CN110878304A - 一种大豆种子特异性启动子的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种大豆种子特异性启动子的应用，属于生物技术领域，涉及到改变经济作物种子品质和产量的应用领域。本发明中种子特异性启动子序列如SEQ ID NO.1所述，克隆该启动子并在拟南芥种子中特异性表达。通过启动子预测分析，分离大豆oleosin基因上游约2000bp序列，将扩增片段与含GUS报告基因的pBI101载体重组，通过根癌农杆菌花序侵染法进行拟南芥转基因功能验证，证明该种子特异性启动子能够正向调控油质蛋白基因的表达，为提高农作物的种子品质和产量提供有利工具。

Description

一种大豆种子特异性启动子的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及到一种大豆种子特异性启动子的应用。
背景技术
培育高油、高质品种是油料作物生产的重要目标之一。相对于传统育种，随着基因工程技术发展应运而生的分子遗传育种具有更快速、高效、精准的优势，进一步提高种子作物的品质和产量也成为农业科学研究的热点。
植物基因的表达调控主要在转录水平上进行，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用，植物基因启动子则是其中重要的顺式作用元件。一般情况下，目标基因可以在一个完整的强启动子调控下进行表达，不同类型的启动子对遗传转化的效果也不同。植物启动子按其转录方式可以分为：组成型、诱导型以及组织(或器官)特异性启动子。其中，组成型启动子在多数植物组织中均可非特异性持续表达，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒胭脂碱合成酶基因NOS启动子等在植物基因工程中已得到广泛应用。美中不足的是，组成型启动子这种高效且非特异性启动外源基因表达的特点容易造成大量异源蛋白或次生代谢物的积累，打破植物原有的代谢平衡，阻碍植物的正常生长。
组织特异性启动子可有效避免上述情况的发生。诱导型启动子、组织特异性启动子都属于特异性启动子。组织特异性启动子可启动外源基因在特定的组织或器官中表达，增加表达物质在目标区域的积累，具有时空特异性。根据其组织与器官的不同、发育进程的不同，可以分为种子特异性启动子、叶片特异性启动子、花特异性启动子、果实特异性启动子以及韧皮部特异性启动子、维管束特异性启动子等。
种子作物与生产发展息息相关，通过基因编辑手段定向提高种子内特定物质的量，进而改变种子品质或产量，符合当下精准育种趋势。因此，对种子特异性启动子的研究具有重要的理论和应用意义。种子作物的种子中富含糖类、蛋白质、脂类等重要物质，种子特异性启动子也大多来源于表达这些物质的基因家族的启动子，比如与淀粉合成相关的gbssⅠ启动子[KluthA,et al.(2002)5’deletion of a gbss1 promoter region fromwheat leads to changes in tissue and developmental specificities.PlantMolecular Biology,49(6):669-682]，将该启动子与gus基因连接后导入小麦中，转基因小麦中gus基因的表达时间与gbssⅠ的表达时间一致，均在灌浆期；芝麻SeFAD2基因的启动子是一种脂肪合成相关的种子特异性启动子[Kim MJ,et al.(2007)The SebHLHtranscription factor mediates trans-activation of the SeFAD2 gene promoterthrough binding to E-and G-box elements.Plant Molecular Biology,64(4):453-466]，另外，脂肪酸延长酶中的3-酮脂酰辅酶A合成酶(FAE1)，其启动子是一种与脂肪合成相关的种子特异性启动子，有研究将其与GUS基因连接转化拟南芥，发现于开花后4-5天鱼雷型胚时期，GUS基因开始转录，在开花后9-11天达到转录高峰[RossakM,et al.(2001)Expression ofthe FAE1 gene and FAE1 promoter activity in developing seedsofArabidopsis thaliana.Plant Molecular Biology,46(6):717-725]；还有一类是与种子贮藏蛋白有关的种子特异性启动子，如伴大豆球蛋白基因启动子[Chiera JM,et al.(2004)Ectopic expression of a soybean phytase in developing seeds of Glycinemax to improve phosphorus availability.Plant MolecularBiology,56(6):895-904]等。
目前，人们已经从植物体内或外源获得了多种类型的启动子，但是现有的针对转基因经济作物切实有效的种子特异性启动子相对不多，尤其是在大豆领域内，相比其他作物种子特异性启动子的数量在应用方面更是少之又少。作为豆科模式植物，针对大豆的种子特异性启动子的研究，将对大豆品种甚至其他油料作物的品种改良具有重要借鉴意义。
发明内容
本发明提供一种大豆种子特异性启动子的应用，具体为该启动子调控作物种子内基因表达、提高种子品质的应用。
所述大豆种子特异性启动子序列如SEQ NO.1所示，还包括与SEQ NO.1所示的序列互补、同源、或该序列经过插入、突变几个核苷酸而形成的具有相同功能的核苷酸序列。
该启动子通过GUS报告基因进行了组织特异性验证，能使下游基因在植物种子中特异高效表达，在其他组织中或发育阶段几乎不表达。该启动子的构建有利于解决大豆种子特异性启动子缺少的问题。
所述大豆种子特异性启动子的应用，步骤如下：
1.种子特异性启动子的克隆
利用SDS法提取大豆基因组总DNA，设计引物扩增目标启动子序列，加入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点，扩增引物为：Forward：5’GTCGACTTCTATTCAGGAGGTGGTTG 3’，Reverse：5’GGATCCGAGTTTTGAGTGAAGAGTGAG 3’。扩增序列大小为1601bp。
将克隆产物与T载体连接，挑单菌落摇菌并提取质粒测序，验证目标启动子序列正确。将测序验证正确的质粒和PBI101双元表达载体用SalⅠ和BamHⅠ限制性内切酶进行双酶切，分别回收的目的片段和载体片段，利用T4连接酶体系进行4℃过夜连接，热击法转化大肠杆菌感受态细胞，37℃复苏1小时后涂LB板(50mg/L卡那霉素)过夜培养，挑取单菌落摇菌并提质粒测序，验证目标启动子序列正确。将上述融合目标启动子的表达载体质粒电击法转化农杆菌感受态细胞，28℃复苏2小时后涂YEP板(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)培养48小时，对各单菌落进行菌落PCR鉴定，阳性单克隆菌落经摇菌扩增后-80℃保存。
2.花序侵染法转化拟南芥
侵染一周前对拟南芥进行打顶，以产生更多的次生花序，浇足水或营养液。
活化上述含目的质粒的农杆菌菌液，扩增收集菌体，重悬于新鲜配置的侵染液待用。
将拟南芥花序浸入侵染液3-5秒，并轻轻晃动，重复两次，滤纸稍微吸干；也可用10μl枪头逐个点花(未授粉的花苞)，并且隔天点一次，持续3-5次即可。
立即将植物移至暗室培养12-16小时后，恢复正常光周期培养。后期按正常培养至收种，单株收种。
3.阳性植株的筛选
阳性苗筛选：将收获的T1代种子经表面消毒后播种于含卡那霉素抗性的MS培养基上，培养7-10天观察，转入了目的质粒的阳性苗会正常生长，不含抗性的幼苗不能长根。阳性苗移入土壤继续生长，正常培养至收种，单株收种。
单拷贝筛选：将收获的T2代种子经表面消毒后播种于含卡那霉素抗性的MS培养基上，如果幼苗长根和不长根的分离比符合3:1，则为单拷贝，移入土壤继续生长，正常培养至收种，单株收种。
进一步的，所述启动子调控的作物基因为种子油质蛋白基因，所述植物为拟南芥。
油质蛋白是一类重要的植物贮藏蛋白，主要在植物种子中表达，在植物其他组织中也可能有少量表达。研究表明，大豆种子中富含油质蛋白，其中油质蛋白基因GmOLE4(基因编号为Glyma20g33850)仅在未成熟种子中有很高的表达量。本发明构建了GmOLE4启动子序列融合的种子特异性启动子重组载体，经转化农杆菌GV3101，再转化拟南芥植株，卡那霉素抗性筛选并获得纯合体后代株系，最后利用GUS底物进行组织染色验证，结果表明GUS基因仅在拟南芥未成熟种子中表达，说明该启动子是种子特异性启动子，能调控油质蛋白基因GmOLE4的表达。以上为所述大豆种子特异性启动子的应用方法，对上述获得的表达种子特异性启动子的单拷贝转基因苗各发育阶段进行GUS底物染色，经脱色、透明，利用体视显微镜进行观察并拍照。结果显示：仅在未成熟种子和种子萌发时期具有较强的GUS活性，在其他组织中基本不表达，说明所获得的油质蛋白基因启动子为种子特异性启动子，它能够增加油体蛋白基因的表达量，具有良好的基因工程应用前景。
本发明所述的油质蛋白基因启动子具有明显的种子特异性特征，与已知的启动子无同源性，是一个全新的种子特异性启动子。通过转基因验证，该启动子能够驱动GUS报告基因在拟南芥未成熟种子中特异性表达。因此，将该启动子用于植物转基因工程中，对提高作物种子内特定物质(如糖类、脂类、蛋白质等)的合成，进而改良作物的种子品质与产量方面有重要应用价值。
附图说明
图1油质蛋白基因GmOLE4在大豆全生育期各组织中的表达分析。
图2种子特异性启动子片段电泳图(左边条带为250bp DNA marker，右边为所克隆的种子特异性启动子)。
图3、图4所述种子特异性启动子序列分析。
图5构建种子特异性启动子与PBI101融合的重组载体简图。
图6所述种子特异性启动子拟南芥转化株GUS组织染色鉴定。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1大豆油质蛋白基因转录水平的相对表达鉴定
1.大豆组织总RNA提取(包括根、茎、幼叶、老叶、花、未成熟种子、成熟种子、幼荚和老荚等)
参照TAKARA RNAiso Plus试剂盒进行
取适量上述大豆组织样品，研磨充分，期间不断加入液氮，直至样品成粉状；迅速将粉末转移至1.5ml液氮预冷的EP管，加入1ml RNAiso Plus抽提液，充分混匀，室温静置5min以上，12000g 4℃离心5min，转移上清至新的1.5ml EP管，加入1/5体积氯仿，用力震荡乳化，室温静置5min，12000g 4℃离心15min，转移上清至新的1.5ml EP管，加入等体积异丙醇，充分颠倒混匀，15-30℃下静置10min，12000g 4℃离心10min，可见白色沉淀。弃上清，加入1ml 75％乙醇清洗沉淀，7500g4℃离心5min，弃上清保留沉淀，干燥(不可加热干燥)，溶解于适量的DEPC处理水，待RNA沉淀完全溶解后，利用超微量分光光度计检测样品RNA的质量和浓度，于-80℃保存。
2.cDNA第一链的合成(20μl体系)
参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒进行
Total RNA 1μg
5×gDNA Eraser Buffer 2μl
gDNA Eraser 1μl
RNase Free ddH<sub>2</sub>O upto10μl
42℃金属浴孵育2min后转移至冰上，依次加入以下试剂并混合：
PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1μl
RT Primer Mix 1μl
5×PrimeScript Buffer2 4μl
RNase Free ddH<sub>2</sub>O 4μl
37℃，15min；85℃，5sec；4℃，-
3.RT-PCR：
根据所述油质蛋白基因的CDS序列设计如下引物，Forward：
5'TACTCCACTCAGGTCGTCAA 3'；Reverse：5'TGTAGATCCACGCCAGCACC3'。
将上述反转录得到的产物稀释5倍，进行PCR扩增。以在大豆中高度保守、并组成型表达的cons6基因为内参，PCR反应体系(25μL)：ddH2O 9.5μL，Mix12.5μL，rTaq酶0.5μL，模板DNA0.5μL，Primer各1μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，退火30sec，72℃30sec，共28个循环；最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物片段大小，并经凝胶成像系统分析内参灰度值，对目的产物进行半定量调试`，结果如图1所示，表明该油体蛋白基因仅在未成熟种子中高丰度表达。
实施例2种子特异性启动子的获得、功能鉴定及应用
1.种子特异性启动子的克隆
利用SDS法提取大豆(品种为“南农99-10”，来源于国家大豆改良中心)总DNA，设计引物扩增目的启动子序列(SEQ NO.1)，加入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点，扩增引物为：Forward：5’GTCGACTTCTATTCAGGAGGTGGTTG 3’，Reverse：5’GGATCCGAGTTTTGAGTGAAGAGTGAG 3’。扩增序列大小为1601bp。
将克隆产物与T载体(购自PROMEGA公司)连接，挑单菌落摇菌并提取质粒测序，验证启动子序列正确。将测序验证正确的质粒和PBI101载体(购自Biovector Science Lab)用SalⅠ和BamHⅠ限制性内切酶双酶切，将酶切回收的目的片段和载体片段在4℃过夜连接，连接产物转入DH5α感受态细胞，37℃恢复1小时后涂板过夜培养。挑取单菌落提质粒测序，验证目的启动子序列正确。将提取质粒经电击转化农杆菌GV3101感受态细胞，测序获得阳性菌株，-80℃保存。
该启动子序列中含有多种与种子特异性表达相关的顺式作用元件，参见图3，图4：如广泛存在于单、双子叶植物种子特异表达基因启动子中的RY MOTIF，对种子特异性基因的高水平表达十分重要。SEF1 MOTIF是SEF1的结合位点，能够增强启动子的转录活性；SEF3MOTIF是胚特异蛋白SEF3的结合位点；SEF4MOTIF是胚特异蛋白SEF4的结合位点；Skn-1motif也是一种胚乳表达顺式作用元件。还有常出现在参与三酰基甘油合成和植物种子特异表达基因启动子中的E-BOX。G-BOX也广泛存在于各种种子特异性启动子中，与邻近元件组合发挥作用，核心序列ACGT的侧翼序列可能在决定特异性结合方面起重要作用。Prolamin box参与醇溶蛋白的表达调控，可影响基因的表达强度。还有一些与种子特异表达有关的元件，如AACA、ACGT、ABRE MOTIF种子特异元件，以及增强转录活性的CAAT-box顺式作用元件。
2.农杆菌介导的拟南芥转基因体系
(1)花序侵染法转化拟南芥
①挑取经活化的含目的质粒的农杆菌单单菌落至5ml含合适抗性的YEP液体培养基(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)，28℃，200rpm震荡培养过夜。
②取上述菌液1ml接至100ml含合适抗性的YEP液体培养基，28℃，200rpm震荡培养，至菌液OD600值达2左右，立即5000g室温离心20min，收集菌体。
③重悬菌体于新鲜配制的侵染液(1/2MS液，0.01μg/ml BAP，5％蔗糖，0.05％Silwet L-77，KOH调pH5.7)，使OD600为0.8左右。
④侵染：将拟南芥花序浸入侵染液3-5秒，并轻轻晃动，重复两次，滤纸稍微吸干；也可用10μl枪头逐个点花(未授粉的花苞)，并且隔天点一次。立即将植物移至暗室培养12-16小时后，恢复正常光周期培养。一般侵染持续两周左右，后期按正常培养至收种，单株收种。
(2)单拷贝纯合植株的筛选
将收获的T1代种子经表面消毒后播种于含卡那霉素抗性的MS培养基上，培养7-10天观察，转入了目的质粒的阳性苗会正常生长，反正不含抗性的幼苗不能长根，阳性苗移入土壤继续生长。此外，提取野生型及转基因植株的gDNA，从基因组水平PCR鉴定转基因植株是否成功转入目的片段。此后正常培养至收种，单株收种。
将收获的T2代种子经表面消毒后播种于含卡那霉素抗性的MS培养基上，如果幼苗长根和不长根的分离比符合3:1，则为单拷贝，移入土壤继续生长，正常培养至收种，单株收种。
将收获的T3代种子经表面消毒后播种于含卡那霉素抗性的MS培养基上，具有100％卡那霉素抗性的转化苗即为转基因阳性纯合体植株。
(3)GUS组织表达活性的检测
对构建的种子特异性启动子表达载体转化的拟南芥阳性纯合体株系进行各发育阶段的GUS组织染色。选取幼苗阶段10d、16d和25d，幼果荚期(含茎叶花)，以及开花后5d、11d、15d、20d的荚果，放入新鲜配制的GUS染液，37℃避光染色。根据组织器官的不同，染色时间也不同，一般种子和荚染色时间较长。染色后各组织经乙醇脱色完毕后，经透明液透明(幼苗、根尖等组织透明5-l0 min左右；荚子、种子等组织需透明几小时乃至过夜)，然后利用体视显微镜观察并拍照，如图6所示。
染色液配方：1)X-Gluc母液：X-Gluc粉末用N-N-二甲基酰胺(DMF)配制成20mM的贮存液，避光-20℃保存(一般有效期1个月)。2)X-Gluc基液(50mM PBS，pH7.0)：50mM NaH2PO4，50mM Na2HPO4，10mM Na2EDTA，0.1％Triton-100，1mM K3[Fe(CN)6]，0.5mM K4[Fe(CN)6]，4℃保存。
染色结果表明，GUS基因只在未成熟种子和种子萌发时期表达，而在其他组织中基本不表达，说明了所获得的油质蛋白基因启动子是种子特异性启动子，能够正向调控种子内基因表达，具有良好的基因工程应用前景。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种大豆种子特异性启动子的应用
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1601
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 1
ttctattcag gaggtggttg ggttttgcta tggtgcagca caatgaagtt cagcagcatt 60
atttgcaaca tggtcttctg tttcggggta agaaatttcg taggtttcct tatttgtttt 120
ggcacgctct atgaagcaca attacatctt tcttgttcaa agtgtcttta tgtccgacat 180
atttctaata ccagcatatt caatactgtt cgatatttat ctgacatttt attgaatttt 240
ttttttacgt aaacactcaa actatcacct ttacataatt aatacactta aaaaatataa 300
aatattaatt ttaaaaaata aaatatatca tcaatttaca tattttgttc tatattattc 360
atgttttatt taattaaaat ctttttgttt gttagtgtct tatattttaa atattaacca 420
tattgaaata tttgtgtggt gttcgatatc ggtatcatag tcggtgcttc acagggcatg 480
ctatttgcga gtgtctatgg actatggttg ctgcggaata aagtggtttt ccaaaatgtg 540
atttcggatg tgtatggtat gctgtcgcac atccgacgta tttcttggat ttggctatac 600
agggtcccct tctctggtag tggtggtgta gtgtttggaa actggtgtat ttgtcccctg 660
gattgcttac ggtgtgtatg ttagagaccc tattatgctc ctttattacg atctgatgta 720
atctttattg tatttgggtc acattttatg gctcttaata atagtatttg attttaattt 780
tcagaaagaa aaaaaaacaa aatagtgtgt ataaaattat tataaacttt tagtatatat 840
atatatatat atgattctta cttataaaaa aataattaca ccaataaatt catcctcaaa 900
tattacgtta tgaaatcaga gctattttag ttatgcatat gcaaatgtct taattttttt 960
ttcttaacct atttttttta tttgctcttc tatataaaat cactctaata agattgtctt 1020
cgctggagtt tacctgtaac ttataccaaa aattataaaa tcgctctaag ggaagatatg 1080
agtatgactg atcccttgtt atattcatgc aaattatatg gtgtgttcgt tctgatataa 1140
atcgataacg tttagtggat ataattgtta gagaaagtag aagccttatc ttatcttggt 1200
atgttaaaac ggttttatta cattttctat cattgcaatt aatcattaaa caaaaacaga 1260
aaatcctagc acataacata tatatgaaca taaccataga agagcggcac gtacatatgt 1320
tggcctagga tcgttgttaa gtgttaacgc tggtccaaaa catgcaacaa acaacaacca 1380
agaaaaaaaa aaaaaaggta cgtacaaaaa acctaacgtg tcatcaaaca catgcatggg 1440
ttttgcatgc aagccttgca tgaaaagctt gccaacacgt gccaaaccac ctcctcaggt 1500
gttgccaccc aagcctccac tcaccaattt ctccatttat accctcatta ccaccacctt 1560
aaaccctacc acattaatta ctcactcttc actcaaaact c 1601

Claims (5)

1.一种大豆种子特异性启动子的应用，其特征在于，所述应用为该启动子在调控作物种子内基因表达、提高种子品质方面的应用；所述大豆种子特异性启动子序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大豆种子特异性启动子序列还包括与SEQ NO.1所示的序列互补、同源、或该序列经过插入、突变几个核苷酸而形成的具有相同功能的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）种子特异性启动子的克隆；
（2）花序侵染法转化植株；
（3）筛选阳性植株。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述启动子调控的作物种子内基因为种子油质蛋白基因。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植株为拟南芥。
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