CN105177006B

CN105177006B - 一种种皮特异性表达启动子及其应用

Info

Publication number: CN105177006B
Application number: CN201510681220.XA
Authority: CN
Inventors: 赵阳; 朱苏文; 王玉; 张敏; 江海洋
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2035-10-15
Also published as: CN105177006A

Abstract

本发明公开了一种种皮特异性表达启动子及其应用，属于植物基因工程技术领域，该启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列。该种皮特异性表达启动子为一种新的启动子基因，其能够启动目的基因在植物的种皮上特异性表达，实现了外源基因在植物中的时空特异性表达；由于该启动子只能驱动下游目的基因在植物种皮中表达，从而避免该目的基因在植物其它组织中持续表达所带来的不利影响；该启动子还可直接应用于转基因植株筛选中，可以在植物种子阶段实现筛选，具有阶段性强、筛选灵敏度高的优点。

Description

一种种皮特异性表达启动子及其应用

技术领域

本发明涉及的是植物基因工程技术领域，尤其涉及的是一种种皮特异性表达启动子及其应用。

背景技术

启动子是基因表达调控的一种重要的顺式作用元件,在植物基因工程中根据作用方式及功能不同可将其分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子三类。目前,植物基因工程中常用的启动子为组成型表达启动子，如大多数双子叶转基因植物中使用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。研究发现在组成型启动子的控制下外源基因的表达存在一些缺陷,如外源基因在植物内持续、高效的表达,必然大量消耗植株体内的基础物质而造成能量负荷和物质浪费,而基础物质的额外消耗又必然影响和抑制植物体内的其他代谢活动,同时还会引起植物形态的改变,影响植物的生长发育等。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用,同时减少其对植物的不利影响,人们对组织特异性表达启动子的研究和应用越来越重视。

组织特异性启动子调控下的基因转录过程一般只发生在某些特定的组织或者器官中。目前已经从植物中分离得到了不同类型的组织特异性启动子，如小麦种子特异性表达启动子TaPR61，水稻花粉特异性表达启动子Orys1，，马铃薯块茎储藏蛋白patatin基因启动子等。这些特异性启动子的应用实现了外源基因在植物中时空特异性的表达。种皮特异性启动子就是这类启动子，可用于调控种皮表达系统改变种皮的颜色，也可以提高所需要元素的表达量，还可以使外源基因在种皮表达起到保护作用等。因此，利用种子特异性启动子控制外源基因在种子中特异表达具有重要的理论和实践意义。

玉米(Zea mays)是中国最大的粮食、油料及其饲料作物，对其基因工程的研究具有重要的意义。从玉米中分离获得种皮特异性启动子，可以利用特异性启动子将目的基因在植物中进行特异性的高效表达，这对玉米进行分子改良或生产具有特殊用途的新玉米品种等方面有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种种皮特异性表达启动子及其应用，以提供一种新的、可在植物种子表皮特异性表达的启动子。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种种皮特异性表达启动子，该启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，该启动子是从玉米自交系B73中克隆获得的，也可通过人工合成方法获得，命名为PZmD4。

本发明还提供了上述种皮特异性表达启动子在驱动植物中目的基因在种皮中特异性表达的应用。

所述的植物包括水稻、玉米。

本发明还提供了一种植物表达载体，该植物表达载体含有上述种皮特异性表达启动子。

所述植物表达载体利用上述种皮特异性表达启动子替换双元表达载体pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子构建获得，为一种改进的pCAMBIA1301载体，命名为pCAM–PZmD4；该植物表达载体可用于转基因植株的筛选，具体为：将待转的外源基因连接至所述植物表达载体的多克隆位点中，并导入植物细胞、组织或器官，获得完熟期的再生植株种子，将完熟期的再生植株种子经GUS组织化学染色，若种皮上有蓝色小点，则该种子为转基因植株种子。

本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，该宿主细胞含有上述种皮特异性表达启动子，或含有上述植物表达载体。

所述宿主细胞为根癌农杆菌细胞。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种种皮特异性表达启动子及其应用，该种皮特异性表达启动子为一种新的启动子，其能够启动目的基因在植物的种皮上特异性表达，实现了外源基因在植物中的时空特异性表达；由于该启动子只能驱动下游目的基因在植物种皮中表达，从而避免该目的基因在植物其它组织中持续表达所带来的不利影响；该启动子还可直接应用于转基因植株筛选中，可以在植物种子阶段实现筛选，具有阶段性强、筛选灵敏度高的优点。

附图说明

图1为构建的植物表达载体PCR验证和双酶切验证电泳结果图，其中，A为PCR验证结果，B为双酶切验证结果；

图2为转基因植株PCR检测电泳结果图，其中，A为GUS基因，B为潮霉素Hyg基因，C为PZmD4启动子基因；

图3为转基因植株不同组织器官的GUS组织化学染色结果图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1种皮特异性表达启动子的获得

根据SEQ ID NO.1所示的PZmD4启动子全长序列，设计PCR扩增引物，所设计的引物上下游分别加了酶切位点，上游为KpnI(GGTACC)酶切位点，下游为NcoI(CCATGG)酶切位点。

引物序列如下：

SEQ ID NO.2：引物1(上游引物)：5’-CGGTACCCTAATCCTATAGCAAATATAGC-3’

SEQ ID NO.3：引物2(下游引物)：5’-GCCATGGGCAAAGTTGAGAAAACCACA-3’

以玉米自交系B73基因组DNA(全式金公司植物基因组试剂盒提取)为模板，通过高保真DNA聚合酶Primer Star max扩增获得目的启动子，PCR反应体系为：

PCR反应条件为：预变性：94℃10min；变性：94℃10s；退火：60℃5s；延伸：72℃1min，33个循环；总延伸：72℃10min。值得注意的是在总延伸之前，需要加Taq酶0.5μL，为了给3’端加上PolyA尾巴。

PCR程序反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。切胶回收并纯化目的片段；将回收片段加载到pEASY T1Cloning Vector(购自北京全式金生物技术有限公司)上，热激法转化到大肠杆菌感受态Trans5α细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中；通过菌落PCR和酶切检测筛选阳性克隆菌株；对检测结果初步判断正确的连接片段，送去进行测序(上海生工公司)，测序结果与预测结果一致。

2.2含PZmD4启动子的植物表达载体的建立

将已连接到pEASY T1Cloning Vector上的pZmD4片段(回收小片段)与农杆菌双元载体pCAMBIA1301(回收大片段，酶切去除pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子)用KpnI和NcoI酶进行双酶切并回收片段，酶切条件为：37℃金属浴中3h，酶切30μL体系如下：

将上述大小片段用T₄DNA连接酶进行连接，25℃连接3h，获得连接产物pCAM–pPZmD4质粒，连接10μL体系如下：

将pCAM–pPZmD4质粒轻轻打入到200μL的EHA105农杆菌感受态细胞中，冰浴5min，液氮速冻1min，37℃水浴5min后，加入200μL YEP液体培养基，28℃，220rpm预表达4～5h；10000rpm离心30s，弃上清，加入100μL YEP液体培养基，重新悬浮细胞，涂布于含100μg/mLKan和50μg/mL Rif的YEP固体平板上，28℃培养约24～48h；挑取平板上长出的微黄色的单菌落，接种于含100μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEP液体培养液中，摇菌24～48h；待菌液浑浊(橙黄色)，提取质粒；分别用PCR和双酶切验证，获得如图1所示的结果，图1中可看出，无论是PCR验证还是双酶切验证，均获得了目的条带，说明pCAM–pPZmD4质粒构建成功。

2.3农杆菌介导水稻转化

通过根癌农杆菌(Agrobacterum-mediated)农杆菌介导法将含pCAM–PZmD4表达载体的农杆菌导入水稻中。水稻遗传转化的过程为：诱导；侵染；选择；分化；生根和移栽。

2.3.1水稻愈伤组织诱导培养基

将100mL N₆大量；10mLN₆微量；10mLVitamin，所述10mLVitamin为1L加0.1g肌醇粉末；10mLFe盐；300mg/L脯氨酸；600mg/L水解酪蛋白CH；30g/L蔗糖；加dd H₂O定容到700mL，用KOH调pH值至5.9，加3.0g/L琼脂粉，煮沸，加入2,4-D储备溶液，用dd H₂O定容至1000mL，再分装到组培瓶中，所述组培瓶为25mL/瓶，高压蒸汽灭菌；待用。

2.3.2侵染培养基

将50mL lN6max；5mL N6min；10mLFe盐；10mL Vitamin，所述10mLVitamin为1L加0.1g肌醇粉末；800mg水解酪蛋白；20g/L蔗糖；加dd H₂O定容至1000mL，用KOH调pH值至5.6，加3ml/l2,4-D储备溶液，6.0个/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌，待培养基冷却到40℃～60℃，加入20mL Glucose葡萄糖储备溶液和1000mL AS储备溶液，倒平板。

2.3.3选择培养基

将100mL N₆大量；10mLN₆微量；10mLVitamin，所述10mLVitamin为1L加0.1g肌醇粉末；10mLFe盐；600mg/L水解酪蛋白CH；30g/L蔗糖；加dd H₂O定容到1000mL，用KOH调pH值至5.9，加3.0g/L琼脂粉，加入2,4-D储备溶液，煮沸，再分装到组培瓶中，所述组培瓶为25mL/瓶，高压蒸汽灭菌；将培养基冷却到40℃～60℃，再加入5mL/L羧苄储备溶液、1mL/L潮霉素储备溶液、1mL/L头孢储备溶液。在超净工作台上分装到组培瓶中。

2.3.4分化培养基

将100mL MSmax；10mLMsmin；10mLFe盐；10mL Vitamin，所述10mL Vitamin为1L加0.1g肌醇粉末；1000mg/L水解酪蛋白CH；30g/L蔗糖；2mL/L NAA储备溶液；2mL/L 6-BA储备溶液；0.200uL/L KT储备溶液；200uL/L IAA储备溶液加入dd H2O定容至1000mL,用KOH调pH值至6.0，加3g/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌；待培养基冷却到40℃～60℃，加入5mL/L羧苄储备溶液和2,5mL/L潮霉素储备溶液，在超净工作台上分装到组培瓶中。

2.3.5生根培养基

将50mlMSmax；5mLMsmin；10mL Fe盐；10mLVitamin，所述10mL Vitamin为1L加0.1g肌醇粉末；20g/L蔗糖加入dd H₂O定容至700mL,用KOH调pH值至5.8；煮沸，加0₂ml/LIBA储备溶液，再加入dd H₂O定容至1000mL，倒入生根瓶。

上述步骤所用到的一些热不稳定性化合物如抗生素、AS、6-BA及KT细菌滤器除菌后于培养基温度降至50℃左右时加入。

2.3.6培养基相关溶液的配制和抗生素溶液配制

A、Msmax储备溶液(10X)：

用ddH₂O定容至1000mL，室温保存；

B、MSmin储备溶液(100X)：

Na₂MoO₄要单独溶解，再加入到混合液中，用ddH₂O定容至1000mL，室温保存；

C、N₆max储备溶液(10X)：

用ddH₂O定容至1000mL，室温保存；

D、N₆min储备溶液(100X)：

用ddH₂O定容至1000mL，室温保存；

E、Fe²⁺-EDTA(100X)：

待两者全部溶化后，相混溶，70℃水浴中保温2h，用ddH₂O定容至1000mL，4℃储存；

F、Vitamin(100X)：

用ddH₂O定容至1000mL，4℃储存；

G、1mg/mL的2,4-D储备溶液：

称取5.61g 2,4-D加入1.0mL 1N KOH，点振5min后加入10mL H₂O，再晃动直至2,4-D全部溶解，再用ddH₂O定容至100mL，室温保存；

H、1mg/mL的6-BA储备溶液：

称取0.1g 6-BA，加入1.0mL 1N KOH，晃动直至6-BA全部溶解，用ddH₂O定容至100mL，室温保存；

I、1mg/mL的NAA储备溶液：

称取0.1g NAA萘乙酸，加入1.0mL 1N KOH，晃动直至NAA全部溶解，用ddH₂O定容至100mL，室温保存；

J、1mg/mL的IAA储备溶液：

称取0.1g IAA吲哚乙酸，加入1.0mL 1N KOH，晃动直至IAA全部溶解，用ddH₂O定容至100mL；

K、抗生素储液配

2.4转基因水稻的鉴定

2.4.1转基因水稻的PCR分子检测

为了检测转基因水稻是否为阳性植株，以提取的转基因水稻总DNA为模板，用目的基因PZmD4启动子片段和植物表达载体上所含的潮霉素Hyg基因和GUS基因为检测对象，设计引物，扩增片段，用以初步鉴定转基因植株，图2为17棵转基因阳性植株的PCR检测结果。

用于检测GUS基因的引物序列如下：

SEQ ID NO.4：引物3(上游引物)：5’-GTGAATCCGCACCTCTGGCAAC-3’

SEQ ID NO.5：引物4(下游引物)：5’-ATCGCCGCTTTGGACATACCAT-3’

PCR反应条件为：预变性：94℃10min；变性：94℃30s；退火：60℃45s；延伸：72℃1min，34个循环；总延伸：72℃10min。

用于检测潮霉素抗性基因Hyg的引物序列如下：

SEQ ID NO.6：引物5(上游引物)：5’-TAGGAGGGCGTGGATATGGC-3’

SEQ ID NO.7：引物6(下游引物)：5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’

PCR反应条件为：预变性：94℃10min；变性：94℃30s；退火：62℃30s；延伸：72℃1min，34个循环；总延伸：72℃10min。

用于检测目的基因PZmD4启动子片段的引物序列如SEQ ID NO.2(引物1)和SEQ IDNO.3(引物2)所示；PCR反应条件为：预变性：94℃10min；变性：94℃10s；退火：60℃5s；延伸：72℃1min，33个循环；总延伸：72℃10min。

2.4.2GUS基因的组织化学染色

分子检测结果初步鉴定为转基因植株后，分别对转PZmD4启动子植株不同时期不同部位进行GUS组织化学染色。具体操作步骤如下：

步骤一：取转基因水稻不同时期不同的组织：将各部位放入试管中，加入适量的GUS固定液，室温下温和摇动30～60min,用50nmol/L的磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗10～15min，重复几次，以除去组织中残留的固定液；

步骤二：对染色液进行1min中真空抽滤，将各组织置于GUS染色液中保温4～12h；结束后，将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再用50％和20％乙醇各侵泡20min以上，直到材料呈白色；肉眼或显微镜下观察，组织上有蓝色小点即为GUS表达部位。

GUS基因的组织化学染色结果如图3所示，其中：A为幼叶，B为幼茎，C为幼根，D为成熟叶，E为成熟茎，F为成熟根，G为穗茎，H为颖壳，I为花药，J为蜡黄期种子，K为完熟期种子，L为完熟期种子(剖面)。结果显示：PZmD4启动子能驱动GUS基因在完熟期种子的种皮器官中表达，在其它组织中(A幼叶，B幼茎，C幼根，D成熟叶，E成熟茎，F成熟根，G穗茎，H颖壳，I花药，J蜡黄期种子)中不表达。从而证明了启动子PZmD4仅在水稻的种皮中特异性表达。

Claims

1.一种种皮特异性表达启动子，其特征在于，该启动子的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述的种皮特异性表达启动子在驱动植物中目的基因在种皮中特异性表达的应用，其特征在于，所述的植物为水稻或玉米。

3.一种植物表达载体，其特征在于，该植物表达载体含有如权利要求1所述的种皮特异性表达启动子。

4.根据权利要求3所述的一种植物表达载体，其特征在于，该植物表达载体为所述种皮特异性表达启动子替换双元表达载体pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子构建获得的。

5.一种如权利要求4所述的植物表达载体在转基因植株筛选中的应用，其特征在于，将待转的外源基因连接至所述植物表达载体的多克隆位点中，并导入植物细胞，获得完熟期的再生植株种子，将完熟期的再生植株种子经GUS组织化学染色，若种皮上有蓝色小点，则该种子为转基因植株种子，其中，所述植株为水稻或玉米。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求1所述的种皮特异性表达启动子，或含有如权利要求3或4的植物表达载体，所述宿主细胞为根癌农杆菌细胞。