CN104651359A - 从玉米中分离的双向启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从玉米中分离的双向启动子及其应用，属于植物双向启动子的分离和应用领域。本发明从玉米中分离获得核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的双向启动子。本发明将SEQ ID NO.1所示序列截短获得SEQ ID NO.7-12所示的6个启动子缺失片段。本发明进一步公开了含有所述双向启动子的重组植物表达载体以及含有表达载体的重组宿主细胞。功能转化实验证明，本发明所分离的双向启动子以及六个启动子缺失片段能够驱动报告基因GUS和GFP在植物组织中进行双向表达。本发明双向启动子以及启动子缺失片段在构建双价植物表达载体、改良植物性状以及培育植物新品种等方面应用广泛。

Description

从玉米中分离的双向启动子及其应用

技术领域

本发明涉及从植物中分离的启动子，尤其涉及从玉米(Zea mays)中分离的双向启动子及其应用，属于双向启动子的分离和应用领域。

背景技术

通过导入外源基因使植物获得新的性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的。花椰菜病毒CaMV 35S启动子以及玉米UBI启动子作为稳定、高效的外源启动子，一直被人们广泛的使用。然而在转基因过程中，由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其是进行多个基因导入时，基因沉默现象会更严重，以至严重影响了转基因植株的获得和后代的稳定性。在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因的表达量、表达时间和位置的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，但使用35S启动子或者玉米UBI启动子很难达到这样的要求，这些都是植物基因工程中亟待解决的技术问题。

对于转基因引起的基因沉默现象人们已经有了比较深入的认识，引起转基因沉默有多种因素，其中最主要的就是重复序列的产生，尤其是多个基因导入时，更人为的造成了多个35S启动子插入的情况，对此至今尚无有效的解决方法。随着基因组学的发展，多种生物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为利用植物自身的双向启动子进行转基因操作从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。通过表达载体将最大数量的基因整合到植物基因组中，需要限制用于表达转基因核酸的调控序列的数量和大小，双向启动子为实现该目标功不可没。双向表达系统允许以化学计量学的方式控制转基因的表达，此外，由于双向表达的缘故，一个表达控制序列能控制两个目的基因的表达，能够有效降低导入生物体重进行异源基因表达的表达盒数量并能有效避免多基因插入引起的基因沉默现象。

玉米(Zea mays)是中国最大的粮食作物，也是重要的转基因作物。从玉米中分离获得双向启动子，可以利用双向启动子将两个目的基因在植物中进行双向表达并有效避免多基因表达所存在的基因沉默现象。

发明内容

本发明目的之一是提供从玉米(Zea mays)中分离的双向启动子。

本发明目的之二是提供含有上述双向启动子的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的双向启动子以及含有该双向启动子的重组表达载体应用于构建转基因植物、改良农作物性状以及培育具有优良性状的植物新品种等方面。

为实现上述目的，本发明首先提供了从玉米(Zea mays)中分离的双向启动子，其多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示:

(a)、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的多核苷酸序列；或

(b)、分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有双向启动子的功能；或

(c)、分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能；优选的，分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能；更优选的，分别与SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能。

本发明将SEQ ID NO.1所示的ZmBD1全长启动子从5’端开始逐渐删除部分序列得到六个截短的启动子缺失片段，这六个启动子缺失片段的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；本发明在这6个启动子缺失片段的两端各融合一个报告基因GUS/GFP，构建得到稳定表达的双向表达载体；转化实验证明，这6个启动子缺失片段均能同时驱动两个报告基因在玉米幼胚中进行稳定表达，说明这6个启动子缺失片段仍具有双向启动子的功能。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的双向启动子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的双向启动子的核苷酸序列70％或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的双向启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

将本发明双向启动子与待转化的异源性DNA序列进行可操作的连接，即得到在植物中双向表达异源性DNA序列的重组植物表达载体；其中待转化的异源性DNA序列数量可以是两条，这两条待转化的异源性DNA序列以相反的方向与双向启动子可操作的连接。

所述的重组植物表达载体中还可含有选择标记基因。

另外，可以将本发明的双向启动子与选择标记序列可操作的连接以确定选择标记序列的活性，所述的选择标记序列通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如：四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。

可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等；所述的目标植物包括单子叶植物、双子叶植物；优选的，所述的目标植物为禾本科植物，例如，可以是玉米、水稻、大麦、小麦、高粱等农作物。

转化实验证明，将本发明的ZmBD1(SEQ ID NO.1)、ZmBD2(SEQ ID NO.2)、ZmBD3(SEQ ID NO.3)、ZmBD4(SEQ ID NO.4)、ZmBD5(SEQ ID NO.5)分别插入载体pMedGG3中的GUS和GFP之间后，ZmBD1、ZmBD2、ZmBD3、ZmBD4、ZmBD5能双向启动GUS和GFP表达，说明ZmBD1、ZmBD2、ZmBD3、ZmBD4和ZmBD5均具有双向启动功能。

当双向启动子ZmBD1(SEQ ID NO.1)两端同时各融合一个报告基因GUS和GFP时，它仍能同时启动这两个报告基因在转基因玉米授粉后不同时期的籽粒、成熟后的干种子和萌发三天的胚的胚和糊粉层中表达，但在营养组织根、叶、叶鞘没有表达，这个结果与ZmBD1在其任意一端融合一个报告基因GUS的在转基因玉米中的表达情况完全一致，实验结果证明ZmBD1是一个组织特异性强的种子特异性双向启动子。

将ZmBD1截短后获得的六个启动子缺失片段的功能验证试验结果可见，ZmBD1双向启动子的6个启动子缺失片段均能同时驱动两个报告基因在玉米幼胚中表达，证明这6个启动子缺失片段仍具有双向启动子的功能。

因此，可以将本发明所分离的双向启动子或启动子缺失片段应用于改良植物性状(例如环境胁迫抗性，例如：抗病虫害、耐盐碱、耐高温、耐低温、耐干旱等)、培育植物新品种等方面。

例如，可以将本发明的双向启动子或启动子缺失片段可操作的与待转化的两个异源性DNA序列相连接，可以指导或调控两个的异源基因在植物中进行双向表达，不仅有效避免基因沉默现象，而且能够得到具有多个预期性状的转基因植物或植物新品种；待转化的异源性DNA序列不受限制，可以是调节基因、调节基因的反义基因或者能干扰内源基因表达的小RNA等；所述的待转录的异源DNA序列可以是来自非靶基因物种的核酸分子或基因，或者是起源于或存在于相同的物种中经过人工改造或修饰的核酸分子或基因。

通常来说，待转化的异源性DNA序列多为提高作物对环境胁迫抗性、改善作物性状或代谢的相关基因，例如，可以是：改善植物生理、生长和发育的相关基因，提高产量的相关基因，强化营养、提高环境胁迫抗性等相关基因，这些基因或者为植物体提供有益的性状，或者提高或改善作物种子品质、促进种子胚发育或提高作物种子对病虫害抗性。

所述待转化的异源性DNA序列可以包括具有RNA活性的序列或产生多肽产物的序列等，例如，可以是反义序列、RNAi序列、核酶序列、剪接体、氨基酸编码序列以及它们的片段。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“互补的”系指遵循碱基配对原则。

术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。包括与本发明双向启动子的核苷酸序列具有优选地60％或更高，更优选地80％或更高，甚至更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同源性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“启动子”指存在于目的基因编码序列的上游，提供RNA聚合酶和正确转录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。

术语“双向启动子”：是指位于一对“头对头”基因转录起始位点之间的具有驱动各自内源基因表达的长度一般小于1.0kb的DNA序列。

术语“异源性DNA序列”指该DNA序列对该特定的宿主细胞而言属于外来的来源，或若来自相同的原始来源但对该原始序列进行了修饰或改造。

术语“内源基因”来自宿主本身的基因，包括DNA或RNA序列。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1原始验证载体pCAMBIA3301的示意图。

图2中间载体pUM3G的示意图。

图3pRTL2-GFP的示意图。

图4中间载体pMedGG3的示意图。

图5表达载体pBD1GG3的示意图。

图6表达载体pBD2GG3的示意图。

图7表达载体pBD3GG3的示意图。

图8表达载体pBD4GG3的示意图。

图9表达载体pBD5GG3的示意图。

图10双向启动子瞬时表达结果；胚的发育时间为20天。

图11pBD12G3稳定表达载体示意图。

图12pBD68G3稳定表达载体示意图。

图13双向启动子ZmBD1的T1代转基因玉米验证双向启动子的功能与组织特异性的实验结果；(a)-(d)、(i)-(k)分别代表双向启动子ZmBD1的一启动方向(BD12)驱动的报告基因GUS在授粉后15、20、25、30天的转基因玉米籽粒中和三叶一心时期的根、叶鞘和叶片中的表达情况。(e)-(h)、(l)-(n)分别代表双向启动子ZmBD1的另一个启动方向(BD68)驱动的报告基因GUS在授粉后15、20、25、30天的转基因玉米籽粒中和三叶一心时期的根、叶鞘和叶片中的表达情况。

图14双向启动子ZmBD1同时驱动GUS和GFP两个报告基因在玉米中表达的功能实验结果；A-I：分别代表双向启动子ZmBD1同时驱动GUS和GFP两个报告基因在授粉后15、20、25和30天的籽粒，成熟后的干种子、萌发三天的种子、三叶一心时期的根、叶鞘和叶片中的表达情况。

图15双向启动子ZmBD1的六个缺失片段的启动子活性验证结果；A-F：依次代表双向启动子ZmBD1的6个缺失片段，每个缺失片段两端各一个融合报告基因GUS/GFP，每一横排的四个图片代表同一个缺失片段两端各一个融合报告基因在基因枪介导的瞬时转化后，9个转化的胚中的三个进行GFP信号观察与拍照，而后包括拍照用的三个转化的胚以及其余的6个转化的胚均经GUS染色8小时，而后9个胚放在一起拍照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1 玉米双向启动子的分离及鉴定

1、玉米双向启动子的克隆及序列分析

根据生物信息学分析的结果，玉米基因组中存在一些潜在的双向启动子序列。以玉米基因组DNA为模板，以下述引物进行PCR扩增：

正向引物：BD1f:5-attctagATTCCGGCCGGCTCTGCTGCTTG-3；

反向引物：BD1r:5-gtcccatggCGCCGGCCGGCGTGGATCGGAT-3；

正向引物：BD2f:5-attctagACGCCCTTGGCCGGAGCCTG-3；

反向引物：BD2r:5-gtcccatggCCTCTCCCCATAAAATTCGGG-3；

正向引物：BD3f:5-cttctaGAACTGGGGAGGCAGGGGGGTTC-3；

反向引物：BD3r:5-ataccatGGCGGGCGGGGGGAACGGTCGG-3；

正向引物：BD4f:5-cttctagACGCATGGCTGGCGGGCGAATCG-3；

反向引物：BD4r:5-atcccatGGTGATAGATGAGGTCGCGGTAC-3；

正向引物：BD5f:5-GATCTAGAGCCTCAGCGGAGCCGGATC-3；

反向引物：BD5r:5-atcccatGGTGCCGGTGTTGGCCGCCCTG-3；

扩增产物进行琼脂糖电泳分离，回收并连接到pEASY-Blunt(全式金公司)克隆载体上，转化大肠杆菌Macth1-T1(全式金公司)中，经测序后确定克隆载体上的克隆片段正确，扩增产物分别命名为ZmBD1、ZmBD2、ZmBD3、ZmBD4、ZmBD5，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示。

2、重组表达载体的构建

1、中间载体的构建

为了便于克隆，本试验将pCAMBIA3301(购自CAMBIA公司)载体的多克隆位点进行改造，用EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ对其进行双酶切，并在此插入一个合成的含有多个酶切位点小片段(序列为如下所示)，来替代原有的多克隆位点构成中间载体pUM3G：

5-GAATTCAAGCTTGGTacccggg(EcoR Ⅰ/HindIII/Kpn Ⅰ/Sma Ⅰ)

ctattgcggtgcaggctgccagagcggcggctgtgacgctgtctttgccggcgccatcaccgccaactccactcttctcgcagaatgatgatagatccaccatggttaacctagacttgtccatcttctggattggccaacttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacacatagtgacatgctaatcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactagttatctgaataaaagagaaagagatcatccatatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattctttgatgaaccagatgcatttcattaaccaaatccatatacatataaatattaatcatatataattaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagTCTAGACTGCAGCCATGGTAGATCT(Xba Ⅰ/Pst Ⅰ/Nco Ⅰ/BglⅡ)-3。

以pUM3G载体为骨架，利用HindⅢ/Sma Ⅰ双酶酶切pRTL2-GFP(图3)回收GFP-35Spoly(A)的Hind Ⅲ/Sma Ⅰ双酶切片，通过同样的双酶切将GFP-35Spoly(A)整合到pUM3G形成中间载体pMedGG3(图4)。

2、植物表达载体的构建

用Xba Ⅰ/Nco Ⅰ将测序正确的克隆载体上的ZmBD1、ZmBD2、ZmBD3、ZmBD4、ZmBD5整合到中间载体pMedGG3分别形成植物表达载体pBD1GG3(图5)、pBD2GG3(图6)、pBD3GG3(图7)、pBD4GG3(图8)和pBD5GG3(图9)。

3、采用瞬时表达体系验证双向启动子的功能

1、基因枪(BIO-RAD公司)介导的转化

选取授粉后20天(20DAP)玉米幼穗，在超净工作台用终浓度为5％的次氯酸钠消毒灭菌30分钟，而后用无菌水清洗3次。用无菌的剥胚工具剥取幼胚置于液体MS培养基(培养基配方详见论文Crop science,1975年，第15卷，页码：417-421)，而后用液体MS培养基清洗2次转移到固体高渗培养基(9个幼胚/皿)(培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)28℃黑暗条件下培养6小时。在压力为1100psi的条件下，进行基因枪转化，每皿轰击一次(使用方法详见论文Plant Cell,Tissue and Organ Culture，1993年，第33卷，页码221-226)。轰击后的幼胚转移到恢复培养基(培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上28℃黑暗条件下培养24小时。

2、转化的幼胚中GFP和GUS的表达分析

基因枪转化恢复培养24小时后，用荧光显微镜(ZEISS公司)在5×物镜下观察幼胚在紫外光谱下的绿色荧光并通过CCD成像(见图10)。GFP表达分析完成后的幼胚立刻进行GUS染色(染色方法参见The EMBO Journal，1987年，第6卷，页码：3901-3907)，分析结果如图10，从实验结果可见，瞬时表达系统幼胚中的GFP和GUS基因均得到表达，说明本发明从玉米中分离的ZmBD1、ZmBD2、ZmBD3、ZmBD4和ZmBD5序列均具有双向启动子的功能。

实验例2 ZmBD1的双向启动子功能与组织特异性的验证实验

一、将ZmBD1的一个启动方向的序列BD12(SEQ ID NO.1)(其序列与BD68(SEQID NO.6)完全互补构成双链的双向启动子ZmBD1)构建得到稳定表达载体pBD12G3(图11)；将ZmBD1的另一个启动方向的序列BD68(SEQ ID NO.6)(其序列与BD12(SEQ ID NO.1)完全互补构成双链的双向启动子ZmBD1)构建得到稳定表达载体pBD68G3(图12)。

将稳定转化载体pBD12G3以及pBD68G3分别以农杆菌介导的方法转化了玉米材料Hi Ⅱ，得到了稳定转化的玉米植株，玉米稳定转化流程如下：

(1)、取授粉后10天的Hi Ⅱ幼穗，首先用无菌水配制5％的次氯酸钠溶液对幼穗进行浸泡灭菌15min,而后用无菌水浸泡清洗三次。

(2)、在无菌条件下，剥取长度在1.5mm-2.0mm左右的幼胚置于加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基(培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)中。

(3)、将事先在具有相应抗性的YEB固体培养基上在28℃培养4天的含有目的表达载体的重组克隆菌体刮取适量重悬在加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基中，28℃恒温摇床低速恢复培养至OD₂₆₀到0.4-0.6。

(4)、用液体侵染培养基清洗剥好的幼胚两次，吸弃清洗液，加入OD₂₆₀＝0.4-0.6的菌体颠倒混匀20次，置于黑暗条件下静置5min。

(5)、吸弃菌液，并用液体侵染培养基清洗浸染的幼胚两次，连带第二次清洗液和幼胚一起倾倒在无筛选压的固体共培养基(培养基配方详见论文MolecularBreeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上，将幼胚均匀分布在培养基上，并将幼胚的平滑面紧贴培养，弧形面朝上。

(6)、吸弃清洗液，将培养物置于25℃恒温箱黑暗条件下培养3天。将共培养3天后的幼胚在无菌条件下转移到无筛选压的固体恢复培养基上，28℃黑暗条件下培养7-10天。

(7)、将恢复培养长势良好且无菌的幼胚衍生物转移到具有basta筛选压的筛选培养基上筛选28℃黑暗条件下培养1-2个月，每2周继代一次。

(8)、待有生长速度显著高于一般愈伤组织的抗性愈伤出现后，将其繁殖到一定后，将一定量的抗性愈伤转移到具有多种激素的分化培养基(培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上28℃黑暗条件下培养2周左右，诱导形成胚状体。

(9)、将胚状体转移到固体生根培养基中，28℃光照条件下培养1周左右。生根成苗，将小苗转移到盛有固体生根培养基的圆柱状培养管中，28℃光照条件下培养1周左右。

(10)、再将展开2-3片幼叶的试管苗转移到有营养土的营养钵中在光照培养箱培养1周左右后即可转移到温室进一步培养并最终移栽到大棚。

检测结果见图13。图13(a)-(d)、(i)-(k)分别代表双向启动子ZmBD1的一启动方向(BD12)驱动的报告基因GUS在授粉后15、20、25、30天的转基因玉米籽粒中和三叶一心时期的根、叶鞘和叶片中的表达情况。图13(e)-(h)、(l)-(n)分别代表双向启动子ZmBD1的另外一个启动方向(BD68)驱动的报告基因GUS在授粉后15、20、25、30天的转基因玉米籽粒中和三叶一心时期的根、叶鞘和叶片中的表达情况。

从图13(a)-(h)可以看出，双向启动子ZmBD1的两个转录方向均能启动报告基因GUS在转基因玉米籽粒中表达，而在叶片，叶鞘和根中均没有表达。说明ZmBD1是一个种子特异性的双向启动子。

二、将ZmBD1的两端分别接上GUS和GFP两个报告基因，构建得到双向稳定表达载体；将该双向稳定表达载体转化玉米，检测玉米中的报告基因的表达情况。

图14A-I分别代表双向启动子ZmBD1同时驱动GUS和GFP两个报告基因在授粉后15、20、25和30天的籽粒，成熟后的干种子、萌发三天的种子、三叶一心时期的根、叶鞘和叶片中的表达情况。

图14A-G的每个小图中左部分为转基因的材料，右半部分为对照材料。图14A-F的每一横排的五个图片均为同一个实验材料在不同处理不同拍照条件下获得的照片，五个图片依次为完整的籽粒在自然光条件下、完整籽粒在紫外线照射加GFP滤光片条件下、籽粒纵切片在自然光条件下、籽粒纵切片在紫外线照射加GFP滤光片条件下和籽粒纵切片经GUS染色后在自然光条件下拍摄的照片。G-I的每一横排的三个图片均为同一个实验材料在不同处理不同拍照条件下获得的照片，三个图片依次为在自然光条件下、在紫外线照射加GFP滤光片条件下、经GUS染色后在自然光条件下拍摄的照片。

从图14A-F可以看出，当双向启动子ZmBD1两端同时各融合一个报告基因GUS和GFP时，它仍能同时启动这两个报告基因在转基因玉米授粉后不同时期的籽粒、成熟后的干种子和萌发三天的胚的胚和糊粉层中表达，但在营养组织根、叶、叶鞘没有表达(G-I)；这个结果与ZmBD1在其任意一端融合一个报告基因GUS的在转基因玉米中的表达情况完全一致。上述实验结果进一步证明ZmBD1是一个组织特异性强的种子特异性双向启动子。

实验例3 双向启动子ZmBD1的缺失片段的功能验证实验

将SEQ ID NO.1所示的ZmBD1全长启动子从5’端开始逐渐删除得到六个截短的启动子片段，这六个启动子片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；在6个缺失片段的两端各融合一个报告基因GUS/GFP，构建得到在玉米中稳定表达的双向表达载体。

将双向表达载体按照实验例2中农杆菌介导的方法分别转化玉米材料Hi Ⅱ，得到了稳定转化的植株，检测启动子片段驱动报告基因的表达情况，检测结果见图15。

图15A-F依次代表双向启动子ZmBD1的6个缺失片段，每个缺失片段两端各一个融合报告基因GUS/GFP，每一横排的四个图片代表同一个缺失片段两端各一个融合报告基因在基因枪介导的瞬时转化后，9个转化的胚中的三个进行GFP信号观察与拍照，而后包括拍照用的三个转化的胚以及其余的6个转化的胚均经GUS染色8小时，而后9个胚放在一起拍照。

从图15可以看出，ZmBD1双向启动子的6个缺失片段均能同时驱动两个报告基因在玉米幼胚中双向表达，说明这6个启动子缺失片段仍具有双向启动子的功能。

Claims (10)

1.从玉米(Zea mays)中分离的双向启动子，其特征在于，其多核苷酸为(a)、(b)或(c)所示：

(a)、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5的互补序列在严谨杂交条件下能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸仍具有双向启动子的功能；或

(c)、与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能或活性。

2.按照权利要求1所述的双向启动子，其特征在于：其与SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能；优选的，其与SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能；最优选的，其与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有95％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能。

3.将权利要求1中SEQ ID NO.1所示的双向启动子截段后获得的启动子缺失片段，其特征在于：其多核苷酸序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。

4.含有权利要求1-3任何一项所述双向启动子或启动子缺失片段的重组表达载体。

5.按照权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是重组植物表达载体；其中，双向启动子和待转化的目的异源基因序列可操作的相连接。

6.权利要求1-3任何一项所述的双向启动子或启动子缺失片段在构建植物表达载体中的应用。

7.权利要求1-3任何一项所述的双向启动子或启动子缺失片段在改良植物性状、构建转基因植物或培育植物新品种中的应用。

8.权利要求1-3任何一项所述的双向启动子或启动子缺失片段在驱动目的异源基因在植物组织或细胞双向表达中的应用。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的植物是双子叶植物或单子叶植物。

10.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的植物为玉米或水稻。