ES2702289T3

ES2702289T3 - Promotores de la soja constitutivos

Info

Publication number: ES2702289T3
Application number: ES14719208T
Authority: ES
Inventors: Shirong Zhang
Original assignee: Bayer CropScience LP
Current assignee: Bayer CropScience LP
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2019-02-28
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: EP2970405A2; AR095472A1; US9944938B2; RU2015144014A; JP2016514963A; AU2014237167A1; RU2714724C2; MX359956B; AU2014237167B2; BR112015022495A2; CN105102474B; MX2015012171A; EP2970405B1; WO2014150449A3; CN105102474A; JP6463724B2; CA2903226C; UA118845C2; WO2014150449A2; CA2903226A1

Abstract

Un casete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal; y (c) una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal.

Description

DESCRIPCIÓN

Promotores de la soja constitutivos

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas, más específicamente, a la identificación y el uso de elementos reguladores en plantas.

Antecedentes de la invención

Actualmente, existe una gran demanda de plantas transgénicas que expresen productos proteicos biotecnológicamente importantes a un nivel alto o inducible. La manipulación de plantas de cultivo para alterar y/o mejorar las características fenotípicas (tales como la productividad o la calidad) requiere la expresión de genes heterólogos en tejidos vegetales. Dicha manipulación genética se ha hecho posible gracias a dos descubrimientos: la capacidad de transformar material genético heterólogo en una célula vegetal y la existencia de promotores que son capaces de impulsar la expresión del material genético heterólogo.

Entre los promotores más usados comúnmente están el promotor de la nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:5745-5749 (1987)); el promotor de la octapina sintasa (OCS), los promotores de caulimovirus tales como el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 19S (Lawton et al., Plant Mol. Biol.

9:315-324 (1987)); el promotor de CaMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985) ) y el promotor del virus del mosaico de la escrofularia 35S (Sanger et al., Plant Mol. Biol. 14:433-43 (1990)); el promotor fotoinducible de la subunidad pequeña del rubisco (Pellegrineschi et al., Biochem. Soc. Trans. 23(2):247-250 (1995)); el promotor de Adh (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:6624-66280 (1987)); el promotor de la sacarosa sintasa (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4144-4148 (1990)); el promotor del complejo génico R (Chandler et al., Plant Cell 1:1175-1183 (1989)); el promotor del gen de la proteína de unión a la clorofila a/b; y similares.

La identificación y el aislamiento de elementos reguladores útiles para una expresión intensa o inducible de genes en microorganismos y plantas sería beneficioso para el desarrollo de variedades comerciales de plantas transgénicas.

Sumario de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para regular la expresión génica en una planta. Las composiciones comprenden secuencias nucleotídicas de Glycine max y variantes de estas que inician la transcripción en una planta. Específicamente, se proporciona una región de iniciación transcripcional aislada a partir de un tonoplasto gamma y un gen de la membrana plasmática de Glycine max. Otras composiciones adicionales de la invención comprenden las secuencias nucleotídicas expuestas en la SEQ ID NO: 2, y variantes y fragmentos de estas. Las composiciones de la presente invención también incluyen casetes de expresión que comprenden una promotor de la invención unido funcionalmente a una secuencia nucleotídica heteróloga de interés. La invención proporciona además vectores que comprenden los casetes de expresión y plantas y células vegetales que tiene incorporados en sus genomas de forma estable un casete de expresión descrito anteriormente. Además, las composiciones incluyen semillas transgénicas de dichas plantas.

Unida funcionalmente al promotor existe una secuencia de interés que puede modificar el fenotipo de la planta. Dicha modificación puede incluir, por ejemplo, la modulación de la producción de un producto endógeno o puede incluir la producción de un producto de expresión exógeno para proporcionar una función o producto nuevo en la planta. Por ejemplo, se abarca una secuencia nucleotídica heteróloga que codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas o plagas.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un casete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal; y (c) una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal. La presente invención proporciona además:

• una célula vegetal que tiene incorporada establemente en su genoma el casete de expresión de la invención; • una célula vegetal que tiene incorporado de manera estable en su genoma el casete de expresión de la invención, en el que dicha secuencia nucleotídica está unida operativamente a un ácido nucleico heterólogo de interés;

• semilla transgénica que comprende el casete de expresión de la invención.

La invención proporciona también un método para expresar una secuencia nucleotídica en una planta, comprendiendo dicho método introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo de interés, en el que dicho promotor comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal; y (c) una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal; y, regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, en la que dicha planta se ha incorporado de manera estable en su genoma, dicho casete de expresión.

La invención proporciona además un método para expresar una secuencia nucleotídica en una célula vegetal, comprendiendo dicho método introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo de interés, en el que dicho promotor comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal; y (c) una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un nivel de expresión alto de luciferasa cuando está bajo el control de los promotores Pbdc6 (SEQ ID NO: 1) y Pbdc7 (SEQ ID NO: 2).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para regular la expresión génica en plantas o células vegetales. Las composiciones de la presente invención comprenden secuencias nucleotídicas nuevas para los promotores de la soja. En particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico promotoras aisladas que comprenden la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2, así como fragmentos y variantes de esta que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 2 o que tienen un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que pueden iniciar la transcripción constitutiva en una célula vegetal. Además, se proporcionan plantas, células vegetales y semillas transformadas.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un casete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal; y (c) una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal.

Las secuencias promotoras de la invención, cuando se ensamblan dentro de una construcción de ADN con el fin de que el promotor se una funcionalmente a una secuencia nucleotídica de interés, impulsan la expresión de la secuencia nucleotídica en las células de un organismo transfectado de forma estable con dicha construcción de ADN, específicamente, células vegetales. Las secuencias promotoras también son útiles como sondas para el aislamiento de otras secuencias promotoras o genes de la soja, tales como marcadores moleculares y similares. Los métodos para expresar una secuencia nucleotídica en una planta comprenden introducir en células vegetales un casete de expresión que comprende un promotor de la invención unido funcionalmente a una secuencia nucleotídica de interés y regenerar una planta transformada a partir de la célula vegetal.

Los artículos “un”, “uno” y “una” se usan en la presente memoria para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa uno o más elementos. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “molécula de ácido nucleico” pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es preferiblemente ADN bicatenario.

Una molécula de ácido nucleico “aislada” o “purificada”, o porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente exenta de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o está sustancialmente exenta de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico “aislado” está exento de secuencias (preferiblemente secuencias que codifican proteínas) que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. A efectos de la invención, “aisladas” cuando se usa en referencia a moléculas de ácido nucleico excluye a cromosomas aislados. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula promotora puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencia nucleotídica que flanquea de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico. Varios aspectos de la invención se describen en mayor detalle en las siguientes subsecciones.

Moléculas de ácido nucleico aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

Las secuencias nucleotídicas de la presente invención incluyen las secuencias promotoras expuestas en la SEQ ID NO: 2, y variantes de esta que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 2 o que tienen un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que pueden iniciar la transcripción constitutiva en una célula vegetal. Pro “promotor” se entiende una secuencia de ácido nucleico que tiene la función de dirigir la transcripción de una secuencia codificante en dirección 3'. Un promotor generalmente comprende una secuencia de ADN homologa a la 5'-TATAAT-3' de consenso (caja TATA) en aproximadamente 10-30 pares de bases en 5' con respecto al sitio de iniciación de la transcripción (cap) que es capaz de dirigir la ARN polimerasa para iniciar la síntesis del ARN. Los promotores pueden comprender además otras secuencias de reconocimiento, generalmente en dirección 5' o en 5' con respecto a la caja TATA, denominadas elementos promotores en dirección 5', que influyen en la velocidad de iniciación de la transcripción. Estos incluyen la caja CAAT, que a menudo se encuentra en aproximadamente 30 a 70 pares de bases en 5' con respecto a la caja TATA y que tiene homología con la 5'-CCAAT-3' canónica (Breathnach and Chambon (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:349-383). En las plantas, la caja CAAT algunas veces se reemplaza por una secuencia conocida tal como la caja AGGA, una región que tiene residuos de adenina que flanquean simétricamente el triplete G(oT)NG (Messing et al. (1983), en Genetic Engineering of Plants, T. Kosuge, C. Meredith and A. Hollaender (eds.), Plenum Press, Nueva York, páginas 211- 227). Estos elementos, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y la traducción (también denominadas “secuencias control”), son necesarias para la expresión de una secuencia de ADN de interés. Los métodos para aislar e identificar elementos reguladores no descritos en la presente memoria, tales como potenciadores y elementos responsables de la expresión tisular o temporal de la región codificante, se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes US-5.635.618; US-6.218.140; US-6.303.370; US-6.310.197 y US-6.355.864.

Por “promotor nuclear” se entiende un promotor sin elementos promotores. Un promotor nuclear contiene secuencias nucleotídicas esenciales para la función promotora, incluida la caja TATA y el sitio de iniciación de la transcripción. Dicha región está presente normalmente, con alguna variación, en la mayoría de los promotores. La región promotora nuclear a menudo se denomina región promotora mínima debido a que es funcional por sí misma para promover un nivel basal de transcripción. La secuencia promotora nuclear para Pbdc6 corresponde a aproximadamente los nucleótidos 29 a 318 de la SEQ ID NO: 1; la TATA corresponde a aproximadamente los nucleótidos 288 a 296 de la SEQ ID NO: 1; y el sitio de iniciación de la traducción corresponde a la posición del nucleótido 318 de la SEQ ID NO: 1. En varias realizaciones, la secuencia promotora nuclear para Pbdc7 corresponde a aproximadamente los nucleótidos 1341 a 1643 de la SEQ ID NO: 2; la TATA corresponde a aproximadamente los nucleótidos 1603 a 1608 de la SEQ ID NO: 2; y el sitio de iniciación de la traducción corresponde a la posición de nucleótido 1643 de la SEQ ID NO: 2. El experto en la materia entenderá que la región promotora nuclear puede diferir de las posiciones mencionadas anteriormente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos en dirección 5' o en dirección 3', y que se pueden tolerar variaciones dentro de la secuencia promotora nuclear.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de las secuencias promotoras divulgadas, también abarcadas por la presente invención, comprenden al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2 o tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, y las cuales pueden iniciar la transcripción constitutiva en una célula vegetal. Por “fragmento” se entiende una porción de la secuencia promotora. Un fragmento de una secuencia nucleotídica puede ser biológicamente activo y, por consiguiente, ser capaz de iniciar la transcripción de una secuencia nucleotídica unida funcionalmente en una planta. También se divulga un fragmento que puede usarse como una sonda de hibridación o cebador de PCR usando métodos divulgadas más adelante. Los ensayos para determinar si dichos fragmentos disminuyen los niveles de expresión o altera la naturaleza de la expresión, es decir, una expresión constitutiva o inducible, se conocen en la técnica.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia promotora pueden comprender al menos aproximadamente 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia promotora de longitud completa divulgada en la presente memoria (por ejemplo, 1688 nucleótidos para la SEQ ID NO: 2) dependiendo del uso previsto. Por nucleótidos “contiguos” se entiende residuos de ácido nucleico que son inmediatamente adyacentes entre sí. Los fragmentos biológicamente activos de los promotores de la presente invención conservarán la actividad promotora (es decir, la iniciación de la transcripción constitutiva). Por “conservar la actividad promotora” se entiende que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 80 % de la actividad promotora del promotor de longitud completa. Una porción biológicamente activa de un promotor puede prepararse aislando una porción de una de las secuencias nucleotídicas promotoras de la invención y evaluando la actividad de dicha porción del promotor. Los métodos para medir la actividad promotora se conocen bien en la técnica. Véase en la sección titulada “Evaluación de la actividad promotora” ejemplos de métodos adecuados.

Dichos fragmentos generalmente comprenderán la secuencia de reconocimiento TATA de la secuencia promotora específica. Estos fragmentos pueden obtenerse escindiendo la secuencia nucleotídica promotora de origen natural divulgada en la presente memoria con enzimas de restricción, sintetizando una secuencia nucleotídica de la secuencia de origen natural de la secuencia de ADN promotora, o mediante el uso de la tecnología PCR. Véase, especialmente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350 y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nueva York). También se abarcan variantes de estos fragmentos promotores, tales como los resultantes de la mutagénesis dirigida al sitio, en las composiciones de la presente invención que comprenden al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2 o tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, y las cuales pueden iniciar la transcripción constitutiva en una célula vegetal.

En la presente memoria también se abarcan variantes de las secuencias promotoras divulgadas en la presente memoria. “Variante” significa una secuencia suficientemente idéntica. Las secuencias promotoras abarcadas por la presente invención son suficientemente idénticas a la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 2. Por “suficientemente idéntica” se entiende una secuencia nucleotídica que tiene al 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos en la presente memoria.

Las variantes de origen natural pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular conocidas, tales como las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación descritas más adelante. Las secuencias nucleotídicas variantes también incluyen secuencias nucleotídicas derivadas sintéticamente que han sido generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio pero que aún tienen actividad promotora tal como se define en la presente memoria.

Las variantes abarcadas en la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan conservando la actividad biológica deseada de la secuencia natural, es decir, conservan la actividad promotora (es decir, iniciación de la transcripción constitutiva). Por “conservar la actividad promotora” se entiende que la variante tendrá al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 80 % o más de la actividad promotora de la secuencia nativa. Los métodos para medir la actividad promotora se conocen en la técnica. Véase en la sección titulada “Evaluación de la actividad promotora” ejemplos de métodos adecuados.

El experto en la materia apreciará también que se pueden introducir cambios por mutación en las secuencias nucleotídicas de la invención sin alterar la capacidad del promotor para impulsar la expresión en una célula vegetal. Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico aisladas variantes pueden crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia nucleotídica correspondiente divulgada en la presente memoria. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Dichas secuencias nucleotídicas variantes también están abarcadas por la presente invención siempre que comprendan al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2 o tengan al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, y puedan iniciar la transcripción constitutiva en una célula vegetal.

De modo alternativo, las secuencias nucleotídicas variantes pueden obtenerse introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia promotora, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse para determinar su capacidad para impulsar la expresión de una secuencia nucleotídica unida funcionalmente en una célula vegetal.

Por “funcionalmente unida” se entiende una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en la que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, pero no siempre, unida funcionalmente significa que las secuencias de ácido nucleico que están unidas son contiguas y, cuando es necesario unen dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para conseguir una comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas más adelante, permitiendo o no huecos. Cuando se calcula el porcentaje de identidad, generalmente se cuentan las coincidencias exactas.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en el programa BLASTN de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas nucleotídicas de BLAST pueden llevarse a cabo con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias nucleotídicas homologas a los promotores de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas a efectos comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. De modo alternativo, se puede utilizar PSI-Blast para llevar a cabo una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN). Véase, www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de ADN, y por lo tanto, puede proporcionar datos sobre la conservación de la secuencia de la secuencia nucleotídica entera. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN comercializados, tales como el módulo ALIGNX del vector NTi Program Suite (Informax, Inc). Un ejemplo no limitativo de un programa de software útil para el análisis de las alineaciones ClustalW es GeneDoc™. Genedoc™ (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud e identidad de ADN entre múltiples genes. Otro ejemplo no limitativo preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que está incluido en el paquete de software de alineación de secuencias GCG (comercializado por Accelrys, Inc., 9865 Scranton Rd., San Diego, California, EE. UU.).

A menos que se indique otra cosa, GAP Versión 10, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, se utilizará para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia nucleotídica utilizado un Peso de GAP de 50 y un Peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando un Peso de GAP de 8 y un Peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También se pueden usar programas equivalentes. Por “programa equivalente” se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias de residuos de nucleótidos idénticos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.

Mediante el uso de métodos tales como PCR, hibridación y similares, pueden identificarse las secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas, teniendo dichas secuencias una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Véase, por ejemplo, Sambrook J., and Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Las secuencias identificadas por su identidad con las secuencias promotoras expuestas en la presente memoria están abarcadas por la presente invención.

Se pueden diseñar cebadores oligonucleotídicos para el uso en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir del ADNc o ^aDⁿgenómico de una planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clones de PCR se conocen en general en la técnica y se divulgan en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Véase también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero sin limitarse a, métodos donde se utilizan cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores específicos simples, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector y cebadores parcialmente no coincidentes.

En un método de hibridación, toda o parte de una secuencia nucleotídica conocida puede usarse para cribar bibliotecas de ADNc o genómicas. Los métodos para la construcción de dichas bibliotecas de ADNc y genómicas se conocen en general en la técnica y se divulgan en Sambrook and Russell, 2001, supra. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómicos, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden ser marcadas con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondas de hibridación pueden obtenerse marcando oligonucleótidos sintéticos en función de la secuencia promotora conocida divulgada en la presente memoria. Además, se pueden usar cebadores degenerados diseñados en función de los nucleótidos conservados en la secuencia nucleotídica. La sonda generalmente comprende una región de secuencia nucleotídica que se híbrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia promotora de la invención o un fragmento o variante de esta. La preparación de sondas para hibridación se conoce en general en la técnica y se divulga en Sambrook and Russell, 2001.

Por ejemplo, la secuencia promotora completa divulgada en la presente memoria, o una o más porciones de la misma, pueden usarse como una sonda capaz de hibridar específicamente con secuencias similares a promotores correspondientes. Para lograr la hibridación específica en una variedad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Dichas sondas pueden usarse para amplificar las secuencias promotoras correspondientes de un organismo seleccionado mediante PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen detección por hibridación de bibliotecas de ADN en placas (ya sea placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo en condiciones rigurosas. Por “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” se entiende condiciones en las que una sonda hibridará con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, se pueden identificar las secuencias diana que son 100 % complementarias con la sonda (hibridación homóloga). De modo alternativo, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir alguna falta de coincidencia en las secuencias de forma que se detecten menores grados de similitud (hibridación heteróloga). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1.000 nucleótidos de longitud o menos de 500 nucleótidos de longitud.

Generalmente, serán condiciones rigurosas aquellas en las que la concentración salina es de menos de aproximadamente una concentración de ion de Na de 1,5 M, generalmente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentración de ion de Na (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas pueden lograrse con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Ejemplos de condiciones de rigurosidad baja incluyen la hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, NaCl 1 M, 1 % de SDS (dodecil sulfato sódico) a 37 °C y un lavado en 1X a 2^xde SSC (20X de SSC = NaCl 3,0 M/citrato de trisodio 0,3 M) a 50 a 55 °C. Ejemplos de condiciones de rigurosidad moderada incluyen la hibridación en 40 a 45 % de formamida, NaCl 1,0 M, 1 % de SDS a 37 °C y un lavado de 0,5X a 1X de SSC a 55 a 60 °C. Ejemplos de condiciones de rigurosidad alta incluyen hibridación en 50 % de formamida, NaCl 1 M, 1 % de SDS a 37 °C y un lavado en 0,1X de SSC a 60 a 65 °C. Opcionalmente, las soluciones tampón de lavado pueden comprender aproximadamente de 0,1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente menos de aproximadamente 24 horas, habitualmente aproximadamente de 4 a aproximadamente 12 horas. Opcionalmente, las soluciones tampón de lavado pueden comprender aproximadamente de 0,1 % a aproximadamente 1 % de SDS.

La especificidad generalmente está en función de los lavados poshibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, se puede calcular la Tm a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-28 : Tm = 81,5 °C 16,6 (log M) 0,41 (%GC) -0,61 (% form) - 500/l; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del hibrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (según se ha definido en la fuerza iónica y pH) a la cual 50 % de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente apareada. La Tm se reduce aproximadamente 1 °C por cada 1 % de no coincidencia; por lo tanto, la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con > 90 % de identidad, la Tm puede reducirse 10 °C. Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, condiciones rigurosas severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y de Tm deseada, los expertos en la materia comprenderán que las variaciones en la rigurosidad de la hibridación y/o las soluciones de lavado se describen de forma inherente. Si el grado deseado de resultados de no coincidencia en una Tm es menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se puede aumentar la concentración de SSC para que pueda utilizarse una temperatura más alta. Se proporciona una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

También se divulgan las secuencias aisladas que tienen actividad promotora y que hibridan en condiciones rigurosas con secuencias promotoras divulgadas en la presente memoria, o con fragmentos de las mismas.

Métodos de uso

Los métodos de la presente invención se refieren a la expresión de secuencias nucleotídicas heterólogas en plantas y células vegetales bajo el control de la secuencia promotora de la presente invención. Las plantas transgénicas pueden tener un cambio en el fenotipo, incluidos, pero sin limitarse a, un mecanismo de defensa contra patógenos o insectos alterado, una resistencia aumentada a uno o más herbicidas, una capacidad aumentada para resistir a condiciones ambientales estresantes, una capacidad modificada para producir almidón, un nivel modificado de producción de almidón, un contenido y/o composición de aceite modificado, una capacidad modificada para utilizar, descomponer y/o almacenar nitrógeno y similares. Estos resultados pueden lograrse a través de la expresión de genes heterólogos o mediante la expresión aumentada de productos endógenos en las plantas. De modo alternativo, los resultados pueden lograrse reduciendo la expresión de uno o más productos endógenos, específicamente enzimas, transportadores o cofactores, o alterando la absorción de nutrientes en la planta.

En general, la secuencia nucleotídica para el promotor de la invención se proporciona en un casete de expresión con una secuencia nucleotídica de interés, generalmente una secuencia nucleotídica heteróloga, para expresión en la planta de interés. Por “secuencia nucleotídica heteróloga” se entiende una secuencia que no está unida funcionalmente de forma natural con la secuencia promotora, incluidas múltiples copias de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. Aunque esta secuencia nucleotídica es heteróloga con respecto a la secuencia promotora, puede ser homologa, o nativa, o heteróloga, o extraña para la planta hospedadora. Se reconoce que el promotor también puede impulsar la expresión de su secuencia nucleotídica homologa o nativa. En algunos casos, la planta transformada puede tener un cambio en el fenotipo. Las secuencias de ácido nucleico heterólogas incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal sin transformar, así como aquellas que pueden ser endógenas o estar presentes en la célula vegetal sin transformar. “Heterólogas” generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas de la célula o parte del genoma nativo en el que están presentes, y han sido añadidas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyeccíón o similares.

Cualquier secuencia de interés puede ser expresada por las secuencias promotoras de la invención. Dichas secuencias nucleotídicas heterólogas incluyen, pero sin limitarse a, secuencias codificantes de tolerancia a herbicidas, secuencias codificantes insecticidas, secuencias codificantes nematicidas, secuencias codificantes antimicrobianas, secuencias codificantes antifúngicas, secuencias codificantes antivirales, secuencias codificantes de tolerancia al estrés abiótico y biótico o secuencias que modifican los rasgos de las plantas tales como el rendimiento, calidad de grano, contenido de nutrientes, calidad y cantidad de almidón, fijación y/o utilización de nitrógeno y contenido y/o composición de aceite.

Los genes más específicos de interés para la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, genes que mejoran el rendimiento del cultivo, genes que mejoran la deseabilidad de los cultivos, genes que codifican proteínas que confieren resistencia al estrés abiótico, tal como sequía, temperatura, salinidad, metales tóxicos o elementos traza, o aquellos que confieren resistencia a toxinas tales como pesticidas y herbicidas, o al estrés biótico, tal como ataques de hongos, virus, bacterias, insectos y nematodos, y el desarrollo de enfermedades asociadas con dichos organismos. Se reconoce que cualquier gen de interés puede unirse funcionalmente con las secuencias promotoras de la invención y expresarse en una planta.

Estas secuencias nucleotídicas heterólogas pueden codificar proteínas que están implicadas en proporcionar resistencia a enfermedades o plagas. Por “resistencia a enfermedades” o “resistencia a plagas” se entiende que las plantas evitan los síntomas dañinos que son el resultado de las interacciones planta-patógeno. Los genes de resistencia a enfermedades y de resistencia a insectos tales como lisozimas o cecropinas para protección antibacteriana, o proteínas tales como defensinas, glucanasas o quitinasas para protección antifúngica, o endotoxinas de Bacillus thuringiensis, inhibidores de la proteasa, colagenasas, lectinas o glucosidasas para el control de nematodos o insectos son todos ejemplos de productos génicos útiles. Se pueden encontrar ejemplos de genes de interés, por ejemplo, en www.nbiap.vt.edu/cfdocs/fieldtests2.cfm.

“Plaga” incluye, pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, virus, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera y Diptera. Los virus incluyen, pero sin limitarse a, virus del mosaico del tabaco o el pepino, virus de las manchas anulares, virus de la necrosis, virus del mosaico del maíz enano, etc. Los nematodos incluyen, pero sin limitarse a, nematodos parásitos tales como los nematodos del nudo de la raíz, los quísiticos y de lesiones, incluidos Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; específicamente miembros de los nematodos quísticos, incluidos, pero sin limitarse a, Heterodera glycines (nematodo quístico de la soja); Heterodera schachtii (nematodo quístico de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo quístico del cereal); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos quísticos de la patata). Los nematodos de lesiones incluyen, pero sin limitarse a, Pratylenchus spp. Las plagas fúngicas incluyen aquellas que provocan royas amarillas, ralladas en hoja y en tallos.

Una “proteína de resistencia a herbicidas” o una proteína resultante de la expresión de una “molécula de ácido nucleico que codifica la resistencia a herbicidas” incluye proteínas que confieren a una célula la capacidad de tolerar una concentración más alta de un herbicida que las células que no expresan la proteína, o de tolerar una concentración determinada de un herbicida durante un período de tiempo más prolongado que las células que no expresan la proteína. Los rasgos de resistencia a herbicidas pueden introducirse en las plantas mediante genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular, los herbicidas del tipo sulfonilurea, genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , glifosato (por ejemplo, el gen de la EPSP sintasa y el gen de GAT) u otros genes de este tipo conocidos en la técnica.

Los genes que mejoran el rendimiento del cultivo incluyen genes de enanismo, tales como Rhtl y Rht2 (Peng et al. (1999) Nature 400:256-261), y aquellos que aumentan el crecimiento de la planta, tales como el de la glutamato deshidrogenasa inducible por amonio. Los genes que mejoran la deseabilidad de los cultivos incluyen, por ejemplo, aquellos que permiten que las plantas tengan un contenido de grasas saturadas reducido, aquellos que refuerzan el valor nutritivo de las plantas y aquellos que aumentan la proteína de los granos. Los genes que mejorar la tolerancia a la sal son aquellos que aumentan o posibilitan el crecimiento vegetal en un ambiente de salinidad más alto que en el ambiente natural de la planta en la cual se ha introducido el gen(es) de tolerancia a la sal.

Además, se proporcionan métodos para identificar elementos reguladores (por ejemplo, promotores, terminadores y potenciadores). Por “elemento regulador” o “región reguladora” se entiende una porción de ácido nucleico que se encuentra en dirección 5' o en dirección 3' de un gen, que puede consistir en ADN o ARN, o ambos ADN y ARN y que participa en la expresión génica. Los elementos reguladores pueden ser capaces de mediar la especificidad para órganos, o controlar la activación génica del desarrollo o temporal e incluyen elementos promotores, elementos promotores nucleares, elementos que son inducibles en respuesta a un estímulo externo, elementos que se activan constitutivamente, terminadores de la transcripción, señales de poliadenilación y elementos que disminuyen o aumentan la actividad promotora tales como elementos reguladores negativos o potenciadores de la transcripción, respectivamente. Por “que actúa en cis” se entiende una secuencia que está físicamente contigua a la secuencia transcrita. Las secuencias que actúan en cis generalmente interactúan con proteínas u otras moléculas para llevar a cabo (activar o desactivar, regular, moderar, etc.) la transcripción. Por “potenciador de la transcripción” se entiende una secuencia de ácido nucleico que, cuando se posiciona próxima a un promotor y está presente en un medio de transcripción capaz de sustentar la transcripción, confiere una actividad de transcripción aumentada en comparación con la resultante a partir del promotor en ausencia del potenciador. Los potenciadores pueden funcionar en dirección 5', dentro, o en dirección 3' de un gen, incluso hasta a 50 kilobases del sitio de iniciación de la transcripción. Los potenciadores también pueden funcionar independientemente de su orientación. Por “terminador de la transcripción” se entiende una secuencia de ADN que incluye una secuencia de pares de bases de nucleótidos necesaria para reducir o eliminar la transcripción. Por “señal de poliadenilación” se entiende una secuencia que controla la terminación de la transcripción y la traducción.

Las secuencias reguladoras para su uso en plantas pueden clonarse a partir de la soja, diseñando uno o más cebadores de PCR en función de la secuencia de un gen vegetal o elemento regulador. El método puede comprender diseñar al menos un cebador capaz de hibridar con una secuencia nucleotídica de una planta, usar el cebador para amplificar ADN de una planta de soja para crear ADN amplificado y probar el ADN amplificado para determinar su actividad como secuencia reguladora. Por “actividad como secuencia reguladora” se entiende la capacidad para producir la transcripción o traducción de un gen. Incluye la actividad promotora, la actividad de potenciación de la transcripción, la actividad de terminación de la transcripción y la actividad de poliadenilación. Los métodos para medir o probar la actividad promotora se conocen en la técnica (véase la sección titulada “Evaluación de la actividad promotora”). Los métodos para medir o probar la actividad de potenciación se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes US-6.806.064, US-6.818.757 y US-6.784.289). Los métodos para medir o probar la actividad de terminación se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, la patente US-5.093.252). Los métodos para medir o probar la actividad de poliadenilación se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, la patente US-6.632.637).

De modo alternativo, los elementos reguladores pueden identificarse y clonarse mediante otros enfoques. Por ejemplo, se podrían construir bibliotecas genómicas o subgenómicas de soja usando vectores BAC, cosmídicos o lambda. Las bibliotecas podrían hibridarse usando elementos promotores de una planta. De modo alternativo, las bibliotecas podrían hibridarse mediante sonda usando regiones codificantes de genes de una planta. Los clones resultantes se podrían secuenciar y se podrían determinar los elementos que actúan en cis circundantes a las regiones codificantes de la soja. De modo alternativo, se podrían amplificar fragmentos de las regiones codificantes de diversos genes de la soja a partir de ADN genómico mediante PCR utilizando cebadores diseñados a partir de regiones conservadas de genes vegetales, tales como regiones conservadas del maíz. Los fragmentos de la región codificante de la soja podrían utilizarse a continuación para hibridar con las bibliotecas genómicas tal como se ha descrito.

Los elementos que actúan en cis podrían clonarse usando PCR inversa. Las secuencia de las regiones codificantes de genes de la soja podrían obtenerse tal como se ha descrito anteriormente, y a continuación podrían utilizarse los cebadores de PCR diseñados y usar la PCR inversa para clonar el ADN que flanquea las regiones codificantes utilizando técnicas conocidas en la técnica.

Secuencia no codificante

La secuencia nucleotídica heteróloga que está funcionalmente unida al promotor de soja divulgado en la presente memoria puede ser una secuencia nucleotídica no codificante para un gen diana. Por secuencia nucleotídica no codificante” se entiende una secuencia que está en sentido inverso al sentido normal de 5'-a-3' de dicha secuencia nucleotídica. La expresión de una secuencia de ADN no codificante en una célula vegetal evita la expresión normal del gen diana. La secuencia nucleotídica no codificante codifica un transcrito de ARN que es complementario y capaz de hibridar con el ARN mensajero (ARNm) endógeno producido por la transcripción del gen diana. De este modo, la producción de la proteína nativa codificada por el gen diana se inhibe y se logra una respuesta fenotípica deseada. Se pueden hacer modificaciones en las secuencias no codificantes siempre que las secuencias hibriden e interfieran en la expresión de ARNm correspondiente. Se pueden usar construcciones no codificantes que tengan aproximadamente 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con las secuencias no codificantes correspondientes. Además, se pueden usar porciones de los nucleótidos no codificantes para interrumpir la expresión del gen diana. Generalmente, se pueden usar secuencias de al menos 50 nucleótidos contiguos, 100 nucleótidos contiguos, 200 nucleótidos contiguos o más. Por consiguiente, las secuencias promotoras divulgadas en la presente memoria pueden unirse funcionalmente a secuencias de ADN no codificantes para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la planta.

Casetes de expresión y vectores de transformación en plantas

La transformación de células vegetales puede lograrse mediante una de las diversas técnicas conocidas en la técnica. Por “planta” se entiende plantas enteras, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de las mismas. Las células vegetales pueden estar diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floemas, polen). “Plantas transgénicas” o “plantas transformadas” o plantas o células o tejidos “transformados de forma estable” se refieren a plantan que tienen incorporadas o integradas secuencias de ácido nucleico o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Por “transformación estable” se entiende que la construcción nucleotídica introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma.

La secuencia promotora de la invención puede proporcionarse en un casete de expresión que permite que este impulse la expresión de una secuencia heteróloga de interés en células vegetales. Por “casete de expresión” se entiende una construcción de ADN que es capaz de dar como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula. El casete incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de iniciación de la transcripción que comprende una de las secuencias nucleotídicas promotoras divulgadas en la presente memoria, o variantes o fragmentos de las mismas, unida funcionalmente a una secuencia heteróloga de interés, y una región de terminación de la traducción y la transcripción (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo, tal como un gen marcador seleccionable. De modo alternativo, el gen o genes adicionales puede proporcionarse en múltiples casetes de expresión. Dicho casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia heteróloga de interés para que esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

A menudo, dichas construcciones también contendrán regiones no traducidas en 5' y 3'. Dichas construcciones también pueden contener una “secuencia señal” o “secuencia líder” traducida para facilitar el transporte cotranslacional o postranslacional del péptido de interés hacia ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), retículo endoplasmático o aparato de Golgi, o para que sea secretado. Por ejemplo, el gen puede manipularse genéticamente para que contenga un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido hacia el retículo endoplasmático. También puede ser preferible manipular genéticamente el casete de expresión vegetal para que contenga un intrón, de forma que el procesamiento del ARNm del intrón sea necesario para la expresión. Por “secuencia señal” se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que tiene como resultado el transporte cotranslacional o postranslacional del péptido a través de la membrana celular. En eucariotas, esto generalmente implica la secreción en el aparato de Golgi, con alguna glucosilación resultante. Por “secuencia líder” se entiende cualquiera secuencia que cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotranslacional de la cadena peptídica hacia un organelo subcelular. Por consiguiente, esta incluye secuencias líder que se dirigen al transporte y/o glucosilación por pasaje hacia el retículo endoplasmático, pasaje hacia las vacuolas, plástidos, incluidos cloroplastos, mitocondrias y similares.

Por “región no traducida en 3'” se entiende una secuencia nucleotídica situada en dirección 3' con respecto a una secuencia codificante. Las secuencias señal de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar a la adición de ácido poliadenílico en el extremo 3' del precursor del ARNm son regiones no traducidas en 3'. Por “región no traducida en 5'” se entiende una secuencia nucleotídica situada en dirección 5' con respecto a una secuencia codificante. Otros elementos no traducidos en dirección 5' o 3' incluyen potenciadores. Los potenciadores son secuencias nucleotídicas que actúan aumentando la expresión de una región promotora. Los potenciadores se conocen en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, la región potenciadora SV40 y el elemento potenciador 35S.

La región de terminación puede ser nativa, comprendiendo la región de iniciación transcripcional la secuencia nucleotídica promotora de la presente invención, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés, o puede derivar de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Si procede, el gen o genes de interés puede optimizarse para una expresión aumentada en la célula hospedadora transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse usando codones preferidos para la célula hospedadora para una expresión mejorada, o pueden sintetizarse usando codones a una frecuencia de uso de codones preferida para la célula hospedadora. Generalmente, el contenido de GC del gen aumentará. Véase, por ejemplo, en Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 una descripción del uso de codones preferido para el hospedador. Los métodos para sintetizar genes preferidos para plantas se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes US-6.320.100; US-6.075.185; US-5.380.831; y US-5.436.391, las Solicitudes publicadas de los Estados Unidos números 20040005600 y 20010003849, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

En una realización, los ácidos nucleicos de interés se dirigen al cloroplasto para expresión. De este modo, cuando el ácido nucleico de interés no está directamente insertado en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica una secuencia señal o peptídica de tránsito para dirigir el producto génico de interés hacia los cloroplastos. Dichos péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Los ácidos nucleicos de interés para dirigirse a los cloroplastos pueden optimizarse para la expresión en el cloroplasto para compensar las diferencias en el uso de codones entre el núcleo vegetal y este organelo. De este modo, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse usando codones preferidos para cloroplastos. Véase, por ejemplo, la patente US-5.380.831.

Generalmente, este “casete de expresión vegetal” se insertará en un “vector de transformación vegetal”. Por “vector de transformación” se entiende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficaz de una célula. Dicha molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión, y puede organizarse en más de una molécula de ADN “vector”. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación vegetales que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones que actúan en cis y trans necesarias para la transformación de células vegetales (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). “Vector” se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células hospedadoras. “Vector de expresión” se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogo en una célula extraña. Por “introducir” se entiende presentar al organismo que se va a transformar, la construcción nucleotídica de tal forma que la construcción consiga el acceso al interior de al menos una célula del organismo.

Este vector de transformación vegetal puede comprender uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación vegetal que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores con frecuencia se denominan en la técnica “vectores binarios”. Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares a menudo se usan para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformación eficaz es bastante grande, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios generalmente contienen un vector plasmídico que contiene las secuencias que actúan en cis necesarias para la transferencia del T-ADN (tal como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionable que se manipula genéticamente para poder expresarse en una célula vegetal, y un “gen de interés” (un gen manipulado genéticamente para poder expresarse en una célula vegetal de la cual se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias necesarias para la replicación bacteriana.

Las secuencias que actúan en cis se disponen de una forma que posibilita la transferencia eficaz a las células vegetales y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen de interés se sitúan entre los bordes izquierdo y derecho. Con frecuencia, un segundo vector plasmídico contiene los factores que actúan en trans que median la transferencia del T-ADN de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que posibilitan la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia del ADN mediante escisión en las secuencias de borde y la transferencia del ADN mediada por vir, tal como se entiende en la técnica (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451) . Se pueden usar varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación vegetal. El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar plantas mediante otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

Transformación de plantas

Los métodos de la invención implican introducir una construcción nucleotídica en una planta. Por “introducir” se entiende presentar a la planta, la construcción nucleotídica de tal forma que la construcción puede acceder al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método específico para introducir una construcción nucleotídica en una planta, solo que la construcción nucleotídica pueda acceder al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir construcciones nucleotídicas en plantas se conocen en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

Por “planta” se entiende plantas enteras, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de las mismas. Las células vegetales pueden estar diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floemas, polen).

“Plantas transgénicas” o “plantas transformadas” o plantas o células o tejidos “transformados de forma estable” se refieren a plantas que tienen incorporadas o integradas secuencias de ácido nucleico o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico heterólogas incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal sin transformar, así como aquellas que pueden ser endógenas o estar presentes en la célula vegetal sin transformar. “Heterólogas” generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas de la célula o parte del genoma natural en el que están presentes, y han sido añadidas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similares.

Las plantas transgénicas de la invención expresan una o más de las secuencias de toxina nuevas divulgadas en la presente memoria. En varias realizaciones, la planta transgénica comprende además uno o más genes adicionales para la resistencia a insectos (por ejemplo, Cry1, tales como miembros de las familias Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E y Cry1F; Cry2, tales como miembros de la familia Cry2A; Cry9, tales como miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F; etc.). El experto en la materia entenderá que la planta transgénica puede comprender cualquier gen que imparta un rasgo agronómico de interés. En varias realizaciones, el promotor de la invención puede usarse para impulsar la expresión de uno o más genes descritos en las publicaciones de patentes indicadas en la Tabla 1, cuyos contenidos se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.

Tabla 1

La transformación de células vegetales puede lograrse mediante una de las diversas técnicas conocidas en la técnica. El gen pesticida de la invención puede modificarse para obtener o potenciar la expresión en células vegetales. Generalmente, una construcción que expresa dicha proteína contendría un promotor para impulsar la transcripción del gen, así como una región no traducida en 3' para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de dichas construcciones se conoce en la técnica. En algunos casos, puede ser útil manipular genéticamente el gen con el fin de que el péptido resultante se secrete, o se dirija de otra forma dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede manipularse genéticamente para que contenga un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido hacia el retículo endoplasmático. También puede ser preferible manipular genéticamente el casete de expresión vegetal para que contenga un intrón, de forma que el procesamiento del ARNm del intrón sea necesario para la expresión.

Generalmente, este “casete de expresión vegetal” se insertará en un “vector de transformación vegetal”. Este vector de transformación vegetal puede comprender uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación vegetal. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación vegetal que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores frecuentemente se denominan en la técnica “vectores binarios”. Los vectores binarios así como vectores con plásmidos auxiliares a menudo se usan para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformación eficaz es bastante grande, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios generalmente contienen un vector plasmídico que contiene las secuencias que actúan en cis necesarias para la transferencia del T-ADN (tal como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionable que se manipula genéticamente para poder expresarse en una célula vegetal, y un “gen de interés” (un gen manipulado genéticamente para poder expresarse en una célula vegetal de la cual se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis se disponen de una forma que posibilita la transferencia eficaz hacia células vegetales y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen pesticida se sitúan entre los bordes izquierdo y derecho. Frecuentemente, un segundo vector plasmídico contiene los factores que actúan en trans que median la transferencia del T-ADN de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido frecuentemente contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que posibilitan la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia del ADN mediante escisión en las secuencias de borde y la transferencia del ADN mediada por vir, tal como se entiende en la técnica (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). Se pueden usar varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación vegetal. El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar plantas mediante otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los métodos de transformación vegetal implican transferir ADN heterólogo a células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos no diferenciados, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección adecuada (en función del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular sin transformar. Los explantes generalmente se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarlas en medio de regeneración complementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. A continuación, los brotes se transfieren a un medio de enraizado selectivo para recuperar el brote o plántula enraizado. Las plántulas transgénicas a continuación crecen hasta convertirse en plantas maduras y producen semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes generalmente se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres and Park (1994) Critical Reviews en Plant Science 13:219-239 y Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células; las células transformadas y no transformadas están presentes en cualquier porción de callo o tejido o grupo de células diana. La capacidad para destruir células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da lugar a cultivos vegetales transformados. A menudo, la capacidad para extraer células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y para la generación con éxito de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias nucleotídicas en plantas pueden variar en función del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledóneas o dicotiledóneas, a las que se dirige la transformación. La generación de plantas transgénicas puede llevarse a cabo mediante varios métodos, incluidos, pero sin limitarse a, microinyección, electroporación, transferencia génica directa, introducción de ADN heterólogo mediante Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN extraño heterólogo adherido a partículas, aceleración de partículas por biolística, transformación por haz de aerosol (solicitud publicada de los Estados Unidos N.° 20010026941; Patente US-4.945.050; Publicación internacional N.° WO 91/00915; Solicitud publicada de los Estados Unidos N.° 2002015066), transformación por Lecl y diversos métodos no mediados por partículas directas para transferir ADN.

Los métodos para la transformación de cloroplastos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la administración con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y dirigir el ADN al genoma plastídico a través de recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación plastídica puede lograrse mediante transactivación de una transgén silencioso en el plástido mediante expresión en tejido preferido de una ARN polimerasa de codificación nuclear y dirigida al plástido. Dicho sistema ha sido descrito en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Tras la integración del ADN extraño heterólogo en las células vegetales, se aplica entonces un nivel umbral máximo de selección apropiada en el medio para destruir las células no transformadas y separar y proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de selección transfiriéndolas regularmente a un medio nuevo. Mediante el pasaje y estimulación constante con la selección adecuada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector plasmídico. Se pueden usar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que han sido transformadas pueden cultivarse hasta convertirse en plantas usando medios convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. A continuación, estás plantas pueden cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o cepas diferentes y se puede identificar el híbrido resultante que presenta expresión constitutiva de las características fenotípicas deseadas. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y hereda de forma estable y luego cosechar las semillas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta forma, la presente invención proporciona semillas transformadas (también denominadas “semillas transgénicas”) que tienen una construcción nucleotídica de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado establemente en su genoma.

Plantas

La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie vegetal, incluidas, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero sin limitarse a, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimiento, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuetes, batata, yuca, café, coco, piña, árboles cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, cajú, macadamia, almendra, avena, verduras, plantas ornamentales y coníferas.

Las verduras incluyen, pero sin limitarse a, tomate, lechuga, judías verdes, judía de lima, guisantes y miembros del género Curcumis tales como pepino, melón y melón amarillo. Las plantas ornamentales incluyen, pero sin limitarse a, azalea, hortensia, hibisco, rosa, tulipán, narciso, petunia, clavel, poinsettia y crisantemo. Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimiento, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, avena, colza, etc.).

La invención es especialmente adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas incluidas, pero sin limitarse a, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, cebolla, plátano, coco y dátiles.

Evaluación de la transformación de plantas

Tras la introducción del ADN extraño heterólogo en las células vegetales, la transformación o integración del ADN heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos métodos tales como análisis de ácidos nucleicos y proteínas y metabolitos asociados con el ADN integrado.

El análisis de PCR es un método rápido para detectar las células, tejidos o brotes transformados para determinar la presencia del ADN incorporado en la etapa inicial antes del trasplante en el suelo (Sambrook and Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo usando cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen de interés o un fondo de vector de Agrobacterium, etc.

La transformación de plantas puede confirmarse mediante análisis de transferencia Southern del ADN genómico (Sambrook and Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae del transformante, se digiere con enzimas de restricción adecuadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. La membrana o “transferencia” se hibrida, por ejemplo, con un fragmento de ADN diana radiomarcado con 32P para confirmar la integración del ADN introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales (Sambrook and Russell, 2001, supra).

En el análisis de transferencia Northern, se aísla ARN de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa formaldehido, se transfiere a un filtro de nailon de acuerdo con procedimientos convencionales que se usan habitualmente en la técnica (Sambrook and Russell, 2001, supra). La expresión del ARN codificado por un gen heterólogo unido funcionalmente al promotor TripPro5 a continuación se prueba hibridando el filtro con una sonda radiactiva derivada del gen heterólogo mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook and Russell, 2001, supra).

Evaluación de la actividad promotora

Existen varios métodos para evaluar la actividad promotora en plantas. La función promotora durante la expresión de un gen de interés bajo su control regulador puede evaluarse en la etapa transcripcional o translacional. En la etapa transcripcional, se pueden probar los niveles de ARN mediante ensayos de hibridación ADN-ARN (es decir, análisis de transferencia Northern), PCR de transcriptasa inversa competitiva y ensayos de protección de ARNasa. En la etapa translacional, la actividad promotora puede determinarse usando ensayos funcionales específicos para la proteína sintetizada (por ejemplo, mediante actividad enzimática o por inmunoensayo de la proteína). Por ejemplo, la actividad génica iniciadora, tal como la actividad p-glucuronidasa, la actividad luciferasa o fluorescencia de GFP puede controlarse en varios puntos temporales después de la transformación. La actividad génica indicadora puede controlarse por actividad enzimática, por tinción de células o tejidos con sustrato para la enzima codificada por el

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un casete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia nucleotídica que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal; y

(c) una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal.

2. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia nucleotídica está unida funcionalmente a una secuencia nucleotídica heteróloga de interés.

3. Una célula vegetal que tiene incorporado de forma estable en su genoma el casete de expresión de la reivindicación 2.

4. La célula vegetal de la reivindicación 3, en la que dicha célula vegetal es de una planta dicotiledónea.

5. La célula vegetal de la reivindicación 4, en la que dicha planta dicotiledónea es la soja.

6. Una planta que tiene incorporado de forma estable en su genoma el casete de expresión de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia nucleotídica está unida funcionalmente a un ácido nucleico heterólogo de interés.

7. La planta de la reivindicación 6, en la que dicha planta es una planta dicotiledónea.

8. La planta de la reivindicación 7, en la que dicha planta dicotiledónea es la soja.

9. Semilla transgénica que comprende el casete de expresión de la reivindicación 1.

10. La planta de la reivindicación 6, en la que el ácido nucleico heterólogo de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, sal, patógenos o plagas.

11. Un método para expresar una secuencia nucleotídica en una planta, comprendiendo dicho método introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende un promotor unido funcionalmente a un ácido nucleico heterólogo de interés, en el que dicho promotor comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2;

(c) una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia inicia la transcripción constitutiva en una célula vegetal; y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, en la que dicha planta tiene incorporado de forma estable en su genoma dicho casete de expresión.

12. Un método para expresar una secuencia nucleotídica en una célula vegetal, comprendiendo dicho método introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende un promotor unido funcionalmente a un ácido nucleico heterólogo de interés, en el que dicho promotor comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2;

13. El método de la reivindicación 11 o 12, en el que dicha planta es una planta monocotiledónea, preferiblemente en el que dicha planta monocotiledónea es el maíz.

14. El método de la reivindicación 11 o 12, en el que dicha planta es una planta dicotiledónea.

15. El método de la reivindicación 11 o 12, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas o plagas.