UA118845C2 - Експресійна касета, що містить конститутивний промотор сої, та її застосування - Google Patents

Експресійна касета, що містить конститутивний промотор сої, та її застосування Download PDF

Info

Publication number
UA118845C2
UA118845C2 UAA201510071A UAA201510071A UA118845C2 UA 118845 C2 UA118845 C2 UA 118845C2 UA A201510071 A UAA201510071 A UA A201510071A UA A201510071 A UAA201510071 A UA A201510071A UA 118845 C2 UA118845 C2 UA 118845C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
plant
promoter
nucleic acid
nucleotide sequence
sequences
Prior art date
Application number
UAA201510071A
Other languages
English (en)
Inventor
Шіжун Чжан
Original Assignee
Байєр Кропсайєнс Лп
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байєр Кропсайєнс Лп filed Critical Байєр Кропсайєнс Лп
Publication of UA118845C2 publication Critical patent/UA118845C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)

Abstract

Винахід стосується експресійної касети, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, функціонально зв’язану з гетерологічною нуклеїновою кислотою, де вказана послідовність ініціює транскрипцію гетерологічної нуклеїнової кислоти в рослинній клітині. Винахід також стосується вектора, який містить експресійну касету, рослинної клітини, що має у своєму геномі стабільно вбудовану експресійну касету, рослини, що має у своєму геномі стабільно вбудовану експресійну касету, трансгенного насіння та способу експресії гетерологічної нуклеїнової кислоти, що становить інтерес, в рослині.

Description

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА РОДИННУ ЗАЯВКУ
Дана заявка заявляє перевагу попередньої заявки на патент США із серійним номером 61/790907, поданої 15 березня 2013 року, зміст якої включено в даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.
ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, НАДАНИЙ В ЕЛЕКТРОННОМУ ВИГЛЯДІ
Копія переліку послідовностей надана в електронному вигляді за допомогою ЕЕ5-Ууеб у вигляді переліку послідовностей у форматі АБСІЇ з назвою файлу "2912939- 201790 01 Зедиепсе І ісйіпудх, створеного 10 березня 2014 року, і що має розмір 4,14 кілобайт, і поданого одночасно з описом. Перелік послідовностей, що знаходиться в цьому документі у форматі АЗСІЇ, є частиною опису та включений у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології рослин, конкретніше до ідентифікації та застосування регуляторних елементів у рослин.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ ВИНАХОДУ
На сьогоднішній день існує високий попит на трансгенні рослини, що експресують біотехнологічно важливі білкові продукти на високому або індуцибельному рівні. Маніпуляція з культурними рослинами з метою зміни та/або покращення фенотипових характеристик (таких як продуктивність або якість) вимагає експресії гетерологічних генів у рослинних тканинах. Такі генетичні маніпуляції стали можливими завдяки двом відкриттям: можливості трансформувати гетерологічний генетичний матеріал у рослинну клітину та існуванню промоторів, що здатні керувати експресією гетерологічного генетичного матеріалу.
Серед промоторів, що використовуються найчастіше, промотор гена нопалін-синтази (МОБ) (Ебет еї аї., Ргос. Маї!. Асад. осі. 0О.5.А. 84:5745-5749 (1987)); промотор гена октопін-синтазь (0С5), промотори каулімовірусів, такі як 195 промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (Самм) (Гаулоп еї аї., Ріапі Мо). Віо!. 9:315-324 (1987)); 355 промотор Саму (Оавеї еї а!ї., Маїиге 313:810- 812 (1985)) ії 355 промотор вірусу мозаїки ранника (Запдег еї аї., Ріапі Мої. ВіоїЇ. 14:433-43 (1990)); світлоїндукований промотор гена малої субодиниці КОВІЗСО (рибулозо-1,5- біфосфаткарбоксилаза/оксигеназа) (РеїПедгіпеб5спі еї аїЇ.,, Віоспет. Зос. Тгап5. 23(2):247-250
Зо (1995)); промотор гена дан (УмаїКег еї аїІ., Ргос. Май. Асай. Зсі. 0.5.А. 84:6624-66280 (1987)); промотор гена сахарозосинтази. (уапод еї аї., Ргос. Маї). Асад. сі. О.5.А. 87:4144-4148 (1990)); промотор комплексу В-генів (Спапаїег єї аї., Ріапі СеїЇ 1:1175-1183 (1989)); промотор гена хлорофіл а/р-зв'язуючого білка й таке інше.
Ідентифікація та виділення регуляторних елементів, придатних для сильної або індуцибельної експресії генів мікроорганізмів та рослин, будуть корисні для розробки комерційних сортів трансгенних рослин.
СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Передбачаються композиції та способи для регулювання експресії генів у рослині.
Композиції містять нуклеотидні послідовності з СіІусіпе тах та їх варіанти, які ініціюють транскрипцію в рослині. Зокрема, передбачається ділянка ініціації транскрипції, виділена із гена гама-білка тонопласта та білка плазматичної мембрани Сіусіпе тах. Додаткові композиції за даним винаходом містять нуклеотидні послідовності, викладені в ЗЕО ІЮО МО-1 і 2, а також їх варіанти та фрагменти. Композиції даного винаходу також включають експресійні касети, що містять промотор за даним винаходом, функціонально пов'язаний 3 гетерологічною нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес. Даний винахід додатково передбачає вектори, що містять експресійні касети, а також рослини та рослинні клітини, що містять стабільно вбудовану в їх геном експресійну касету, описану вище. Крім того, композиції включають трансгенне насіння таких рослин.
З промотором функціонально пов'язана послідовність, що становить інтерес та може модифікувати фенотип рослини. Така модифікація може включати, наприклад, модуляцію продукування ендогенного продукту, або вона може включати продукування екзогенного продукту експресії для забезпечення нової функції або продукту в рослині. Наприклад, даним описом охоплюється гетерологічна нуклеотидна послідовність, що кодує генний продукт, який надає стійкість до гербіцидів або шкідників.
ОПИС ФІГУР
На фігурі 1 показано високий рівень експресії люциферази у випадку, коли її ген перебуває під контролем промоторів Ррасб (ЗЕО ІО МО:1) ії Ррас7 (ЗЕО ІО МО:2).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід відноситься до композицій і способів для регуляції експресії генів у рослинах 60 або рослинних клітинах. Композиції за даним винаходом містять нові нуклеотидні послідовності для промоторів сої. Зокрема, даний винахід передбачає виділені молекули нуклеїнових кислот промотора, що містять нуклеотидну послідовність, викладену в ХЕО ІЮ МО:1 або 2, а також її фрагменти та варіанти. Крім того, передбачаються трансформовані рослини, рослинні клітини та насіння.
Промоторні послідовності за даним винаходом, коли вони зібрані в ДНК-конструкції таким чином, що промотор функціонально пов'язаний із нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес, регулюють експресію нуклеотидної послідовності в клітинах організму, стабільно трансформованого цією ДНК-конструкцією, зокрема, у рослинних клітинах. Промоторні послідовності також можуть бути придатними в якості зондів для виділення інших промоторних послідовностей або генів сої, в якості молекулярних маркерів і т.п.
Способи експресії нуклеотидної послідовності в рослині передбачають введення в клітини рослин експресійної касети, що містить промотор за даним винаходом, функціонально пов'язаний із нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес, і регенерацію трансформованої рослини із рослинної клітини.
Використовувані в даному документі форми однини позначають один або більше одного (тобто щонайменше один) граматичного об'єкта, наведеного в такій формі. Наприклад, "елемент" означає один або кілька елементів.
Мається на увазі, що використовуваний у даному документі термін "молекула нуклеїнової кислоти" включає молекули ДНК (наприклад, кКДНК або геномної ДНК) і молекули РНК (наприклад, мРНК), а також аналоги ДНК або РНК, отримані із використанням нуклеотидних аналогів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК. "Виділена" або "очищена" молекула нуклеїнової кислоти або її біологічно активна частина практично не містить іншого клітинного матеріалу або культурального середовища, якщо вона отримана за допомогою рекомбінантних технологій, або практично не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин, якщо вона синтезована хімічним шляхом. Переважно, "виділена" нуклеїнова кислота не містить послідовностей (переважно послідовностей, що кодують білок), які зазвичай фланкують молекулу нуклеїнової кислоти (тобто послідовності, розташовані на 5'- і 3'-кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого отримана
Зо нуклеїнова кислота. У контексті даного винаходу "виділений" при використанні стосовно молекул нуклеїнової кислоти виключає виділені хромосоми. Наприклад, у різних варіантах здійснення даного винаходу молекула промотора може містити менше ніж приблизно 5 т.н., 4 т.н., З т.н., 2 т.н., 1 т.н., 0,5 т.н. або 0,1 т.н. нуклеотидної послідовності, що зазвичай фланкує молекулу нуклеїнової кислоти в геномній ДНК клітини, з якої отримана нуклеїнова кислота. Різні аспекти даного винаходу описані детальніше в наступних підрозділах.
Виділені молекули нуклеїнової кислоти та їх варіанти та фрагменти
Нуклеотидні послідовності за даним винаходом включають промоторні послідовності, викладені в 5ЕО ІЮ МО:1 і 2, та їх варіанти. Під "промотором" мають на увазі послідовність нуклеїнової кислоти, яка функціонує з метою керування транскрипцією кодуючої послідовності, що лежить нижче. Промотор, як правило, містить послідовність ДНК, гомологічну консенсусній послідовності 5'-ТАТААТ-3' (ТАТА-боксу), розташованій приблизно за 10-30 пар основ у 5' напрямку від сайту початку транскрипції ("кеп"), яка здатна направляти РНК-полімеразу для ініціації синтезу РНК. Промотори можуть додатково включати інші послідовності розпізнавання, як правило, розташовані вище або в напрямку 5' кінця відносно ТАТА-боксу, що називаються промоторними елементами, що лежать вище, які впливають на швидкість ініціації транскрипції.
Вони включають СААТ-бокс, який часто знаходиться на відстані приблизно 30-70 пар основ у напрямку до 5' кінця відносно ТАТА-боксу та характеризуються гомологією з канонічною формою 5-ССААТ-3 (Вгтеайпаси апа Спатроп (1981) Апп. Нем. Віоспет. 50:349-383).. У рослинах СААТ-бокс іноді замінений послідовністю, відомою як АОСА-бокс, ділянкою, в якій залишки аденіну симетрично фланкують триплет з(абоТ)МО (Мез5іпу еї а. (1983), в Сепеїїс
Епдіпеегіпо ої Ріапів, Т. Козиде, С. Мегейдйй апа А. НоїЇаєпавег (єдв.), Ріеєпит Ргезв, Мем МоїК, рр. 211-227). Ці елементи разом з іншими транскрипційними та трансляційними регуляторними послідовностями нуклеїнової кислоти (що також називають "керуючими послідовностями") необхідні для експресії послідовності ДНК, що становить інтерес. Не описані в даному документі способи виділення та ідентифікації регуляторних елементів, таких як енхансери та елементи, відповідальні за експресію кодуючої ділянки у певних тканинах або в певний час, добре відомі у рівні техніки. Див., наприклад, патенти США МоМо 5635618, 6218140, 6303370, 6310197 і 6355864.
Під "коровим промотором" мається на увазі промотор без промоторних елементів. Коровий бо промотор містить необхідні для функціонування промотора нуклеотидні послідовності, у тому числі ТАТА-бокс і сайт ініціації транскрипції. Така ділянка звичайно присутня, з певними змінами, в більшості промоторів. Ділянка корового промотора часто називається мінімальною промоторною ділянкою, оскільки вона сама по собі є функціональною для забезпечення базального рівня транскрипції. У різних варіантах здійснення даного винаходу послідовність корового промотора для Ррасб приблизно відповідає нуклеотидам з 29 по 318 в 5ЕО ІЮ МО:1;
ТАТА приблизно відповідає нуклеотидам з 288 по 296 в 5ЕО ІО МО:1; і сайт ініціації трансляції відповідає положенню нуклеотида 318 в 5ЕО ІЮО МО:1. В інших варіантах здійснення даного винаходу послідовність корового промотора для Ррас7 приблизно відповідає нуклеотидам з 1341 по 1643 в 5ЕО ІЮ МО:2; ТАТА приблизно відповідає нуклеотидам з 1603 по 1608 в 5ЕО ІЮ
МО:2; і сайт ініціації трансляції відповідає положенню нуклеотида 1643 в 5ЕО ІЮ МО:2. Фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що ділянка корового промотора може відрізнятися від наведених вище положень на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше нуклеотидів у напрямку вище або нижче, і такі зміни в межах послідовності корового промотора можуть допускатися.
Молекули нуклеїнової кислоти, які являють собою фрагменти розкритих промоторних послідовностей, також охоплюються даним винаходом. Під "фрагментом" мається на увазі частина промоторної послідовності. Фрагмент нуклеотидної послідовності може бути біологічно активним і, отже, здатним ініціювати транскрипцію функціонально пов'язаної нуклеотидної послідовності в рослині, або він може являти собою фрагмент, який можна застосовувати в якості гібридизаційного зонда або ПЛР праймера із застосуванням способів, описаних нижче.
Аналізи для визначення здатності таких фрагментів знижувати рівні експресії або змінювати характер експресії, тобто конститутивну або індуковану експресію, добре відомі у рівні техніки.
Молекули нуклеїнових кислот, що є фрагментами промоторної послідовності, можуть містити щонайменше приблизно 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 суміжних нуклеотидів або нуклеотиди в кількості аж до числа нуклеотидів, присутніх у повнорозмірній промоторній послідовності, розкритій в даному документі (наприклад, 1230 нуклеотидів для 5ЕО ІЮ МО:1 або 1688 нуклеотидів для ЗЕО ІЮ
МО:2), залежно від передбачуваного застосування. Під "суміжними" нуклеотидами маються на увазі залишки нуклеїнової кислоти, які безпосередньо приєднуються один до одного. Біологічно активні фрагменти промоторів за даним винаходом будуть зберігати промоторну активність
Зо (тобто ініціювати транскрипцію). Під "збереженням промоторної активності" мається на увазі, що фрагмент буде мати щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 70 96 або щонайменше приблизно 80 95 від промоторної активності повнорозмірного промотора. Біологічно активну частину промотора можна одержати шляхом виділення частини однієї із промоторних нуклеотидних послідовностей за даним винаходом й оцінюючи активність цієї частини промотора. Способи вимірювання активності промотора добре відомі у рівні техніки. Див. розділ під назвою "Оцінка активності промотора" для прикладів придатних способів.
Такі фрагменти, як правило, будуть містити послідовність розпізнавання ТАТА-боксу в конкретній промоторній послідовності. Ці фрагменти можна одержати шляхом розщеплення промоторної послідовності, що зустрічається в природних умовах та описана в даному документі, ферментами рестрикції, шляхом синтезу наявної в природних умовах нуклеотидної послідовності ДНК промотора або із застосуванням технології ПЛР. Див., зокрема, Миїйїв еї аї. (1987) Меїнод5 Епгутої. 155:335-350, і Епісп, ей. (1989) РСК Тесппоїоду (5іосКкіоп Ргез5, Мем/
Могк). Варіанти цих фрагментів промотора, як таких, що були отримані в результаті сайт- спрямованого мутагенезу, також охоплюються композиціями за даним винаходом.
Також охоплюються варіанти промоторних послідовностей, розкритих у даному документі.
Під "варіантом" мається на увазі достатньо ідентична послідовність. Промоторні послідовності, охоплені даним винаходом, є достатньо ідентичними нуклеотидній послідовності 562 ІЮ МО 1 або 2. Під "достатньо ідентичною" мається на увазі нуклеотидна послідовність, яка щонайменше приблизно на 70 95 або 75 95, приблизно на 80 95 або 85 95 ідентична, приблизно на 90 95, 9195, 9295, 93 95, 94 965, 9595, 96 95, 97 965, 9895 або 9995 ідентична еталонній послідовності при використанні однієї із програм вирівнювання, як описано в даному документі.
Варіанти, що зустрічаються в природних умовах, можуть бути ідентифіковані із застосуванням добре відомих молекулярно-біологічних методів, таких як полімеразно- ланцюгова реакція (ПЛР) і методи гібридизації, як зазначено нижче. Варіантні нуклеотидні послідовності також включають послідовності синтетичного походження, створені, наприклад, із використанням сайт-спрямованого мутагенезу, але які все ще мають промоторну активність, як визначено в даному документі.
Охоплювані даним винаходом варіанти є біологічно активними, тобто вони як і раніше 60 мають необхідну біологічну активність нативної послідовності, тобто зберігають промоторну активність (тобто ініціюють транскрипцію). Під "збереженням промоторної активності" мається на увазі, що варіант буде характеризуватися активністю, що становить щонайменше приблизно 3095, щонайменше приблизно 50 95, або щонайменше приблизно 7095, або щонайменше приблизно 8095 або більше від промоторної активності нативної послідовності. Способи вимірювання промоторної активності добре відомі у рівні техніки. Див. розділ під назвою "Оцінка промоторної активності" для прикладів придатних способів.
Фахівцеві в даній галузі техніки також буде зрозуміло, що зміни можуть бути внесені шляхом мутації в нуклеотидні послідовності за даним винаходом без зміни здатності промотора керувати експресією в рослинній клітині. Таким чином, варіантні виділені молекули нуклеїнової кислоти можна створити шляхом введення однієї або декількох нуклеотидних замін, додавань або делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, розкриту в даному документі. Мутації можуть бути введені за допомогою стандартних методик, таких як сайт-спрямований мутагенез і
ПЛР-опосередкований мутагенез. Такі варіантні нуклеотидні послідовності також охоплюються даним винаходом.
В якості альтернативи, варіантні нуклеотидні послідовності можна одержати шляхом введення мутацій випадковим чином уздовж усієї промоторної послідовності або її частини, наприклад, шляхом мутагенезу, що насичує, і отримані мутантні послідовності можна піддати скринінгу на здатність керувати експресією функціонально пов'язаної нуклеотидної послідовності в рослинній клітині.
Під "функціонально пов'язаним" мається на увазі функціональний зв'язок між промотором і другою послідовністю, де промоторна послідовність ініціює та опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає другій послідовності. Як правило, але не завжди, функціонально пов'язаний означає, що послідовності нуклеїнової кислоти є суміжними, а якщо необхідно з'єднати дві ділянки, що кодують білок, вони є суміжними та знаходяться в одній і тій самій рамці зчитування.
Для визначення процентної ідентичності двох нуклеїнових кислот, послідовності вирівнюють з метою отримання оптимального порівняння. Процентна ідентичність між двома послідовностями залежить від числа ідентичних положень, загальних для послідовностей (тобто процентна ідентичність - число ідентичних положень/загальне число положень
Зо (наприклад положення, що перекриваються) х 100). В одному варіанті здійснення даного винаходу дві послідовності мають однакову довжину. Процентну ідентичність двох послідовностей можна визначити із застосуванням методик, аналогічних описаним нижче, із або без забезпечення можливості гепів. При розрахунках відсоткової ідентичності підраховують, як правило, точні збіги.
Визначення процентної ідентичності двох послідовностей можна здійснювати (із використанням математичного алгоритму. Необмежуючим прикладом математичного алгоритму, застосованого для порівняння двох послідовностей, є алгоритм за Капіп апа Акб5спиі! (1990) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 87:2264, модифікований як в Кагіїп апа Айбспи! (1993) Ргос.
Май. Асад. 5сі. ОБА 90:5873-5877. Такий алгоритм включений у програму ВІГАЗТМ за АїЇї5спиї еї аІ. (1990) У. Мої. Віої. 215:403. Пошук нуклеотидів ВГ А5Т може бути виконаний за допомогою програми ВГАБТМ, оцінка - 100, довжина слова - 12, для отримання нуклеотидних послідовностей, гомологічних промоторам за даним винаходом. Щоб отримати вирівнювання з гепами з метою порівняння, можна застосовувати Саррей ВГА5Т, як описано в Айбепиі! еї аї. (1997) Мисієїс Асій5 Ке5. 25:3389. В якості альтернативи можна використати РБІ-ВІ А5Т для виконання ітеративного пошуку, який виявляє віддалене споріднення між молекулами. Див.
Айбспи! еї аІ. (1997), вище. При використанні програм ВГАЗТ, Сарреа ВІ АБ5Т і РЗІ-ВІ А5Т можуть бути застосовані параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад,
ВІАЗТМ). Див. мумлу.пебі.піт.пійдом. Іншим о необмежуючим прикладом математичного алгоритму, що можна застосовувати для порівняння послідовностей, є алгоритм Сіиеїаму (Ніддіп5 еї аї. (1994) Мисієїс Асід5 Нев5. 22:4673-4680). Сіивіаму порівнює послідовності та здійснює вирівнювання вздовж усієї послідовності ДНК, і, отже, може представити дані про консервативність послідовності всієї нуклеотидної послідовності. Алгоритм Сіиеїаму/ використовується в декількох комерційно доступних пакетах програмного забезпечення для аналізу ДНК, таких як модуль АГІСОМХ у наборі програмного забезпечення месіог МТі Ргодгат
Зийе (Іп'огтах, Іпс). Необмежуючим прикладом програмного забезпечення, придатного для аналізу вирівнювань із використанням алгоритму СіивеіаіМУ, є Сепедос"М, (Зепедос"м (Кагі
Міспоїа5), що дозволяє оцінити подібність та ідентичність ДНК між декількома генами. Іншим переважним, але необмежуючим прикладом математичного алгоритму, що можна використовувати для порівняння послідовностей, є алгоритм за Муег5 апа МіШег (1988) САВІО5 бо 4:11-17. Такий алгоритм включений у програму АСОМ (версія 2.0), що є частиною пакету програмного забезпечення для вирівнювання послідовностей (Со (доступного від Ассеїгув,
Іпс., 9865 5сгапіоп Ка., Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
Якщо не зазначено інше, САР версія 10, в якій використовується алгоритм за Меедіетап апа М/ипзей (1970) У). Мої. Віої. 48(3):443-453, буде застосована для визначення ідентичності або подібності послідовності із застосуванням наступних параметрів: 95 ідентичності та 95 подібності для нуклеотидної послідовності із використанням штрафу за відкриття гепа 50 і штрафу за продовження гепа 3 та оцінної матриці пуздарапа.стр; 95 ідентичності або 95 подібності для амінокислотної послідовності з використанням штрафу за відкриття гепа 8 і штрафу за продовження гепа 2 та оцінної програми ВІО5ИОМ62. Також можуть бути використані еквівалентні програми. Під "еквівалентною програмою" мається на увазі будь-яка програма для порівняння послідовностей, яка для будь-яких двох послідовностей у запиті створює вирівнювання, що має ідентичні збіги нуклеотидних залишків та ідентичну процентну ідентичність послідовності у порівнянні з відповідним вирівнюванням, створеним САР версії 10.
За допомогою таких способів, як ПЛР, гібридизація і т.п., можна ідентифікувати відповідні послідовності з інших організмів, зокрема, інших рослин, такі послідовності характеризуються суттєвою ідентичністю з послідовностями за даним винаходом. Див., наприклад, затюогоок .., апа ВивзеїІї, ОМ. (2001) Моїіесшаг Сіопіпд: А Гарогаюгу Мапиаї. (Соїд 5ргіпуд Нагброг І арогаюгу
Рге55, Соїй 5ргіпд Нагрог, МУ); і Іппіб5, еї аІ. (1990) РСК РгоїосоЇ5: А Сціде То МеїШтоа»5 апа
Арріїсайоп5 (Асадетіс Ргевз5, МУ). Послідовності, ідентифіковані за їх ідентичністю із промоторними послідовностями, викладеними в даному документі, охоплюються даним винаходом.
Олігонуклеотидні праймери можна сконструювати для застосування в реакціях ПЛР для ампліфікації відповідних послідовностей ДНК із кКДНК або геномної ДНК із рослини, що становить інтерес. Способи конструювання ПЛР праймерів і ПЛР-клонування, як правило, відомі у рівні техніки та описані в затьгоок еї аї. (1989) МоІесшаг Сіопіпд: А Гарогафогу Мапаиаї! (24 єд.,
Со Зргіпд Нагбог І арогагу Ргез55, Соїй Зргіпуд Нагрог, МУ). Див., також, Іппів еї аї., еав. (1990)
РОСА Ргоїюсоїв: А Сшіде о Меїйпод5 апа Арріїсайопе (Асадетіс Ргез5, Мем Мої); Іппів апа
Сеапа, єдз». (1995) РСВ 5ігагедієз (Асадетіс Ргез5, Мем МогкК); і Іппі5 апа Сеїгапа, еав. (1999)
РСК МешШшоа5 Мапиа! (Асадетіс Ргез5, Мем/ МогК). Відомі способи ПЛР включають без
Зо обмеження способи із застосуванням спарених праймерів, вкладених праймерів, одиночних специфічних праймерів, вироджених праймерів, ген-специфічних праймерів, вектор- специфічних праймерів і частково невідповідних праймерів.
У способі гібридизації для скринінгу КДНК або геномних бібліотек можна використовувати повну відому нуклеотидну послідовність або її частину. Способи створення таких кДНК і геномних бібліотек, як правило, відомі у рівні техніки та описані в ЗатбьгоокК апа КизвзеїЇ, 2001, вище. Зонди для гібридизації можуть бути фрагментами геномної ДНК, фрагментами кДНК, фрагментами РНК або іншими олігонуклеотидами та можуть бути позначені групою із можливістю її детектування, такою як ЗР, або будь-яким іншим маркером із можливістю детектування, таким як інші радіоїзотопи, флуоресцентна сполука, фермент або кофактор ферменту. Зонди для гібридизації можна одержати шляхом мічення синтетичних олігонуклеотидів, виходячи з відомої послідовності промотора, описаної в даному документі.
Також можна застосовувати вироджені праймери, створені на основі консервативних нуклеотидів у нуклеотидної послідовності. Зонд, як правило, містить ділянку нуклеотидної послідовності, що гібридизується в жорстких умовах щонайменше приблизно з 12, щонайменше приблизно з 25, щонайменше приблизно з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 послідовними нуклеотидами в промоторній послідовності за даним винаходом або її фрагменті або варіанті. Одержання зондів для гібридизації, як правило, відомо у рівні техніки і описано в затрьгоок апа Киззеїї, 2001, вище, включеній в даний документ за допомогою посилання.
Наприклад, повну промоторну послідовність, описану в даному документі, або одну або декілька її частин, можна застосовувати в якості зонда, здатного до специфічної гібридизації з відповідною промотор-подібною послідовністю. Для досягнення специфічної гібридизації за різних умов такі зонди мають у своєму складі послідовності, які є унікальними та мають довжину щонайменше приблизно 10 нуклеотидів або щонайменше приблизно 20 нуклеотидів. Такі зонди можуть бути використані для ампліфікації відповідних промоторних послідовностей із необхідного організму за допомогою ПЛР. Ця технологія може бути використана для виділення додаткових кодуючих послідовностей із необхідного організму або в якості діагностичного аналізу для визначення наявності кодуючих послідовностей в організмі. Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг висіяних ДНК бібліотек (або бляшок, або колоній; див, наприклад, ЗатрбгоокК еї аї. (1989) МоїІесшіаг Сіопіпд: А ІГарогаюгу Мапиаї! (24 еа., Со Бргіпд (510) Нарог І арогаюгу Ргез5, Соїд Зргіпуд Наїбог, МУ).
Гібридизацію таких послідовностей можна проводити в жорстких умовах. Під "жорсткими умовами" або " жорсткими умовами гібридизації" маються на увазі умови, за яких зонд гібридизується зі своєю цільовою послідовністю в більшому ступені (що можна детектувати), ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше в 2 рази більше у порівнянні із фоном).
Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть відрізнятися за різних обставин.
Контролюючи жорсткість умов гібридизації й/або умови відмивки, можна ідентифікувати цільові послідовності, які комплементарні зонду на 10095 (гомологічне зондування). В якості альтернативи, жорсткість умов можна регулювати для забезпечення можливості деякої розбіжності в послідовностях для того, щоб виявити нижчі ступені подібності (гетерологічне зондування). Як правило, зонд має довжину менше приблизно 1000 нуклеотидів або менше 500 нуклеотидів.
Як правило, жорсткими умовами будуть вважатися умови, за яких концентрація солі становить менше приблизно 1,5 М іонів Ма, звичайно за концентрації іонів Ма (або інших солей) приблизно 0,01-1,0 М за рН 7,0-8,3, і температура становить щонайменше приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 "С для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорстких умов можна також досягнути додаванням дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гіоридизацію в буферному розчині 30-35 95 формаміду, 1 М Масі, 1 95 505 (додецилсульфат натрію) при 37 "С і відмивку в 1Х-2Х 55БС (20Х 550-3,0 М Масі/ю),3 М цитрат натрію тризаміщений) при 50-55 "С. Ілюстративні умови помірної жорсткості включають гібридизацію у 40-45 95 формаміді, 1,0 М Масі, 195 505 при 37 "С і відмивку в 0,5-1Х 55С при 55-60 76.
Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію в 50 95 формаміді, 1 М Масі, 1 95 5О5 при 37 "С і відмивку в 0,1Х 55С при 60-65 "С. Необов'язково, буфери для відмивки можуть містити від приблизно 0,195 до приблизно 195 505. Тривалість гібридизації, як правило, становить менше приблизно 24 годин, зазвичай від приблизно 4 до приблизно 12 годин.
Необов'язково, буфери для відмивки можуть містити від приблизно 0,1 96 до приблизно 1 95
ОБ.
Специфічність, як правило, залежить від відмивок після гібридизації, причому вирішальними факторами є іонна сила та температура кінцевого розчину для відмивки. Для гібридів ДНК-ДНК
Зо Тт можна апроксимувати з рівняння за МеїпКкоїй апа Умані (1984) Апаї. Віоспет. 138:267-284:
Тт-81,57С-16,6 (09 М) ж 0,41 (9505С) - 0,61 (95 формаміду) - 500/; де М являє собою молярність одновалентних катіонів, У603С являє собою процентний вміст гуанозинових та цитозинових нуклеотидів у ДНК, 96 формаміду являє собою процентний вміст формаміду в розчині для гібридизації; і Її являє собою довжину гібрида в парах основ. Тт являє собою температуру (за певних іонної силита рН), за якої 50 95 комплементарної цільової послідовності гібридизуються з ідеально співпадаючим зондом. Тт знижується приблизно на 1 "С для кожного 195 розбіжності; отже, Тт, умови гібридизації та/"або відмивки можна регулювати для гібридизації з послідовностями необхідної ідентичності. Наприклад, якщо проводять пошук послідовностей з ідентичністю »90 95, Тя можна зменшити на 10 "С. Як правило, жорсткі умови обирають таким чином, щоб температура за них була приблизно на 5 "С нижче температури плавлення (Тт) для конкретної послідовності та її комплементарної послідовності за певних іонної сили та рН. Проте, за дуже жорстких умов гібридизацію та/або відмивку можна проводити при температурі, яка на 1, 2, З або 4 "С нижче температури плавлення (Тт); за помірно жорстких умов гібридизацію та/або відмивку можна проводити при температурі, яка на 6, 7, 8, 9 або 10 С нижче температури плавлення (Тт); за умов низької жорсткості гібридизацію та/або відмивку можна проводити при температурі, яка на 11, 12, 13, 14, 15 або 207С нижче температури плавлення (Тт). Із використанням рівняння, композицій для гібридизації та відмивки та необхідної Тт, фахівець у даній галузі техніки зрозуміє, що зміни жорсткості умов гібридизації та/або розчинів для відмивки, по суті, вже описані. Якщо необхідний рівень розбіжностей призводить до Тт менше 45 "С (водний розчин) або 32 "С (розчин з формамідом), концентрацію
З5ЗС можна підвищити для того, щоб можна було використовувати вищу температуру.
Вичерпний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведений в Тії55еп (1993) І арогаїгу
Тесппідне5 іп Віоспетівігу апа Моїесшіаг Віоіоду-Нубгіаігайоп м/ййп Мисієїс Асій Ргобевз, Рай |,
Спаріег 2 (ЕІбвемівег, Мем МогК); і А!з5ибеї еї аї., еа5. (1995) Ситгепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, СПарієг 2 (Стеєпе Рибіївпіпа апа УмМієу-Іпіегесіепсе, Мем/ Могк). Див., затогоок еї аї. (1989)
Моїесшіаг Сіопіпд: А ІГарогаїогу Мапаиаї! (24 єад., Соїд Зріїпа Натог І арогаїюгу Ргевз5, Соїд ргіпд
Нагбог, МУ).
Виділені послідовності, які характеризуються промоторною активністю та гібридизуються в жорстких умовах із промоторними послідовностями, розкритими в даному документі, або їх 60 фрагментами, охоплюються даним винаходом.
Способи застосування
Способи за даним винаходом спрямовані на експресію гетерологічних нуклеотидних послідовностей у рослинах і рослинних клітинах під контролем промоторної послідовності за даним винаходом. Трансгенні рослини можуть мати зміну у фенотипі, у тому числі без обмеження змінений механізм захисту від патогенів або комах, підвищену стійкість до одного або декількох гербіцидів, підвищену здатність витримувати стресові умови навколишнього середовища, модифіковану здатність виробляти крохмаль, модифікований рівень вироблення крохмалю, модифікований вміст олії та/або її склад, модифіковану здатність використовувати, розподіляти та/або запасати азот і т.п. Ці результати можуть бути досягнуті шляхом експресії гетерологічних генів або підвищеної експресії ендогенних продуктів у рослинах. В якості альтернативи, результати можуть бути досягнуті за рахунок зниження експресії одного або декількох ендогенних продуктів, особливо ферментів, транспортерів або кофакторів, або шляхом впливу на поглинання поживних речовин у рослині.
Як правило, нуклеотидна послідовність промотора за даним винаходом забезпечується в експресійній касеті із нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес, зазвичай гетерологічною нуклеотидною послідовністю, для експресії в рослині, що становить інтерес. Під "гетерологічною нуклеотидною послідовністю" мається на увазі послідовність, яка в природних умовах не є функціонально пов'язаною із промоторною послідовністю, включаючи множинні копії що не зустрічаються в природних умовах, послідовності ДНК, що зустрічається в природних умовах. Хоча ця нуклеотидна послідовність є гетерологічною щодо промоторної послідовності, вона може бути гомологічною, або нативною, чи гетерологічною, або чужорідною, щодо рослини-хазяїна. Зрозуміло, що промотор може також керувати експресією гомологічної або нативної нуклеотидної послідовності. У деяких випадках трансформована рослина може мати зміну у фенотипі. Гетерологічні послідовності нуклеїнової кислоти включають такі, що є екзогенними або відсутніми в нетрансформованій рослинній клітині, а також такі, що можуть бути ендогенними або присутніми в нетрансформованій рослинній клітині. "Гетерологічний", як правило, відноситься до послідовностей нуклеїнової кислоти, що не є ендогенними щодо клітини або частини нативного геному, у якому вони знаходяться, а були додані в клітину шляхом інфекції, трансфекції, мікроїін'єкції електропорації шляхом бомбардування
Зо мікрочастинками або т.п.
Будь-яку послідовність, що становить інтерес, можна експресувати за допомогою промоторних послідовностей за даним винаходом. Такі гетерологічні нуклеотидні послідовності включають кодуючі послідовності, що забезпечують стійкість до гербіцидів, кодуючі послідовності, що забезпечують інсектицидний ефект, кодуючі послідовності, що забезпечують нематоцидний ефект, кодуючі послідовності, що забезпечують антимікробний ефект, кодуючі послідовності, що забезпечують протигрибковий ефект, кодуючи послідовності, що забезпечують противірусний ефект, кодуючі послідовності, що забезпечують витривалість до біотичних та абіотичних стресів, або послідовності, що модифікують ознаки рослин, такі як урожайність, якість зерна, вміст поживних речовин, якість і кількість крохмалю, фіксація та/або утилізація азоту та вміст та/або склад олії, але не обмежуються ними.
Більш конкретні гени, що становлять інтерес, за даним винаходом включають без обмеження гени, які покращують урожайність, гени, які покращують привабливість культур, гени, що кодують білки, які надають стійкість до абіотичного стресу, такого як посуха, температура, засолення, токсичні метали або мікроелементи, або гени, які надають стійкість до токсинів, таких як пестициди та гербіциди, або до біотичного стресу, такого як зараження грибками, вірусами, бактеріями, комахами та нематодами, а також розвиток хвороб, пов'язаних із цими організмами. Зрозуміло, що будь-який ген, що становить інтерес, може бути функціонально пов'язаним із промоторними послідовностями за даним винаходом і може експресуватися в рослині.
Ці гетерологічні нуклеотидні послідовності можуть кодувати білки, залучені до забезпечення стійкості до хвороб або шкідників. Під "стійкістю до хвороб" або "стійкістю до шкідників" мається на увазі, що рослини уникають шкідливих симптомів, які є наслідком взаємодій рослина-патоген.
Всі з генів білків, що забезпечують стійкість до хвороб і шкідників, таких як лізоцими або цекропіни, для антибактеріального захисту, або білків, таких як дефензини, глюканази або хітинази, для протигрибкового захисту, або ендотоксинів Васійи5 ІВПигіпдієпвів, інгібіторів протеаз, колагеназ, лектинів або глікозидаз для боротьби з нематодами або комахами, являють собою приклади придатних генних продуктів. Приклади генів, що становлять інтерес, можна знайти, наприклад, на сайті мумлу.пріар міеди/стдосз/ЛеІдгевів2.стт. "Шкідник" включає комах, гриби, бактерії, віруси, нематод, кліщів, свербунів і т.п., але не 60 обмежується ними. Комахи-шкідники включають комах, обраних із рядів СоіІеорієга, Оірієга,
Нутепорієга, Іерідорієга, МаїЇПорнпада, Ноторієега, Нетірієга, Опійпгорієга, ТНузапоріега,
Регтаріега, Ізорієега, Апоріига, 5ірпопаріега, Тгіспорієга і т.д., особливо, СоіІеоріега, І ерідорієга і Оірієга. Віруси включають вірус мозаїки тютюну або огірка, вірус кільцевої плямистості, вірус некрозу, вірус карликової мозаїки маїгїсу і т.д., але не обмежуються ними. Нематоди включають без обмеження паразитичних нематод, таких як яванська галова нематода, цистоутворююча нематода, нематоди, що ранять, у тому числі нематод Неїегодега 5рр., МеІоідодупе 5рр. і
СіІородега 5рр.; особливо, представників цистоутворюючих нематод, у тому числі без обмеження Неїегодега діусіпе5 (соєву цистоутворюючу нематоду); Неїегодега зспаснії (бурякову нематоду); Неїегодега амепає (злакову цистоутворюючу нематоду) і СіІородега гоіоспіепвів і сіободега раїїда (картопляну нематоду). Нематоди, що ранять, включають без обмеження Ргаїуїепспизх 5рр. Грибкові шкідники включають таких, що викликають листову, жовту та стеблову іржі.
Термін "білок, що забезпечує стійкість до гербіцидів", або білок, отриманий у результаті експресії "молекули нуклеїнової кислоти, що кодує стійкість до гербіцидів", включає білки, які надають клітині здатність витримувати вищу концентрацію гербіциду, ніж клітини, що не експресують білок, або витримувати певну концентрацію гербіциду протягом більш тривалого періоду часу, ніж клітини, які не експресують білок. Ознаки стійкості до гербіцидів можуть бути надані рослини за допомогою генів, що кодують стійкість до гербіцидів, які діють шляхом інгібування активності ацетолактат-синтази (АГ 5), особливо, гербіцидів сульфонілсечовинного типу, генів, що кодують стійкість до гербіцидів, які діють шляхом інгібування активності глутамін- синтази, таким як фосфінотрицин або Баста (наприклад, ген Баг), гліфосат (наприклад, ген
ЕРБР-синтази та ген САТ), або інших подібних генів, відомих у рівні техніки.
Гени, які покращують урожайність культури, включають гени карликовості, такі як КМ і ВН2 (Репу еї аї. (1999) Маїште 400:256-261), і гени, які підвищують ріст рослин, такі як ген глутаматдегідрогенази, що індукується амонієм. Гени, що покращують привабливість культур, включають, наприклад, гени, які дозволяють рослинам мати знижений вміст насичених жирів, гени, які підвищують поживну цінність рослин, і гени, які підвищують вміст білка в зерні. Генами, які покращують витривалість до засолення, є гени, що дозволяють підвищити ріст або забезпечують можливість росту рослини в середовищі з вищою солоністю, ніж природне
Зо навколишнє середовище рослини, в яку були введені ген(и) витривалості до засолення.
Також передбачаються способи ідентифікації регуляторних елементів (наприклад, промоторів, термінаторів і енхансерів). Під "регуляторним елементом" або "регуляторною ділянкою" мається на увазі частина нуклеїнової кислоти, що знаходиться вище або нижче гена, яка може складатися із ДНК або РНК або ДНК і РНК, і яка залучена у експресію гена.
Регуляторні елементи можуть бути здатні опосередковувати органоспецифічність або контролювати активацію генів залежно від періоду розвитку або часового періоду та включають промоторні елементи, корові промоторні елементи, елементи, індукція яких відбувається у відповідь на зовнішній стимул, елементи, які активуються конститутивно, термінатори транскрипції, сигнали поліаденілювання та елементи, які знижують або підвищують активність промотора, такі як негативні регуляторні елементи або транскрипційні енхансери, відповідно.
Під "цис-діючою" мається на увазі послідовність, яка є фізично суміжною із послідовністю, що транскрибується. Цис-діючі послідовності, як правило, взаємодіють із білками або іншими молекулами для здійснення (вмикання/вимикання, регулювання, модуляції і т.д.) транскрипції.
Під "транскрипційним енхансером" мається на увазі послідовність нуклеїнової кислоти, яка, розташовуючись поблизу промотора та знаходячись у транскрипційному середовищі, здатна підтримувати транскрипцію, забезпечуючи підвищену транскрипційну активність у порівнянні з активністю, отриманою в результаті від промотора за відсутності енхансера. Енхансери можуть функціонувати вище, в межах або нижче відносно гена навіть на відстані 50 кілобаз від сайту ініціації транскрипції. Енхансери також можуть функціонувати незалежно від їхньої орієнтації.
Під "термінатором транскрипції" мають на увазі послідовність ДНК, яка включає послідовність пар нуклеотидних основ, необхідну для зниження або усунення транскрипції. Під "сигналом поліаденілювання" мається на увазі послідовність, що керує термінацією транскрипції та трансляції.
Регуляторні послідовності для застосування у рослинах можна клонувати із сої шляхом конструювання одного або декількох ПЛР праймерів на основі послідовності гена рослини або регуляторного елемента. Спосіб може передбачати конструювання щонайменше одного праймера, здатного до гібридизації з нуклеотидною послідовністю із рослини, застосування праймера для ампліфікації ДНК із рослини сої із одержанням ампліфікованої ДНК і тестування ампліфікованої ДНК на активність регуляторної послідовності. Під "активністю регуляторної бо послідовності" мається на увазі здатність впливати на транскрипцію або трансляцію гена. Вона включає промоторну активність, активність транскрипційного енхансера, активність щодо термінації транскрипції та активність щодо поліаденілювання. Способи вимірювання або визначення промоторної активності добре відомі у рівні техніки (див. розділ під назвою "Оцінка промоторної активності"). Способи вимірювання або тестування енхансерної активності добре відомі у рівні техніки (див., наприклад, патенти США МоМо 6806064, 6818757 і 6784289). Способи вимірювання або тестування термінаторної активності добре відомі у рівні техніки (див., наприклад, патент США Мо 5093252). Способи вимірювання або тестування активності стосовно поліаденілювання добре відомі у рівні техніки (див., наприклад, патент США Мо 6632637).
В якості альтернативи, регуляторні елементи можна ідентифікувати та клонувати за допомогою інших підходів. Наприклад, геномні або субгеномні бібліотеки сої можна сконструювати із використанням векторів на основі ВАС, космід або фага лямбда. Бібліотеки можна піддати зондуванню з використанням промоторних елементів із рослин. В якості альтернативи, бібліотеки можна піддати зондуванню із використанням кодуючих ділянок гена із рослини. Отримані клони можна секвенувати та визначити цис-діючі елементи, що оточують кодуючі ділянки сої. В якості альтернативи, фрагменти із кодуючих ділянок різних генів сої можна ампліфікувати із геномної ДНК за допомогою ПЛР із використанням праймерів, сконструйованих із консервативних ділянок генів рослин, таких як консервативні ділянки з маїсу.
Фрагменти кодуючих ділянок сої можна використовувати для дослідження геномних бібліотек, як описано.
Цис-діючі елементи можна клонувати за допомогою ПЛР зі зворотною транскрипцією.
Послідовність кодуючих ділянок генів сої можна одержати, як описано вище, потім сконструювати праймери для ПЛР і використовувати ПЛР зі зворотною транскрипцією для клонування ДНК, що фланкує кодуючі ділянки, з використанням методик, добре відомих у рівні техніки.
Антисенсова послідовність
Гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка функціонально пов'язана із промотором сої, розкритим у даному документі, може являти собою антисенсову нуклеотидну послідовність для цільового гена. Під "антисенсовою нуклеотидною послідовністю" мається на увазі послідовність, яка перебуває у зворотній орієнтації щодо нормальної орієнтації 5-3 даної нуклеотидної
Зо послідовності. Експресія антисенсової послідовності ДНК у рослинній клітині перешкоджає нормальній експресії цільового гена. Антисенсова нуклеотидна послідовність кодує РНК- транскрипт, який є комплементарним і здатним до гібридизації із ендогенними матричними РНК (МРНК), виробленими в результаті транскрипції цільового гена. Таким чином, продукування нативного білка, що кодується цільовим геном, пригнічується та досягається бажана фенотипова відповідь. Модифікації за допомогою антисенсових послідовностей можуть бути здійснені, оскільки послідовності гібридизуються з відповідною мРНК і перешкоджають її експресії. Можна використовувати антисенсові конструкції, послідовність яких приблизно на 70 95, 80 95, 85 95, 90 95 або 95 95 ідентична відповідним антисенсовим послідовностям. Крім того, ділянки антисенсових нуклеотидів можна використовувати для порушення експресії цільового гена. Як правило, можна використовувати послідовності щонайменше з 50 суміжних нуклеотидів, 100 суміжних нуклеотидів, 200 суміжних нуклеотидів або більше. Таким чином, промоторні послідовності, розкриті в даному документі, можуть бути функціонально пов'язані із антисенсовими послідовностями ДНК з метою зниження або пригнічення експресії нативного білка в рослині.
Експресійні касети та вектори трансформації рослин
Трансформацію рослинних клітин можна здійснювати одним з декількох способів, відомих у рівні техніки. Під "рослиною" маються на увазі цілі рослини, органи рослин (наприклад, листя, стебла, коріння і т.д.), насіння, рослинні клітини, пагони, зародки та їх потомство. Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, суспензійна культура клітин, протопласти, клітини листя, клітини кореня, клітини флоеми, пилок). "Трансгенні рослини", або "трансформовані рослини", або "стабільно трансформовані" рослини, або клітини, або тканини належать до рослин, що мають екзогенні послідовності нуклеїнової кислоти або фрагменти ДНК, вбудовані або інтегровані в рослинну клітину. Під "стабільною трансформацією" мається на увазі, що нуклеотидна конструкція, введена в рослину, інтегрується в геном рослини та здатна успадковуватися її потомством.
Промоторна послідовність за даним винаходом може забезпечуватися у вигляді експресійної касети, що дозволяє їй керувати експресією гетерологічної послідовності, що становить інтерес, в рослинних клітинах. Під "експресійною касетою" мається на увазі конструкція ДНК, яка здатна приводити до експресії білка з відкритої рамки зчитування в клітині. бо Касета буде включати в 5-3" напрямку транскрипції ділянку ініціації транскрипції, що включає одну із промоторних нуклеотидних послідовностей, розкритих у даному документі, або їх варіанти або фрагменти, функціонально пов'язані з гетерологічною послідовністю, що становить інтерес, і ділянку термінації трансляції та транскрипції (тобто ділянку термінації), функціональну у рослинах. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген, який потрібно котрансформувати в організм, такий як селектовний маркерний ген. У якості альтернативи, додатковий ген(и) можна забезпечити на декількох експресійних касетах. Така експресійна касета оснащена декількома сайтами рестрикції для вставки гетерологічної послідовності, що становить інтерес, під транскрипційним контролем регуляторних ділянок.
Часто такі конструкції також будуть містити 5 '"ї 3' ділянки, що не транслюються. Такі конструкції можуть також містити трансльовану "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептиду, що становить інтерес, до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласт (або інший тип пластид), ендоплазматичний ретикулум або апарат Гольджі, або для подальшої секреції.
Наприклад, ген може бути сконструйований таким чином, щоб містити сигнальний пептид для полегшення транспорту пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Також може бути переважним конструювання експресійної касети для рослин, що містить інтрон так, щоб процесинг мРНК інтрона був необхідний для експресії. Під "сигнальною послідовністю" мають на увазі послідовність, про яку відомо або передбачається, що вона приводить до котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептиду через клітинну мембрану. У еукаріотів це зазвичай включає секрецію в апарат Гольджі із одержанням у результаті певного глікозилювання. Під "лідерною послідовністю" мають на увазі будь-яку послідовність, яка в результаті трансляції приводить до утворення амінокислотної послідовності, достатньої для запуску котрансляційного транспорту пептидного ланцюга до внутрішньоклітинної органели. Таким чином, це поняття включає спрямований лідерними послідовностями транспорт і/або глікозилювання під час проходження в ендоплазматичний ретикулум, проходження у вакуолі, пластиди, у тому числі хлоропласти, мітохондрії і т.п.
Під "З'і-ділянкою, що не транслюється", мається на увазі нуклеотидна послідовність, розташована нижче щодо кодуючої послідовності. Сигнальні послідовності поліаденілювання та інші послідовності, що кодують регуляторні сигнали, здатні впливати на додавання трактів поліаденілової кислоти до 3' кінця попередника мРНК, являють собою 3'-ділянки, що не транслюються. Під "5'-ділянкКкою, що не транслюється", мається на увазі нуклеотидна послідовність, розташована вище щодо кодуючої послідовності. Інші елементи, що не транслюються, розташовані вище або нижче, включають енхансери. Енхансери являють собою нуклеотидні послідовності, за допомогою яких здійснюється підвищення експресії промоторної ділянки. Енхансери добре відомі у рівні техніки та включають без обмеження енхансерну ділянку 5М40 і енхансерний елемент 355.
Ділянка термінації транскрипції може бути нативною щодо ділянки ініціації транскрипції, що містить промоторну нуклеотидну послідовність за даним винаходом, може бути нативною щодо послідовності ДНК, що становить інтерес, або може бути отримана з іншого джерела. Придатні ділянки термінації доступні із Ті-плазміди А. ішптегасієп5, такі як ділянки термінації транскрипції генів октопін-синтази та нопалін-синтази. Див. також, Сцегіпеаи еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Сеї!! 64:671-674; Запіасоп єї аІ. (1991) Сепе5 Оем. 5:141-149;
Модеп еї аї. (1990) Ріапі Сеї! 2:1261-14272; Мипгое еї аї. (1990) Сепе 91:151-158; Ваїйаз еї аї. (1989) Мисівіс Асіах Нев. 17:7891-7903; і довпі еї аї. (1987) Мисівїс Асіа Не. 15:9627-9639.
Якщо це доцільно, ген(и), що представляє(ють) інтерес, можна оптимізувати з метою підвищення експресії у трансформованій клітині-хазяїні. Тобто гени можна синтезувати з використанням переважних для клітини-хазяїна кодонів для покращеної експресії, або їх можна синтезувати із використанням кодонів відповідно до переважної для хазяїна частоти використання кодонів. Як правило, вміст С у складі гена буде підвищеним. Див., наприклад,
Сатррбеї! апа Сомлі (1990) Ріапі Рнузіої. 92:1-11, для обговорення використання переважних для хазяїна кодонів. Способи синтезу переважних для рослин генів відомі у рівні техніки. Див., наприклад, патенти США МоМо 6320100, 6075185, 5380831 і 5436391; опубліковані заявки на патент США Мо 20040005600 і Мо 20010003849; і Миїтау еї аї. (1989) Мисіевїс Асід5 Ке5. 17:477- 498, включені в даний документ за допомогою посилання.
В одному варіанті здійснення даного винаходу, нуклеїнові кислоти, що становлять інтерес, направляються у хлоропласт для експресії. Таким чином, у випадку, коли нуклеїнова кислота, що становить інтерес, не введена безпосередньо в хлоропласт, експресійна касета буде додатково містити нуклеїнову кислоту, що кодує транзитний пептид або сигнальну послідовність для спрямування продукту гена, що становить інтерес, у хлоропласти. Такі транзитні пептиди бо відомі у рівні техніки. Див., наприклад, Моп Неїпе еї аї. (1991) Ріапі Мої. ВіоїІ. Кер. 9:104-126;
Сіатк еї а)ї. (1989) У). Віої. Снет. 264:717544-17550; ОеМПа-Сіорра еї а. (1987) Ріапі Рнпузіо!. 84:965- 968; Вотег еї аї. (1993) Віоспет. Віорпуз. Ве5. боттип. 196:1414-1421; і пап еї аї. (1986)
Зсіепсе 233:478-481.
Нуклеїнові кислоти, що становлять інтерес, які потрібно направити в хлоропласт, можуть бути оптимізовані для експресії в хлоропластах з урахуванням відмінностей використання кодонів між ядром рослини та цією органелою. У цьому випадку, нуклеїнові кислоти, що становлять інтерес, можуть бути синтезовані із використанням кодонів, переважних для хлоропластів. Див., наприклад, патент США Мо 5380831, включений у даний документ за допомогою посилання.
Як правило, ця "експресійна касета для рослин" буде вставлена у "вектор для трансформації рослин". Під "вектором для трансформації" мається на увазі молекула ДНК, необхідна для ефективної трансформації клітини. Така молекула може складатися з однієї або декількох експресійних касет і може бути організована у більш ніж одну "векторну" молекулу
ДНК. Наприклад, бінарні вектори являють собою вектори для трансформації рослин, в яких використовуються два несуміжні ДНК-вектори для кодування всіх необхідних цис- і транс-діючих функцій для трансформації рослинних клітин (НеПеп5 апа Миїїїпеаих (2000) Тгепав іп Ріапі
Зсіепсе 5:446-451). "Вектор" відноситься до конструкції нуклеїнової кислоти, призначеної для передачі між різними клітинами-хазяїнами. "Експресійний вектор" відноситься до вектора, здатного до вбудовування, інтеграції та експресії гетерологічних послідовностей або фрагментів
ДНК у чужорідній клітині. Під "введенням" мається на увазі надання організму, який потрібно трансформувати, нуклеотидної конструкції таким чином, щоб конструкція отримувала доступ до внутрішнього простору щонайменше однієї клітини організму.
Цей вектор для трансформації рослин може складатися з одного або декількох ДНК векторів, необхідних для досягнення трансформації рослини. Наприклад, загальноприйнятою практикою у даній галузі техніки є застосування векторів для трансформації рослин, які складаються з одного або декількох суміжних сегментів ДНК. У даній галузі техніки ці вектори часто називають "бінарними векторами". Бінарні вектори, а також вектори із хелперними плазмідами, найчастіше використовується для Адгобрасієгійшт-опосередкованої трансформації, де розмір і складність сегментів ДНК, необхідних для досягнення ефективної трансформації, є
Зо досить великими, та доцільно розділити функції між окремими молекулами ДНК. Бінарні вектори зазвичай містять плазмідний вектор, що містить цис-діючі послідовності, необхідні для переносу
Т-ДНК (наприклад, ліву граничну ділянку та праву граничну ділянку), маркер селекції, що сконструйований із можливістю його експресії в рослинній клітині, та "ген, що становить інтерес" (ген, сконструйований із можливістю експресії в рослинній клітині, з якої є бажаним одержання трансгенних рослин). Також на даному плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для реплікації бактерій.
Цис-діючі послідовності розташовані таким чином, щоб сприяти ефективному переносу в рослинні клітини й експресії в них. Наприклад, маркерний ген селекції та ген, що становить інтерес, розташовані між лівою та правою граничними ділянками. Часто, другий плазмідний вектор містить транс-діючі фактори, які опосередковують перенос Т-ДНК із Адгорасіегішт у рослинні клітини. Ця плазміда часто містить функціональні елементи вірулентності (Міг гени), які забезпечують можливість інфікування рослинних клітин Адгобасієгчт і переносу ДНК шляхом розщеплення послідовностей граничних областей і мі--опосередкованого переносу ДНК, як цей процес розуміється в даній галузі техніки (НейПеп5 апа Миїйпеайх (2000) Тгепавз іп Ріапі Зсієпсе, 5:446-451). Кілька типів штамів Адгобасіегіит (наприклад, ГГ ВА4404, 5МУ3101, ЕНАТО1, ЕНАТО5 і т.д.) можна використовувати для трансформації рослин. Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослин іншими способами, такими як бомбардування мікрочастинками, мікроїін'єкція, електропорація, трансформація із використанням поліетиленгліколю і т.д.
Трансформація рослин
Способи за даним винаходом передбачають введення нуклеотидної конструкції в рослину.
Під "введенням" мається на увазі надання рослині нуклеотидної конструкції таким чином, що конструкція отримує доступ до внутрішнього простору клітини рослини. Способи за даним винаходом не вимагають використання конкретного способу введення нуклеотидної конструкції в рослину, головне, щоб нуклеотидна конструкція мала доступ до внутрішнього простору щонайменше однієї клітини рослини. Способи введення нуклеотидних конструкцій у рослини відомі в рівні техніки, у тому числі без обмеження способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації та вірус-опосередковані способи.
Під "рослиною" маються на увазі цілі рослини, органи рослин (наприклад, листя, стебла, 60 коріння і т.д.), насіння, рослинні клітини, пагони, зародки та їх потомство. Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, суспензійна культура клітин, протопласти, клітини листя, клітини коріння, клітини флоеми, пилок). "Трансгенні рослини", або "трансформовані рослини", або "стабільно трансформовані" рослини, або клітини, або тканини відносяться до рослин із вбудованими або інтегрованими в рослинну клітину екзогенними послідовностями нуклеїнової кислоти або фрагментами ДНК. Ці послідовності нуклеїнової кислоти включають послідовності, які є екзогенними або відсутніми в нетрансформованій рослинній клітині, а також послідовності, які можуть бути ендогенними або бути присутніми у нетрансформованій рослинній клітині. "Гетерологічний", як правило, відноситься до послідовностей нуклеїнових кислот, які не є ендогенними для клітини або частини нативного геному, в якому вони знаходяться, а були додані в клітину за допомогою інфекції, трансфекції, мікроїін'єкції, електропорації, бомбардування мікрочастинками або т.п.
Трансгенні рослини за даним винаходом експресують одну або кілька нових послідовностей токсину, описаних у даному документі. У різних варіантах здійснення даного винаходу трансгенна рослина також містить один або кілька додаткових генів стійкості до комах (наприклад, Стгуїт, такі як члени родин СтутА, Сту1В, Сту1С, Сту10, СтутЕ і СтуїЕ; Сгуг, такі як члени родини СтугА; Стгуб, такі як члени родин СтубА, Сту9В, Сту9С, Сту9О, Сту9Е і Стгу9Е; і т.д.).
Фахівцеві в даній галузі техніки буде зрозуміло, що трансгенна рослина може містити будь-який ген, що надає агрономічну властивість, що становить інтерес. У різних варіантах здійснення даного винаходу промотор за даним винаходом можна застосовувати для керування експресією одного або декількох генів, описаних у патентних публікаціях, наведених у Таблиці 1, зміст яких включено в даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.
Таблиця 1
Ефективність використання води
Ефективність використання азоту
Таблиця 1
Стійкість до нематод
Зменшене розтріскування стручків
Стійкість до попелиці
Стійкість до склеротинії
Таблиця 1
Стійкість до бремії
Стійкість до клостеровірусу ши
Витривалість до стресу (у тому числі витривалість до посухи)
Таблиця 1
Таблиця 1
Стійкість до тобамовірусу
СЛ ТУ ооооооввв
Врожайність
Таблиця 1
Таблиця 1
Вміст/склад олії
Вироблення біофармацевтичних
Покращена рекомбінація пе Момот
Зовнішній вигляд рослин іні стеки зни
Боротьба із хворобами (інші)
Таблиця 1
Таблиця 1
Витривалість до гербіцидів
Таблиця 1
Метаболізм рослин
Трансформацію рослинних клітин можна здійснювати одним або декількома способами, відомими у рівні техніки. Пестицидний ген за даним винаходом можна модифікувати для одержання або посилення експресії в рослинних клітинах. Як правило, конструкція, що експресує такий білок, міститиме промотор для керування транскрипцією гена, а також 3'- ділянку, що не транслюється, для забезпечення можливості термінації транскрипції та поліаденілювання. Будова таких конструкцій добре відома у рівні техніки. У деяких випадках корисним може бути конструювання гена таким чином, щоб отриманий пептид був секреторним або яким-небудь іншим способом направлявся в рослинній клітині. Наприклад, ген можна сконструювати таким чином, щоб він містив сигнальний пептид для забезпечення транспорту пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Переважним також може бути конструювання експресійної касети для рослин, що містить інтрон, так, щоб експресія потребувала процесинг
МРНК інтрону.
Як правило, ця "експресійна касета для рослин" буде вставлена в "вектор для трансформації рослин". Цей вектор для трансформації рослин може складатися з одного або декількох ДНК векторів, необхідних для здійснення трансформації рослини. Наприклад, загальноприйнятою практикою в даній галузі техніки є застосування векторів для трансформації рослин, які складаються з більш ніж одного суміжного сегмента ДНК. Ці вектори часто згадуються в даній галузі техніки як "бінарні вектори". Бінарні вектори, а також вектори з хелперними плазмідами, найчастіше використовуються для Адгобасіегіит-опосередкованої трансформації, де розмір і складність сегментів ДНК, необхідних для досягнення ефективної трансформації, досить великі, та доцільно розділити функції між окремими молекулами ДНК.
Бінарні вектори зазвичай містять плазмідний вектор, що містить цис-діючі послідовності, необхідні для переносу Т-ДНК (наприклад, ліву та праву граничну ділянку), маркер селекції, розроблений з можливістю його експресії в рослинній клітині, та "ген, що становить інтерес" (ген, сконструйований із можливістю експресії в рослинній клітині, з якої є бажаним одержання трансгенних рослин). Також на даному плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для реплікації бактерій. Цис-діючі послідовності розташовані таким чином, щоб забезпечувати можливість ефективного переносу в рослинні клітини й експресії в них. Наприклад, маркерний ген селекції та пестицидний ген розташовані між лівою і правою граничними ділянками. Часто, другий плазмідний вектор містить транс-діючі фактори, які опосередковують перенос Т-ДНК із
Адгорасієгішт у рослинні клітини. Ця плазміда часто містить функціональні елементи вірулентності (Міг-ени), що забезпечують можливість інфікування рослинних клітин
Адгобасіегішт і переносу ДНК шляхом розщеплення послідовностей граничних областей і міг- опосередкованого переносу ДНК, як цей процес розуміється в даній галузі техніки (НеїПепз апа
Мийпеаих (2000) Тгтепід5 іп Ріапі ЗОсієпсе, 5:446-451). Кілька типів штамів Адгобасіегійт (наприклад, І ВА4404, (ЗМ3101, ЕНАТОЇ, ЕНАТО5 і т.д.) можуть бути використані для
Зо трансформації рослин. Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослин за допомогою інших способів, таких як бомбардування мікрочастинками, мікроїін'єкція, електропорація, трансформація за допомогою поліетиленгліколю і т.д.
У цілому, способи трансформації рослин включають перенос гетерологічної ДНК у рослинні клітини-мішені (наприклад, незрілі або зрілі зародки, суспензійні культури, недиференційований калюс, протопласти і т.д.) їз подальшим застосуванням максимального граничного рівня відповідного засобу селекції (залежно від маркерного гена селекції) з метою виділення трансформованих рослинних клітин із групи нетрансформованої клітинної маси. Експланти, як правило, переносять на свіжу порцію того ж самого поживного середовища та культивують із застосуванням стандартних підходів. В подальшому, після перенесення у регенераційне середовище, доповнене максимальним граничним рівнем засобу селекції, трансформовані клітини диференціюються в пагони. Потім пагони переносять на селективне середовище для вкорінення з метою виділення вкорінених пагонів або проростків. Потім трансгенна рослина виростає в зрілу рослину та продукує фертильне насіння (наприклад, Ніеєї еї а. (1994) Те Ріапі
Уоитаї! 6:271-282; Ібпіда сеї аї. (1996) Маїшге Віоїесппоіоду 14:745-750). Експланти, як правило, переносять на свіжу порцію того ж самого поживного середовища й культивують із застосуванням стандартних підходів. Загальний опис методик і способів одержання трансгенних рослин можна знайти в Ауге5 апа Рагк (1994) Стййса! Кеміему5 іп Ріапі Зсіепсе 13:219-239; і
Воттіпепі апа дашнаг (1997) Мауадіса 42:107-120. Оскільки трансформований матеріал містить багато клітин, як трансформовані, так і нетрансформовані клітини присутні в будь-якій частині цільового калюса, або тканини, або групі клітин, що були піддані впливу. Можливість знищення нетрансформованих клітин і надання можливості трансформованим клітинам проліферувати приводить до отримання трансформованих рослинних культур. Часто можливість видалення нетрансформованих клітин є обмеженням для швидкого відновлення трансформованих рослинних клітин і успішного одержання трансгенних рослин.
Протоколи трансформації, як і протоколи для введення нуклеотидних послідовностей у рослини, можуть змінюватися залежно від типу рослини або рослинної клітини, тобто однодольних або дводольних, обраних для трансформації. Створення трансгенних рослин можна здійснювати за допомогою одного з декількох способів, у тому числі без обмеження за допомогою мікроін'єкції, електропорації, прямого переносу генів, введення гетерологічної ДНК у бо рослинні клітини за допомогою Адгобасіегічт (Адгобасієегічшт-опосередкованої трансформації),
бомбардування рослинних клітин гетерологічною чужорідною ДНК, прикріпленої на частинках, балістичного прискорення частинок, трансформації аерозольним потоком (опублікована заявка на патент США Мо 20010026941; патент США Мо 4945050; публікація міжнародної заявки Мо УМО 91/00915; опублікована заявка на патент США Мо 2002015066), трансформації з використанням
Їес1ї, а також різних інших способів переносу ДНК, не опосередкованого використанням частинок.
Способи трансформації хлоропластів добре відомі у рівні техніки. Див., наприклад, Змаб еї а!. (1990) Ргос. Маїй!. Асад. бсі. ОБА 87:8526-8530; 5маб апа Маїїда (1993) Ргос. Маї). Асай. зсі.
БА 90:913-917; 5маб апа Маїїда (1993) ЕМВО .. 12:601-606. Спосіб заснований на доставці з використанням гармати частинок з ДНК, що містить селективний маркер, і цілеспрямованій доставці ДНК у геном пластиди шляхом гомологічної рекомбінації. Крім того, трансформацію пластид можна здійснювати шляхом трансактивації мовчазного пластидного трансгена шляхом тканиноспецифічної експресії РНК-полімерази, що кодується ядерним геномом та спрямовується в пластиди. Про таку систему повідомлялося в МеВгіде еї аї. (1994) Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. ОБА 91:7301-7305.
Після інтеграції гетерологічної чужорідної ДНК у клітини рослин застосовують максимально допустимий граничний рівень відповідного засобу селекції у складі середовища для знищення нетрансформованих клітин, а також відокремлення та забезпечення проліферації ймовірно трансформованих клітин, які виживають після даної селекційної обробки, шляхом регулярного переносу на свіже середовище. Шляхом безперервного пасажування та впливу відповідної селекції ідентифікують і забезпечують проліферацію клітин, трансформованих плазмідним вектором. Для підтвердження наявності інтегрованого гетерологічного гена, що становить інтерес, у геномі трансгенної рослини застосовують молекулярні та біохімічні способи.
Клітини, що були трансформовані, можна виростити у рослини відповідно до загальноприйнятих способів. Див., наприклад, МеСоптіск еї аї. (1986) Ріапі Сеї! Керогів 5:81-84.
Ці рослини можна потім виростити та запилити або тією ж самою трансформованою лінією, або іншими лініями та ідентифікувати отриманий у результаті гібрид із конститутивною експресією необхідної фенотипової ознаки. Два або більше поколінь можуть бути вирощені для підтвердження того, що експресія необхідної фенотипової характеристики стабільно
Зо зберігається та успадковується, а потім насіння можна зібрати для підтвердження того, що була досягнута експресія необхідної фенотипової характеристики. Таким чином, даний винахід передбачає одержання трансформованого насіння (що також згадується як "трансгенне насіння"), що містить нуклеотидну конструкцію за даним винаходом, наприклад, експресійну касету за даним винаходом, стабільно вбудовану в їхній геном.
Рослини
Даний винахід можна застосовувати для трансформації будь-яких видів рослин, у тому числі без обмеження дводольних і однодольних. Приклади рослин, що становлять інтерес, включають без обмеження кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томат, хрестоцвіті, перці, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь, олійний рапс, Вгазвіса 5р., люцерну, жито, просо, сафлор, арахіс, солодку картоплю, маніок, каву, кокос, ананас, цитрусові дерева, какаос, чай, банан, авокадо, інжир, гуаяву, манго, оливу, папаю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні та хвойні рослини.
Овочі включають без обмеження томати, латук, зелені боби, лімську квасолю, горох і членів роду Сигситів, таких як огірок, диня та мускусна диня. Декоративні рослини включають без обмеження азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, нарциси, петунії, гвоздики, пуансетію та хризантему. Переважно, рослини за даним винаходом є сільськогосподарськими культурами (наприклад, маїс, сорго, пшениця, соняшник, томат, хрестоцвіті, перці, картопля, бавовник, рис, соя, цукровий буряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь, олійний рапс і т.д.).
Даний винахід є особливо придатним для будь-якого члена класу однодольних рослин, у тому числі без обмеження для маїсу, рису, ячменю, вівса, пшениці, сорго, жита, цукрового очерету, ананаса, ямсу, цибулі, банана, кокоса та фініка.
Оцінка трансформації рослин
Після введення гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини, трансформацію або інтеграцію гетерологічної ДНК у геном рослини підтверджують за допомогою різних способів, таких як аналіз нуклеїнових кислот або білків і метаболітів, асоційованих з інтегрованою ДНК.
ПЛР-аналіз є швидким способом для скринінгу трансформованих клітин, тканин або пагонів на наявність вбудованої ДНК на ранній стадії до пересадження у грунт (Затрбгоок апа Кигззеї, 2001. МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї. Соїа Зрііпд Набог І арогаїюгу Ргез5, Соїд 5ргіпд
Нагбог, МУ). ПЛР проводять із використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів для бо гена, що становить інтерес, або фонового елемента вектора Адгорасіегішт, без урахування гена, що становить інтерес і т.д.
Трансформацію рослини можна підтвердити за допомогою аналізу геномної ДНК методом
Саузерн-блотингу (ЗатргооК апа КиззеїЇ, 2001, вище). У цілому, загальну ДНК екстрагують із трансформанта, розщеплюють необхідними ферментами рестрикції, фракціонують в агарозному гелі та переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану. Потім проводять зондування мембрани або "блота", наприклад, цільовим фрагментом ДНК, міченим радіоактивним ЗР, для підтвердження інтеграції введеної ДНК у геном рослини згідно зі стандартними методиками (Ззатюогоок апа Киззеїї, 2001, вище).
У Нозерн-блот аналізі РНК виділяють із конкретних тканин трансформанта, фракціонують в агарозному гелі з формальдегідом, переносять промоканням на нейлоновий фільтр згідно зі стандартними методиками, які звичайно використовуються у даній галузі техніки (Затрогоок апа
Вивзеїї, 2001, вище). Експресію РНК, що кодується гетерологічним геном, функціонально пов'язаним із промотором ТгірРго5, потім перевіряють шляхом гібридизації фільтра з радіоактивним зондом, отриманим із гетерологічного гена способами, відомими у рівні техніки (ЗатргоокК апа Киззеї, 2001, вище).
Оцінка промоторної активності
Доступні численні способи оцінки промоторної активності в рослинах. Функціонування промотора під час експресії гена, що становить інтерес та знаходиться під його регуляторним контролем, можна досліджувати або на етапі транскрипції, або на етапі трансляції. На етапі транскрипції рівні РНК можна досліджувати за допомогою аналізів гібридизації ДНК-РНК (тобто
Нозерн-блот аналізу), конкурентної ПЛР зі зворотною транскрипцією й аналізу із захистом від
РНКази. На етапі транскрипції промоторну активність можна визначити із використанням специфічних функціональних аналізів для синтезованого білка (наприклад, ферментативної активності або за допомогою імунологічного аналізу білка). Наприклад, активність репортерного гена, як наприклад, В-глюкуронідазна активність, люциферазна активність або флуоресценція
СЕР, можна відслідковувати в різні моменти часу після трансформації. Активність репортерного гена можна відслідковувати за ферментативною активністю, шляхом фарбування клітин або тканин субстратом для ферменту, що кодується репортерним геном, або шляхом прямої візуалізації за відповідної довжини хвилі світла (див., наприклад, УмМапо еї аї. (2000) Ріапі Зсіепсе
Зо 156:201-211). Вестерн-блотинг можна проводити для трансгенних рослин 3 метою підтвердження наявності білка, що кодується геном, що становить інтерес, функціонально пов'язаним із промотором ТгірРго5, відповідно до стандартних процедур (ЗатрбгоокК апа Киззеї, 2001, вище) із використанням антитіл, які зв'язуються з одним або декількома епітопами білка.
Можна визначити повнорозмірні промоторні послідовності, делеції та мутації промоторної послідовності та порівняти рівні їх експресії. Див., наприклад, патент США Мо 6072050; і затбргооК еї аї. (1989) МоїІесшаг Сіопіпда: А Іарогаїгу Мапиа! (24 єед., Соїй 5рііпуд Нагбог
ІГарогаїогу Рге55, Соїй Зргіпд Нагрог, Мем/ Могк), включені в даний документ за допомогою посилання.
Наступні приклади пропонуються для ілюстрації, а не в якості обмеження.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
Приклад 1. Ідентифікація конститутивних промоторів сої
Загальнодоступні бази даних транскриптому сої використовували для ідентифікації генів, що експресуються на високому рівні в різних тканинах (листя, стручок, квіти, коріння і т.д.).
Промоторні ділянки (вище відносно першого АТО) цих генів ампліфікували за допомогою ПЛР із геномної ДНК сої (даск) і зчіплювали з кодуючою ділянкою гена люциферази та термінатором
РіпІ. Ці промотор-вмісні вектори трансформували в Адгобасіегішт. Трансформовані
Адгорасіегішт використовували для просочування листових дисків молодої сої або квасолі.
Після 2 днів інкубації при 25 С за 16-годинного освітлення листові диски гомогенізували в буфері РВ5 для екстракції білка. Далі розчинні білки аналізували на активність люциферази із використанням системи аналізу люциферазної активності ЗТЕАОУ-СГОД від Рготеда.
Люциферазна активність, що являє собою середнє значення трьох незалежних наборів просочених листових дисків сої для кожного вектора, показана на Фігурі 1. Ррасб і Ррас7 показали активність, порівнянну з РибріЗ із Агарідорзіє. Ррасб (5ЕО ІЮ МО:1) одержували з
Сіута03934310, який кодує внутрішній білок тонопласта гама. Ррас7 (ЗЕБЕО ІЮ МО: 2) одержували з Сіута23942220, який кодує внутрішній білок плазматичної мембрани.
Приклад 2. Аналіз іп ріапіа
Послідовності ДНК, що містять промотори Ррасб і Ррас7, відповідно, клонували в ре28133 для зчеплення цих промоторів з дгд23Асе5. Отримані бінарні вектори, ре28806 і рез28807, трансформували в Адгобасіегішт ІГВА4404 і використовували для одержання трансгенних бо рослин сої. Приблизно 150 трансгенних трансформантів для кожного вектора аналізували шляхом обприскування 4Х гліфосатом. Стійкість до 4Х гліфосату оцінювали через тиждень після обприскування (таблиця 2, 0 означає відсутність стійкості, а 4 відображає найсильнішу стійкість). ЮОВОЗ використовували в якості контролю. Ррасб і Ррас7 знову показували рівень стійкості, порівнянний з РибріздАї.
Таблиця 2
Стійкість до 4х гліфосату (представлена як відсоток рослин, оцінений для кожної з категорій)
Вектори |Промотори| (0 2 Б І; 1-5 | 24 | З | 2кабозя р528133 РиБіЗАЇ 0528806 Ррасб 0528807 Ррас7
Усі публікації та заявки на патенти, згадані в описі, указують на рівень кваліфікації фахівців у даній галузі техніки, до якої відноситься даний винахід. Усі публікації та заявки на патенти включені в даний документ за допомогою посилання в тій же мірі, як ніби кожна окрема публікація або патентна заявка була конкретно й окремо зазначена як включена за допомогою посилання.
Незважаючи на те, що даний винахід був описаний у деяких деталях для ілюстрації та прикладу з метою ясності розуміння, буде очевидним, що певні зміни та модифікації можуть бути здійснені в межах обсягу доданої формули винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 БАЙЄР КРОПСАЄНС ЛП
Чжан, Шіжун «1205 КОНСТИТУТИВНІ ПРОМОТОРИ СОЇ «130» 2912939-201794001 «1605 2 «1705 РабепсІпПп версія 3.5 «2105 1
Зо «2115 1230 «2125 ДНК «213» біусіпе шах «4005 1 сЕСЧдааасад аасасадсад Едаєсеєссадд Едсасуддсдс сассеЕдессєд сеааааааса (216) аааасааєєд адддддеєсаа сеаадссааєс ссааассада дассададсд ддадаєссааєс 120 гЕсааєаавс сеЕСЕсадесе сессаєстаад асрссєЕсеЕвеЕ ссаваєсаа Есааасеєта 180
Едсаааасає савсаєєєєса єсссадаааа асаааааадс бассдсбасає асаасаєсаа 240 дЕЄсааааса аасаадсаса деЕссасссас дедссадессду соддЕсСесдса асаасасстд Зоо
СЕС еєсСсо дсдоддсесасс адададесас адсодсссаєс сссстассес аєесаєтаєса 3З6о
Єгаєдаєдаа Єгардсссєє асааєсаєад аєсаассасе асеЕеєсдсадеі гагааасекта 420 аааєєсасаа ЄЄСЕСЕСТає саєєєсЕссд сасасдсдає асаасасааа ассстададс 480
Ббаєсдеєсаєє сасаасеєвса ааааааассаа аааадссаає Сасассадад Сдсаасадсе 540 сасссссссс ссесссасддда ассасссада басасаааага адассадаса ардессастє 60 аєсадсдсесс басаєддсес єсаєссаєсі содасасуаєд єсадеЕсстьдуда дасуддсестд 6бо дсссааасда ЄЄсдсЕеЕдЕеЕсСЕ Єаададсаас саасадсдає дсддддасбає ассссссдес 720 й ЕЕСЕЕЕЕЕсСсСеЕ Єсаааєагваєсе асдсаєааєд сасеЕсаєаає аєвгастсест васесествааа 78о0 асааєтаєеєс сдсасадеЕсе сдаєдаєаає сегаєдссааа ЕдЕєсаєсуєва ааастаєєства 840 сасЕсеЕсвтаа гасаєбадаса ЄсаасеЕсеЕсеЕ єссеєсеєсаєса ааєдеЕссааа аєааааддаа 900 ааасааєсаа Єааєєєдааа Єдаадаассо дссссаддесс дссассааає аддасссесес 960
СЕЕЕсССЯОдДсС ЕСООЧЕДЯДЕСЕЄ єЄдааааасесє даєрєсседас асеєсеЕсоддаа дсаєєдсдса 1020 1 й тає сєссаа агаддаааає аааааєаасс дддаассдуда басадссдує ддааєсстад 1080 чдсаддсЕсдє сЕсСсааєссас ддбасаєаад аадссасудаа дсдаааасда асадсагадс 1140 дааасадада деЕддЕЕссад ЄдадеЕдаєсу дЕДдЕсСасеЕє даєссессає аадссддесає 1200 саєсаєсаєс ассаєсассдя ЄЕДдаєєдаадж 1230 «2105 2 «2115» 1688 «2125 ДНК «213» біусіпе шах
Зо «4005 2 стаасЯясссс содсссасаа сссааасрда ссаадаассеє єссареєеєває єаасарєтаєсс (216) сеЕсасаадсс асссадасса ассааддсас гбааассааєд сагаєсаддс аасрдсааатга 120 аасааєдасу сеЕССсССсСаєдаа баєєссааасу чсЕСсСсСЕСЕСУ сСЕСЕСЕдсССЕ аасдасеЕсеє 180 чЧдеЕаєсеЕстас дааєстасевєд адааааадсс дссассаєса ссасссаасо асбсасааасаа 240 аєдчааадсва садеЕсаадда саєддсссає Саасаасаса Сдсадасссуд ассассдессе Зоо 4 й саєсєссасдад асадааасаа аасасасааа адддсеєсаєє асдсессассс адсссаадва 3З6о ачадчаддааа аєчадесаєд саєдеадсса даасдаасає ссдаєсаєда асдсдадаєса 420 адеЕсааєсоудс Едасадссає дЕдссддасса СЯЄСсСсЕеЕваса аасдаааада аадааадааа 480
ЄдЕеЕсСдвава сааєааєсеса сдддсасаад аассеседеЕса аєвгаєтаєєса Есассєееее 5340
ЕЕСЕЕЕЕЕеЕСвд аааассеєвдеє ЕссСЕСсааєс аєсдаєднає аєседеЕааєс ЕсСЕСЕСсаас 60 7 ЕссЕсассає деадедадда деЕдааєссса сассаасаєсс ддссаєссаса абсассаєсаа 6бо сСЕсссдасодсос аааєссадаає асасасааас ЕЕссдсдсеста аасаєєстєвта ааасаєсоде 720 ассєсєєдднад деааачасєє асаассасда асаадсааса аадааєсєсвєеє саєасдсасе 78о0 сааєдасссс дассасдсдс сасссдчєєсЕ дааасасста гаєсєдададас єдададсаєс 840 гЕЧДЕеЕваєєта Єдасесдсеса Есааєєсьссс сеЕссаєдсся баєсєааєса деЕесаааєає 900 7 аєвсаєєєсеЕс сЕєЄДдваєааа ааааааєссає дассссссса ассасасаса Єсададааса 960 асеЕєдаааєсє агаєссаасу баєсєааєсодс аєсассеєсса асдедссааа асааєаааєа 1020 ааасєааааа срассасаає саєаааєсудс дЕДЧДЕЧДУЧєЄєДда аєєсдадасаа асеЕстаєєсся 1080 аааавадааа аасаєсааса аааададааа дааааааававвва ассдссдаса сссдасадсд 1140
ЧдЕаасаддда адсадсдуєа ддадаєєдодас дЕДЕСУЯдЕСЕ ссаасесьду ааєссаасдае 1200 дссааасєда даасодсадда дааададаса сдєдсссаає Єдсаддсосдуд адсссаасЧе 1260 часааєєсда аадссеєдас ааєсодсассдд сссадсаєсєсдуд аасдсадаса аддассасді 1320 ччдааєєсдадЕ сссеЕдваєсс десЕсаааасує єЕсЕсСрасссє сеЕссеЕссеЕеєс адеесьссса 1380
СЕСсЕСавєсє (осЕсеЕссааас сасадсааєс сасуєеєссад Едсєдсдсдуа аасаєдаєсд 1440 дЕСЕЕЕСсСсад дадедудєєду ааєсссудсса дссаддасаа ассссаєсаа Есаседдесс 1500 ссаєсаааса аааасаєсеєс сааааассса асасаєсасу ссасдддасс сассеєсссас 1560 сассссесас ссеЕСсасеЕсєсеє асеаасссаа ассвраєєссу деЕрагаааєс сддсаасссьс 1620 дЕЄСсСЕвсасва асссасссас сасаассса деЕдааадада аєссдаддсу аададаадад 1680 аааааєта 1688

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Зо 1. Експресійна касета, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з гетерологічною нуклеїновою кислотою, де вказану нуклеотидну послідовність вибирають із групи, що складається з: (а) нуклеотидної послідовності, викладеної в ЗЕО ІЮО МО: 2; та (р) нуклеотидної послідовності, яка принаймні на 99 95 ідентична до послідовності, викладеної в ЗЕО ІЮ МО: 2, де вказана послідовність ініціює транскрипцію гетерологічної нуклеїнової кислоти в рослинній клітині.
  2. 2. Вектор, який містить експресійну касету за пунктом 1.
  3. 3. Рослинна клітина, що має у своєму геномі стабільно вбудовану експресійну касету за пунктом 1, де вказана нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з гетерологічною нуклеїновою кислотою, що становить інтерес.
  4. 4. Рослинна клітина за пунктом 3, де вказана рослинна клітина походить із дводольної рослини.
  5. 5. Рослинна клітина за пунктом 4, де вказана дводольна рослина являє собою сою.
  6. 6. Рослина, що має у своєму геномі стабільно вбудовану експресійну касету за пунктом 1, де вказана нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з гетерологічною нуклеїновою кислотою, що становить інтерес.
  7. 7. Рослина за пунктом 6, де вказана рослина являє собою дводольну рослину.
  8. 8. Рослина за пунктом 7, де вказана дводольна рослина являє собою сою.
  9. 9. Трансгенне насіння, що містить експресійну касету за пунктом 1.
  10. 10. Рослина за пунктом 6, де гетерологічна нуклеїнова кислота, що становить інтерес, кодує генний продукт, який надає стійкість до гербіцидів, засолення, патогенів або шкідників.
  11. 11. Спосіб експресії гетерологічної нуклеїнової кислоти, що становить інтерес, в рослині, де вказаний спосіб передбачає введення в рослинну клітину експресійної касети, що містить промотор, функціонально зв'язаний з гетерологічною нуклегсовою кислотою, що становить інтерес, де вказаний промотор містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що складається з: (а) нуклеотидної послідовності, викладеної в ЗЕО ІЮО МО: 2; та (р) нуклеотидної послідовності, яка принаймні на 99 95 ідентична до послідовності, викладеної в ЗЕО ІЮ МО: 2, бо де вказана нуклеотидна послідовність ініціює транскрипцію гетерологічної нуклеїнової кислоти, що становить інтерес, в рослинній клітині; та,
    регенерацію трансформованої рослини з вказаної рослинної клітини, де вказана рослина містить у своєму геномі стабільно вбудовану вказану експресійну касету.
  12. 12. Спосіб за пунктом 11, де вказана рослина являє собою однодольну рослину.
  13. 13. Спосіб за пунктом 11, де вказана рослина являє собою дводольну рослину.
  14. 14. Спосіб за пунктом 12, де вказана однодольна рослина являє собою маїс.
  15. 15. Спосіб за пунктом 11, де вказана гетерологічна нуклеїнова кислота кодує генний продукт, який надає толерантність до гербіцидів або резистентність до шкідників.
  16. 16. Спосіб експресії гетерологічної нуклеїнової кислоти, що становить інтерес, в рослинній клітині, де вказаний спосіб передбачає введення в рослинну клітину експресійної касети, що містить промотор, функціонально зв'язаний з гетерологічною нуклетновою кислотою, що становить інтерес, де вказаний промотор містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що складається 3: (а) нуклеотидної послідовності, викладеної в ЗЕО ІЮО МО: 2; та (р) нуклеотидної послідовності, яка принаймні на 99 95 ідентична до послідовності, викладеної в ЗЕО ІЮ МО: 2, де вказана послідовність ініціює транскрипцію гетерологічної нуклеїнової кислоти, що становить інтерес в рослинній клітині.
  17. 17. Спосіб за пунктом 16, де вказана рослинна клітина являє собою однодольну рослинну клітину.
  18. 18. Спосіб за пунктом 16, де вказана рослинна клітина являє собою дводольну рослинну клітину.
  19. 19. Спосіб за пунктом 17, де вказана однодольна рослина являє собою маїс.
  20. 20. Спосіб за пунктом 16, де гетерологічна нуклеїнова кислота кодує генний продукт, який надає толерантність до гербіцидів або резистентність до шкідників.
UAA201510071A 2013-03-15 2014-11-03 Експресійна касета, що містить конститутивний промотор сої, та її застосування UA118845C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361790907P 2013-03-15 2013-03-15
PCT/US2014/023291 WO2014150449A2 (en) 2013-03-15 2014-03-11 Constitutive soybean promoters

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA118845C2 true UA118845C2 (uk) 2019-03-25

Family

ID=50549220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201510071A UA118845C2 (uk) 2013-03-15 2014-11-03 Експресійна касета, що містить конститутивний промотор сої, та її застосування

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9944938B2 (uk)
EP (1) EP2970405B1 (uk)
JP (1) JP6463724B2 (uk)
CN (1) CN105102474B (uk)
AR (1) AR095472A1 (uk)
AU (1) AU2014237167B2 (uk)
BR (1) BR112015022495A8 (uk)
CA (1) CA2903226C (uk)
ES (1) ES2702289T3 (uk)
MX (1) MX359956B (uk)
RU (1) RU2714724C2 (uk)
UA (1) UA118845C2 (uk)
WO (1) WO2014150449A2 (uk)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016305181B2 (en) 2015-08-07 2022-02-24 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Root-preferential and stress inducible promoter and uses thereof
CN110267975B (zh) 2016-11-23 2024-04-19 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 Axmi669和axmi991毒素基因及其使用方法
AU2017382305A1 (en) 2016-12-22 2019-07-18 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Use of CRY14 for the control of nematode pests
UY37570A (es) 2017-01-18 2018-08-31 Bayer Cropscience Lp Uso de bp005 para el control de patógenos de planta
UY37571A (es) 2017-01-18 2018-08-31 Bayer Cropscience Lp Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso
AU2021233009A1 (en) * 2020-03-11 2022-09-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Transcription regulating nucleotide sequences and methods of use

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5093252A (en) 1988-04-27 1992-03-03 Eli Lilly And Company Transcription terminator and related recombinant DNA vectors and transformants
WO1991000915A1 (en) 1989-07-11 1991-01-24 Biotechnology Research & Development Corporation Aerosol beam microinjector
US20010003849A1 (en) 1989-08-07 2001-06-14 Kenneth A. Barton Expression of genes in plants
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
TW261517B (uk) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5914451A (en) * 1998-04-06 1999-06-22 Monsanto Company Efficiency soybean transformation protocol
US20080256662A1 (en) * 1999-05-10 2008-10-16 Byrum Joseph R Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US6938976B2 (en) 1999-06-16 2005-09-06 Eastman Kodak Company Printer and method therefor adapted to sense data uniquely associated with a consumable loaded into the printer
ES2252070T3 (es) 1999-10-13 2006-05-16 Immunex Corporation Vectores y procedimientos para la expresion de proteinas recombinantes.
BR0016030A (pt) 1999-11-29 2002-07-30 Midwest Oilseeds Inc Métodos e composições para a introdução de moléculas em células
US6784289B2 (en) 1999-12-21 2004-08-31 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Translational regulatory elements
CA2396348A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 Beth Israel Deaconess Medical Center Cardiac-cell specific enhancer elements and uses thereof
US6806064B2 (en) 2001-07-09 2004-10-19 Academia Sinica Baculovirus enhancer-like sequence
AU2003228440B2 (en) 2002-04-01 2008-10-02 Walter Reed Army Institute Of Research Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
AR042552A1 (es) * 2002-12-27 2005-06-22 Ct Ingenieria Genetica Biotech Promotor artificial para la expresion de secuencias de adn en celulas vegetales
US8395021B2 (en) * 2007-05-08 2013-03-12 The Ohio State University Research Foundation Highly active soybean promoter from the SUBI-3 polyubiquitin gene and uses thereof
US8697857B2 (en) * 2007-11-20 2014-04-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean EF1A2 promoter and its use in constitutive expression of transgenic genes in plants
US8026412B2 (en) * 2008-09-09 2011-09-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean MTH1 promoter and its use in constitutive expression of transgenic genes in plants
CA2828196A1 (en) * 2011-03-18 2012-09-27 Basf Plant Science Company Gmbh Promoters for regulating expression in plants
WO2015061158A1 (en) * 2013-10-21 2015-04-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean pip1 promoter and its use in constitutive expression of transgenic genes in plants

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015144014A (ru) 2017-04-21
AU2014237167A1 (en) 2015-10-01
EP2970405A2 (en) 2016-01-20
ES2702289T3 (es) 2019-02-28
MX2015012171A (es) 2015-11-30
RU2714724C2 (ru) 2020-02-19
CN105102474A (zh) 2015-11-25
AU2014237167B2 (en) 2018-07-12
WO2014150449A3 (en) 2014-11-13
CN105102474B (zh) 2019-11-12
BR112015022495A2 (pt) 2017-10-24
US20150376643A1 (en) 2015-12-31
MX359956B (es) 2018-10-16
EP2970405B1 (en) 2018-09-12
CA2903226A1 (en) 2014-09-25
JP2016514963A (ja) 2016-05-26
BR112015022495A8 (pt) 2022-06-28
CA2903226C (en) 2022-03-15
WO2014150449A2 (en) 2014-09-25
AR095472A1 (es) 2015-10-21
JP6463724B2 (ja) 2019-02-06
US9944938B2 (en) 2018-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9481890B2 (en) Modification of plant development and morphology
UA118845C2 (uk) Експресійна касета, що містить конститутивний промотор сої, та її застосування
CN105408485B (zh) 用于植物中产生性能的手段和方法
EP1869188B1 (en) Cis-acting regulatory elements from tripsacum dactyloides
US8962916B2 (en) Viral promoter, truncations thereof, and methods of use
EP2314702B1 (en) Plant having resistance to low-temperature stress and method of production thereof
US10889828B2 (en) Transgenic plants with enhanced traits
US10597670B2 (en) PHD gene involved in development and formation of plant phloem
US7605302B2 (en) Maize promoter active in silks, stalk nodes, roots and leaf sheaths
US20190023753A9 (en) Transgenic Plants with Enhanced Traits
US20160281101A1 (en) Compositions and methods containing a specific leaf promoter to modify the expression of genes of interest in plants
KR102027542B1 (ko) 애기장대 유래의 습도를 센싱하는 sagl1 프로모터 및 이의 용도
US10961542B2 (en) Compositions and methods containing a constitutive promoter to modify the expression of genes of interest in plants
US20090205078A1 (en) Maize Leaf- and Stalk-Preferred Promoter
Rodríguez Transfenic plants comprising a mutant pyrabactin like (PYL4) regulatory component of an aba receptor
WO2013152408A2 (pt) Composições e métodos para modificar a expressão de genes de interesse
MX2008005276A (en) Maize promoter active in silks, stalk nodes, roots and leaf sheaths