ES2601577T3

ES2601577T3 - Proteínas insecticidas

Info

Publication number: ES2601577T3
Application number: ES08732817.5T
Authority: ES
Inventors: Hope Hart; Jeng S. Chen; Cheryl Stacy; Frederick Walters
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2007-03-28
Filing date: 2008-03-26
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2028-03-26
Also published as: CA2682227A1; AU2008232826B2; CL2008000912A1; CN103588865B; PT2137211T; CN101679491A; AU2008232826A1; CN101679491B; RU2009139447A; RU2497830C2; PH12013500911B1; MX2009010062A; ZA200906699B; BRPI0809352B1; AR077319A2; UA96187C2; EP2137211A1; RU2532838C2; RU2011146867A; WO2008121633A1

Abstract

Una proteína insecticida híbrida diseñada (eHIP) que comprende desde el N-terminal al C-terminal una región Nterminal de una primera proteína Cry del Bacillus thuringiensis (Bt) fusionada con una región C-terminal de una segunda proteína Cry del Bt diferente de la primera proteína Cry del Bt, donde al menos una posición de entrecruzamiento entre la primera y la segunda proteína Cry del Bt está situada en el bloque conservado 2, el bloque conservado 3, la región variable 4 o el bloque conservado 4, y y donde la primera proteína Cry es una Cry3Aa y donde la segunda proteína Cry es una Cry1Ab, una Cry1Fa, una Cry1Aa, una Cry1Ac o una Cry1Ia, y donde la proteína insecticida híbrida diseñada comprende opcionalmente (a) una región de la cola de la protoxina de una proteína Cry del Bt situada en un C-terminal; o (b) en el N-terminal un fragmento peptidilo; o (c) ambos (a) y (b), y donde la proteína insecticida híbrida diseñada presenta actividad insecticida contra el gusano del la raíz del maíz del oeste o el barrenador del maíz europeo.

Description

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SEQ ID NO: 40 es la 5*OL-7 codificada por SEQ ID NO: 39. SEQ ID NO: 41 es la secuencia de nucleótidos 2OL-10. SEQ ID NO: 42 es la 2OL-10 codificada por SEQ ID NO: 41. SEQ ID NO: 43 es la secuencia de nucleótidos 5*2OL-10.

5 SEQ ID NO: 44 es la 5*OL-10 codificada por SEQ ID NO: 43. SEQ ID NO: 45 es la secuencia de nucleótidos 2OL-12A. SEQ ID NO: 46 es la 2OL-12A codificada por SEQ ID NO: 45. SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleótidos 2OL-13. SEQ ID NO: 48 es la 2Ol-13 codificada por SEQ ID NO: 47. SEQ ID NO: 49 es la secuencia de nucleótidos V5 y 6. SEQ ID NO: 50 es la V5 y 6 codificada por SEQ ID NO: 49. SEQ ID NO: 51 es la secuencia de nucleótidos 5*V5 y 6. SEQ ID NO: 52 es la 5*V5 y 6 codificada por SEQ ID NO: 51. SEQ ID NO: 53 es la secuencia de nucleótidos 88A-dm3.

15 SEQ ID NO: 54 es la 88A-dm3 codificada por SEQ ID NO: 53. SEQ ID NO: 55 es la secuencia de nucleótidos FR(1Fa). SEQ ID NO: 56 es la FR(1Fa) codificada por SEQ ID NO: 55. SEQ ID NO: 57 es la secuencia de nucleótidos FR(1Ac). SEQ ID NO: 58 es la FR(1Ac) codificada por SEQ ID NO: 57. SEQ ID NO: 59 es la secuencia de nucleótidos FR(1Ia). SEQ ID NO: 60 es la FR(1Ia) codificada por SEQ ID NO: 59. SEQ ID NO: 61 es la secuencia de nucleótidos DM23A. SEQ ID NO: 62 es la DM23A codificada por SEQ ID NO: 61. SEQ ID NO: 63 es la secuencia de nucleótidos 8AF.

25 SEQ ID NO: 64 es el 8AF codificada por SEQ ID NO: 63. SEQ ID NO: 65 es la secuencia de nucleótidos 5*cry3A055. SEQ ID NO: 66 es la 5*Cry3A055 codificada por SEQ ID NO: 65. SEQ ID NO: 67 es una secuencia de nucleótidos cry3A optimizada de maíz. SEQ ID NO: 68 es la Cry3A codificada por SEQ ID NO: 67. SEQ ID NO: 69 es la secuencia de nucleótidos cry3A055. SEQ ID NO: 70 es la Cry3A055 codificada por SEQ ID NO: 69. SEQ ID NO: 71 es una secuencia de nucleótidos cry1Ab optimizada de maíz. SEQ ID NO: 72 es la Cry1Ab codificada por SEQ ID NO: 71. SEQ ID NO: 73 es una secuencia de nucleótidos cry1Ba optimizada de maíz.

35 SEQ ID NO: 74 es la Cry1Ba codificada por SEQ ID NO: 73. SEQ ID NO: 75 es una secuencia de nucleótidos cry1Fa optimizada de maíz. SEQ ID NO: 76 es la Cry1Fa codificada por SEQ ID NO: 75. SEQ ID NO: 77 es una secuencia de nucleótidos cry8Aa. SEQ ID NO: 78 es la Cry8Aa codificada por SEQ ID NO: 77. SEQ ID NO: 79 es una secuencia de nucleótidos cry1Ac. SEQ ID NO: 80 es la Cry1Ac codificada por SEQ ID NO: 79. SEQ ID NO: 81 es una secuencia de nucleótidos cry1Ia. SEQ ID NO: 82 es la Cry1Ia codificada por SEQ ID NO: 81. SEQ ID NOs 83-125 son secuencias cebadoras útiles en la presente invención.

45 SEQ ID NOs 126-134 son fragmentos peptidilo N-terminal. SEQ ID NO: 135 es una proteína Cry3A de longitud completa. SEQ ID NO: 136-143 son secuencias cebadoras útiles en la presente invención. SEQ ID NO: 144 es la secuencia codificante de T7-8AF. SEQ ID NO: 145 es la T7-8AF codificada por SEQ ID NO: 144. SEQ ID NO: 146 es la secuencia codificante de catG8AF. SEQ ID NO: 147 es la CatG8AF codificada por SEQ ID NO: 146. SEQ ID NO: 148 es la secuencia codificante de 8AFdm3. SEQ ID NO: 149 es la 8AFdm3 codificada por SEQ ID NO: 148. SEQ ID NO: 150 es la secuencia codificante de 8AFlongdm3.

55 SEQ ID NO: 151 es la 8AFlongdm3 codificada por SEQ ID NO: 150. SEQ ID NO: 152 es la secuencia codificante de cap8AFdm3. SEQ ID NO: 153 es la cap8AFdm3 codificada por SEQ ID NO: 152. SEQ ID NO: 154 es la secuencia codificante de 8AFdm3T. SEQ ID NO: 155 es la 8AFdm3T codificada por SEQ ID NO: 154. SEQ ID NO: 156 es la secuencia codificante de 8AFlongdm3T. SEQ ID NO: 157 es la 8AFlongdm3T codificada por SEQ ID NO: 156. SEQ ID NO: 158 es la secuencia codificante de cap8AFdm3T. SEQ ID NO: 159 es la cap8AFdm3T codificada por SEQ ID NO: 158. SEQ ID NO: 160 es la eHIP FR8a +34.

65 DEFINICIONES

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La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo por homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual (véase, en general, Ausubel et al., infra).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para la determinación del porcentaje de identidad de la secuencia y la similitud de la secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Se dispone de un software de acceso público para la realización de los análisis BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo incluye identificar primero los pares de las secuencias de puntuación alta (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que igualan o satisfacen alguna puntuación T de umbral evaluado positivo cuando son alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Se hace referencia a T como al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., 1990). Estas coincidencias iniciales de las palabras vecinas actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSP más largos que las contienen. Las coincidencias de las palabras se extienden posteriormente en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de las palabras en cada dirección se ve interrumpida cuando la puntuación de alineación acumulada disminuye una cantidad X respecto a su valor máximo alcanzado, la puntuación acumulada tiende a cero o por debajo de cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa, o se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M = 5, N = -4, y una comparación de las dos hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad de la secuencia, el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE. UU.

90: 5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una igualdad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se produzca por casualidad. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de examen se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación de la secuencia de ácidos nucleicos de examen con la secuencia de ácidos nucleicos de referencia es menor de aproximadamente 0.1, más preferentemente menor de aproximadamente 0.01 y en el caso más preferible menor de aproximadamente 0.001.

Otro programa de ordenador de uso extendido y aceptado para llevar a cabo las alineaciones de las secuencias es CLUSTALW v1,6 (Thompson, et al., Nuc. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). El número de bases o de aminoácidos coincidentes se divide por el número total de bases o de aminoácidos y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad. Por ejemplo, si dos secuencias de 580 pares de base tenían 145 bases coincidentes, serían un 25 por ciento idénticas. Si las dos secuencias comparadas son de diferentes longitudes, el número de coincidencias se divide por la menor de las dos longitudes. Por ejemplo, si habían 100 aminoácidos coincidentes entre una proteína de 200 y 400 aminoácidos, estas son 50 por ciento idénticas con respecto a la secuencia más corta. Si la secuencia más corta es menor de 150 bases o 50 aminoácidos de longitud, el número de coincidencias se divide por 150 (para bases de ácidos nucleicos) o 50 (para aminoácidos) y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad.

Otra indicación de que dos ácidos nucleicos son sustancialmente idénticos es que las dos moléculas hibriden entre sí en condiciones rigurosas. La frase “hibridar específicamente con” se refiere a la unión, la duplicación o la hibridación de una molécula solo con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en un ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total). “Se une o unen sustancialmente” se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico de sondeo y un ácido nucleico diana, e incluye las pocas no coincidencias que puedan tener lugar mediante la reducción de la rigurosidad del medio de hibridación para alcanzar la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico diana.

Las “condiciones de hibridación rigurosas” y “condiciones de lavado de hibridación rigurosas” en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como las hibridaciones Southern y Northern, dependen de la secuencia y son diferentes con parámetros ambientales distintos. Secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra

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en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, capítulo 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, Nueva York. En general, se seleccionan condiciones de lavado y de hibridación altamente rigurosas que sean aproximadamente 5ºC más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos. Normalmente, en “condiciones rigurosas” una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

La Tm es la temperatura (a un pH y una fuerza iónica definidos) en la que el 50% de la secuencia diana se hibrida para obtener una sonda perfectamente coincidente. Se seleccionan condiciones muy rigurosas para ser iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en un ensayo de inmunotransferencia de Southern o Northern es un 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42ºC, llevando a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy rigurosas es NaCl 0.15 M a 72ºC durante unos 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con 0.2x SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, infra, para obtener una descripción del tampón SSC). A menudo, un lavado de rigurosidad alta va precedido por un lavado de rigurosidad baja para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de rigurosidad baja para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es de 4-6x SSC a 40ºC durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones rigurosas normalmente incluyen concentraciones de sal menores de aproximadamente 1.0 M de ión Na, normalmente una concentración de ión Na de aproximadamente 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0-8.3 y la temperatura es normalmente de al menos aproximadamente 30ºC. También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes de desestabilización, tales como formamida. En general, una proporción de señal respecto a ruido de 2x (o superior) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que estos codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.

Los siguientes son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridación/lavado que se pueden utilizar para clonar secuencias de nucleótidos homólogas que son sustancialmente idénticas a las secuencias de nucleótidos de referencia de la presente invención: una secuencia de nucleótidos de referencia preferentemente se hibrida con la secuencia de nucleótidos de referencia en 7% de dodecilsulfato sódico (SDS), NaPO4 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 2X SSC, 0.1% de SDS a 50°C, más deseablemente en 7% de dodecilsulfato sódico (SDS), NaPO4 0.5 M , EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 1X SSC, 0.1% de SDS a 50°C, aún más deseablemente en 7% de dodecilsulfato sódico (SDS), NaPO4 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0.5X SSC, 0.1% de SDS a 50°C, preferentemente en 7% de dodecilsulfato sódico (SDS), NaPO4 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0.1X SSC, 0.1% de SDS a 50°C, más preferentemente en 7% de dodecilsulfato sódico (SDS), NaPO4 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0.1X SSC, 0.1% de SDS a 65°C.

Una indicación adicional de que dos ácidos nucleicos o proteínas son sustancialmente idénticos es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico presente reactividad cruzada inmunológicamente con, o se una específicamente a la proteína codificada por el segundo ácido nucleico. Así pues, normalmente una proteína es sustancialmente idéntica a una segunda proteína, por ejemplo, cuando las dos proteínas se diferencian únicamente por sustituciones conservadoras.

“Insecticida” se define como una actividad biológica tóxica capaz de controlar los insectos, preferentemente matándolos.

Una secuencia de ácidos nucleicos “isocodifica con” una secuencia de ácidos nucleicos de referencia cuando la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de referencia.

Una molécula de ácido nucleico “aislada” o una toxina aislada es una molécula de ácido nucleico o toxina que, debido a la intervención humana, existe en un entorno diferente de su entorno nativo y, por lo tanto, no es un producto natural. Una toxina o molécula de ácido nucleico aislada puede existir en una forma purificada o puede existir en un entorno no nativo como, por ejemplo, sin carácter limitante, una célula microbiana recombinante, una célula vegetal, un tejido vegetal o una planta.

Una “toxina Cry3A modificada” o “Cry3A055” de esta invención se refiere a una toxina derivada de la Cry3A que tiene al menos un sitio de reconocimiento de la proteasa adicional que es reconocido por una proteasa del intestino de un insecto diana, que no es de origen natural en una toxina Cry3A, tal y como se describe en la patente de EE. UU. 7 030 295.

Una “secuencia codificante de cry3A modificada”, de acuerdo con esta invención se puede derivar de una secuencia codificante de cry3A nativa o de una secuencia codificante de cry3A sintética y comprende la secuencia codificante

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de al menos un sitio de reconocimiento de la proteasa adicional que no es de origen natural en un gen cry3A sin modificar.

Una “molécula de ácido nucleico” o “secuencia de ácidos nucleicos” es un segmento de ADN o ARN mono-o bicatenario que se puede aislar de cualquier fuente. En el contexto de la presente invención, la molécula de ácido nucleico normalmente es un segmento de ADN.

Una “planta” es cualquier planta en cualquier etapa de desarrollo, en particular, una planta de semillas.

Una “célula vegetal” es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una única célula aislada o una célula cultivada, o como una parte de una unidad más organizada tal como, por ejemplo, un tejido vegetal, un órgano vegetal o una planta entera.

“Cultivo de células vegetales” significa los cultivos de unidades vegatales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en los tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diferentes etapas de desarrollo.

“Material vegetal” se refiere a las hojas, tallos, raíces, flores o partes de las flores, frutas, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos tisulares o celulares, o cualquier otra parte o producto de una planta.

Un “órgano vegetal” es una parte visiblemente diferenciada y estructurada de una planta tal como una raíz, tallo, hoja, brote de la flor o embrión.

“Tejido vegetal”, tal como se utiliza en la presente, significa un grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional. Queda incluido cualquier tejido vegetal in planta o en cultivo. Este término incluye, pero no se limita a, plantas enteras, órganos vegetales, semillas de las plantas, el cultivo tisular y cualquier grupo de células vegetales organizado en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de este término junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido vegetal, como el que se indica anteriormente o que esté contemplado por esta definición, no pretende ser exclusivo para cualquier otro tipo de tejido vegetal.

Un “promotor” es una secuencia de ADN delantera sin traducir de la región codificante que contiene el sitio de unión para la ARN polimerasa e inicia la transcripción del ADN. La región promotora puede incluir también otros elementos que actúan como reguladores de la expresión génica.

“Elementos reguladores” se refiere a las secuencias involucradas en el control de la expresión de una secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores comprenden un promotor unido operablemente a la secuencia de nucleótidos de interés y las señales de terminación. También suelen incluir las secuencias requeridas para la correcta traducción de la secuencia de nucleótidos.

“Transformación” es un proceso para la introducción de ácidos nucleicos heterólogos en una célula huésped u organismo. En particular, “transformación” significa la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

“Transformado / transgénico / recombinante” se refiere a un organismo huésped, tal como una bacteria o una planta, en el que se ha introducido una molécula de ácido nucleico heteróloga. La molécula de ácido nucleico puede estar integrada de forma estable en el genoma del huésped o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Tal molécula extracromosómica puede autoreplicarse. Se sobreentenderá que las células, los tejidos o las plantas transformadas no contemplan únicamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica de este. Un huésped “no transformado”, “no transgénico” o “no recombinante” se refiere a un organismo de tipo salvaje, por ejemplo, una bacteria o planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heteróloga.

Los nucleótidos vienen indicados por sus pares de bases mediante las siguientes abreviaturas estándares: adenina (A), citocina (C), timina (T) y guanina (G). Asimismo, los aminoácidos vienen indicados mediante las siguientes abreviaturas estándares: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), glutamina (Gln; Q), ácido glutámico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

DESCRIPCIÓN

Esta invención se relaciona con nuevas proteínas insecticidas híbridas diseñadas (eHIP), creadas para que presenten actividad contra al menos el gusano de la raíz del maíz del oeste y puede incluir además el gusano de la raíz del maíz del norte, el gusano de la raíz del maíz mexicano y/o el escarabajo de la papa de Colorado. Algunas eHIP presentan actividad contra la plaga de Lepidópteros, el barrenador del maíz europeo. Dichas eHIP nuevas se sintetizan mediante la fusión de combinaciones únicas de bloques conservados y regiones variables totales o

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En otra realización, las regiones variables y los bloques conservados de la primera proteína Cry activa contra los insectos coleópteros se utilizan para sintetizar la eHIP de la invención en combinación con las regiones variables y los bloques conservados de una segunda proteína Cry activa contra un insecto lepidóptero. Las proteínas Cry activas contra Lepidópteros incluyen pero no se limitan a Cry1. En un aspecto de esta realización, la primera proteína Cry es una Cry3A y la segunda proteína Cry es una Cry1A. En otro aspecto, la proteína Cry3A se puede sustituir por una Cry3A modificada, por ejemplo, sin limitación, la proteína Cry3A055 descrita en la Patente de EE. UU. 5 659 123. En otro aspecto más de esta realización, la proteína Cry3A es una Cry3Aa y la proteína Cry1A es una Cry1Aa o una Cry1Ab. En otro aspecto de esta realización, la Cry3Aa se selecciona del siguiente grupo y tiene el Número de Acceso a GenBank indicado: Cry3Aa1 (M22472), Cry3Aa2 (J02978), Cry3Aa3 (Y00420), Cry3Aa4 (M30503), Cry3Aa5 (M37207), Cry3Aa6 (U10985), Cry3Aa7 (AJ237900), Cry3Aa8 (AAS79487), Cry3Aa9 (AAW05659), Cry3Aa10 (AAU29411) y Cry3Aa11 (AY882576). En otro aspecto de esta realización, la Cry1Aa se selecciona del siguiente grupo y tiene el Número de Acceso a GenBank indicado: Cry1Aa1 (M11250), Cry1Aa2 (M10917), Cry1Aa3 (D00348), Cry1Aa4 (X13535), Cry1Aa5 (D17518), Cry1Aa6 (U43605), Cry1Aa7 (AF081790), Cry1Aa8 (I26149), Cry1Aa9 (AB026261), Cry1Aa10 (AF154676), Cry1Aa11 (Y09663), Cry1Aa12 (AF384211), Cry1Aa13 (AF510713), Cry1Aa14 (AY197341) y Cry1Aa15 (DQ062690). En otro aspecto más de esta realización, la Cry1Ab se selecciona del siguiente grupo y tiene el Número de Acceso a Genbank indicado: Cry1Ab1 (M13898), Cry1Ab2 (M12661), Cry1Ab3 (M15271), Cry1Ab4 (D00117), Cry1Ab5 (X04698), Cry1Ab6 (M37263), Cry1Ab7 (X13233), Cry1Ab8 (M16463), Cry1Ab9 (X54939), Cry1Ab10 (A29125), Cry1Ab11 (I12419), Cry1Ab12 (AF059670), Cry1Ab13 (AF254640), Cry1Ab14 (U94191), Cry1Ab15 (AF358861), Cry1Ab16 (AF37560), Cry1Ab17 (AAT46415), Cry1Ab18 (AAQ88259), Cry1Ab19 (AY847289), Cry1Ab20 (DQ241675), Cry1Ab21 (EF683163) y Cry1Ab22 (ABW87320). En otro aspecto más de esta realización, la primera proteína Cry3Aa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo conformado por SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 135, y la segunda proteína Cry comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 72.

En una realización, la presente invención contempla una eHIP de la invención que comprende al menos una posición de entrecruzamiento entre la región N-terminal de la primera proteína Cry y la región C-terminal de la segunda proteína Cry situada en el bloque conservado 3, la región variable 4 o el bloque conservado 4. En un aspecto de esta realización, la posición de entrecruzamiento en el bloque conservado 3 está situada inmediatamente después de un aminoácido correspondiente a Ser451, Phe454 o Leu468 de SEQ ID NO: 70. En otro aspecto de esta realización, la posición de entrecruzamiento está situada en el bloque conservado 3 inmediatamente después de Ser451, Phe454 o Leu468 de SEQ ID: 70 o Ser450, Phe453 o Leu467 de SEQ ID NO: 68; o Ser497, Phe100, Leu114 de SEQ ID NO:

135. Las posiciones de entrecruzamiento en ciertas realizaciones de eHIP Cry3A/Cry1Ab o realizaciones de eHIP Cry3A/Cry1Ab modificadas de acuerdo con la invención se indican en la Figura 2, la cual indica el porcentaje de identidad.

En otra realización, una eHIP de la invención comprende al menos dos posiciones de entrecruzamiento entre una secuencia de aminoácidos de una primera proteína Cry del Bt y una secuencia de aminoácidos de la segunda proteína Cry del Bt. En un aspecto de esta realización, una posición de entrecruzamiento entre una Cry3A o una Cry3A modificada y una Cry1A está situada en el bloque conservado 2, inmediatamente después de un aminoácido correspondiente a Asp232 de SEQ ID NO: 70 y una segunda posición de entrecruzamiento entre Cry1A y Cry3A o Cry3A modificada está situada en el bloque conservado 3 inmediatamente después de un aminoácido correspondiente a Leu476 de SEQ ID NO: 72. En otro aspecto de esta realización, una posición de entrecruzamiento entre Cry3Aa o Cry3Aa modificada y una Cry1Ab está situada en el bloque conservado 2 inmediatamente después de Asp232 de SEQ ID NO: 70, y una segunda posición de entrecruzamiento entre Cry1Ab y Cry3Aa o Cry3Aa modificada está situada en el bloque conservado 3 inmediatamente después de Leu476 de SEQ ID NO: 72.

En otro aspecto de esta realización, la primera posición de entrecruzamiento entre una Cry3A o Cry3A modificada y una Cry1A está situada en el bloque conservado 3 inmediatamente después de un aminoácido correspondiente a Leu468 de SEQ ID NO: 70 y una segunda posición de entrecruzamiento entre una Cry1A y una Cry3A o Cry3A modificada está situada en el bloque conservado 4 inmediatamente después de un aminoácido correspondiente a Ile527 de SEQ ID NO: 72. En otro aspecto de esta realización, la primera posición de entrecruzamiento entre una Cry3Aa o Cry3Aa modificada y una Cry1Ab está situada en el bloque conservado 3 inmediatamente después de Leu468 de SEQ ID NO: 70, y la segunda posición de entrecruzamiento entre una Cry1Ab y una Cry3Aa o Cry3Aa modificada está situada en el bloque conservado 4 inmediatamente después de Ile527 de SEQ ID NO: 72. En otro aspecto más de esta realización, la eHIP comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO:

34.

En otra realización más, la presente invención contempla una proteína eHIP que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo conformado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 160.

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En una realización, las eHIP de la invención presentan actividad contra otras plagas de insectos incluidos, pero sin limitarse a, el gusano de la raíz del maíz del norte, el gusano de la raíz del maíz mexicano, el escarabajo de la papa de Colorado y/o el barrenador del maíz europeo.

En otra realización, la presente invención contempla una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una eHIP de la invención. En un aspecto de esta realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo conformado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154 y SEQ ID NO: 158. Específicamente las enseñanzas de los métodos ejemplificados para sintetizar moléculas de ácido nucleico que codifican las eHIP se pueden encontrar en los Ejemplos 1-41. Aquellos expertos en la materia se percatarán de que se pueden realizar modificaciones a los métodos ejemplificados para la síntesis de las eHIP contempladas por la presente invención.

La presente invención contempla además casetes de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico, los vectores recombinantes y las células huésped transgénicas no humanas, tales como las células bacterianas o células vegetales, que comprenden los casetes de expresión de la invención.

La presente invención también contempla los vectores recombinantes que comprenden los ácidos nucleicos de esta invención. En dichos vectores, los ácidos nucleicos están preferiblemente comprendidos en casetes de expresión que comprenden elementos reguladores para la expresión de las secuencias de nucleótidos en una célula huésped capaz de expresar las secuencias de nucleótidos. Tales elementos reguladores suelen comprender el promotor y las señales de terminación y, preferentemente, también comprenden elementos que permiten una eficaz traducción de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de la presente invención. Los vectores que comprenden los ácidos nucleicos puede que sean capaces de replicarse en células huésped particulares, preferentemente como moléculas extracromosómicas, y, por lo tanto, se utilizan para amplificar los ácidos nucleicos de esta invención en las células huésped. En una realización, las células huésped para tales vectores son microorganismos, tales como bacterias, en particular, el Bacillus thuringiensis o la E. coli. En otra realización, las células huésped para tales vectores recombinantes son endófitas o epífitas. En otra realización más, tales vectores son vectores virales y se utilizan para la replicación de las secuencias de nucleótidos en particular las células huésped, por ejemplo, las células vegetales. Los vectores recombinantes se utilizan también para la transformación de las secuencias de nucleótidos de esta invención en células huésped, donde las secuencias de nucleótidos están integradas de forma estable en el ADN de un huésped transgénico. En una realización, el huésped transgénico es una planta tal como la planta de maíz.

Las eHIP de la presente invención presentan actividad de control de insectos cuando se prueban contra plagas de insectos en bioensayos. En una realización, las eHIP de la invención son activas contra insectos coleópteros o insectos lepidópteros o ambos. En un aspecto de esta realización, las eHIP de la invención son activas contra el gusano de la raíz del maíz del oeste, el gusano de la raíz del maíz del norte y/o el gusano de la raíz del maíz mexicano. En otro aspecto de esta realización, las eHIP de la invención son activas contra el barrenador del maíz europeo. Las propiedades de control de insectos de las eHIP de la invención se ilustran además en los Ejemplos 43, 45 y 46.

La presente invención también contempla una composición que comprende una cantidad eficaz para el control de insectos de una eHIP de acuerdo con la invención.

En otra realización, la invención contempla un método para producir una eHIP que es activa contra los insectos, que comprende: (a) obtener una célula huésped que comprende un gen, que a su vez comprende una secuencia promotora heteróloga unida operablemente a una molécula de ácido nucleico de la invención; y (b) cultivar las células huésped transgénicas de tal manera que expresen una eHIP que es activa contra los insectos.

En otra realización más, la invención contempla un método de producción de una planta transgénica resistente a los insectos, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico de la invención en la planta transgénica, donde la molécula de ácido nucleico provoca la expresión de una eHIP en la planta transgénica en una cantidad eficaz para el control de insectos. En un aspecto de esta realización, los insectos son insectos coleópteros o insectos lepidópteros. En otro aspecto de esta realización, los insectos coleópteros son el gusano de la raíz del maíz del oeste, el gusano de la raíz del maíz del norte y/o el gusano de la raíz del maíz mexicano. En otro aspecto más de esta realización, los insectos lepidópteros son el barrenador del maíz europeo.

En otra realización más, la invención contempla un método para controlar los insectos, que comprende el suministro de una cantidad eficaz de una eHIP de la invención a los insectos. En un aspecto de esta realización, los insectos son insectos coleópteros o insectos lepidópteros. En otro aspecto de esta realización, los insectos coleópteros son el gusano de la raíz del maíz del oeste, el gusano de la raíz del maíz del norte y/o el gusano de la raíz del maíz mexicano. En otro aspecto más de esta realización, los insectos lepidópteros son el barrenador del maíz europeo. Normalmente, la eHIP se suministra a los insectos por vía oral. En un aspecto, la eHIP se suministra por vía oral

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polinucleótido patrón bicatenario; desnaturalizar la mezcla resultante de los fragmentos aleatorios bicatenarios y los oligonucleótidos en fragmentos monocatenarios; incubar la población resultante de los fragmentos monocatenarios con una polimerasa en condiciones que resultan en la hibridación de dichos fragmentos monocatenarios en dichas áreas de identidad para formar pares de fragmentos hibridados, dichas áreas de identidad siendo suficientes para un miembro de un par para la primera replicación de la otra, formando de esta manera un polinucleótido bicatenario mutagenizado; y repetir el segundo y tercer pasos durante al menos dos ciclos más, donde la mezcla resultante en el segundo paso de un nuevo ciclo incluye el polinucleótido bicatenario mutagenizado del tercer paso del ciclo anterior, y el nuevo ciclo forma otro polinucleótido bicatenario mutagenizado. Preferiblemente, la concentración de una sola especie del fragmento aleatorio bicatenario en la población de fragmentos aleatorios bicatenarios es menor del 1% en peso del ADN total. El polinucleótido bicatenario patrón puede comprender al menos alrededor de 100 especies de polinucleótidos. Preferiblemente, el tamaño de los fragmentos aleatorios bicatenarios es de alrededor de 5 pb a 5 kb. El cuarto paso del método puede además comprender repetir el segundo y el tercer paso durante al menos 10 ciclos.

Como agentes de control biológico de insectos, las eHIP son producidas por la expresión de los ácidos nucleicos en células huésped heterólogas capaces de expresar los ácidos nucleicos. En una realización, se sintetizan células del

B. thuringiensis que comprenden modificaciones de un ácido nucleico de esta invención. Dichas modificaciones contemplan mutaciones o deleciones de elementos reguladores existentes, lo cual conduce a la expresión alterada del ácido nucleico, o la incorporación de nuevos elementos reguladores que controlan la expresión del ácido nucleico. En otra realización, se añaden copias adicionales de uno o más de los ácidos nucleicos a las células del Bacillus thuringiensis ya sea por inserción en el cromosoma o por introducción de moléculas que se replican extracromosómicamente que contienen los ácidos nucleicos.

En otra realización, se inserta al menos uno de los ácidos nucleicos de la invención en un casete de expresión apropiado, que comprende un promotor y una señal de terminación. La expresión del ácido nucleico es constitutiva o se utiliza un promotor inducible que responde a varios tipos de estímulos para iniciar la transcripción. En otra realización, la célula en la que se expresa la eHIP es un microorganismo, tal como una bacteria.

Las células bacterianas son huéspedes para la expresión de los ácidos nucleicos de la invención. En una realización, se utilizan las bacterias simbióticas no patógenas, que son capaces de vivir y replicarse dentro de los tejidos vegetales, conocidas como endófitas, o las bacterias simbióticas no patógenas, que son capaces de colonizar la filosfera o la rizosfera, conocidas como epífitas. Esas bacterias incluyen las bacterias de los géneros Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces y Xanthomonas.

Las técnicas utilizadas para estas manipulaciones genéticas son específicas para los diferentes huéspedes disponibles y son de uso común en la materai. Por ejemplo, los vectores de expresión pKK223-3 y pKK223-2 se pueden utilizar para expresar genes heterólogos en E. coli, ya sea en la fusión traduccional o transcripcional, después del promotor tac o trc. Para la expresión de los operones que codifican múltiples ORF, el procedimiento más sencillo es insertar el operón en un vector tal como pKK223-3 en fusión transcripcional, lo que permite que el ribosoma conocido se una al sitio de los genes heterólogos a utilizar. También son de uso común en la materia las técnicas para la sobreexpresión en especies Gram positivas, tales como Bacillus, y se pueden utilizar en el contexto de esta invención (Quax et al., En: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Los sistemas alternativos para la sobreexpresión dependen, por ejemplo, de los vectores de levaduras e incluyen el uso de Pichia, Saccharomyces y Kluyveromyces (Sreekrishna, En: Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, eds. Baltz, Hegeman, y Skatrud., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin y Barre, Biotechnology L2: 173 -177 (1994), van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).

En una realización, al menos una de las eHIP de la invención se expresa en un organismo superior, por ejemplo, una planta. En este caso, las plantas transgénicas que expresan cantidades eficaces de la eHIP se autoprotegen contra las plagas de insectos. Cuando el insecto comienza a alimentarse de una planta transgénica, también ingiere la eHIP expresada. Esto disuadirá al insecto de volver a atacar el tejido de la planta o incluso puede dañar o matar al insecto. Se inserta un ácido nucleico de la presente invención en un casete de expresión, que se puede integrar de forma estable posteriormente en el genoma de la planta. Las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero no se limitan a, maíz, trigo, cebada, centeno, batata, alubias, guisante, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinacas, espárragos, cebolla, ajo, pimienta, apio, calabaza, cáñamo, calabacín, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, mora, piña, aguacate, papaya, mango, plátano, soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, arroz, papa, berenjena, pepino, Arabidopsis y plantas leñosas tales como coníferas y árboles deciduos.

Una vez que un ácido nucleico deseado se ha transformado en una especie de planta particular, se puede propagar en esa especie o trasladar a otras variedades de la misma especie, incluidas, en particular, las variedades comerciales, utilizando técnicas de cultivo selectivo tradicionales.

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fitopatógenos. Idealmente, un promotor de este tipo debería ser activo únicamente en los sitios de infección y de esta forma las eHIP solo se acumulan en las células que necesitan sintetizar las eHIP para matar la plaga de insectos invasores. Los promotores preferidos de este tipo incluyen los descritos por Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993) y Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).

Los promotores de tejido específico o de tejido preferencial útiles para la expresión de genes que codifican eHIP en plantas, particularmente el maíz, son aquellos que dirigen la expresión en la raíz, médula, hojas o polen, en particular la raíz. Esos promotores, por ejemplo, los aislados de PEPC o trpA, se describen en la Pat. de EE. UU. N.o 5 625 136, o MTL, descrito en la Pat. de EE. UU. N.o 5 466 785.

Otras realizaciones son las plantas transgénicas que expresan los ácidos nucleicos de forma inducible por herida o inducible por infección de patógenos.

Además de los promotores, también se dispone de varios terminadores transcripcionales para utilizar en la construcción de ácidos nucleicos híbridos usando los genes de las eHIP de la presente invención. Los terminadores transcripcionales son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgén y de su correcta poliadenilación. Los terminadores transcripcionales apropiados y aquellos que se sabe que funcionan en las plantas incluyen el terminador de CaMV 35S, el terminador tml, el terminador de la sintasa nopalina (NOS), el terminador de rbcS E9 de guisante y otros de uso común en la materia. Estos se puede utilizar tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Cualquier terminador disponible que se sabe funciona en las plantas se puede utilizar en el contexto de esta invención.

Se pueden incorporar otras muchas secuencias en los casetes de expresión descritos en esta invención. Estos incluyen secuencias que han demostrado mejorar la expresión tal como las secuencias de intrón (por ejemplo, de Adhl y bronzel) y secuencias virales líderes (por ejemplo, de TMV, MCMV y AMV).

Puede ser preferible dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención a diferentes localizaciones celulares en la planta. En algunos casos, la localización en el citosol puede ser deseable, mientras que en otros casos, se puede preferir la localización de algunos orgánulos subcelulares. La localización subcelular de enzimas de transgenes codificados se lleva a cabo usando técnicas de uso común en la materia. Normalmente, se manipula el ADN que codifica el péptido diana de un producto génico dirigido al orgánulo conocido y se fusiona antes del ácido nucleico. Muchas de estas secuencias diana son conocidas por el cloroplasto y se ha demostrado su funcionamiento en construcciones heterólogas. La expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención también está dirigida al retículo endoplasmático o a las vacuolas de las células huésped. Las técnicas para lograr esto son de uso común en la materia.

Los vectores adecuados para la transformación de la planta se describen en otras secciones de esta especificación. Para la transformación mediada por Agrobacterium, los vectores binarios o vectores portadores de al menos una secuencia frontera T-ADN son adecuados, mientras que para la transferencia directa de genes cualquier vector es adecuado y puede que se prefiera el ADN lineal que contenga sólo la construcción de interés. En el caso de la transferencia directa de genes, se pueden utilizar la transformación con una sola especie de ADN o la transformación conjunta (Schocher et al., Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). Tanto para la transferencia directa de genes como para la transferencia mediada por Agrobacterium, la transformación se suele llevar a cabo (pero no necesariamente) con un marcador seleccionable que puede presentar resistencia a un antibiótico (kanamicina, higromicina o metotrexato) o a un herbicida (basta). Los vectores de transformación de la planta que comprenden los genes de la eHIP de la presente invención pueden incluir también genes (por ejemplo, fosfomanosa isomerasa; PMI) que proporcionan una selección positiva de las plantas transgénicas, como se describió en las Patentes de EE. UU. 5 767 378 y 5 994 629. Sin embargo, la selección del marcador seleccionable no es crucial para la invención.

En otra realización, un ácido nucleico de la presente invención se transforma directamente en el genoma del plasto. Una ventaja principal de la transformación de plastos es que los plastos son, por lo general, capaces de expresar genes bacterianos sin una optimización sustancial del codón, y los plastos son capaces de expresar múltiples marcos de lectura abiertos controlados por un único promotor. La tecnología de transformación de plastos se describe con todo detalle en las Patentes de EE. UU. N.os 5 451 513, 5 545 817 y 5 545 818, en la solicitud PCT N.o WO 95/16783 y en McBride et al., (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. La técnica básica para la transformación de cloroplastos incluye la introducción de las regiones de ADN del plasto clonadas flanqueando un marcador seleccionable junto con el gen de interés en un tejido diana adecuado, por ejemplo, mediante la transformación biolística o del protoplasto (por ejemplo, la transformación mediada por cloruro de calcio o PEG). Las regiones de acompañamiento de 1 a 1.5 kb, denominadas secuencias dianas, facilitan la recombinación homóloga con el genoma del plasto y de esta forma permiten la sustitución o modificación de regiones específicas del plastoma. Inicialmente, se utilizan mutaciones puntuales en los genes del cloroplasto 16S rARN y rps12 que confieren resistencia a la espectinomicina y/o estreptomicina como marcadores seleccionables para la transformación (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., y Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 87, 8526-8530; Staub, JM, y Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Esto resultó en transformantes homoplásmicos estables con una

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Ejemplo 1. Secuencias codificantes parenterales

Las secuencias codificantes de cry3Aa, cry1Ab, cry1Ba y cry1Fa de maíz optimizadas; designadas en la presente como mocry3Aa, mocry1Ab, mocry1Ba y mocry1Fa, respectivamente, se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en la Patente de EE. UU. 5 625 136.

La secuencia codificante de cry3A055 (SEQ ID NO: 67), la cual codifica una proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 68), se sintetizó modificando la secuencia codificante de mocry3A por inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de reconocimiento de la proteasa catepsina G en el dominio I de acuerdo con la Patente de EE. UU. 7 030 295.

La mocry3Aa (SEQ ID NO: 67), que codifica la proteína expuesta en SEQ ID NO: 68, la cry3A055 (SEQ ID NO: 69), que codifica la proteína expuesta en SEQ ID NO: 70, la mocry1Ab ( SEQ ID NO: 71), que codifica la proteína expuesta en SEQ ID NO: 72, la mocry1Ba (SEQ ID NO: 73), que codifica la proteína expuesta en SEQ ID NO: 74, la mocry1Fa (SEQ ID NO: 75), que codifica la proteína expuesta en SEQ ID NO: 76, la cry8Aa (SEQ ID NO: 77), que codifica la proteína expuesta en SEQ ID NO: 78, la cry1Ac (SEQ ID NO: 79), que codifica la proteína expuesta en SEQ ID NO: 80 y la cry1Ia (SEQ ID NO: 81), que codifica la proteína expuesta en SEQ ID NO: 82, se utilizaron en la construcción de los ácidos nucleicos híbridos y de las proteínas que estos codifican y que se describen en los siguientes Ejemplos.

Ejemplo 2. Uso de cebadores de PCR para construir ácidos nucleicos híbridos.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una síntesis repetitiva y enzimática con cebadores de una secuencia de ácidos nucleicos. Este procedimiento es de uso común y los expertos en la materia estarán familiarizados con él (véase Mullis, Pat. de EE. UU. N.os 4 683 195, 4 683 202 y 4 800 159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim [1985] “Enzymatic Amplification of .beta.-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia”, Science 230:1350-1354.). La PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que está flanqueado por dos cebadores oligonucleótidos que se hibridan con hebras opuestas de la secuencia diana. Los cebadores se orientan con los extremos 3' apuntando uno hacia el otro. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del patrón, la hibridación de los cebadores con sus secuencias complementarias y la extensión de los cebadores hibridados con una ADN polimerasa da como resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de PCR. Debido a que el producto de la extensión de cada cebador puede servir como un patrón para el otro cebador, cada ciclo esencialmente duplica la cantidad de fragmentos de ADN producidos en el ciclo anterior. Esto produce la acumulación exponencial del fragmento diana específico hasta varios millones de veces en unas pocas horas. Usando una ADN polimerasa termoestable, tal como la Taq polimerasa, la cual se aísla de la bacteria termofílica Thermus aquaticus, se puede automatizar el proceso de amplificación completamente.

Las secuencias codificantes quiméricas descritas en los siguientes ejemplos se construyeron usando varias combinaciones de los cebadores ejemplificados que se muestran en la Tabla 1. Las mezclas de reacción de la PCR y los protocolos de termociclado de la PCR usados en los experimentos se enumeran en las Tablas 2 y 3, respectivamente. En cada uno de los siguientes ejemplos, se hace referencia a los cebadores de PCR utilizando su nombre y “SEQ ID NO:”, y se hace referencia a las mezclas de reacción de la PCR y a los protocolos de termociclado de la PCR utilizando sus respectivos números. Un experto se percatará de que se pueden utilizar otros cebadores de PCR y otras condiciones de la reacción PCR para construir las secuencias codificantes quiméricas de la invención, y no se pretende que al enumerar los cebadores ejemplificados y de las condiciones de la PCR que se utilizaron en la presente invención esto suponga ningún tipo de limitación.

Tabla 1. Cebadores utilizados para la construcción de las secuencias codificantes que codifican las eHIP.

Nombre del cebador: Secuencia SEQ ID NO:

5’3A-1-bam: 5’-CCGGATCCATGACGGCCGACAACAACACCGAGGC-3’ 83

C3-3A-6: 5’-CAGGGGCAGCTGGGTGATCT-3’ 84

C3-1Ab-3: 5’-AGATCACCCAGATCCCCCTG-3’ 85

1Ab-6-sac: 5’-CCGAGCTCAGCTCCTACACCTGATCGATGTGGTAGTCGG-3’ 86

8A-atg-delRI: 5’-CCGGATCCACCATGACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGTATTCGCCCTTATGAC-3’ 87

C2-3A-4: 5’-GTCCAGCACGGTCAGGGTCA-3’ 88

inverso: 5’-GCGTGCAGTCAAGTCAGATC-3’ 89

FR8a-OL-1: 5’-GGTGTTGTTGTCGGCCGTCATAGGGCGAATACCAGCAC-3’ 90

FR8a-OL-2: 5’-GCCGACAACAACACCGAGGCCCTGGACAGCAGCACCACC-3’ 91

C1-3A-2: 5’-CAGGTGGGTGTTGGCGGCCTGGGCGTA-3’ 92

5’FR8a: 5’-GGATCCACCATGACTAGTAAC-3’ 93

5’FR8a-12aa: 5’-CCGGATCCACCATGTATGACGGCCGACAACAACACC-3’ 94

C2-3A-3: 5’-TGACCCTGACCGTGCTGGAC-3’ 95

3’1Ab-dm3: 5’-GAGCTCCTAGGTCACCTCGGCGGGCAC-3’ 96

5’FR-del6: 5’-GGATCCACCATGTGTGCTGGTATTCGCCCTAT-3’ 97

5’1Ab-bam: 5’-CCGGATCCATGGACAACAACCCCAACATCAAC-3’ 98

C3-3A-8: 5’-GATGTCGCCGCCGGTGAAGC-3’ 99

C3-3A-7: 5’-GCTTCACCGGCGGCGACATC-3’ 100

1B-5: 5’-CCGCCGCGACCTGACCCTGGGCGTGCTGGAC-3’ 101

1B-10: 5’-CCGAGCTCCTAGAACAGGGCGTTCAC-3’ 102

3A-22: 5’-GGCCTTCACCAGGGGCAGCTGGGTGAT-3’ 103

1B-7: 5’-ATCACCCAGATCCCCATGGTGAAGGCC-3’ 104

C3-1Ab-2: 5’-CAGGGGGATCTGGGTGATCT-3’ 105

C3-3A-5: 5’-AGATCACCCAGCTGCCCCTG-3’ 106

3A-12-sac: 5’-CCGAGCTCAGCTCAGATCTAGTTCACGGGGATGAACTCGATCTT-3’ 107

C4-3A-10: 5’-TGGTGCTGGCGTAGTGGATGCGG-3’ 108

C4-3A-9: 5’-CCGCATCCACTACGCCAGCACCA-3’ 109

C1-1Ab-1: 5’-TACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTG-3’ 110

5’8Aa-dm3: 5’-AGATCACCCAGCTGCCCCTGGTAAAGGGAGACATGTTATATC-3’ 111

3’8Aa-dm3: 5’-GAGCTCCTATGTCTCATCTACTGGGATGAA-3’ 112

tant-OL-2: 5’-GAGGGTGTGGGCCTTCACCAGGGGCAGCTGGGT-3’ 113

tant-OL-1: 5’-ACCCAGCTGCCCCTGGTGAAGGCCCACACCCTC-3’ 114

tant-3’sac: 5’-GAGCTCTAGCTTAAGCAGTCCACGAGGTT-3’ 115

1Ac-OL-2: 5’-TAAAAAGAAAGTTTCCCTTCACCAGGGGCAGCTGGGT-3’ 116

1Ac-OL-1: 5’-ACCCAGCTGCCCCTGGTGAAGGGAAACTTTCTTTTTA-3’ 117

1Ac-3’sac: 5’-GAGCTCCTATGTTGCAGTAACTGGAATAAA-3’ 118

1Ia-OL-2: 5’-AAGACAGATTGAAAGCTTTTACTCAGGGGCAGCTGGGT-3’ 119

1Ia-OL-1: 5’-ACCCAGCTGCCCCTGAGTAAAAGCTTTCAATCTGTCTT-3’ 120

1Ia-3’sac: 5’-GAGCTCCTACATGTTACGCTCAATATGGAGT-3’ 121

FR-1Ab-2: 5’-GATGTTGTTGAACTCGGCGCTCTTGTGGGTCCA-3’ 122

FR-1Ab-1: 5’-TGGACCCACAAGAGCGCCGAGTTCAACAACATC-3’ 123

FR-1Ab-4: 5’-GGCTCGTGGGGATGATGTTGTTGAAGTCGACGCTCTTGTGG-3’ 124

FR-1Ab-3: 5’-CCACAAGAGCGTCGACTTCAACACATCATCCCCAGCAGCC-3’ 125

CMS94: 5’-GGCGCGCCACCATGGCTAGCATGACTGGTGG-3’ 136

CMS95: 5’-GCAGGAACAGGTGGGTGTTG-3’ 137

CMS96: 5’-CCTGAACACCATCTGGCCCA-3’ 138

CMS97: 5’-CTGGCTGCTGGGGATGATGTTGTTGAAGTCGACGCTCTT-3’ 139

CMS98: 5’-GAGCTCTTAGGTCACCTCGGC-3’ 140

CMS99: 5’-AAGAGCGTCGACTTCAACAACATCATCCCCAGCAGCCAG-3’ 141

CMS100: 5’-GAAGTACCGCGCCCGCATCCGCTACGCCAGCACCACCAAC-3’ 142

CMS101: 5’-GTTGGTGGTGCTGGCGTAGCGGATGCGGGCGCGGTACTTC-3’ 143

Tabla 2. Mezclas de reacción de la PCR.

Mezcla 1: Mezcla 2 Mezcla 3

50-100ng de patrón ADN 0.8 µM de cebador 1 0.8 µM de cebador 2 Tampón Pfu 1X 0.4 mM de dNTPs Formamida 2% 1.25 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene) 2.5 unidades de Taq polimerasa (Qiagen) agua hasta un volumen total de 50 µl: 50-100ng de patrón ADN 0.8 µM de cebador 1 0.8 µM de cebador 2 Tampón Tqa 1X 0.4 mM de dNTPs Formamida 2% 2.5 unidades de Taq polimerasa (Qiagen) agua hasta un volumen total de 50 µl 50-100ng de patrón ADN 0.8 µM de cebador 1 0.8 µM de cebador 2 Tampón ADNc Advantage 1X 0.4 mM de dNTPs x unidades de ADNc polimerasa Advantage (Clontech) agua hasta un volumen total de 50 µl

Mezcla 4: Mezcla 5

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cebadores C3-1Ab-3 (SEQ ID NO: 85) y 1Ab-6-Sac (SEQ ID NO: 86) y la mezcla de reacción 1 y el perfil del termociclo 1 de la PCR.

El primer y el segundo ácido nucleico descritos anteriormente se conectaron utilizándolos como patrones en una reacción PCR de solapamiento (Horton et al., 1989. Gene 77: 61-68) con los cebadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) y 1Ab-6-Sac (SEQ ID NO: 86) utilizando la mezcla de reacción 2 y el perfil del termociclo 1 de la PCR, a excepción de un gradiente de 45-65°C que se utilizó para la temperatura de hibridación.

El amplicón resultante se ligó como un fragmento de extremos romos con un vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) cortado con SmaI para formar el plásmido p2OL8a/CR2.1. Posteriormente, se ligó un fragmento BamHI-SacI de p2OL8a/CR2.1 con pET21a (EMD Biosciences, Inc, San Diego, CA), que se cortó con BamHI-SacI y se transformó en E. coli. El fragmento BamHI-SacI de p2OL8a/CR2.1 comprendía 40 nucleótidos derivados del vector pCR2.1-TOPO adyacente al amplicón desfasado de la primera reacción PCR. Al ligar este fragmento BamHI-SacI con pET21a se creó un marco de lectura abierto que comenzaba con el codón de inicio (ATG) de una etiqueta T7 y terminaba en el sitio SacI del ADN insertado. Este marco de lectura abierto se designó como 2OL-8a (SEQ ID NO: 1) y codifica la proteína insecticida quimérica 2OL-8a (SEQ ID NO: 2). De esta manera, la proteína insecticida quimérica 2OL-8a comprende, desde el N-terminal hasta el C-terminal, un fragmento peptidilo que comprende la secuencia de aminoácidos MASMTGGQQMGRGSTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 126), los aminoácidos 10-468 de una proteína Cry3A055 ( SEQ ID NO: 70), que comprende las regiones variables 1, el bloque conservado 1, la región variable 2, el bloque conservado 2, la región variable 3 y los 24 aminoácidos N-terminal del bloque conservado 3; los aminoácidos 477-648 de una proteína Cry1Ab (SEQ ID NO: 72), que comprende los 24 aminoácidos C-terminal del bloque conservado 3, la región variable 4, el bloque conservado 4, la región variable 5, el bloque conservado 5 y la región variable 6; y 38 aminoácidos de la región de la cola de la protoxina de Cry1Ab.

Los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1-14 del fragmento peptidilo se derivan de la etiqueta-T7 y el sitio de escisión BamHI del vector pET21a. Los nucleótidos que codifican los aminoácidos 15-26 del fragmento peptidilo se derivan del vector pCR2.1-TOPO. Y los nucleótidos que codifican los aminoácidos 27 -35 del fragmento peptidilo se derivan de la cry3A055 que no están en fase con el resto de la secuencia codificante de cry3A055.

Ejemplo 4. Construcción de FR8a.

La secuencia codificante de FR8a se construyó colocando un secuencia de Kozak (ACC) y un codón de inicio (ATG) justo antes de un sitio BamHI N-terminal en 2OL-8a (véase el Ejemplo 3). Además, se interrumpió un sitio EcoRI en 2OL-8a para facilitar la futura vectorización de FR8a. Todos estos cambios se llevaron a cabo utilizando una reacción PCR con 2OL-8a como patrón y los cebadores: 8a-atg-delRI (SEQ ID NO: 87) y C2-3A-4 (SEQ ID NO: 88) usando la mezcla de reacción 2 y el perfil del termociclo 2 de la PCR.

El amplicón resultante se ligó con un vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Posteriormente, se ligó un fragmento BamHI-PpuMI del producto de la PCR clonado con un fragmento PpuMI-NcoI de 2OL8a/pCR2.1 (véase el Ejemplo 3) y un fragmento BamHI-NcoI de 2OL8a/pCR2.1 para crear la FR8a (SEQ ID NO: 3) que codifica la proteína insecticida quimérica FR8a (SEQ ID NO: 4). Así pues, la proteína insecticida quimérica FR8a comprende, desde el N-terminal hasta el C-terminal, un fragmento peptidilo que comprende la secuencia de aminoácidos MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), los aminoácidos 10-468 de una proteína Cry3A055 ( SEQ ID NO: 70), que comprende las regiones variables 1, el bloque conservado 1, la región variable 2, el bloque conservado 2, la región variable 3 y los 24 aminoácidos N-terminal del bloque conservado 3, y los aminoácidos 477-648 de una proteína Cry1Ab (SEQ ID NO: 72), que comprende los 24 aminoácidos C-terminal del bloque conservado 3, la región variable 4, el bloque conservado 4, la región variable 5, el bloque conservado 5, y la región variable 6; y 38 aminoácidos de la región de la cola de la protoxina de Cry1Ab.

La eHIP FR8a fue muy activa contra el gusano de la raíz del maíz del oeste, como se muestra en la Tabla 5. Por lo tanto, la eliminación de la secuencia de aminoácidos T7 del fragmento peptidilo N-terminal de la eHIP 2OL-8a no tuvo un impacto negativo sobre la actividad insecticida.

La adición de 34 aminoácidos adicionales al N-terminal de FR8a creó una eHIP, designada como FRa+34 (SEQ ID NO: 160), con un fragmento peptidilo N-terminal de 56 aminoácidos (SEQ ID NO: 131). El fragmento peptidilo Nterminal de 56 aminoácidos no tuvo efecto negativo sobre la actividad de FR8a contra el gusano de la raíz del maíz del oeste (véase la Tabla 5).

Ejemplo 5. Construcción de FRCG.

Con el fin de determinar si se requería un sitio de reconocimiento de la proteasa catepsina G para la actividad insecticida de una proteína híbrida que comprendía un fragmento N-terminal de la Cry3A055, se realizó una construcción que eliminó el sitio catepsina G de la proteína híbrida FR8a (Ejemplo 4). Un primer fragmento de ácido nucleico MluI-PpuMI de un plásmido que comprendía la FR8a (SEQ ID NO: 3) y un segundo fragmento de ácido nucleico PpuMI/MluI de un plásmido que comprendía la mocry3Aa (SEQ ID NO: 67) se ligaron usando técnicas de biología molecular estándares para crear la FRCG (también designada como FR8a-catg) (SEQ ID NO: 5) que

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codifica la proteína híbrida FRCG (SEQ ID NO: 6). Así pues, la proteína insecticida quimérica FRCG comprende, desde el N-terminal hasta el C-terminal, un fragmento peptidilo que comprende la secuencia de aminoácidos MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), los aminoácidos 10-467 de una proteína Cry3A (SEQ ID NO: 68), que comprende las regiones variables 1, el bloque conservado 1, la región variable 2, el bloque conservado 2, la región variable 3 y los 24 aminoácidos N-terminal del bloque conservado 3, y los aminoácidos 477-648 de una proteína Cry1Ab (SEQ ID NO: 72), que comprende los 24 aminoácidos C-terminal del bloque conservado 3, la región variable 4, el bloque conservado 4, la región variable 5, el bloque conservado 5, y la región variable 6; y 38 aminoácidos de la región de la cola de la protoxina de Cry1Ab.

La proteína FRCG fue tan activa contra del gusano de la raíz del maíz del oeste, como la proteína FR8a (véase la Tabla 5) lo que sugiere que no se requiere un sitio de la proteasa catepsina G para la actividad insecticida de una eHIP.

Ejemplo 6. Construcción de FR8a-9F.

Un primer fragmento de ácido nucleico de aproximadamente 323 pb se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la FR8a (SEQ ID NO: 3) usando cebadores inversos (SEQ ID NO: 89) y FR8a-OL-1 (SEQ ID NO: 90) y la mezcla de reacción 2 y el perfil del termociclo 2 de la PCR. Un segundo fragmento de ácido nucleico de aproximadamente 470 pb se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la FR8a usando los cebadores FR8a-OL-2 (SEQ ID NO: 91) y C1-3A-2 (SEQ ID NO: 92) y la mezcla de reacción 2 y el perfil del termociclo 2 de la PCR. Los dos amplicones resultantes se conectaron utilizándolos como patrones en una reacción PCR de solapamiento con los cebadores 5'FR8a (SEQ ID NO: 93) y C1-3A-2 (SEQ ID NO: 92) usando la mezcla de reacción 2 y el perfil del termociclo 2 de la PCR para amplificar el extremo 5' de FR8a-9F. El producto de la PCR de solapamiento se clonó en un vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) designado como 5'FR-9F/pCR2.1. Posteriormente, se ligó un fragmento BamHI/PpuMI de 5'FR-9F/pCR2.1 con un fragmento PpuMI/BamHI de FR8a para crear la FR8a-9F (SEQ ID NO: 7) que codifica la proteína quimérica FR8a-9F (SEQ ID NO: 8). Así pues, la proteína insecticida quimérica FR8a-9F comprende, desde el N-terminal hasta el C-terminal, un fragmento peptidilo que comprende la secuencia de aminoácidos MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), los aminoácidos 1-468 de una proteína Cry3A055 ( SEQ ID NO: 70), que comprende las regiones variables 1, el bloque conservado 1, la región variable 2, el bloque conservado 2, la región variable 3 y los 24 aminoácidos N-terminal del bloque conservado 3; los aminoácidos 477-648 de una proteína Cry1Ab (SEQ ID NO: 72), que comprende los 24 aminoácidos C-terminal del bloque conservado 3, la región variable 4, el bloque conservado 4, la región variable 5, el bloque conservado 5, y la región variable 6; y 38 aminoácidos de la región de la cola de la protoxina de Cry1Ab.

La eHIP FR8a-9F fue ligeramente menos activa contra el gusano de la raíz del maíz del oeste que la eHIP FR8a (véase la Tabla 5) lo que sugiere que los 9 aminoácidos C-terminal del fragmento peptidilo de SEQ ID NO: 127 desempeñan una función en la concesión de actividad insecticida total a FR8a.

Ejemplo 7. Construcción de FR-9F-catg.

La secuencia codificante de FR-9F-catg se creó para volver a colocar en fase los nucleótidos derivados de la cry3A055 desfasados de FR8a y para eliminar el sitio de reconocimiento de la proteasa catepsina G. Se ligó un fragmento BamHI/PpuMI de 5’FR-9F/pCR2.1 (véase el Ejemplo 6) con un fragmento PpuMI/BamHI de FRCG (véase el Ejemplo 5) para crear la secuencia codificante de FR-9F-catg (SEQ ID NO: 9) que codifica la proteína quimérica FR-9F-catg (SEQ ID NO: 10). Así pues, la proteína quimérica FR-9F-catg comprende, desde el N-terminal hasta el C-terminal, un fragmento peptidilo que comprende la secuencia de aminoácidos MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), los aminoácidos 1-467 de una proteína Cry3Aa (SEQ ID NO: 68), que comprende las regiones variables 1, el bloque conservado 1, la región variable 2, el bloque conservado 2, la región variable 3 y los 24 aminoácidos Nterminal del bloque conservado 3, y los aminoácidos 477-648 de una proteína Cry1Ab (SEQ ID NO: 72), que comprende los 24 aminoácidos C-terminal del bloque conservado 3, la región variable 4, el bloque conservado 4, la región variable 5, el bloque conservado 5, y la región variable 6; y 38 aminoácidos de la región de la cola de la protoxina de Cry1Ab.

La eHIP FR8a-9F-catg proporcionó el mismo nivel de actividad que la FR8a contra el gusano de la raíz del maíz del oeste (véase la Tabla 5), lo que confirma que una eHIP se puede elaborar ya sea a partir de una secuencia Cry3A modificada o una Cry3 nativa.

Ejemplo 8. Construcción de FR8a-12aa.

Los nucleótidos que codifican los aminoácidos 2-13 del fragmento peptidilo comprendido en FR8a (SEQ ID NO: 4) se eliminaron utilizando la PCR. Un fragmento se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la FR8a (SEQ ID NO: 3) usando los cebadores 5'FR8a-12aa (SEQ ID NO: 94) y C1-3A-2 (SEQ ID NO: 90) y la mezcla de reacción 1 y el perfil del termociclo 1 de la PCR. El amplicón resultante se clonó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Posteriormente, se ligó un fragmento BamHI-PpuMI del clon pCR2.1-TOPO con un fragmento PpuMI-BamHI de un plásmido que comprendía la FR8a para crear la FR8a-12aa (SEQ ID NO: 11) que codifica la proteína insecticida quimérica FR8a-12aa (SEQ ID NO: 12). Así pues, la proteína insecticida quimérica FR8a-12aa comprende, desde el

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Estos 2 productos de la PCR se utilizaron como patrones en una reacción PCR de solapamiento con los cebadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) y 1Ac-3'sac (SEQ ID NO: 118) y las siguientes condiciones: mezcla 3 y perfil de termociclado: 94°C -30 segundos, 68°C -30 segundos, 68°C -30 segundos para 20 ciclos. El producto de la PCR de solapamiento se clonó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Un fragmento BamHI/MluI de un plásmido que comprendía la FR8a, el fragmento MluI/SacI del producto de la PCR de solapamiento en pCR2.1 y el fragmento BamHI/SacI de pET21a se ligaron para crear el FR(1Ac)/pET21a. La proteína FR(1Ac) comprende, desde el N-terminal hasta el Cterminal, un fragmento peptidilo que comprende la secuencia de aminoácidos MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), los aminoácidos 10-468 de una proteína Cry3A055 ( SEQ ID NO: 70) y los aminoácidos 477-608 de una proteína Cry1Ac (SEQ ID NO: 80).

Ejemplo 32. Construcción de FR (1Ia)

Un fragmento de nucleótidos que codificaba los dominios I y II de FR8a se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la FR8a (SEQ ID NO: 3) usando los cebadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) y 1Ia-OL-2 (SEQ ID NO: 119) y la mezcla de reacción 3 y el perfil de termociclado 3 de la PCR. Un segundo fragmento de nucleótidos que codificaba el dominio III de una proteína Cry1Ia (SEQ ID NO: 82) se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la cry1Ia (SEQ ID NO: 81) usando los cebadores 1Ia-OL-1 (SEQ ID NO: 120) y 1Ia-3'sac (SEQ ID NO: 121) y la mezcla de reacción 3 y el perfil de termociclado 3 de la PCR. Estos dos productos de la PCR se utilizaron como patrones en una reacción PCR de solapamiento con los cebadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) y 1Ia-3'sac (SEQ ID NO: 121) y la mezcla de reacción 3 y el perfil de termociclado de la PCR: 94°C -30 segundos, 68°C -45 segundos para 20 ciclos. El producto de la PCR de solapamiento se clonó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). El fragmento BamHI/MluI de un plásmido que comprendía la FR8a, el fragmento MluI/SacI del producto de la PCR de solapamiento en pCR2.1 y el fragmento BamHI/SacI de pET21a se ligaron para crear el FR(1Ia)/pET21a. La proteína FR(1Ia) comprende, desde el N-terminal hasta el C-terminal, un fragmento peptidilo que comprende la secuencia de aminoácidos MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), los aminoácidos 10-468 de una proteína Cry3A055 ( SEQ ID NO: 70) y los aminoácidos 513-719 de una proteína Cry1Ia (SEQ ID NO: 82).

Ejemplo 33. Construcción de Dm2-3A

Parte del extremo 5' de esta secuencia codificante se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la cry3A055 (SEQ ID NO: 69) usando los cebadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) y FR-1Ab-2 (SEQ ID NO: 122) y la mezcla de reacción 3 y el perfil de termociclado 2 de la PCR. Un fragmento de nucleótidos que codificaba el dominio III de Cry1Ab se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la mocry1Ab (SEQ ID NO: 71) usando los cebadores FR1Ab-1 (SEQ ID NO: 123) y 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) y la mezcla de reacción 3 y el perfil de termociclado 2 de la PCR. Estos dos productos de la PCR se utilizaron como patrones en una reacción PCR de solapamiento con los cebadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) y 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) y la mezcla de reacción 3 y el perfil de termociclado 2 de la PCR. El amplicón resultante se clonó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Se ligaron FR8a BamHI/MluI y el producto de la PCR anterior en pCR2.1-TOPO AflIII, FR8a AflIII/SacI en pET21a BamHI/SacI. Posteriormente, se trasladó la secuencia codificante completa (BamHI/SacI) a 1454. La proteína insecticida quimérica DM2-3A comprende, desde el N-terminal hasta el C-terminal, un fragmento peptidilo que comprende la secuencia de aminoácidos MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), los aminoácidos 10-451 de una proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que comprende la región variable 1, el bloque conservado 1, la región variable 2, el bloque conservado 2, la región variable 3 y los 7 aminoácidos N-terminal del bloque conservado 3, y los aminoácidos 460-648 de una proteína Cry1Ab (SEQ ID NO: 72), que comprende los 41 aminoácidos C-terminal del bloque conservado 3, la región variable 4, el bloque conservado 4, la región variable 5, el bloque conservado 5 y la región variable 6. Así pues, la eHIP DM2-3A tiene una unión de entrecruzamiento entre Cry1Ab y Cry3A055 situada en el bloque conservado 3, inmediatamente después de Ser451 que está antes de la unión del dominio II y el dominio III. La DM2-3A presenta actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz del oeste pero la actividad fue menor que la de las eHIP 8AF y FR8a como se muestra en la Tabla 5.

Ejemplo 34. Construcción de T7-8AF.

Un fragmento de ácido nucleico que codificaba una porción N-terminal de una proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70) se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la cry3A055 (SEQ ID NO: 69) usando los cebadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) y C3-3A-6 (SEQ ID NO: 84) y la mezcla de reacción 1 y el perfil de termociclado 1 de la PCR.

Un fragmento de ácido nucleico que codificaba una porción C-terminal de una proteína Cry1Ab (SEQ ID NO: 72) se amplificó por PCR a partir de un plásmido que comprendía la mocry1Ab (SEQ ID NO: 71) usando los cebadores C31Ab-3 (SEQ ID NO: 85) y 1Ab-6-Sac (SEQ ID NO: 86) y la mezcla de reacción 1 y el perfil del termociclo 1 de la PCR.

Los dos productos de la PCR anteriormente descritos se utilizaron a continuación como patrones en una reacción PCR de solapamiento con los cebadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) y 1Ab-6-Sac (SEQ ID NO: 86) usando la mezcla de reacción 2 y el perfil de termociclado 1 de la PCR.

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Tabla 5. Resultados de los bioensayos para el gusano de la raíz del maíz del oeste.

Proteínas analizadas: Actividad contraCRW Fragmentoproteico Fragmento peptidilo Dominio I Dominio II Dominio III Región de la protoxina

V1: C1 V2 C2 V3 C3 V4 C4 V5 C5 V6

8AF: ++++ ++ - 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

T7-8AF: - + #7 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

-CatG8AF: ++++ ++ - 3A 3A 3A 1Ab 1Ab-38

8AFdm3: - + - 3A055 3A055 1Ab -

8AFdm3T: +++ ++ - 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

8AFlongdm3: - + - 3A055 3A055 3A055 1Ab -

8AFlongdm3T: - + - 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

Cap8AFdm3: + + #2 3A055 3A055 1Ab -

Cap8AFdm3T: ++ ++ #2 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

2OL-8a: ++++ ++ #1 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

FR8a +34: ++++ ++ #6 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

FR8a: ++++ ++ #2 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

FRCG: ++++ ++ #2 3A 3A 3A 1Ab 1Ab-38

FR8a-9F: +++ ++ #5 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

FR8a-9F-catg: ++++ ++ #5 3A 3A 3A 1Ab 1Ab-38

FR8a-12aa: ++++ ++ #3 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

Cry3A055: ++++ ++ - 3A055 3A055 3A055 -

5*Cry3A055: - ++ #2 3A055 3A055 3A055 -

Wr-9mut: - ++ #3 3A055 3A055 3A055 -

FRD3: ++++ ++ #2 3A055 3A055 3A055 1Ab -

FR-12-cg-dm3: ++ ++ #3 3A055 3A055 3A055 1Ab -

9F-cg-del6: - ++ #5 3A 3A 3A 1Ab 1Ab-38

FR-cg-dm3: ++++ ++ #2 3A 3A 3A 1Ab -

9F-cg-dm3: ++++ ++ #5 3A 3A 3A 1Ab -

B8a: - + - 3A055 3A055 3A055 1Ba 1Ba-18

5*B8a: - + #2 3A055 3A055 3A055 1Ba 1Ba-18

V3A: ++ + - 3A055 1Ab 3A055 -

V4F: - ++ - 3A055 3A055 1Ab 3A055 -

5*V4F: ++ + #2 3A055 3A055 1Ab 3A055 -

2OL-7: - ++ - 3A055 1Ab 1Ab 1Ab 1Ab-38

5*2OL-7: - + #2 3A055 1Ab 1Ab 1Ab 1Ab-38

2OL-10: - + - 3A055 1Ab 1Ab 1Ab-38

5*2OL-10: +/ +/ #2 3A055 1Ab 1Ab 1Ab-38

2OL-12A: - ++ - 1Ab 1Ab 3A -

2OL-13: - - - 3A055 1Ab 1Ab 3A055 -

2OL-20: - + - 3A 3A 3A 1Ab 1Ab-38

V5y6: - ++ - 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

5*V5y6: - ++ #2 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38

88A-dm3: - ++ #2 3A055 3A055 3A055 8Aa -

38

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Los datos se recopilaron unos 2-4 días tras la inoculación de la raíz. Se calculó el porcentaje de mortalidad de las larvas y también se realizó una evaluación visual del daño de la raíz. El daño por alimentación se registró mediante la observación del número de agujeros debidos a alimentación (FH) en la pieza de la raíz causados por las larvas del gusano de la raíz y se calificó como alto, moderado, bajo o ausente y se le dio un valor numérico de categoría 3, 2 ó 1, 5 respectivamente (en la Categoría 1 se incluyen las evaluaciones del daño como ausente y/o bajo). Las plantas de la Categoría 1 suelen tener de 0-FH a 2-FH; las plantas de la Categoría 2 tienen de 3 a 4-FH y las plantas de la Categoría 3 tienen >5-FH. Las muestras de las raíces con una evaluación del daño en la Categoría 1 se consideraron excelentes ejecutores, en la Categoría 2: ejecutores promedio y en la Categoría 3: ejecutores pobres. Se seleccionaron plantas de la Categoría 1 para la realización de análisis más exhaustivos en el invernadero y en el campo. 10 Los resultados de la Tabla 7 muestran que las plantas que expresan las eHIP FR8a y FRCG protegieron las raíces del daño por alimentación causados por el gusano de la raíz del maíz del oeste. La mayoría de los casos que expresaban la proteína insecticida quimérica se consideraron plantas de la Categoría 1, mientras las plantas de control que no expresaban una proteína insecticida quimérica entraban en la Categoría 3. Las plantas que expresaban la eHIP FRD3 15 proporcionaron niveles comparables de control del gusano de la raíz del maíz del oeste.

Tabla 7. Eficacia de las plantas transgénicas que expresan FR8a y FRCG contra el WCR.

Vector: Caso Evalua ción del daño (N.o de FH) Catego ría Vector Caso Evalua ción del daño (N.o de FH) Catego ría

12161: 1 1 1 12207 1 0 1

2: 1 1 2 2 1

3: 0 1 3 1 1

4: 3 2 4 2 1

5: 2 1 5 1 1

6: 0 1 6 2 1

7: 0 1 7 4 2

8: 0 1 8 3 2

9: 1 1 9 4 2

10: 1 1

11: 4 2 Control 1 7 3

12: 0 1 2 9 3

3: 8
3

Control: 1 6 3 4 11 3

2: 6 3 5 7 3

3: 6 3 6 12
3

4: 18 3

12208: 1 0 1 12274 1 3 2

2: 0 1 2 0 1

3
3: 2 3 3 2

4
4: 2 4 3 2

5: 1 1 5 0 1

6: 4 2 6 3 2

7: 0 1 7 3 2

8: 4 2 8 0 1

9: 4 2 9 3 2

10: 1 1 10 3 2

11: 1 1 11 0 1

12: 1 1

13: 0 1 Control 1 10 3

2: 10 3

Control: 1 10 3 3 10 3

2: 5 3 4 7 3

3: 7 3 5 8
3

4: 7 3 6 6 3

5: 8 3

6: 8 3

Ejemplo 46. Análisis de las plantas de maíz transgénicas para determinar la eficacia contra el gusano de la raíz del maíz en el campo

5 Se evaluaron en el campo algunas plantas positivas identificadas usando el bioensayo de la escisión de la raíz descrito anteriormente. Se extrajeron dieciocho plantas de cada caso de las parcelas del campo y se evaluaron para determinar el daño a las raíces. El daño a las raíces se evaluó usando la escala lineal del daño a las raíces de 0 a 3 del Estado de Iowa (Oleson, J.D. et al., 2005. J. Econ Entomol. 98(1): 1-8), donde 0.00 = no existe daño por alimentación (la calificación más baja que se puede otorgar); 1.00 = un nodo (círculo de raíces) o el equivalente de un nodo entero,

10 comido hacia dentro hasta aproximadamente 1 ½ pulgadas del tallo (línea del suelo en el 7.o nodo); 2.00 = dos nodos completos comidos; 3.00 = tres o más nodos comidos (la calificación más alta que se puede dar); y el daño entre nodos comidos completos se indica como el porcentaje de nodos desaparecidos, es decir, 1.50 = 1 1/2 de nodos comidos, 0.25 = 1/4 de un nodo comido, etc.

15 Los resultados de los ensayos de campo contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y del norte se muestran en la Tabla 8 y contra el gusano de la raíz del maíz mexicano en la Tabla 9. Todo el maíz transgénico que expresa la proteína insecticida quimérica FR8a logró mejores resultados que un insecticida químico comercial estándar contra el gusano de la raíz del maíz del oeste, del norte y mexicano.

20 Tabla 8. Resultados de los ensayos de campo para el gusano de la raíz del maíz del oeste y del norte.

Caso: Plásmido Evaluación de la raíz

1: 12161 (ubi:FR8a) 0.08

2: 12161 0.05

3: 12161 0.09

4: 12161 0.04

5: 12274 (cmp:FR8a) 0.04

6: 12274 0.08

7: 12274 0.05

Químico: 0.15

Verif. Neg.: 0.87

Tabla 9. Resultados de los ensayos de campo para el gusano de la raíz del maíz mexicano.

Caso: Plásmido Evaluación de la raíz

1: 12161 (ubi:FR8a) 0.04

5: 12274 (cmp:FR8a) 0.22

6: 12274 0.05

Químico: 0.15

Verif. Neg.: 1.04

Claims

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