CN104651367A - 一种种皮与纤维组织特异性表达启动子sfs及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了一种种皮与纤维组织特异性表达启动子SFS及其应用，所述启动子SFS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的SFS启动子具有如下特性：A、在棉花和拟南芥组织的表达情况十分明确，该启动子在棉花等植物上没有报道；B、结构新，在核酸水平上与已见报道的其它启动子无任何同源性，同源性位点不含有现有专利保护序列和突变位点。

Description

一种种皮与纤维组织特异性表达启动子SFS及其应用

技术领域

本发明涉及一种种皮与纤维组织特异性表达启动子SFS及其应用，具体为一种能够在植物种子表皮和棉花纤维特异表达的启动子ProSFS(简称为SFS启动子)以及该启动子在植物遗传改良上的应用。

背景技术

植物生长发育是不同基因在时间、空间上有序表达和协同作用的过程。基因在整个生长过程中的开关、表达模式以及表达丰度等均受到精确调控。植物基因的表达调控可以分为转录前、转录、转录后、翻译、翻译后等5个不同水平，其中转录水平上的调控是最主要和最为关键的环节。基因在转录水平上的调控主要是通过调控转录调节因子与启动子的结合与否、强弱变化等来实现。因此，分离克隆有关特异的启动子可以有效调节基因的转录水平，包括基因在不同组织以及不同环境条件下的表达。此外，获得组织特异性启动子对于转基因作物的研究以及商业化开发都具有重大意义。

组织器官特异型启动子按照植物组织器官可以分为根、维管束、花器官、种子特异以及其它组织特异表达启动子等。组织器官特异型启动子可以定向表达外源蛋白，在发育生物学研究、以及植物基因工程方面逐步得到应用。果实和种子是植物的生殖器官、营养物质主要的储藏场所。利用果实或种子等器官特异启动子来调控相应的目的基因表达，不但可以提高基因在这些部位的表达量，而且可以降低生物能耗，有利于表达产物的分离以及提高作物的产量和品质。

来源于小麦的TaPR61基因启动子在禾本科作物中可以维持其种子特异表达的模式(Kovafchuk et al,2012)。瓜尔豆甘露糖聚合酶基因的启动子能够在紫花苜蓿的胚乳组织中特异表达(Naoumkina and Dixon,2011)。近年来，分离与种子特异表达有关的启动子还包括：来源于西瓜的果实特异表达基因AGPL1的启动子(Yin et aL,2009)、番茄的E8基因启动子等。研究表明：2个胚乳特异表达顺式作用元件—GCN4和AACA对于维持基因的胚乳特异表达模式起着重要的作用(Qu and Takaiwa,2004；Wu et aL,1998；Takaiwa et aL,1996)。此外，糊粉层特异表达的基因ALJ启动子、胚乳特异表达启动子Gtl3a在生物反应器上展现了很好的应用前景(Kuwano et al,2011；He et al,2011)。

尽管科学家已经在不同的植物种克隆了上述与种子特异表达有关的启动子，但是到目前为止还没有有关具有种皮特异和棉花纤维组织特异的启动子报道。

发明内容

本发明针对上述技术缺陷，目的在于提供一种种皮与纤维组织特异性表达启动子-SFS及其应用，即提供一种新的能够在植物种皮以及棉花纤维组织中特异表达的启动子SFS。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种核苷酸SFS，序列如SEQ ID NO.1所示；该序列可以通过人工合成的方法进行合成，也可以通过PCR和酶切的方法从棉花的基因组中进行克隆。

第二方面，本发明提供一组用于扩增所述核苷酸SFS的外侧引物对，所述外侧引物对的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本发明提供一组用于扩增所述核苷酸SFS的内侧引物对，所述内侧引物对的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

第四方面，本发明提供一种重组载体，包含所述核苷酸SFS，如实施例1中的连接核苷酸SFS的pMD18-T载体等。

第五方面，本发明提供一种转化体，包含所述核苷酸SFS，所述转化体采用的宿主为大肠杆菌或农杆菌。

第六方面，本发明提供一种所述核苷酸SFS作为启动子的用途。

优选地，所述用途具体为核苷酸SFS作为启动子在驱动植物中目的基因在特定组织中表达的应用；所述植物包括棉花、拟南芥；所述组织包括表皮、纤维等。

优选地，所述核苷酸SFS作为启动子在驱动植物中目的基因在特定组织中表达的应用具体为用所述转化体的悬浮液浸泡植物组织。

优选地，所述用途具体为核苷酸SFS作为启动子在植物育种中的应用。

第七方面，本发明提供一种所述核苷酸SFS的制备方法，包括人工合成法或生物克隆法；

优选地，所述核苷酸SFS的人工合成的方法具体为：

步骤一、根据核苷酸SFS的正链和副链序列，分别合成出长度150～200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段；

步骤二、将所述单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段分别退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段；

步骤三、混合所述双链寡核苷酸片段，经T4DNA连接酶催化组装成一个完整的核苷酸SFS。

优选地，所述生物克隆法具体为：

步骤1、提取棉花DNA；

步骤2、以所述DNA为模板，依次用所述外侧引物、内侧引物进行扩增；

步骤3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，即得核苷酸SFS。

优选地，所述棉花为陆地棉。

本发明首次采用分子克隆方法，从陆地棉(Gossypium hirsutum)基因组中分离获得了新的SFS启动子，并且通过转基因实验证实了它具有种皮及纤维组织特异性，利用该启动子可以特异驱动基因在上述组织中高水平地转录表达，从而达到了本发明目的。

本发明克隆分离组织特异表达启动子SFS，并利用该启动子在拟南芥中特异表达报告基因以提高基因在特定组织的表达水平。

本发明的SFS启动子具有如下特性：A)在棉花和拟南芥组织的表达情况十分明确，该启动子在棉花等植物上没有报道；B)结构新，在核酸水平上与已见报道的其它启动子无任何同源性，同源性位点不含有现有专利保护序列和突变位点。

SFS启动子为提高基因在植物种皮、以及棉花纤维的衣分含量提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是SFS启动子遗传转化载体的构建示意图；

其中，LB、RB分别为T-DNA的左右边界序列，SFS为本发明所特异表达启动子，NOS为终止子；

图2是转SFS启动子转化拟南芥的不同组织的GUS染色分析图；

其中，A：根；B：茎；C-D：果荚；E：叶片；F：表皮毛；G：花；H：心皮与雄蕊；

图3是qRT-PCR与RNA原位杂交分析GhLTPG1基因的表达模式；

其中，A：GhLTPG1在棉花不同组织及胚珠不同时期的定量检测结果；B：在纤维伸长发育阶段，胚珠中GhLTPG1在徐州142及其突变体间的表达差异；C-D：反义探针杂3DPA野生型胚珠；E-F：反义探针杂3DPA无絮突变体胚珠；G-H：正义探针杂3DPA野生型胚珠；D，F，G为放大的视野；f：纤维；isc：内表皮层；osc：外表皮层；C，E，G为放大100倍视野，D，F，G为放大200倍视野。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1种皮与纤维组织特异启动子SFS的克隆

(一)陆地棉(Gossypium hirsutum)DNA提取

1)取新鲜棉花叶片加入有500μL的CTAB缓冲液的离心管中(65℃预热)，加入钢珠，用样品快速研磨仪55Hz处理100秒直至叶片彻底打碎，65℃水浴锅水浴30分钟。

2)加入5M KAc溶液150μL，冰上20分钟；

3)取出样品，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:l)，温和颠倒混匀10分钟；4℃，12000rpm离心10分钟；

4)转移上清至新离心管中，加入2/3倍体积的异丙醇(-20℃)；室温放置30分钟，12000rpm离心2分钟，弃上清；

5)加入75％乙醇溶液500μL，漂洗沉淀一小时；重复漂洗三次；

6)加入75％乙醇溶液500μL，室温过夜沉淀DNA；

7)12000rpm离心2分钟，弃上清，将沉淀溶于30～50μL水中，-20℃储存备用。

(二)SFS启动子序列克隆

以棉花基因组DNA为模板，先用外侧引物进行第一轮扩增，所述外侧引物如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示：

SEQ ID NO.2：TAGAGAGCGTCAAAGGCTAAATACAAAT，

SEQ ID NO.3：TTGCTGCACTCATTCGCTAACC；

然后以稀释50倍的第一轮PCR产物为模板，用内侧引物进行第二轮扩增，所述外侧引物如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示：

SEQ ID NO.4：ACGCG TCGAC CAGTT TGCCG CCTGC CGTTC，

SEQ ID NO.5：CTCAT GCCAT GGCCC CTAAA CTATT GAAGC AAAT；

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约930bp的启动子序列。回收后连接pMD18-T载体，送交生物公司测序检测。该序列即为SFS启动子，序列见SEQ NO：1。

实施例2：SFS启动子植物表达载体构建

选实施例1中测序正确的菌株提取质粒，用于植物表达载体的构建。将上述含有目的基因的重组载体质粒与空的pCAMBIA1305质粒分别进行SacΙ和NcoΙ双酶切。37℃酶切15～30分钟，对酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收重组质粒酶切后的SFS启动子片段和pCAMBIA1305酶切后的载体大片段并连接，连接体系如下：

16℃连接过夜，取5μL转化大肠杆菌DH5α，并挑取阳性克隆进行检测；

构建完成的SFS启动子表达载体见图1。在本图中GFP以及GUS基因可以根据需要替换成其它的基因，以用于不同的实验目的。

实施例3：SFS启动子驱动GUS基因在拟南芥中组织表达分析

(一)SFS-pCAMBIA1305载体的遗传转化

1)SFS-pCAMBIA1305载体转化农杆菌

挑选实施例2中测序正确的菌株，提取质粒用于后续农杆菌转化。与转化大肠杆菌类似。取10μL重组质粒加入100μL农杆菌GV3101感受态细胞中，轻轻混匀后冰上静置30分钟。液氮处理3分钟后立即37℃热激10分钟，随后冰浴1～3分钟。加入800μLLB无抗性液体培养基，28℃摇床180转/分钟培养3～5小时。4000rpm离心3分钟后弃掉大部分上清液，将菌体悬浮后均匀涂布于固体LB抗性平板上，28℃培养箱，培养2～3天。

挑单克隆菌以抗性LB液体培养基28℃摇床培养过夜，取2μL菌液进行PCR扩增检测。

2)浸花法转化拟南芥

将获得的阳性农杆菌克隆活化培养后，以1:100比例接种到500mL LB抗性培养基中，28℃过夜培养至OD6000.6。4000rpm离心10分钟收集菌体，用拟南芥转化Buffer重悬。选用五周左右生长良好花蕾较多的拟南芥植株，将花蕾浸入菌液中约30秒。将植株用保鲜膜封好，暗培养一天。揭去保鲜膜，转为正常培养条件培养，待种子成熟后收集T0代转基因种子。

(二)转基因拟南芥的阳性筛选

将T0代种子用无菌播种的方法播种于25mg/L潮霉素抗性的MS培养基上，约1周后将抗性植株移植至穴盘中培养。继续培养1～2周后提取拟南芥DNA进行PCR验证，阳性植株即为T1代植株。收获T1代种子(T2代)继续播种筛选，重复至T3代获得纯系。

(三)转基因拟南芥的GUS活性组织化学染色

在MS培养基上播种纯系SFS-pCAMBIA1305转基因拟南芥，分别取不同生长时期及不同组织进行GUS染色，观察启动子表达活性。

将拟南芥材料放入GUS染液中，37℃避光反应2～6小时，待观察到着色现象后用100％酒精脱色3次(30min)，去掉浮色后将材料转移至载玻片，置于显微镜下观察。

(四)SFS启动子驱动GUS基因的拟南芥GUS活性染色

GUS组织化学染色后，在转基因拟南芥的根、叶、花瓣、花药、柱头及发育中的种子种均可检测到GUS报告基因的表达，并在叶表皮毛中表达较强。比较分析后发现，这些所有组织的染色存在一个共同的特征，即在所有组织中上表皮毛的染色最深。

实施例4：种皮及纤维特异表达启动子SFS的人工合成

根据SFS启动子的核苷酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度约150～200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经T4DNA连接酶催化组装成一个完整的SFS启动子。该合成的DNA片段含有SEQ ID NO:1中1～930位的核苷酸序列。

实施例5：SFS启动子的表达特征与组织定位分析

(一)SFS启动子的表达特征

选取陆地棉徐州142及其无絮突变体的营养器官(根、茎、叶)及开花后不同天数(DPA，正数表示开花后，负数表示开花前)的棉花胚珠(-3DPA，-1DPA，0DPA，1DPA，3DPA，5DPA，8DPA，12DPA)材料抽提总RNA。不同组织的总RNA利用试剂盒进行反转录成一链的cDNA作为qRT-PCR模板。利用qRT-PCR定量检测SFS在棉花中控制的GhLTPG1基因的表达。

结果表明GhLTPG1在根、茎、叶等营养器官中表达量很低，在胚珠的伸长发育阶段有优势表达(图3A)。纤维发育起始后(开花当天)，GhLTPG1的转录表达一直保持快速增长，到开花后8天达到最高，此时其表达水平超出开花当天10倍。在无絮突变体的胚珠中(图3B)，GhLTPG1从开花前3天到开花后3天表达量变化差异不显著。野生型与无絮突变体相比，野生型中GhLTPG1的表达量在开花前并无显著变化。从0DPA开始，野生型中的GhLTPG1表达量显著高于无絮突变体，到3DPA达到其11倍。由于在野生型棉花胚珠中，该过程中包含种子与纤维两部分的发育，而无絮突变体仅存在种子的发育，因此二者间基因的表达差异表明SFS启动子能够控制GhLTPG1基因在胚珠与纤维特异表达。

(二)SFS启动子的表达特征与组织定位分析

原位杂交实验选取陆地棉徐州142及其无絮突变体在开花后3天的胚珠材料，分别利用GhLTPG1的正义与反义探针进行杂交，室温避光显色36小时后观察结果。比较野生型与无絮突变体中GhLTPG1杂交信号差异发现(图3-C-H)，其差异主要集中于纤维与胚珠外表皮层细胞。在3DPA野生型胚珠的纤维以及种子外表皮层细胞中可观察到明显的紫色信号，而在无絮突变体中未观察到任何信号。这一结果与qRT-PCR结果一致，表明GhLTPG1主要在胚珠外表皮层细胞及纤维细胞中表达，暗示GhLTPG1基因在纤维发育过程中发挥的重要功能。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.一种核苷酸SFS，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一组用于扩增根据权利要求1所述核苷酸SFS的外侧引物对，其特征在于，所述外侧引物对的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

3.一组用于扩增根据权利要求1所述核苷酸SFS的内侧引物对，其特征在于，所述内侧引物对的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包含根据权利要求1所述的核苷酸SFS。

5.一种转化体，其特征在于，包含根据权利要求1所述的核苷酸SFS。

6.一种根据权利要求1所述的核苷酸SFS作为启动子的用途。

7.一种根据权利要求1所述的核苷酸SFS的制备方法，其特征在于，包括人工合成法或生物克隆法。

8.根据权利要求7所述的核苷酸SFS的制备方法，其特征在于，所述人工合成的方法具体为：

步骤一、根据核苷酸SFS的正链和副链序列，分别合成出长度150～200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段；

步骤二、将所述单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段分别退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段；

步骤三、混合所述双链寡核苷酸片段，经T4DNA连接酶催化组装成一个完整的核苷酸SFS。

9.根据权利要求7所述的核苷酸SFS的制备方法，其特征在于，所述生物克隆法具体为：

步骤1、提取棉花DNA；

步骤2、以所述DNA为模板，依次用权利要求2所述的外侧引物、权利要求3所述的内侧引物进行扩增；

步骤3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，即得核苷酸SFS。