CN105647925B - 一种水稻花药强表达启动子OsAnth4及其应用 - Google Patents

一种水稻花药强表达启动子OsAnth4及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水稻花药强表达启动子OsAnth4及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒和重组表达载体。具体而言，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻中一段具有转录调控活性的DNA序列。本发明将上述启动子应用在作物基因工程中，用于培育转基因植株。本发明提供的启动子可以特异地驱动目标基因在花药中强表达，从而可有效用于水稻育性改良，应用于杂交水稻育种。本发明将水稻花药强表达启动子连接于载体中具有改善水稻花药性状功能的基因上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，进而获得相应转基因植株。该植株中，启动子能够驱动目标基因在花药中特异表达，进而改善水稻的育性。

Description

一种水稻花药强表达启动子OsAnth4及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻花药强表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在花药中强表达，从而改良作物育性。
背景技术
启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，调控基因在不同发育阶段及组织中表达。启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。深入研究这些启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。
根据启动子的转录模式及功能，可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。目前，在植物基因工程中使用的大多数为组成型启动子，使外源目的基因在植物各组织部位高水平表达，但是，在此过程中会出现多种多样的问题，例如不能从时间和空间上有效的调控目的基因的表达，过度消耗细胞内的物质和能量；大量异源蛋白或代谢产物在植物体内积累，打破植物的代谢平衡，不利于植物生长；引起基因沉默或共抑制现象；此外还存在转基因植物安全性隐忧。因此，科学家们不断寻找更为有效的组织或器官特异性启动子来代替组成型启动子，以期更精确的调控外源基因的表达。
组织特异型启动子仅在特定的组织器官或细胞类型中具有驱动能力，其活性可能受发育信号的影响。在基因工程中，组织特异型启动子控制了所驱动基因表达产物在特定器官或组织中积累，限定了目的基因的作用范围，避免了非必要组织中范式表达造成的物质能量浪费，特别适用于有组织针对性的遗传改良和生物反应器的应用。
花药特异性表达启动子与育性的研究密切相关。因此，目前研究人员经常采用花药特异启动子来进行雄性不育系的培育。优良的雄性不育系在杂种优势的利用上起着重要的作用。从分子水平上揭示花药花粉基因特异表达调控的机理，越来越受到重视，因此开发和利用新的植物花药花粉特异表达启动子具有重要的理论及实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种驱动目的基因在水稻花药强表达的启动子，获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“作物”是指禾谷类作物，例如水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦等，优选为水稻。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻花药强表达启动子，所述水稻花药强表达启动子OsAnth4包含下述序列之一或者下述序列的互补序列之一：
(a)序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(b)序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(c)在序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(d)在序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(e)与序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；
(f)与序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；
(g)在序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(h)在序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(i)序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(j)序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(k)与带有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；
(l)与带有序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。
优选地，所述水稻花药强表达启动子由序列表中SEQ ID No:1或2所示的DNA序列构成。
序列表中SEQ ID No:1或2所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)的序列，本文中称为OsAnth4或启动子OsAnth4。具体而言，本申请的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到了序列表中SEQ ID No:1或2所示的DNA序列，并且发现该DNA序列具有驱动目标基因在水稻花药特异性强表达的作用。
需要说明的是：序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列与序列表中SEQ ID No:2所示的DNA序列相比，序列开头多出22bp，即“acaatcgttc tcaaacactg cg”其为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾多出22bp，即“tctcgatctt cttggatggc at”，其为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)；序列表中SEQ ID No:2所示的DNA序列为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻花药强表达启动子的表达盒。
又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻花药强表达启动子。在所述重组表达载体中，所述水稻花药强表达启动子连接于待表达的基因序列的上游，待表达基因可以为任何对水稻的花药性状具有改善能力的基因，通过本发明的启动子驱动该基因在花药中特异性地集中表达，从而实现改善水稻花药相应性状的功能；优选地，所述待表达的基因为Gus基因。
又一方面，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsAnth4，该重组表达载体为将SEQID No:1所示的序列即OsAnth4或启动子OsAnth4构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsAnth4。
另一方面，本发明还提供一种利用所述的水稻花药强表达启动子OsAnth4获得相应宿主菌的方法，所述方法包括将所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth4、所述的表达盒或者所述的重组表达载体，利用冻融法转入根癌农杆菌。
另一方面，本发明提供一种利用所述的水稻花药强表达启动子OsAnth4获得相应转化子的方法，所述方法包括将上面所获得的宿主菌通过农杆菌介导方法对目标细胞、愈伤组织或植株进行转化，获得相应转化子。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
再一方面，本发明提供上述水稻花药强表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻花药强表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育，进而获得相应转基因植株，优选地，所述待表达的基因为结构基因、调节基因、结构基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。
另一方面，本发明提供一种在植物的花药中驱动特定目的基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：
A)、将所述的水稻花药强表达启动子OsAnth4连接于目的基因的上游；
B)、将所述水稻花药强表达启动子OsAnth4与目的基因的结合产物转入到根癌农杆菌中；
C)、利用转入了所述结合产物的根癌农杆菌对目标植物的种子进行农杆菌转化；
D)、利用转化后的种子培育相应植株，在所述植株中，权利要求1中所述的水稻花药强表达启动子OsAnth4能够驱动目的基因表达。
综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)中一段具有转录调控活性的DNA序列，并将其命名为OsAnth4(序列表中的SEQ ID No:1或2)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在花药中特异性强表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，GUS强烈着色于花粉和花药壁上，在颖壳和花丝基部有不显著染色，从而证明该序列具有驱动基因特异的在花药中强表达的活性。
本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的目标基因连接，构建重组表达载体，经转化后，可在花药特异的驱动目标基因的表达。
技术效果
本发明所克隆的水稻启动子OsAnth4能够调控基因在植株花药中集中表达，具有重要的理论及实际意义。通过该启动子对农作物的育性进行基因改造，获取优质的雄性不育系，用于作物杂交育种。为揭示花粉花药发育机理的分子水平研究提供实验材料。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将OsAnth4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-OsAnth4示意图，其中示出了利用OsAnth4启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；
图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
图3为10周龄OsAnth4-GUS转基因植物各组织GUS染色图。(A)根；(B)茎；(C)成熟叶片；(D)小花；(E)雄蕊；(F)花药。标尺为1mm。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
含有酶切位点的OsAnth4启动子的获得
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsAnth4基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:3)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:4)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下：
正向引物：AAGCTTACAATCGTTCTCAAACACTGCG HindIII
反向引物：GGATCCATGCCATCCAAGAAGATCGAGA BamHI
由深圳华大基因公司合成。
步骤2、启动子OsAnth4的获得
以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsAnth4，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1872bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsAnth4，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
作物表达载体的构建和农杆菌的转化
从上面“启动子OsAnth4的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和BamHI双酶切，回收启动子OsAnth4片段。同时利用HindIII和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsAnth4片段和pCAMBIA1391片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsAnth4与Gus基因融合的重组表达载体pCAMBIA1391-OsAnth4(图1B)，利用冻融法将重组表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
利用启动子OsAnth4驱动Gus报告基因在水稻中表达
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用上述“作物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
步骤2、GUS组织化学染色
参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色。脱色时在37℃条件下用75％乙醇处理，至组织中叶绿素完全脱掉。结果见图3(需要说明的是，鉴于专利文本中不接受彩色图片，因此，本申请的发明人将彩色的图3修改为灰度图像，但是，即便这样，基于图3中的颜色深浅度，也可以清晰地分辨出各部位是否发生染色)，各组织于GUS染液中染色1h后，在雄蕊组织有代表GUS活性的蓝色出现，而在根、茎、叶等营养组织中无表达。组织放大后表明GUS强烈着色于花粉和花药壁上，在颖壳和花丝基部有不显著染色，因此实验表明OsAnth4启动子具有花药强表达活性，同时在植物其他组织中表达极微弱。
实施例2
为了验证本发明的序列表SEQ ID No.2中的序列同样具有启动子功能，本发明对该序列利用其他引物也进行了类似于上面实施例1的实验，即：以水稻品种日本晴DNA为模板，利用新的正向引物、反向引物进行启动子扩增；回收PCR扩增的目的片段，连接到PGEM-T-Easy载体，转入到激活的感受态细胞；然后，将其和pCAMBIA1391片段用T4连接酶进行连接获得相应作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；对成熟水稻种子进行农杆菌介导的水稻遗传转化，培育再生植株培养；最后进行染色验证。
经实验验证，序列表SEQ ID No.2中的序列也具有驱动Gus基因在花粉中强表达的作用。由于实验方法和结果与实施例1类似，这里不再详述。
虽然本发明以水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用场景不限于水稻，本发明启动子可以用于各种禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Figure IDA0000950322740000011
Figure IDA0000950322740000021
Figure IDA0000950322740000031
Figure IDA0000950322740000041

Claims (2)

1.一种水稻花药强表达启动子OsAnth4在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述水稻花药强表达启动子OsAnth4连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，进而获得相应转基因植株，所述待表达的基因为结构基因、调节基因或者结构基因的反义基因，所述水稻花药强表达启动子OsAnth4由序列表中SEQ ID No:1或SEQ ID NO:2所示的DNA序列构成，所述水稻花药强表达启动子OsAnth4能够驱动待表达的基因表达，所述待表达的基因是具有改善花药性状功能的基因，
其中，序列表中SEQ ID No:1为：
Figure FDA0001921903800000011
Figure FDA0001921903800000021
序列表中SEQ ID No:2为
Figure FDA0001921903800000022
Figure FDA0001921903800000031
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良作物生长特性，所述作物为水稻。
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