CN112011541B

CN112011541B - 甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子及其应用

Info

Publication number: CN112011541B
Application number: CN202010956413.2A
Authority: CN
Inventors: 卢坤; 刘绪梅; 段回春; 曲存民; 李加纳
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: CN112011541A

Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子及其应用，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，能够在拟南芥的根、叶、茎、花、角果、种子等组织中都具有很强的表达；表明该序列具有很强的组成型启动子的表达活性与特征，并能作为强组成型启动子应用于植物基因工程研究中。因此，该启动子不仅创建优良种质资源等基因工程研究方面，具有良好的应用潜力，且可代替目前植物基因工程研究中常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，构建植物转基因表达载体，应用于植物基因工程，广泛培育具有较高生物安全性转基因植物。

Description

甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子，还涉及该启动子的应用。

背景技术

我国是世界上最大的油菜(Brassica napus)生产国和菜籽油消费国，每年可提供优质食用油约520万t，占国产植物油的47％。但是，目前我国食用植物油供给形势仍较为严峻，自产量不足，严重威胁到了我国的食用植物油安全。油菜生产主要利用冬闲田，不与粮食作物争地，目前长江流域尚有冬闲田66hm²以上，具有巨大的发展油菜产业的潜力。

植物基因启动子在基因的表达调控中起着关键作用，位于结构基因5'端上游区域，可被RNA聚合酶识别并与其结合，并准确起始转录一段含有顺式作用元件的特异DNA序列。启动子作为重要的顺式作用元件不但决定着转录方向、效率和其使用的RNA聚合酶的类型，而且通过与转录因子结合，还精确的控制基因表达的时间、空间以及强度。根据启动子的转录模式可分为组成型、组织特异型和诱导型启动子。组成型启动子控制的基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部位表达水平没有明显差异，其特点是表达持续、RNA和蛋白表达量相对恒定，不表现出时空和器官特异性、不受外界因素的诱导。因此，进行启动子研究对基因表达调控机制和植物基因工程方面具有重要的科学意义。

基因工程的研究与应用离不开启动子，挖掘有应用价值的启动子一直是植物分子育种的重要研究领域。近些年来，有关油菜启动子的研究不断有报道。阳永学(2016)等克隆油菜半胱氨酸蛋白酶家族基因BnCP51的启动子序列，通过转基因功能验证该启动子仅在花蕾和花药器官中表达，是一种组织特异型启动子；陈松(2017年)等研究表明油菜ALS基因启动子能驱动GUS报告基因在烟草幼苗各个器官中表达，是一个强组成型启动子；华兆晖(2018年)等从油菜中克隆BnaC05g31880D的启动子，验证该启动子驱动的下游基因在根、茎、叶、花、角果皮、胚珠、种皮和成熟种子中都有很强表达，也是一种组成型启动子。相信随着时间，会越来越多油菜基因的启动子被发现和应用。

目前在基因工程研究中应用较多的启动子，主要为花椰菜花病毒的启动子(CaMV)35S，是一个来源于植物DNA病毒的组成型表达的启动子，可驱动外源基因在大部分植物中表达。但毕竟不是来源于植物，在植物基因工程中应用此启动子会存在潜在的生物安全风险。所以，挖掘新的高表达活性且生物安全风险相对低的植物来源的启动子显得尤其重要。油菜是重要的食用油来源，通过转基因来提高油菜的产量、含油量和抗性等性状是科研工作者炙手可热的课题，那么筛选油菜内源的组成型表达启动子就很有必要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子；

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

IDD基因家族是广泛存在于植物中的一类Cys₂His₂锌指结构(C₂H₂)转录因子，涉及植物生长发育的多个调控途径，对作物产量具有较为重要的影响。从芸薹属基因表达数据库(BrassicaEDB v1.0)中，提取Bna.A08IDD7基因表达模式为组成型表达。Bna.A08IDD7基因的启动子序列含有多个顺式作用元件，如含有光响应元件(ACE、AE-box、ATAC-motif)、TATA-box、激素反应元件，如含有赤霉素响应(GARE-motif、P-box、TATC-box)和水杨酸响应(TCA-element)元件等，甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的目的之二在于提供含有所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子的重组载体，提供如下技术方案：

含有所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子的重组载体。

本发明的目的之三在于提供扩增所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子的引物，提供如下技术方案：

扩增所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第13～37位和SEQ ID NO.2的第15～39位所示。

本发明的目的之四在于提供所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子在转基因植物中组成型表达目的基因的应用，提供如下技术方案：

本发明通过实验分析，发现Bna.A08IDD7基因的启动子呈现出很强的组成型特性，在启动子转基因拟南芥中，其所驱动的报告基因GUS在转基因拟南芥的根、茎、叶、花、角果皮、种子中都有强表达，这些数据充分表明Bna.A08IDD7基因的启动子是一个强的组成型表达启动子，在植物转基因育种组成型表达目的基因具有良好的应用前景。

本发明的目的之五在于提供所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子在替换花椰菜花叶病毒35S启动子构建植物转基因表达载体中的应用，提供如下技术方案：

所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子在替换花椰菜花叶病毒35S启动子构建植物转基因表达载体中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明克隆了甘蓝型油菜基因Bna.A08IDD7启动子序列，通过生物信息学软件预测了序列所包含的启动子元件，并通过构建植物表达载体对其启动子活性进行了定性检测，结果表明所克隆序列能驱动GUS报告基因在植物幼苗、根、茎、叶、花、角果皮和种子中表达，表明该序列具有强的组成型启动子的表达活性与特征，并可以作为强组成型表达启动子应用于植物基因工程研究中。

育种专家可利用其组成型表达特性表达目的基因来用于人工创建优良种质资源等方面，对于现代农业具有良好的应用潜力。

该启动子可替代目前植物基因工程研究中常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，构建植物转基因表达载体，用于植物的基因工程，降低转基因植物的生物安全风险。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为pCAMBIA1305.1-Bna.A08IDD7::GUS启动子载体示意图。

图2为Bna.A08IDD7基因启动子扩增产物条带图。Maker为2000bp，泳道1、2表示获得1925bp启动子扩增片段。

图3为T-Bna.A08IDD7-Pro菌检条带图。Maker为5000bp，PCR检测含T-Bna.A08IDD7-Pro载体的克隆菌，泳道10、12和21表示阳性克隆菌。

图4为pCAMBIA1305.1-Bna.A08IDD7::GUS菌检条带图。Maker为2000bp，PCR检测含pCAMBIA1305.1-Bna.A08IDD7::GUS载体的克隆菌,泳道1～6、9～11和13～24表示阳性克隆菌。

图5为Bna.A08IDD7基因的组成型表达模式图。

图6为Bna.A08IDD7基因启动子转基因拟南芥的GUS组织化学染色图(其中各图表示的是：A苗期B.花蕾及茎C.花D.茎生叶E.嫩荚果(花后10d)F.幼嫩种子(花后10d)G.成熟荚果H.成熟角果皮I.成熟种子。从染色结果可以看出，各个组织都有蓝色显示，表明Bna.A08IDD7基因启动子为组成型启动子)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子克隆

在NCBI上查找甘蓝型油菜Bna.A08IDD7翻译起始位点(ATG)上游2000bp的启动子序列，利用Primer Premier 5.0设计克隆其启动子片段的PCR扩增引物Pro-Bna.A08IDD7-F/R和载体通用引物pM13F/R，在启动子扩增前引物5’端加上BamHI酶切位点，后引物5’端加上NcoI酶切位点。表1为设计的引物序列。

表1、Bna.A08IDD7基因启动子扩增引物和载体通用引物序列

以甘蓝型油菜ZS11的基因组DNA为模板，使用TAKARA公司提供的高保真酶

扩增。扩增体系(50μL)：

PCR反应程序：98℃预变性30s；98°℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸120s，35个循环；72℃延伸10min。

扩增产物进行电泳检测，凝胶成像系统检测条带片段是否正确，结果如图2所示。检测正确后，回收目的条带。采用Bioer公司提供的胶回收试剂盒Biospin Gel ExtractionKit进行胶回收，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

实施例2、植物启动子载体构建

将PCR回收产物连到全式金公司提供的的平末端T载体pEASY-Blunt simplecloning vector上，转化大肠杆菌DH5α感受态；利用菌落PCR选择测序结果正确的菌液扩繁，提取包含Bna.A08IDD7基因启动子序列的质粒T-BnaIDD7-pro，检测结果如图3。利用Thermo scientific公司的限制性内切酶BamHⅠ和NcoⅠ，对T-BnaIDD7-pro载体和目的载体pCAMIBIA1305.1进行双酶切；随后采用Promega公司提供的T4 DNA Ligase将Bna.A08IDD7基因启动子片段与完全酶切的pCAMIBIA1305.1载体骨架进行连接，以Bna.A08IDD7基因启动子替换pCAMIBIA1305.1(Ping Li，Yan Pei，Xianchun Sang，Yinghua Ling，ZhenglinYang，Guanghua He，Transgenic indica rice expressing a bitter melon(Momordicacharantia)class I chitinase gene(McCHIT1)confers enhanced resistance toMagnaporthe grisea and Rhizoctonia solani，2009)载体上的35S启动子，构建植物表达载体pCAMBIA1305.1-Bna.A08IDD7::GUS，结构如图1所示。酶切体系和连接体系如下表1和表2所示：

表1、酶切体系

表2、连接体系

将得到的目的载体pCAMBIA1305.1-Bna.A08IDD7::GUS转大肠杆菌DH5α感受态，在LB(Kan)固体培养基上筛选，挑选单克隆于800μL Kan(50mg/L)的LB液体中进行摇菌，利用引物对pM13R+Pro-Bna.A08IDD7-F及pM13F+Pro-Bna.A08IDD7-R对摇至浑浊的菌液进行PCR检测，结果如图4所示。挑选扩增片段大小与预测相一致的阳性克隆子送华大公司测序，测序正确的菌液摇菌，提取质粒。

实施例3、植物重组表达载体转化根癌农杆菌GV3101

农杆菌感受态为实验室购买，采用液氮冷激法将构建好的pCAMBIA1305.1-Bna.A08IDD7::GUS表达载体质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞中。

具体操作：取1管100μL，-80℃保存的农杆菌GV3101感受态，冰水浴解冻后加入pCAMBIA1305.1-Bna.A08IDD7::GUS表达载体质粒，用枪头轻轻混匀，先冰水浴5min，液氮冷击8min后迅速在37℃水浴锅中热激5min，在超净工作台加入800μL空白YEB液体培养基后于28℃、180r摇床复苏3h，复苏结束后于室温5000rpm离心5min。吸取600μL上清，剩下菌液重悬，均匀涂布于添加抗生素Kan 50mg/L+Gen 25mg/L+Rif 20mg/L+Str 25mg/L的YEB固体培养基上，放入28℃培养箱倒置培养2d，挑取单斑菌落。将菌落接种于添加抗生素Kan 50mg/L+Gen 25mg/L+Rif 20mg/L+Str 25mg/L的YEB液体培养基，28℃、250rpm摇至浑浊。利用引物对pM13R+Pro-Bna.A08IDD7-F及pM13F+Pro-Bna.A08IDD7-R进行菌落PCR检测，选取正确的菌液在超净工作台上加入等量50％甘油后于-80℃保存，用于后续拟南芥转化。

实施例4、农杆菌浸染转化拟南芥

将上述保存的菌液取200μL，添加到200mL YEB液体培养基(含抗生素Kan 50mg/L+Gen 25mg/L+Rif 20mg/L+Str 25mg/L)中，于28℃、250r摇床摇菌培养48h，培养到OD600＝1.0即可准备浸染。将培养菌液转入50mL离心管中，4℃，5000rpm离心20min,弃上清，用重悬液(200mL ddH₂O+10g蔗糖+100μL silwet L-77+0.1gMES+0.05g乙酰丁香酮)均匀重悬至OD600＝0.8左右。将拟南芥花序浸泡在浸染液中静止30s，取出放在塑料盘中用黑色塑料膜覆盖保湿，暗培养24h后解开薄膜，在正常条件下继续培养转化后的拟南芥植株，之后再重复浸染两次，直至收获。取T₃代转基因阳性植株进行GUS染色试验。

GUS组织化学染色具体方法如下：

配制GUS染液(1L)：0.1mol/LK₄[Fe(CN)₆]，0.1mol/L K₃[Fe(CN)₆]，10mmol/L EDTA(PH＝8.0)，20％甲醇，0.001％Triton X-100，0.2mol/L磷酸缓冲液(PH＝7.0)，0.5g/L X-Gluc(先溶于DMF，需现配现用)。

GUS染色步骤：取拟南芥不同时期组织进行GUS染色。具体步骤如下：首先取新鲜的组织置于合适的管中，加入90％丙酮溶液固定20min后，弃丙酮，加适量GUS染色(不含X-Gluc)润洗一遍，加入GUS染液，进行真空处理20min来加快染液吸收。37℃恒温避光处理12～24h，之后用75％乙醇脱色12h，再更换75％乙醇一次。脱色完成后，利用体视镜(OlympusSZ61)进行观察拍照。植株着色为蓝色的即GUS基因表达的部位，即启动子发挥功能启动下游基因的部位，染色越深表示启动子在该部位表达越强。

GUS染色结果：转基因拟南芥的苗期、根、茎、叶、花、角果皮、种子都有强表达，如图6。表明Bna.A08IDD7基因启动子为组成型表达启动子，其表达模式如图5所示。

实施例5、启动子序列分析和功能预测

利用PlantCARE数据库对Bna.A08IDD7基因启动子扩增序列中的顺式作用元件进行分析，结果表明甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子含有大量核心元件TATA-box和CAAT-box及许多其他重要的顺式作用元件，包括许多光响应相关调节元件，如Box 4、LAMP-element和GT1-motif等，也有与干旱诱导有关的顺式调节元件MBS和参与赤霉素调控反应的顺式调节元件TATC-box和GARE-motif等，调控核心软件元件如表3。

表3.Bna.A08IDD7基因启动子核心调控元件

因此，本发明的启动子具有强的组成型启动子的表达活性与特征，并可以作为强组成型表达启动子应用于植物基因工程研究中。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcggatccg cgtgatttgt gtccatagct cgatgta 37

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgccatgg catgtctttg ttcatcatca tcagtatta 39

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 5

<211> 1925

<212> DNA

<213> 人工序列(Brassica napus)

<400> 5

tgatttgtgt ccatagctcg atgtatatat aaagtaggtt agggcatgtg tcactgaata 60

aatttttgcg tccactgaac catagttaat cattcaatta tattttctcc tttaacatga 120

aaaatcctca agaacccaat aaaaaaagaa aagtgaacct ttctcccttt taatcaatga 180

atcaatcatg tatagtactg taatttacaa aaaaaaaaag tattctctgt tggttagggt 240

cttaaagttt gaggtttcgc gatgcctgag atttaattgg ccatacaaga atttgtttgc 300

atattatata ctcttttata ttttaaactg atcataactt caaaatattc acatataaca 360

aacacaaaga aaattaaact agaaatgttt tatattgata tttcaaaatg ttagaagttt 420

tttagatcat tttttatttt ctcaaaacta tgttaccaaa tatatttaag aaaatttgat 480

cttataacaa aaaataaaat atttcaccaa ctaatcatat tatcccattt ttctcttcct 540

gtttctcttt actttttact acaaatctag tatttttttc aatatcattc atcaaattaa 600

cctttatatt taatagtcta ttttgtagtt tgttgaatat tttttttatt tatagtgtta 660

cttataacaa agtaacatta gcaatatgtg tgttactttt ttaatatgtg tgttttgact 720

aaaatatctt atatttatga atggaagtat aattttgaag tcaatcaaga ttactcaaaa 780

ttatagcacg gaaatcataa aaaattgttc aataacaaaa aaaaaagata tttaaacatg 840

ggagtgggag tgcaaatttt tgttcatttt atacaacaca catcaatatt caaaacatga 900

ttatatataa ttttagatga attgacaatg ttgttacaaa agtagaaacc aataaattac 960

agattctgtt ccacaaaaca cagtacaatt atgaagactg gaataataaa aactattaat 1020

agtgagtgca tgcacgaaag cgaattcaaa catgtcttct cactatctcg agaaacgtac 1080

aaacttacaa tcctctttct gcaagctttt cacacaactg tgcgagaaag tatataaaaa 1140

tttggcccac ctttctttat caaaacaaaa aaaattatat aaaaaacagt ttcccaataa 1200

ccatattgta tgaaaaacgg tgataataat ttaaaaggac agactgctct gtgcttctgt 1260

gtaagctgta aattattatt tataatttct tttttccatt agcagtaggg ttccccattg 1320

ctattattat tattttcttt taaattccga atttataagc ttcaaatata acacaaagag 1380

agaaagataa tagagtttct tctcttgtcc acaatctctc tcttctctcc cctcttcttc 1440

taggtattgt ggatttactt ccttcttcct tcttgctttt tttttcttat tttgttattg 1500

attgttgtgt gctcttgttg tttgttaatg tttctttgga gtgttgttgg taaaaagcaa 1560

gccttaaaag ctttcttgtt caagtttgaa acgaacaaga acaaaactct ggttcttatg 1620

ttcagctttc aaacaaactt tctctcttga catatcttgg actttgggtc ttattattat 1680

ttttgatttt cccataagct aaagcttgtc tcttgggttg aagccaacca agaaagctta 1740

atttaaatag ctatataatt atatatgggt ttcaagaact tcttggatgt ttctgcttga 1800

gtcttctttt tgctagtttc cccactacta tttgtctgct ttttactaat tacatacaca 1860

gatctgaatt tttttgtttt attaattctt attaaggttt taatactgat gatgatgaac 1920

aaaga 1925

Claims

1.甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子，其特征在于：所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.含有权利要求1所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子的重组载体。

3.扩增权利要求1所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子的引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第13～37位和SEQ ID NO.2的第15～39位所示。

4.权利要求1所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子在转基因植物中组成型表达目的基因的应用。

5.权利要求1所述甘蓝型油菜Bna.A08IDD7基因启动子在替换花椰菜花叶病毒35S启动子构建植物转基因表达载体中的应用。