆种子用氯气灭菌16小时，然后播种到萌发培养基后15h，吸胀的大豆种子沿种脐用手术刀纵切分成两半，去除种皮，得到的含胚轴和子叶的两瓣作为外植体，用重悬好的实施例3中的含有p1300-CSV/CAL-35S/G10的农杆菌LBA4404侵染液侵染1h，取出外植体，用无菌吸水纸吸干后置于放有无菌滤纸的共培养基上暗培3天。然后把外植体转移到不含筛选剂的芽诱导培养基上光培一周，一周后把外植体转移到含有筛选剂草甘膦(20mg/L)的芽诱导培养基上，培养两周，两周后更换一次芽诱导培养基，继续以相同浓度草甘膦筛选两周。芽诱导四周后，将外植体转移到芽伸长培养基，用5mg/L的草甘膦筛选，每两周更换一次培养基，4到8周后长出伸长的芽。伸长的芽长至3cm左右时，切除剩余部分，将伸长的芽切下，基部在吲哚丁酸中泡3分钟左右，然后插入生根培养基中培养2周左右，待根长至2cm左右，苗较壮时，移栽到温室培养，收取种子用于进一步研究。

实施例5草甘膦抗性的鉴定

选取实施例4中的10个基因大豆株系进行草甘膦抗性分析。每盆种植4棵，每个株系种植3盆，另外设置6盆非转基因对照。在大豆长到4叶期(4周左右)，先通过PCR检测选择阳性植株，阳性植株喷施200倍体积稀释的农达，45ml/m²，一周后统计结果。结果如表4。结果表明导入了本发明外源DNA的转基因大豆对草甘膦具有良好的抗性。

表4 转基因大豆喷施大豆后的成活率

株系	死亡率	生长是否受抑制
			Event 1	0％	否
Event 2	0％	否
			Event 3	0％	否
Event 4	0％	否
			Event 5	0％	否
Event 6	0％	否
			Event 7	0％	否
Event 8	0％	否
			Event 9	0％	否
Event 10	0％	否
			非转基因对照	100％

实施例6转基因大豆抗虫性能的鉴定

选取实施例4中的10个转基因大豆株系进行抗虫性能鉴定。在大豆长到四叶期，取第四叶2cm，分别接上初孵的棉铃虫、粘虫、斜纹夜蛾，72小时候统计结果，结果如表5。结果表明导入了本发明外源DNA的本发明的转基因大豆对棉铃虫、粘虫、斜纹夜蛾均具有良好的抗性。

表5 转基因大豆的抗虫效果鉴定

株系	棉铃虫死亡率	粘虫死亡率	斜纹夜蛾死亡率
				Event 1	100％	100％	100％
Event 2	100％	100％	100％
				Event 3	100％	100％	100％
Event 4	100％	100％	100％
				Event 5	100％	100％	100％
Event 6	100％	100％	100％
				Event 7	100％	100％	100％
Event 8	100％	100％	100％
				Event 9	100％	100％	100％
Event 10	100％	100％	100％
				非转基因对照	0％	0％	0％

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种植物多基因表达载体、转化子及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gacgctcttc cagctacctt cgacgttatc gtgcatccag ctagagaact cagaggtgaa 60

cttagagcac agccatccaa gaactacacc actagatacc tcctcgccgc tgctctcgct 120

gagggtgaaa ccagagttgt tggtgtggct acctctgagg atgccgaagc tatgctcaga 180

tgcctcagag attggggtgc tggtgttgag cttgttggtg atgacgccgt gatcagaggt 240

ttcggtgcta gaccacaggc tggtgttacc cttaacccag gtaacgctgc tgcggtggcc 300

agactcctta tgggtgttgc tgctctcacc tctggtacaa ctttcgttac cgattaccct 360

gattcccttg gtaagagacc tcagggtgac cttcttgaag ccctcgaaag acttggtgct 420

tgggtgtcct ccaacgatgg tagactccct atctccgttt ccggtccagt tagaggtggt 480

acagtggagg tttccgccga aagatcctcc cagtacgctt ccgcccttat gttcctcggt 540

cctcttcttc ctgacggact cgaacttaga ctcaccggtg atatcaagtc ccacgctcct 600

cttagacaga cacttgacac cctctctgat ttcggtgtta gagctactgc ctccgatgac 660

cttagaagaa tctccatccc tggtggtcag aagtacagac caggtagagt gctcgttcct 720

ggtgattacc ctggttccgc tgctatcctt accgccgctg ctcttctccc aggtgaggtt 780

agactttcta accttagaga acacgacctc cagggtgaga aggaagctgt gaacgttctt 840

agagagatgg gtgctgatat cgttagagaa ggtgataccc ttaccgtgag aggtggtaga 900

cctctccacg ctgttactag agatggtgat tccttcaccg acgccgtgca agctcttacc 960

gctgctgctg ccttcgctga gggtgatacc acctgggaaa acgttgctac tcttagactc 1020

aaggaatgcg atagaatctc tgacaccaga gctgagcttg aaagacttgg tcttagagca 1080

agagagaccg ccgattctct ctccgttact ggttctgctc accttgctgg tggtatcacc 1140

gctgatggtc acggtgacca cagaatgatc atgcttctca cccttcttgg tctcagagca 1200

gatgctccac ttagaatcac cggtgcacac cacatcagaa agtcctaccc tcagttcttc 1260

gctcaccttg aagctcttgg tgctagattc gaatacgctg aggctaccgc ctaatag 1317

<210> 2

<211> 437

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Asp Ala Leu Pro Ala Thr Phe Asp Val Ile Val His Pro Ala Arg Glu

1 5 10 15

Leu Arg Gly Glu Leu Arg Ala Gln Pro Ser Lys Asn Tyr Thr Thr Arg

20 25 30

Tyr Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Glu Thr Arg Val Val Gly

35 40 45

Val Ala Thr Ser Glu Asp Ala Glu Ala Met Leu Arg Cys Leu Arg Asp

50 55 60

Trp Gly Ala Gly Val Glu Leu Val Gly Asp Asp Ala Val Ile Arg Gly

65 70 75 80

Phe Gly Ala Arg Pro Gln Ala Gly Val Thr Leu Asn Pro Gly Asn Ala

85 90 95

Ala Ala Val Ala Arg Leu Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly

100 105 110

Thr Thr Phe Val Thr Asp Tyr Pro Asp Ser Leu Gly Lys Arg Pro Gln

115 120 125

Gly Asp Leu Leu Glu Ala Leu Glu Arg Leu Gly Ala Trp Val Ser Ser

130 135 140

Asn Asp Gly Arg Leu Pro Ile Ser Val Ser Gly Pro Val Arg Gly Gly

145 150 155 160

Thr Val Glu Val Ser Ala Glu Arg Ser Ser Gln Tyr Ala Ser Ala Leu

165 170 175

Met Phe Leu Gly Pro Leu Leu Pro Asp Gly Leu Glu Leu Arg Leu Thr

180 185 190

Gly Asp Ile Lys Ser His Ala Pro Leu Arg Gln Thr Leu Asp Thr Leu

195 200 205

Ser Asp Phe Gly Val Arg Ala Thr Ala Ser Asp Asp Leu Arg Arg Ile

210 215 220

Ser Ile Pro Gly Gly Gln Lys Tyr Arg Pro Gly Arg Val Leu Val Pro

225 230 235 240

Gly Asp Tyr Pro Gly Ser Ala Ala Ile Leu Thr Ala Ala Ala Leu Leu

245 250 255

Pro Gly Glu Val Arg Leu Ser Asn Leu Arg Glu His Asp Leu Gln Gly

260 265 270

Glu Lys Glu Ala Val Asn Val Leu Arg Glu Met Gly Ala Asp Ile Val

275 280 285

Arg Glu Gly Asp Thr Leu Thr Val Arg Gly Gly Arg Pro Leu His Ala

290 295 300

Val Thr Arg Asp Gly Asp Ser Phe Thr Asp Ala Val Gln Ala Leu Thr

305 310 315 320

Ala Ala Ala Ala Phe Ala Glu Gly Asp Thr Thr Trp Glu Asn Val Ala

325 330 335

Thr Leu Arg Leu Lys Glu Cys Asp Arg Ile Ser Asp Thr Arg Ala Glu

340 345 350

Leu Glu Arg Leu Gly Leu Arg Ala Arg Glu Thr Ala Asp Ser Leu Ser

355 360 365

Val Thr Gly Ser Ala His Leu Ala Gly Gly Ile Thr Ala Asp Gly His

370 375 380

Gly Asp His Arg Met Ile Met Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Arg Ala

385 390 395 400

Asp Ala Pro Leu Arg Ile Thr Gly Ala His His Ile Arg Lys Ser Tyr

405 410 415

Pro Gln Phe Phe Ala His Leu Glu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Glu Tyr

420 425 430

Ala Glu Ala Thr Ala

435

<210> 3

<211> 4350

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60

gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120

agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180

gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240

gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300

gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360

cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420

ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480

tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540

cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600

ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660

cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720

ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780

agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840

cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900

aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960

atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020

atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcata gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080

accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140

agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200

taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260

ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320

agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380

gagttcaaca acatcatccc cagcagccag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440

aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500

cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560

cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620

atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680

ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740

agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800

cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860

cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920

accgactacc acatcgatca ggtgcgaggc cccggtggag caggtggagc aggtggaggg 1980

ggtaaaggaa acaacaccaa gctgaacgcc agggccctgc cgagcttcat cgactacttc 2040

aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 2100

gacaccggcg gcaacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgag 2160

atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 2220

ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctg aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 2280

aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccgaag 2340

atcaccagca tgctgagcga cgtgatgaag cagaactacg ccctgagcct gcaggtggag 2400

tacctgagca agcagctgaa ggagatcagc gacaagctgg acgtgatcaa cgtgaacgtg 2460

ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc ccggcctacc agaggatcaa gtacgtgaac 2520

gagaagttcg aggagctgac cttcgccacc gagaccaccc tgaaggtgaa gaaggacagc 2580

agcccggccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggccaa gagcgtgacc 2640

aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 2700

aacaacctgt tcggcaggag cgccctgaag accgccagcg agctgatcgc caaggagaac 2760

gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 2820

ctgcaggcca aggccttcct gaccctgacc acctgcagga agctgctggg cctggccgac 2880

atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ctgaacaagg agaaggagga gttcagggtg 2940

aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc 3000

agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gccaagccgg gccacgccct ggtgggcttc 3060

gagatcagca acgacagcat gaccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac 3120

taccaggtgg acaaggacag cctgagcgag gtgatctaca gcgacatgga caagctgctg 3180

tgcccggacc agagcgagca gatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 3240

gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tgaggtacga ggtgaccgcc 3300

aacagctacg acagcagcac cggcgagatc gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc 3360

gaggccgagt acaggaccct gagcgccaac aacgacggcg tgtacatgcc gctgggcgtg 3420

atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac ggcttcggcc tgcaggccga cgagaacagc 3480

aggctgatca ccctgacctg caagagctac ctgagggagc tgctgctggc caccgacctg 3540

agcaacaagg agaccaagct gatcgtgccg ccgatcagct tcatcagcaa catcgtggag 3600

aacggcaacc tggagggcga gaacctggag ccgtggatcg ccaacaacaa gaacgcctac 3660

gtggaccaca ccggcggcat caacggcacc aaggtgctgt acgtgcacaa ggacggcgag 3720

ttcagccagt tcgtgggcgg caagctgaag agcaagaccg agtacgtgat ccagtacatc 3780

gtgaagggca aggccagcat ctacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 3840

gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agaggttcac caccggcacc 3900

gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 3960

aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac 4020

accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac 4080

cagggcggca ggggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag cacctacagg 4140

gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgaggatca ggaacagcag ggaggtgctg 4200

ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 4260

gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc 4320

gtgcacttct acgacgtgag catcaagtaa 4350

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<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

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Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

195 200 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

210 215 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly

485 490 495

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg

500 505 510

Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg

515 520 525

Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg

530 535 540

Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn

545 550 555 560

Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn

565 570 575

Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn

580 585 590

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu

595 600 605

Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val

610 615 620

Asn Glu Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val

625 630 635 640

Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Arg Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly

645 650 655

Ala Gly Gly Gly Gly Lys Gly Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala

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Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr

675 680 685

Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly

690 695 700

Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu

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Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile

725 730 735

Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile

740 745 750

Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp

755 760 765

Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met

770 775 780

Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Val Glu

785 790 795 800

Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Lys Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile

805 810 815

Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala

820 825 830

Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe

835 840 845

Ala Thr Glu Thr Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp

850 855 860

Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr

865 870 875 880

Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp

885 890 895

Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala

900 905 910

Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val

915 920 925

Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys

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Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp

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Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu

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Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ser Asn

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Asp Ser Met Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn

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Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Ser Asp Met

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Asp Lys Leu Leu Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn

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Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr

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Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp

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Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser

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Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asn Asp Gly Val Tyr Met

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Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe

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Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys

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Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu

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Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ile Ser Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu

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Asn Gly Asn Leu Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Ile Ala Asn Asn

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Lys Asn Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Ile Asn Gly Thr Lys Val

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Leu Tyr Val His Lys Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Val Gly Gly Lys

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Leu Lys Ser Lys Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Ile Val Lys Gly Lys

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Ala Ser Ile Tyr Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu

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Asp Thr Asn Asn Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe

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Thr Thr Gly Thr Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln

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Asn Gly Asp Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser

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Pro Ser Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp

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Thr Ser Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr

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Gln Gly Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe

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Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg

1380 1385 1390

Ile Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly

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Ala Lys Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn

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actctcgtct actccaagaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggctattgag 420

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ctcgagtcaa cacaacatat acaaaacaaa cgaatctcaa gcaatcaagc attctacttc 60

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gaacgcctac gtggaccaca ccggcggcat caacggcacc aaggtgctgt acgtgcacaa 3720

ggacggcgag ttcagccagt tcgtgggcgg caagctgaag agcaagaccg agtacgtgat 3780

ccagtacatc gtgaagggca aggccagcat ctacctgaag gacgagaaca ccggctacat 3840

ccactacgag gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agaggttcac 3900

caccggcacc gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc 3960

ctggggcgac aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga 4020

gctgatcaac accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct 4080

gaccctgtac cagggcggca ggggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag 4140

cacctacagg gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgaggatca ggaacagcag 4200

ggaggtgctg ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac 4260

caccaagttc gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg 4320

cggcccgatc gtgcacttct acgacgtgag catcaagtaa gagctcttca aacatttggc 4380

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 4440

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 4500

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 4560

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcggtacc 4620

Claims

1.一种植物多基因表达载体，其特征在于所述表达载体是在基本载体pCAMBIA1300的XhoI位点插入抗草甘膦基因G10表达框，同时在MCS位点插入抗虫基因CAL表达框而构成；

抗草甘膦基因G10表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQ ID NO:5所示转录调控区的启动子CaMV 35s，SEQ ID NO:6所示TEV5’UTR，SEQ ID NO:7所示转导肽序列CTP，SEQID NO:1所示抗草甘膦基因G10和SEQ ID NO:8所示3’端的CaMV35s终止子片段；

抗虫基因CAL表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQ ID NO:9所示转录调控区的启动子CSV，SEQ ID NO:3所示抗虫基因CAL和SEQ ID NO:10所示3’端的NOS终止子。

2.一种含有权利要求1所述植物多基因表达载体的转化子。

3.一种权利要求1所述植物多基因表达载体在制备转基因植物细胞中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述植物细胞中植物为大豆、棉花或油菜。