KR100543051B1 - 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를암호화하는 유전자 - Google Patents

Abstract

푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드, 또는 그 활성과 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 갖는 단리된 유전자.

Description

푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자{GENE CODING FOR THE POLYPEPTIDE HAVING A DEGRADING ACTIVITY OF THE SULFATED-FUCOSE-CONTAINING POLYSACCHARIDE}

도 1은 ORF-1과 ORF-2의 위치를 도시한 도면이다.

도 2는 푸코스 황산 함유 다당의 침전 형성율을 나타낸 도면이다.

도 3은 fdlA의 위치를 도시한 도면이다.

도 4는 fdlB의 위치를 도시한 도면이다.

도 5는 DEAE-세파로스FF를 이용한 크로마토그램이다.

본 발명은 푸코스 황산 함유 다당의 구조 해석이나 그 다당의 저분자화물의 조제에 유용한 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 그 폴리펩티드의 유전자 공학적 제조 방법 및 그 방법에 의해서 얻어지는 폴리펩티드에 관한 것이다.

해조(海藻)에서 유래하는 푸코스 황산 함유 다당은 총칭적으로 푸코이단이라고 불리는, 푸코스를 주성분으로 하는 황산화다당이며, 갈락토오스, 글루쿠론산, 크실로스, 만노오스, 글루코스 등도 포함하는 것이 알려져 있다. 이들 구성 당의 종류나 양은 유래가 되는 해조의 종류에 따라 다르다. 예컨대, 시판되는 시그마사 제조의 푸코이단을 13종쯤의 분자종으로 나누었다고 하는 보고가 있다〔카르보하이드레이트 리서치(Carbohydrate Research), 제255권, 제213∼224쪽(1994)〕.

이들을 크게 구분하면, 우론산을 실질적으로 포함하지 않고 구성 당의 주성분이 푸코스인 것과, 우론산을 포함하여 구성 당에 푸코스나 만노오스를 포함하는 것의 2종류로 나뉜다.

푸코스 황산 함유 다당의 생물 활성에 대해서는 대식세포 활성 증강, 암 전이 억제, 항응혈 등 여러 가지 것이 보고되어 있지만, 푸코스 황산 함유 다당에는 분자종이 있기 때문에 활성의 본체가 어떤 분자종에 있는지를 조사하기 위해서는 푸코스 황산 함유 다당을 분리 정제하여 조사할 필요가 있었다. 그러나 이전의 방법에서는 그 분리가 불충분하기 때문에 약품으로서 대량 조제가 곤란하였다. 또한, 푸코스 황산 함유 다당은 매우 분자량이 큰 황산화 다당이며, 그대로 의약품으로서 이용하려면, 항원성, 균일성, 항응혈 활성 등의 문제가 있기 때문에, 푸코스 황산 함유 다당을 어느 정도 분해할 필요가 있었다.

푸코스 황산 함유 다당을 효소적으로 분해하여 저분자화물을 조제하는 방법은 온화한 조건으로 반응을 행할 수 있는 동시에, 효소의 기질 특이성으로부터 균일한 저분자화물을 얻을 수 있는 유리한 방법이다. 종래부터 전복, 가리비, 섬게, 해양 미생물 등이 푸코스 황산 함유 다당을 분해하는 효소를 생산하고 있는 것이 보고되어 있다. 그러나, 이들 효소는 일반적으로 생체 내에 미량으로 포함되어 있 는 데다 복수의 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 가지고 있기 때문에 단일 효소를 얻기 위하여 여러 가지 정제 공정이 필요하게 되어 있었다. 또한 이들 효소의 아미노산 서열이나 유전자 구조 등이 분명하게 밝혀진 것은 전혀 없었다.

본 발명의 목적은 푸코스 황산 함유 다당의 조제나 구조 해석, 또 저분자화 푸코스 황산 함유 다당의 조제에 유용한 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 및 그 유전자를 이용하여 유전공학적으로 얻을 수 있는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 염기 서열을 밝히기 위해서, 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 생산하는 미생물의 유전자에 관해서 예의 연구를 진행시킨 결과, 알테로모나스속 세균, 플라보박테리움속 세균에서 유래하는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자가 각 2종 존재하는 것을 밝히는 동시에, 그 전체 염기 서열을 확정하여, 그 폴리펩티드의 아미노산 서열을 처음으로 밝히고, 또한 그 유전자를 이용하여 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 공업적으로 유리하게 생산하는 방법도 개발하는 데에 성공하여, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명의 제1 발명은 푸코스 황산 함유 다 당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 그 활성과 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 갖는 단리된 유전자에 관한 것이다.

본원의 제2 발명은 본원의 제1 발명의 유전자를 포함하여 이루어지는 재조합 DNA에 관한 것이다.

본원의 제3 발명은 본원의 제2 발명의 재조합 DNA가 삽입되어 있고, 미생물, 동물 세포 또는 식물 세포를 숙주 세포로 하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본원의 제4 발명은 본원의 제3 발명인 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본원의 제5 발명은 본원의 제4 발명의 형질전환체를 배양하여, 그 배양물로부터 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 그 활성과 기능적으로 동일한 활성을 가지는 폴리펩티드를 수집하는 것을 특징으로 하는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 그 활성과 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제6 발명은 서열 목록의 서열 번호 1∼4 중 어느 한 아미노산 서열을 지니며, 또한 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 그 활성과 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.

발명의 실시 형태

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 이 유전자에 암호화되는 폴리펩티드의 일례로서는 알 테로모나스속 세균에서 유래하는 하기 (1)의 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 들 수 있다.

(1) 하기 이화학적 성질을 갖는 푸코스 황산 함유 다당(이하, 푸코스 황산 함유 다당-F라 함)에 작용하여, 그 푸코스 황산 함유 다당을 저분자화시킨다.

(a) 구성당 : 우론산을 실질적으로 함유하지 않는다.

(b) 플라보박테리움(Flavobacterium) sp. SA-0082(FERM BP-5402)가 생산하는 푸코이단 분해 효소에 의해 실질적으로 저분자화되지 않는다.

이 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드로는 알테로모나스 sp. SN-1009가 생산하는 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소가 있고, 그 효소는 참고예 1-(3)에 기재한 바와 같이 조제할 수 있다.

상기 푸코스 황산 함유 다당-F는 참고예 1에 기재한 바와 같이 조제할 수 있다.

또한 플라보박테리움 sp. SA-0082(FERM BP-5402)가 생산하는 푸코이단 분해 효소는 참고예 5에 기재한 바와 같이 조제할 수 있다.

푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 다른 폴리펩티드로는 플라보박테리움속 세균에서 유래하는 하기 (2)의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 예시할 수 있다.

(2) 하기 이화학적 성질을 갖는 푸코스 황산 함유 다당(이하, 푸코스 황산 함유 다당-U라 함)에 작용하여, 그 푸코스 황산 함유 다당을 저분자화하여, 하기 화학식 1, 2, 3 및 4로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 화합물을 유리시킨다.

(c) 구성당 : 우론산을 함유한다.

(d) 플라보박테리움 sp. SA-0082(FERM BP-5402)가 생산하는 푸코이단 분해 효소에 의해서 분해된다.

이 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드로는 플라보박테리움 sp. SA-0082가 생산하는 푸코이단 분해 효소가 있고, 그 효소는 참고예 5에 기재한 바와 같이 조제할 수 있다.

또, 푸코스 황산 함유 다당-F, 푸코스 황산 함유 다당-U의 혼합물은, 이하 푸코스 황산 함유 다당 혼합물이라 기재한다.

본 발명에 있어서 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드란, 천연형의 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소 뿐만 아니라, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 한 천연형의 아미노산 서열에 아미노산의 결실(欠失), 치환, 삽입, 부가 등이 일어나 아미노산 서열이 개변된 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다는 의미이다.

또한, 여기서 말하는 천연형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소로는, 예컨대 알테로모나스속 세균, 플라보박테리움속 세균에서 유래하는 것을 들 수 있지만, 본 발명이 이것에 한정되는 것은 아니며, 그 밖의 세균류는 물론, 효모류, 사상균류, 자낭균류, 담자균류 등의 미생물에서 유래하는 것, 혹은 식물, 동물 등의 생물체에서 유래하는 것도 포함된다.

본 명세서에 있어서, 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드란 다음과 같은 것을 말한다.

천연에 존재하는 단백질에는 그것을 암호화하는 유전자의 다형(多型)이나 변이 외에, 생성후의 단백질의 생체내 및 정제 중의 수사(modification) 반응 등에 의해서, 그 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입, 치환 등의 변이가 일어날 수 있지만, 그에 상관없이 변이를 갖지 않는 단백질과 실질적으로 동등한 생리, 생물학적 활성을 보이는 것이 있음이 알려져 있다. 이와 같이 구조적으로 차이가 있더라도, 그 기능에 있어서는 큰 차이가 인정되지 않는 것을 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드라 부른다.

인위적으로 단백질의 아미노산 서열에 상기와 같은 변이를 도입한 경우라도 마찬가지이며, 이 경우는 더욱 다종 다양한 변이체를 제작하는 것이 가능하지만, 변이를 갖지 않는 것과 실질적으로 동등한 생리 활성을 보이는 한, 이들 변이체는 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드라 해석된다.

예컨대, 대장균에서 발현된 단백질의 N 말단에 존재하는 메티오닌 잔기는 대부분의 경우, 메티오닌 아미노펩티다아제의 작용에 의해 제거된다고 여겨지고 있지만, 단백질의 종류에 따라서는 메티오닌 잔기를 갖는 것과 갖지 않는 것 양자가 생성된다. 그러나, 이 메티오닌 잔기의 유무는 단백질의 활성에는 영향을 주지 않는 경우가 많다. 또한, 인간 인터루킨2(IL-2)의 아미노산 서열 중의, 어떤 시스테인 잔기를 세린으로 치환한 폴리펩티드가 인터루킨2 활성을 유지하는 것이 알려져 있다〔사이언스(Science), 제224권, 1431쪽(1984)〕.

더욱이, 유전자 공학적으로 단백질을 생산할 때는 융합 단백질로서 발현시키는 것이 종종 행해진다. 예컨대, 목적 단백질의 발현량을 증가시키기 위해서, 목적 단백질의 N 말단에 다른 단백질에서 유래하는 N 말단 펩티드 고리를 부가하거나, 목적 단백질의 N 말단, 혹은 C 말단에 적당한 펩티드 고리를 부가하여 발현시켜, 부가한 펩티드 고리에 친화성을 갖는 담체를 사용함으로써, 목적 단백질의 정제를 용이하게 하는 방법 등이 행하여지고 있다.

또, 목적 단백질의 아미노산 서열에 1개 혹은 복수 개의 아미노산 잔기를 결실, 부가, 삽입 혹은 치환 중 적어도 1가지를 행한 폴리펩티드도 목적 단백질과 기능적으로 동등한 활성을 가지는 경우가 적지 않은데, 이러한 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 암호화하는 유전자도 천연에서 유래하여 단리된 것이든 인위적으로 제 작된 것이든 본 발명에 포함된다.

일반적으로 유전자 상에서 아미노산을 지정하는 코돈(3개 염기의 조합)은 아미노산의 종류마다 1∼6 종류씩 존재한다는 것이 알려져 있다. 따라서, 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 그 아미노산 서열에 따르기도 하지만, 다수 존재할 수 있다. 유전자는 자연계에 있어서 결코 안정적으로 존재하고 있는 것은 아니며, 그 핵산에 변이가 발생하는 경우가 드물지 않다. 유전자 상에 발생한 변이가 암호화하는 아미노산 서열에는 변화를 주지 않는 경우(침묵 변이라 함)도 있으며, 이 경우에는 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 다른 유전자가 생겼다고 할 수 있다. 따라서, 어떤 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 단리되더라도, 그것을 함유하는 생물이 계대(繼代)하는 중에 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 많은 종류의 유전자가 생겨 날 가능성은 부정할 수 없다.

또한, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 많은 종류의 유전자를 인위적으로 제작하는 것은 여러 가지 유전자 공학적 수법을 이용하면 곤란한 일은 아니다.

예컨대, 유전자 공학적인 단백질 생산에 있어서, 목적 단백질을 암호화하는 본 래의 유전자 상에서 사용되고 있는 코돈이 사용하고 있는 숙주 중에서는 사용 빈도가 낮은 것이었던 경우, 단백질의 발현량이 낮은 경우가 있다. 이러한 경우에는 암호화되는 아미노산 서열에 변화를 주지 않고서, 코돈을 숙주에서 빈번하게 이용되고 있는 것으로 인위적으로 변환시킴으로써, 목적 단백질의 높은 발현을 도모하고 있다. 이와 같이 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 인위적으로 많은 종류로 제작하는 것이 가능한 것은 물론이다. 따라서, 이들 인위적으로 제작 된 상이한 폴리뉴클레오티드라도 본 발명에 개시된 아미노산 서열이 암호화되는 한, 본 발명에 포함되는 것이다.

또, 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드는 그것을 암호화하는 유전자가 상동성을 갖는 경우가 많다. 따라서, 본 발명에 이용되는 유전자와 엄밀한 조건에서 하이브리드할 수 있어, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자도 본 발명에 포함된다.

이하, 알테로모나스 sp. SN-1009 및 플라보박테리움 sp. SA-0082를 예로 하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

이 알테로모나스 sp. SN-1009는 Alteromonas sp. SN-1009라 표시되어, 1996년 2월 13일(원 기탁일)부터, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소[일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3호(우편번호305-8566)]에, FERM BP-5747로서 국제 기탁되어 있다. 또한 플라보박테리움 sp. SA-0082는 Flavobacterium sp. SA-0082라 표시되어, 상기 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에, FERM BP-5402로서 국제 기탁되어 있다.

알테로모나스 sp. SN-1009 또는 플라보박테리움 sp. SA-0082가 생산하는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 얻기 위해서는, 예컨대 하이브리드화법이나 PCR법, 혹은 이들을 조합시킨 방법을 이용할 수 있다. 이들 방법에는 상기 유전자에 하이브리드화 가능한 프로브, 혹은 PCR법에 의해서 상기 유전자 또는 그 일부를 증폭할 수 있는 프라이머가 필요하지만, 이들 균주가 생산하는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미 노산 서열이나 유전자 구조는 전혀 알려져 있지 않기 때문에, 프로브 혹은 프라이머로서 이용 가능한 합성 올리고뉴클레오티드를 제작할 수 없다. 그래서, 우선 상기 미생물이 생산하는 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 부분 아미노산 서열을 결정하여, 프로브 혹은 프라이머로서 이용 가능한 합성 올리고뉴클레오티드의 제작을 검토한다.

우선, 예컨대 알테로모나스 sp. SN-1009 또는 플라보박테리움 sp. SA-0082를 배양하고, 이어서 그 배양물로부터, 생성된 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 각각 단리, 정제한다.

이어서, 정제된 각 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소에 관해서, 그 부분 아미노산 서열에 관한 정보를 얻는다. 부분 아미노산 서열을 결정하기 위해서는, 예컨대 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 직접 통상의 방법에 따라서 에드만 분해법에 의한 아미노산 서열 분석[예컨대, 프로테인 시퀀서 476A(장입드 바이오시스템즈사 제조)를 이용할 수 있음]에 제공함으로써, 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 N 말단 아미노산 서열을 결정한다. 혹은, 정제 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소에, 특이성이 높은 단백질 가수 분해 효소, 예컨대 아크로모박터(Achromobacter) 프로테아제 I, N-토실-L-페닐알라닐클로로메틸케톤 (TPCK)-트립신 등을 작용시켜 한정 가수 분해하고, 얻어진 펩티드 단편을 역상계 HPLC를 이용하여 분리, 정제한 후, 정제 펩티드 단편에 대해서 아미노산 서열을 분석하면, 대부분의 아미노산 서열 정보를 얻을 수 있다.

이렇게 해서 얻어지는 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소에 특이적인 부분 아 미노산 서열에 관한 정보를 선택하여, 그 정보를 바탕으로 염기 서열을 축중(縮重)시킨 올리고뉴클레오티드를 디자인하여 합성한다. 이 때 축중의 정도가 낮고 긴 올리고뉴클레오티드, 바꿔 말하면, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 특이성이 높은 올리고뉴클레오티드를 합성할 필요가 있어, 올리고뉴클레오티드의 디자인이 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 클로닝에 중요한 요인이 된다.

이어서 서던 하이브리드화법에 의해서 합성 올리고뉴클레오티드와 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자와의 특이적 하이브리드화의 조건을 검토할 필요가 있다.

예컨대, 알테로모나스 sp. SN-1009 또는 플라보박테리움 sp. SA-0082의 게놈 DNA를 적당한 제한 효소로 완전 분해하여, 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, 통상의 방법에 따라서 나일론막 등에 블로팅한다. 하이브리드화는 우선, 예컨대 6×SSC(1×SSC는 염화나트륨 8.77g 및 구연산나트륨 4.41g을 물 1 리터에 용해한 것), 1% 라우릴황산나트륨(SDS), 100 ㎍/㎖의 연어정자 DNA, 5×덴하르츠(소 혈청 알부민, 폴리비닐피롤리돈, 피콜을 각각 0.1%의 농도로 포함함)를 포함하는 예비 하이브리드화 용액 중에서 65 ℃하에 수시간 유지하여 나일론막을 블로킹한 후, 예컨대 ³²P 등으로 표지한 합성 올리고뉴클레오티드를 가하여 42℃에서 하룻밤 유지한다. 이 나일론막을 0.1% SDS를 포함하는 1×SSC로 42℃, 30분간 세정한 후, 오토라디오그래피를 수행하여 합성 올리고뉴클레오티드 프로브와 하이브리드하는 DNA 단편을 검출한다. 이 때, 이용한 합성 올리고뉴클레오티드의 길이나 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자와의 상보성에 따라서, 유지 온도나 세정 용액의 염 농도 등을 검토하여 최적의 조건을 선택하는 것이 효과적이다.

이와 같이 하여 검출된 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻는 방법으로서, 직접 검출된 밴드의 위치에 상당하는 DNA 단편을 겔로부터 추출, 정제한 후, 통상 이용되는 숙주-벡터계의 벡터에 조립한 라이브러리를 제작하고, 서던 하이브리드화법과 같은 조건으로 콜로니 하이브리드화 혹은 플라크 하이브리드화를 행하여, 목적의 DNA 단편을 포함하는 클론을 스크리닝, 단리하면 된다. 혹은 직접 알테로모나스 sp. SN-1009 또는 플라보박테리움 sp. SA-0082의 게놈 DNA를 적당한 제한 효소로 분해한 후, 통상 이용되는 숙주-벡터계의 벡터에 조립한 라이브러리를 제작하여, 마찬가지로 하이브리드화법으로 목적의 DNA 단편을 포함하는 클론을 스크리닝, 단리하여도 좋다.

이용되는 숙주-벡터계로서는 공지의 것을 사용할 수 있고, 예컨대 대장균을 숙주로 하는 pUC18, pUC19 등의 플라스미드 벡터, 혹은 람다 파지 등의 파지 벡터 등을 들 수 있지만, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니다.

이들 숙주-벡터계의 종류나 취급 방법은 일반적으로 이용되는 종류나 방법을 이용하면 되며, 예컨대 몰리큘라 클로닝 어 레보레이토리 메뉴얼 제2판(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, J. Sambrook 외 저, 콜드 스프링 하버 라보러터리 1989년 발행)에 기재되어 있다.

목적의 DNA 단편을 포함하는 벡터를 선별할 수 있으면, 이 벡터에 삽입되어 있는 목적의 DNA 단편의 염기 서열은 통상의 방법, 예컨대 디데옥시법〔프로시딩즈 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이엔시즈 오브 더 USA(Proc. Nat. Acad. Sci, U.S.A.), 제74권, 제5463쪽(1977)〕에 의해 결정할 수 있다. 결정된 염기 서열을 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 N 말단 분석, 부분 아미노산 서열, 분자량 등과 비교함으로써, 얻어진 DNA 단편 중의 유전자 구조 및 그 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 알 수 있다.

또, 상기 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 부분 아미노산 서열을 바탕으로 얻어진 올리고뉴클레오티드를 이용하여 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 얻는 방법으로서, PCR법을 이용할 수 있다. 그 중에서도 카세트 DNA를 이용한 PCR법은 단시간에 적은 아미노산 서열 정보로부터 하이브리드화법에 사용 가능한 목적 유전자의 단편을 얻는 방법이다.

예컨대, 플라보박테리움 sp. SA-0082의 배양 균체로부터 통상의 방법에 따라서 추출한 게놈 DNA를 적당한 제한 효소로 분해한 후, 이미 알려진 서열을 갖는 합성 DNA(카세트 DNA)를 연결한다. 이 혼합물을 주형으로 하여, 상기 부분 아미노산 서열의 정보를 바탕으로 디자인한 상기 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머와 카세트 DNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머(카세트 프라이머)를 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 목적 DNA 단편을 증폭하는 것이 가능하다. 카세트 DNA 혹은 카세트 프라이머로는, 예컨대 다카라츠죠사에서 제조한 것을 이용할 수 있다. 카세트 DNA는 2종류의 카세트 프라이머에 대응하는 서열을 포함하고 있 는 것이 바람직하고, 우선 연결한 제한 효소 부위에서 먼 쪽의 프라이머를 이용하여 1회째의 PCR 반응을 행한 뒤, 그 반응액의 일부를 주형으로 하고 또한 내측의 프라이머를 이용하여 2회째의 PCR 반응을 행하면 효과적이다. 또, 상기 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대해서도, 나란히 2종류를 디자인, 합성하여, 상류의 프라이머를 1회째의 PCR 반응에 이용하고, 2회째의 PCR 반응에서는 하류의 프라이머를 이용하면 그 유전자의 특이성이 높아져, 목적 DNA 단편의 특이적인 증폭의 가능성이 높아진다.

그러나, 목적 유전자의 염기 서열은 분명하지 않기 때문에, 카세트 DNA의 연결에 이용한 제한 효소 부위가 부분 아미노산 서열을 암호화하는 영역으로부터 PCR에 의한 증폭 반응에 적당한 위치에 있다고는 할 수 없다. 그 때문에, 많은 종류의 제한 효소 부위의 카세트 DNA를 이용해 볼 필요가 있다. 또, PCR은 예컨대 PCR 테크놀러지〔PCR Technology, 엘리히(Erlich H.A.) 편집, 스톡톤 프레스사, 1989년 발행〕에 기재되어 있는 것과 같은, 일반적으로 이용되고 있는 조건으로 행할 수 있지만, 이용한 합성 올리고뉴클레오티드의 길이나 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자와의 상보성에 따라서, 어닐링 온도, 사이클수, 마그네슘 농도, 내열성 폴리머라제 농도 등을 검토하여, 비특이적인 증폭 밴드가 가장 적어지는 최적 조건을 선택할 필요가 있다.

PCR 반응액은 아가로스겔 등의 전기 영동에 제공하여, 증폭된 DNA 단편을 확인한다. 이들 단편은 통상의 방법에 따라서 추출, 정제하여, 통상적으로 이용되는 pUC18, pUC19 등의 클로닝 벡터에 삽입한 후, 예컨대 디데옥시에 의해 염기 서열 을 해석할 수 있다. 혹은 회수한 증폭 DNA 단편을 PCR 반응에 이용한 카세트 프라이머를 이용하여 직접 염기 서열을 해석하더라도 좋다. 그 결과, 프라이머의 서열 이외에, 앞서 결정한 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 부분 아미노산 서열을 암호하고 있는 것을 얻을 수 있으면, 그 효소를 암호화하는 유전자 혹은 그것에 상동성을 보이는 유전자의 단편를 얻을 수 있게 된다.

이와 같이 하여 서던 하이브리드화법 혹은 PCR법에 의해 얻어진 DNA 단편이 목적의 효소를 암호화하는 유전자의 일부였던 경우에는, 그 DNA 단편을 프로브로 한 하이브리드화에 의해 게놈 라이브러리의 스크리닝을 행하거나, 혹은 그 DNA 단편의 염기 서열을 바탕으로 하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 행함으로써, 목적의 효소를 암호화하는 유전자의 전체 길이를 포함하는 DNA 단편을 얻을 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이 얻어진 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소 유전자 혹은 그 일부를 프로브로서 알테로모나스 sp. SN-1009 또는 플라보박테리움 sp. SA-0082의 게놈 DNA를 서던 하이브리드화법에 의해서 해석하면, 검출된 밴드의 위치로부터, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 알테로모나스 sp. SN-1009 또는 플라보박테리움 sp. SA-0082의 게놈 DNA 제한 효소 단편 크기의 정보를 얻을 수 있고, 또한 검출된 밴드의 수에 따라서, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 및 그것에 상동성을 보이는 유전자의 수를 예상할 수 있으며, 이들 유전자를 포함하는 DNA 단편은 전술한 바와 같은 방법에 의해 단리할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 DNA 단편이 목적의 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는지의 여부는 최종적으로 단리된 상기 DNA 단편을 포함하는 발현 벡터를 제작하여, 그 벡터를 이용하여 숙주를 형질전환시키고, 이어서 이 형질전환체를 배양하여, 발현된 폴리펩티드의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서는 알테로모나스 sp. SN-1009로부터, 서열 목록의 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 각각 나타내어지는 아미노산 서열을 가지고, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열을 갖는 유전자가 단리되었다. 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열의 예를, 서열 목록의 서열 번호 5 및 서열 번호 6에 각각 나타낸다.

또, 플라보박테리움 sp. SA-0082로부터, 서열 목록의 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 각각 나타내어지는 아미노산 서열을 가지고, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열을 갖는 유전자가 단리되었다. 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 각각 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열의 예를, 서열 목록의 서열 번호 7 및 서열 번호 8에 각각 나타낸다.

본 발명의 유전자의 염기 서열을 이용하여, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성 또는 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 하이브리드화에 의해 얻는 방법으로서는, 예컨대 이하의 방법을 적용할 수 있다.

우선 목적의 유전자원으로부터 얻은 염색체 DNA, 혹은 mRNA로부터 역전사 효소에 의해 제작한 cDNA를 통상의 방법에 따라서 플라스미드나 파지 벡터에 연결하여 숙주에 도입하여, 라이브러리를 제작한다. 그 라이브러리를 플레이트 상에서 배양하여, 생육한 콜로니 또는 플라크를 니트로셀룰로오스나 나일론 막으로 옮기고, 변성 처리에 의해 DNA를 막에 고정한다. 이 막을, 예컨대 ³²P 등으로 표지한 프로브(사용하는 프로브로는 서열 목록의 서열 번호 1∼4 중 어느 한 아미노산 서열 또는 그 일부를 암호화하는 염기 서열이면 좋고, 예컨대 서열 목록의 서열 번호 5∼8 중 어느 한 염기 서열 또는 그 일부를 사용할 수 있음)를 포함하는 용액 중에서 유지하여, 막 상의 DNA와 프로브와의 사이에서 하이브리드를 형성시킨다. 예컨대 DNA를 고정화한 막을, 6×SSC, 1% SDS, 100 ㎍/㎖의 연어 정자 DNA, 5×덴하르츠를 포함하는 용액 중에서 65℃하에 20시간 동안 프로브와 하이브리드화를 행한다. 하이브리드화후, 비특이적으로 흡착한 프로브를 씻어낸 후, 오토라디오그래피 등에 의해 프로브와 하이브리드 형성한 클론을 동정(同定)한다. 이 조작을, 하이브리드 형성한 클론이 단일하게 될 때까지 반복한다. 이렇게 해서 얻어진 클론 중에는 목적의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자가 삽입되어 있다.

얻어진 유전자는 예컨대 다음과 같이 염기 서열을 결정하여, 얻어진 유전자가 목적의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성 또는 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자인가를 확인한다.

염기 서열의 결정은 형질전환체가 플라스미드로 형질전환된 대장균이라면 시 험관 등에서 배양을 행하고, 플라스미드를 통상의 방법에 따라서 추출한다. 이것을 제한 효소에 의해 절단하고 삽입 단편을 꺼내어, M13 파지 벡터 등에 서브클로닝하여, 디데옥시법에 의해 염기 서열을 결정한다. 재조합체가 파지 벡터를 이용한 경우에도 기본적으로 같은 과정에 의해 염기 서열을 결정할 수 있다. 이들의 배양에서부터 염기 서열 결정까지의 기본적인 실험법에 관하여는, 예컨대 몰리큘라 클로닝 어 레보레이토리 매뉴얼 제2판〔J. 삼브르크(J. Sambrook) 외 저, 콜드 스프링 하버 레보레이토리 1989년 발행〕에 기재되어 있다.

얻어진 유전자가 목적의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성 또는 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자인지의 여부를 확인하기 위해서는 결정된 염기 서열 혹은 암호화되는 아미노산 서열을, 본 발명의 서열 목록의 서열 번호 5∼8 중 어느 한 염기 서열 혹은 서열 목록의 서열 번호 1∼4 중 어느 한 아미노산 서열과 비교한다.

얻어진 유전자가 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성 또는 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 영역의 전부를 포함하지 않는 경우에는, 얻어진 유전자를 기초로 하여 합성 DNA 프라이머를 제작하고, PCR에 의해 모자라는 영역을 증폭하거나, 얻어진 유전자의 단편을 프로브로 하여, DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 추가로 스크리닝함으로써, 본 발명의 유전자에 하이브리드화하는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성 또는 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드의 전체 암호 영역의 염기 서열을 결정할 수 있다.

한편, 본 발명의 유전자의 염기 서열로부터 PCR 반응용의 프라이머를 디자인 할 수 있다. 이 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 행함으로써 본 발명의 유전자와 상동성이 높은 유전자 단편을 검출하거나, 나아가서는 그 유전자 전체를 얻을 수도 있다.

이어서 얻어진 유전자를 발현시켜, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 측정하고, 얻어진 유전자의 기능을 확정한다.

본 발명의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 이용하여 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 생산하기 위해서는 이하의 방법이 편리하다.

우선, 목적의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 숙주를 형질전환시키고, 이어서 통상 이용되는 조건으로 이 형질전환체를 배양함으로써, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 이 때 그 폴리펩티드는 봉입체(inclusion body)의 형태로 생산되는 경우도 있다. 숙주로서는 미생물, 동물 세포, 식물 세포 등의 배양 세포를 이용할 수 있다.

발현의 확인은, 예컨대 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 측정함으로써 행하는 것이 편리하다. 활성 측정은, 예컨대 재조합체 대장균의 세포 추출액을 효소액으로 하여 측정할 수 있다.

목적의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 발현이 인정된 경우에는, 예컨대 형질전환체가 대장균이라면, 배지 조성, 배지의 pH, 배양 온도, 유도 물질의 사용량·사용 시기, 배양 시간 등에 관하여, 최적 조건을 결정 함으로써 효율적으로 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 생산시킬 수 있다.

형질전환체의 배양물로부터 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 정제하기 위해서는 통상의 방법이 이용된다. 형질전환체가 대장균인 경우와 같이 세포 내에 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 축적할 때는 배양 종료후 원심 분리에 의해서 형질전환체를 모아, 이것을 초음파 처리 등에 의해서 파쇄한 후, 원심 분리 등으로 무세포 추출액을 얻는다. 이로부터, 염석이나, 이온 교환, 겔 여과, 소수, 친화성 등의 각종 크로마토그래피 등의 일반적인 단백질 정제법을 사용하여 목적의 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 이용하는 숙주-벡터계에 따라서 발현산물이 형질전환체 밖으로 분비되는 경우가 있는데, 이 경우는 배양 상청액으로부터 같은 식으로 정제를 하면 된다.

형질전환체가 생산하는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드는 그것이 균체 내에 생산될 때는 균체 내의 여러 효소가 공존하지만, 이들은 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 양에 비하여 미량에 지나지 않기 때문에, 그 정제는 매우 용이하다. 또한, 숙주로서 이용하는 세포를 선택하면, 푸코스 황산 함유 다당에 작용하는 숙주에서 유래하는 효소는 대폭으로 저감된다. 또한, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드가 균체 밖으로 분비되는 경우는 배지 성분 등이 공존하지만, 이들은 용이하게 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드와 분리할 수 있다.

또, 예컨대 숙주가 대장균인 경우, 발현산물이 불용성인 봉입체로서 형성되 는 경우가 있다. 이 경우, 배양 종료후 원심 분리에 의해서 균체를 모아, 이것을 초음파 처리 등에 의해서 파쇄한 후, 원심 분리 등을 행함으로써 봉입체를 포함하는 불용성 분획을 모은다. 봉입체를 세정한 후, 통상 이용되는 단백질 가용화제, 예컨대 요소나 구아니딘염산염 등으로 가용화하고, 필요에 따라서 이것을 이온 교환, 겔 여과, 소수, 친화성 등의 각종 크로마토그래피를 행함으로써 정제한 후, 투석법 혹은 희석법 등을 이용한 리폴딩(refolding) 조작을 행함으로써 활성을 유지한 목적의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 필요에 따라서 이 샘플을 더욱 각종 크로마토그래피로 정제하면, 고순도의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

또, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드를 생산하는 경우에도 같은 생산 방법, 정제 방법을 이용하면 된다.

이와 같이 본 발명에 의해, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 일차 구조 및 유전자 구조를 제공할 수 있다. 또한, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 그 활성과 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드의 유전자 공학적인 제조가 가능해진다.

본 발명의 유전자 공학적 제조법을 이용하면 저렴하게 고순도의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 그 활성과 기능적으로 동등한 활성을 가지는 폴리펩티드를 얻는 것이 가능해진다.

이상, 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 생산하는 알테로모나스속 세균 또 는 플라보박테리움속 세균을 배양하여 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 생산하는 방법은, 동시에 프로테아제나 다른 다당 분해 효소가 생산되기 때문에, 목적의 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 단리하기 위해서는 매우 성가신 이들 효소와의 분리 정제가 필요하며, 또한 효소의 생산을 유도하기 위해서 배양시에 배지에 고가의 푸코스 황산 함유 다당을 첨가하여 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 유도할 필요가 있었지만, 본 발명에 의해 저렴하게 고순도의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 제공이 가능해졌다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1

(1) 건조 가고메 다시마(Kjellmaniella crassifolia) 2kg를 자유 분쇄기 M-2형(나라기까이세이사쿠쇼 제조)으로 분쇄하고, 4.5배량의 80% 에탄올 중에서 80℃, 2시간 처리후, 여과하였다. 잔류물에 대하여, 상기 80% 에탄올 추출, 여과 공정을 다시 3회 반복하여, 에탄올 세정 잔류물 1870g을 얻었다. 잔류물에 36 리터의 물을 첨가하고, 100℃, 2시간 처리하고, 여과에 의해 추출액을 얻었다. 추출액의 염 농도를 400mM의 염화나트륨 용액과 같게 한 후, 5%의 세틸피리디늄 염화물을 이 이상 침전이 일어나지 않을 때까지 첨가하고, 원심 분리하였다. 그 침전을 80%의 에탄올로 반복 세정하여, 세틸피리디늄 염화물을 완전히 제거한 후, 3 리터의 2M 염화나트륨에 용해하여, 불용물을 원심 분리로 제거하고, 2M의 염화나트륨으로 평형화한 100㎖의 DEAE-셀룰로파인 A-800을 현탁하여, 교반한 후 여과하여, 수지를 제 거하였다. 이 여과액을 2M의 염화나트륨으로 평형화한 100㎖의 DEAE-셀러파인 A-800의 컬럼에 걸어, 그냥 지나치는 분획을 한외여과기(여과막의 배제 분자량 10만)에 의해 탈염 및 저분자 제거를 행하고, 이 때 생긴 침전을 원심 분리에 의해 제거하였다. 이 상청액을 동결 건조하여 정제 가고메 다시마 푸코스 황산 함유 다당 혼합물 82.2g을 얻었다.

(2) 상기 가고메 다시마에서 유래하는 푸코스 황산 함유 다당 혼합물 7g을 700㎖의 0.2M 염화칼슘을 포함하는 20mM의 아세트산나트륨(pH6.0)에 용해한 후, 미리 0.2M의 염화칼슘을 포함하는 20mM의 아세트산나트륨(pH6.0)으로 평형화한 4000㎖의 DEAE-세파로스FF의 컬럼에 걸고, 0.2M의 염화칼슘을 포함하는 20mM의 아세트산나트륨(pH6.0)으로 충분히 컬럼을 세정한 후, 0∼4M의 염화나트륨 구배로 용출하였다. 염화나트륨 농도 0.9∼1.5M에서 용출되어 오는 분획을 모아, 배제 분자량 10만의 한외여과막을 장착한 한외여과기로 농축 탈염한 후 동결 건조하여, 푸코스 황산 함유 다당-F의 동결 건조 샘플 4.7g을 얻었다.

또한 염화나트륨 농도가 0.05∼0.8M에서 용출되는 분획을 모아, 배제 분자량 10만의 한외여과막을 장착한 한외여과기로 농축 탈염한 후 동결 건조하여, 푸코스 황산 함유 다당-U의 동결 건조 샘플 2.1g을 얻었다.

(3) 알테로모나스 sp. SN-1009(FERM BP-5747)을 글루코스 0.25%, 펩톤 1.0%, 효모 엑기스 0.05%를 포함하는 인공 해수(쟈마린 레보레이토리사 제조) pH8.2로 이루어지는 배지 600㎖을 나누어 넣어 살균한(120℃, 20분) 2 리터의 삼각플라스크에 접종하고, 25℃에서 25시간 배양하여 종배양액으로 하였다. 펩톤 200g, 효모 엑기 스 4g 및 소포제(신에츠가가쿠고교사 제조 KM70) 4㎖를 포함하는 인공 해수 pH8.0로 이루어지는 배지 18 리터를 30 리터들이 발효기에 넣어 120℃에서 20분 살균하였다. 냉각후, 따로 120℃, 15분 살균한 2 리터의 인공 해수에 용해한, 참고예 1-(1)의 방법을 이용하여 조제한 가고메 다시마에서 유래하는 푸코스 황산 함유 다당-F 20g을 첨가하고, 또 상기 종배양액 600㎖를 접종하여, 24℃에서 20시간, 매분 10 리터의 통기량과 매분 250 회전의 교반 속도의 조건으로 배양하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체 및 배양 상청액을 얻었다.

배양 상청액 중의 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 활성을 푸코스 황산 함유 다당-F를 기질에 이용하여, 참고예 2에 기재한 방법으로 측정한 바, 10 mU/㎖·배양액이었다.

얻어진 배양 상청액을 분획 분자량 1만의 한외여과기에 의해 농축한 후, 생긴 침전을 원심 분리에 의해 제거하여, 85% 포화 황산암모늄 염석을 하여, 생긴 침전을 원심 분리에 의해 모아, 10분의 1 농도의 인공 해수(쟈마린 S)를 포함하는 20mM의 트리스-염산 완충액(pH8.2)에 대하여 충분히 투석하여, 400㎖의 조효소를 얻었다.

얻어진 조효소액을, 미리 5mM의 아지화나트륨 및 10분의 1 농도의 인공 해수(쟈마린 S)를 포함하는 20mM의 트리스-염산 완충액(pH8.2)으로 평형화한 DEAE-셀러파인 A-800(세이가가쿠고교사 제조)의 컬럼에 흡착시켜, 흡착물을 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 동 완충액 중에 100mM, 200mM, 300mM, 400mM 및 600mM의 염화나트륨을 포함하는 용액으로 용출하여, 활성 분획을 모았다.

얻어진 활성 분획의 효소 활성을 참고예 2에 기재한 방법으로 측정한 바, 20400mU(20.4U)였다.

얻어진 활성 분획을 분획 분자량 1만의 한외여과기에 의해 농축한 후, 10mM의 염화칼슘 및 50mM의 염화나트륨을 포함하는 20mM의 트리스-염산 완충액(pH8.2)을 첨가하면서 한외여과하여, 완전히 완충액을 치환하였다.

얻어진 효소 용액을, 미리 동 완충액으로 평형화한 DEAE-세파로스FF의 컬럼에 흡착시켜, 흡착물을 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 염화나트륨 농도가 150mM인 동 완충액으로 더욱 세정하고, 그 후 150mM 내지 400mM의 염화나트륨을 포함하는 동 완충액으로 염화나트륨 구배 용출을 행하였다.

얻어진 활성 분획을 모아, 한외여과에 의해 농축한 후, 세파크릴 S-200에 의한 겔 여과를 행하였다. 용출액에는 5mM의 아지화 나트륨 및 10분의 1 농도의 쟈마린 S를 포함하는 10mM 트리스-염산 완충액(pH8.0)를 이용하였다. 또, 상기 크로마토그래피에 의해 분자량을 구한 바, 약 10만이었다.

얻어진 활성 분획을 모아, 10mM의 염화칼슘, 10mM의 염화칼륨 및 4.2M의 염화나트륨을 포함하는 20mM의 트리스-염산 완충액(pH8.2)에 대하여 충분히 투석하고, 염화나트륨 농도가 4M인 동 완충액으로 미리 평형화한 페닐세파로스 CL-4B의 컬럼에 걸어, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M 및 0.15M의 염화나트륨을 포함하는 동 완충액으로 용출하였다.

얻어진 활성 분획을 모아, 한외여과에 의해 농축한 후, 10mM의 염화칼슘, 10mM의 염화칼륨 및 150mM의 염화나트륨을 포함하는 20mM의 트리스-염산 완충액 (pH8.2)을 첨가하면서 한외여과하여, 완전하게 완충액을 치환하였다. 이 효소액을, 미리 동 완충액으로 평형화한 DEAE-셀러파인 A-800에 걸고, 같은 완충액으로 세정한 후, 150mM 내지 350mM의 염화나트륨의 구배 용출을 행하였다.

얻어진 활성 분획을 모아, 50mM의 염화나트륨을 포함하는 동 완충액으로 충분히 투석한 후, 50mM의 염화나트륨을 포함하는 동 완충액으로 미리 평형화한 DEAE-셀러파인 A-800에 흡착시키고, 동 완충액으로 세정한 후, 50mM 내지 150mM의 염화나트륨 구배 용출을 행하였다. 얻어진 활성 분획을 통합하여, 정제 효소를 얻었다.

또한, SDS(도데실황산나트륨)-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 상기 정제 효소의 분자량을 구한 바 약 9만이었다.

참고예 2

참고예 1-(2)의 공정에 의해 얻어진 푸코스 황산 함유 다당-F를 이용하여 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 하기와 같이 측정하였다.

즉, 2.5%의 푸코스 황산 함유 다당-F 용액 12㎕과, 6㎕의 1M 염화칼슘 용액과 9㎕의 4M 염화나트륨 용액과, 60㎕의 50mM의 아세트산과 이미다졸과 트리스-염산을 포함하는 완충액(pH7.5)과 21㎕의 물과, 12㎕의 분해 활성 측정용 피검액을 혼합하여, 30℃, 3시간 반응시킨 후, 반응액을 100℃, 10분간 처리하여, 원심 분리한 후, 100㎕를 HPLC로 분석하여, 저분자화의 정도를 측정하였다.

대조군으로서, 분해 활성 측정용 피검액 대신에, 피검액에 사용하고 있는 완충액을 이용하여 같은 조건에 의해 반응시킨 것 및 푸코스 황산 함유 다당-F 용액 대신에 물을 이용하여 반응을 행한 것을 준비하여, 각각 같은 식으로 HPLC에 의해 분석하였다.

*1단위의 효소는 상기 반응계에 있어서 1분간에 1μmol의 푸코스 황산 함유 다당-F의 푸코실 결합을 절단하는 효소량으로 한다. 절단된 프코실 결합의 정량은 하기 식에 의해 구하였다.

{(12×2.5)/(100×MF)}×{(MF/M)-1}×{1/(180×0.01)}×1000=U/㎖

(12 x 2.5)/100 : 반응계 중에 첨가한 푸코스 황산 함유 다당-F(㎎)

MF : 기질 푸코스 황산 함유 다당-F의 평균 분자량

M : 반응 생성물의 평균 분자량

(MF/M)-1 : 1분자의 푸코스 황산 함유 다당-F가 효소에 의해 절단된 수

180 : 반응 시간(분)

0.01 : 효소액량(㎖)

또, HPLC의 조건은 하기와 같다.

장치 : L-6200형(히타치세이사쿠쇼 제조)

칼럼 : OHpak SB-806(8mm×300mm)(쇼와덴꼬사 제조)

용출액 : 5mM의 아지화나트륨, 25mM의 염화칼슘 및 50mM의 염화나트륨을 포함하는 25mM의 이미다졸 완충액(pH 8)

검출: 시차 굴절률 검출기(Shodex RI-71, 쇼와덴꼬사 제조)

유속 : 1㎖/분

칼럼 온도 : 25℃

반응 생성물의 평균 분자량을 측정하기 위해, 시판되는 분자량이 이미 알려진 풀란(STANDARD P-82, 쇼와덴꼬사 제조)을 상기 HPLC 분석과 같은 조건으로 분석하여, 풀란의 분자량과 OHpak SB-806의 유지 시간과의 관계를 곡선으로 나타내어, 상기 효소 반응 생성물의 분자량 측정을 위한 표준 곡선으로 하였다.

참고예 3

참고예 1-(2)의 공정에서 얻어진 푸코스 황산 함유 다당-U를 이용하여 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 하기와 같이 측정하였다.

2.5%의 푸코스 황산 함유 다당-U 용액 50㎕과, 10㎕의 분해 활성 측정용 피검액과, 60㎕의 667mM 염화나트륨을 포함하는 83mM 인산 완충액(pH7.5)을 혼합하여, 37℃, 3시간 반응시킨 후, 반응액 105㎕과 물 2㎖을 혼합, 교반하여, 그 230nm에 있어서의 흡광도(AT)를 측정한다. 대조군으로서, 분해 활성 측정용 피검액 대신에, 피검액에 사용하고 있는 완충액만을 이용하여 같은 조건으로 반응시킨 것 및 푸코스 황산 함유 다당-U 용액 대신에 물만을 이용하여 반응을 수행한 것을 준비하여, 각각 같은 식으로 흡광도를 측정한다(AB1 및 AB2).

1단위의 효소는 상기 반응계에 있어서 1분 동안에 1μmo1의 만노오스와 우론산 사이의 글리코시드 결합을 탈리적으로 절단하는 효소량으로 한다. 절단된 결합의 정량은 탈리 반응시에 생긴 불포화 우론산의 밀리몰 분자 흡광 계수를 5.5로서 계산하여 수행한다. 또, 효소의 활성은 하기 식에 따라서 산출하였다.

(AT-AB1-AB2)×2.105×120/5.5×105×0.01×180= U/㎖

식 중,

2.105은 흡광도를 측정하는 샘플의 액량(㎖),

120은 효소 반응액의 액량(㎕),

5.5는 불포화 우론산의 230nm에 있어서의 밀리몰 분자 흡광 계수(/mM),

105는 희석에 이용하는 반응액의 액량(㎕),

0.01은 효소액량(㎖),

180은 반응 시간(분)이다.

참고예 4

(1) 푸코스 황산 함유 다당-F 및 푸코스 황산 함유 다당-U의 분자량을 세파크릴 S-500을 이용한 겔 여과법에 의해 구한 바, 각각 약 19만을 중심으로 한 분자량 분포를 보였다.

(2) 푸코스 황산 함유 다당-U 및 푸코스 황산 함유 다당-F의 각 염화나트륨 농도에 있어 과잉량의 세틸피리디늄 염화물 존재하에서의 침전 형성성을 도 2에 나타낸다.

도 2의 종축은 침전 형성율(%)을 나타내고, 횡축은 염화나트륨 농도(M)를 나타낸다. 도면 중, 실선 및 빈 원은 푸코스 황산 함유 다당-U의 각 염화나트륨 농도에서의 침전 형성율을 나타내고, 도면 중, 점선 및 빈 삼각형은 푸코스 황산 함유 다당-F의 각 염화나트륨 농도(M)에서의 침전 형성율을 나타낸다.

침전 형성율의 측정은 용액 온도 37℃에서, 다음과 같이 수행하였다.

푸코스 황산 함유 다당-U 및 푸코스 황산 함유 다당-F를 각각 2%의 농도로 물 및 4M의 염화나트륨에 용해하여, 이들을 여러 가지 비율로 혼합함으로써 여러 가지 농도의 염화나트륨에 용해한 푸코스 황산 함유 다당-U 및 푸코스 황산 함유 다당-F 용액을 각각 125㎕씩 조제하였다. 이어서, 세틸피리디늄 염화물을 2.5%의 농도로 물 및 4M의 염화나트륨에 용해하여, 이들을 혼합함으로써 여러 가지 농도의 염화나트륨에 용해한 1.25%의 세틸피리디늄 염화물 용액을 조제하였다.

물에 용해하고 있는 2%의 푸코스 황산 함유 다당-U 및 푸코스 황산 함유 다당-F를 1.25%의 세틸피리디늄 염화물로 완전히 침전시키기 위해서는 용량으로 3.2배 필요하였다. 그래서, 각 농도의 염화나트륨에 용해한 2%의 푸코스 황산 함유 다당-U 및 푸코스 황산 함유 다당-F 각 125㎕에 대하여 각 농도의 염화나트륨에 용해한 세틸피리디늄 염화물 용액을 400㎕ 첨가후, 충분히 교반하여, 30분 방치한 후, 원심 분리하여 상청액 중의 당 함량을 페놀-황산법[아날리티컬 케미스트리(Analyical Chemistry), 제28권, 제350쪽(1956)]에 의해 측정하여, 각 염화나트륨 농도하에서의 각 푸코스 황산 함유 다당의 침전 형성율을 산출하였다.

(3) 푸코스 황산 함유 다당-F의 성분을 이하에 나타내는 방법으로 분석하였다.

우선, 저널 오브 바이오로지컬 케미스트리[Journal of Biological Chemistry, 제175권, 제595쪽(1948)]의 기재에 따라서 푸코스량을 정량하였다.

푸코스 황산 함유 다당-F의 건조 샘플을 1N 염산에 0.5%의 농도로 용해하여, 110℃에서 2시간 처리하여, 구성 단당으로 가수 분해하였다. 글라이코탁 (GlycoTAG^TM) 및 글라이코닥 리젠트 키트(GlycoTAG^TM Reagent Kit)(모두 다카라츠죠사 제조)를 이용하여 가수 분해하여 얻어진 단당의 환원성 말단을 피리딜-(2)-아미노화(PA화)하여, HPLC에 의해 구성 당의 비율을 조사하였다.

이어서, 아날리티컬 바이오케미스트리(Analytical Biochemistry), 제4권, 제330쪽(1962)의 기재에 따라서 우론산의 양을 정량하였다.

또한, 바이오케미컬 저널(Biochemical Journal), 제84권, 제106쪽(1962)의 기재에 따라서 황산 함량을 정량하였다.

이 푸코스 황산 함유 다당-F의 구성 당은 푸코스, 갈락토오스이며, 그 몰비는 약 10:1였다. 우론산 및 기타의 중성당은 실질적으로 함유되어 있지 않았다. 또한, 푸코스와 황산기의 몰비는 약 1:2였다.

푸코스 황산 함유 다당-U의 성분을 상기 방법에 준하여 측정하였다. 그 결과, 푸코스 황산 함유 다당-U의 구성 당은 푸코스, 만노오스, 갈락토오스, 글루코스, 람노오스, 크실로스, 우론산이었다. 그 밖의 중성당은 실질적으로 함유되어 있지 않았다. 또한, 주요 성분인 푸코스:만노오스:갈락토오스:우론산:황산기는 몰비로 약 10:7:4:5:20이었다.

(4) 이 푸코스 황산 함유 다당-F의 동결 건조물의 비선광도를 고속·고감도 선광계 SEPA-300(호리바세이사쿠쇼 제조)에 의해 측정한 바, -135도였다.

또한 푸코스 황산 함유 다당-U의 비선광도는 -53.6도였다.

(5) 1%의 푸코스 황산 함유 다당-F 용액 16㎖과, 50mM의 인산 완충액(pH8.0) 12㎖과 4M의 염화나트륨 4㎖과 32mU/㎖의 하기 참고예 5에 기재한 엔도형 푸코이단 분해 효소 용액 8㎖을 혼합하여, 25℃에서 48시간 반응시켰다. 반응에 의한 분해물의 생성은 확인되지 않았다.

상기 조건으로 푸코스 황산 함유 다당-U와 참고예 5에 기재한 푸코이단 분해 효소를 25℃에서 48시간 반응시켰다. 반응의 진행과 함께 230nm의 흡광도가 증가하는 것을 확인하여, 본 효소에 의해 푸코스 황산 함유 다당-U가 분해되고 있는 것이 판명되었다.

참고예 5

참고예 4에 기재한 푸코이단 분해 효소는 이하의 방법에 의해 조제된다. 상기 푸코이단 분해 효소의 생산에 이용하는 균주로서는 상기 효소 생산 능력을 갖는 균주라면 어떠한 균주라도 좋지만, 구체예로서는 예컨대, 플라보박테리움 sp. SA-0082주(FERM BP-5402)를 들 수 있다.

본 균주는 아오모리현의 해수 중에서 새롭게 검색하여 얻은 균주이며, 이 균주는 Flavobacterium sp. SA-0082로 표시되어, 1995년 3월 29일(원 기탁일)부터, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 FERM BP-5402의 수탁 번호로 국제 기탁되어 있다.

본 균주의 배지에 가하는 영양원은 사용하는 균주가 이용하여, 푸코이단 분해 효소를 생산하는 것이면 좋으며, 탄소원으로서는 예컨대 푸코이단, 해조 분말, 알긴산, 푸코스, 글루코스, 만니톨, 글리세롤, 사카로스, 말토스, 락토스, 전분 등을 이용할 수 있고, 질소원으로서는 효모 엑기스, 펩톤, 꽃게산, 옥수수 침지액, 육즙, 탈지 대두, 황산암모늄, 염화암모늄 등이 적당하다. 그 밖에 나트륨염, 인산염, 칼륨염, 마그네슘염, 아연염 등의 무기질 및 금속염류를 가하더라도 좋다.

본 푸코이단 분해 효소의 생산균을 배양함에 있어, 생산량은 배양 조건에 따라 변동되지만, 일반적으로 배양 온도는 15℃∼30℃, 배지의 pH는 5∼9가 좋고, 5∼72시간의 통기 교반 배양으로 본 푸코이단 분해 효소의 생산량은 최고에 달한다. 배양 조건은 사용하는 균주, 배지 조성 등에 따라, 본 푸코이단 분해 효소의 생산량이 최대가 되도록 설정하는 것은 당연한 일이다.

본 푸코이단 분해 효소는 균체 중이나 배양물 상청액 중에도 존재한다.

상기 플라보박테리움 sp. SA-0082주를 적당한 배지에서 배양하여, 그 균체를 모아, 통상 이용되는 세포 파괴 수단, 예컨대, 초음파 처리 등으로 균체를 파쇄하면 무세포 추출액를 얻을 수 있다.

이어서, 이 추출액으로부터 통상 이용되는 정제 수단에 의해 정제 효소 샘플을 얻을 수 있다. 예컨대, 염석, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 소수 결합 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 등에 의해 정제를 행하여, 순화된 본 푸코이단 분해 효소를 얻을 수 있다.

또한, 상기 배양액으로부터 균체를 제거한 배양액 상청액 중에도 본 효소(균체외 효소)가 대량으로 존재하기 때문에, 균체내 효소와 같은 정제 수단에 의해 정제할 수 있다.

푸코이단 분해 효소의 정제예를 나타낸다.

플라보박테리움 sp. SA-0082(FERM BP-5402)를 글루코스 0.25%, 펩톤 1.0%, 효모 엑기스 0.05%를 포함하는 인공 해수(쟈마린 레보레이토리 제조) pH7.5로 이루어지는 배지 600㎖를 나누어 넣고 살균한(120℃, 20분) 2 리터의 삼각플라스크에 접종하여, 24℃에서 24시간 배양하여 종배양액으로 하였다. 글루코스 0.25%, 펩톤 1.0%, 효모 엑기스 0.05%, 및 소포제(신에츠가가구고교사 제조, KM70) 0.01%를 포함하는 인공 해수(쟈마린 레보레이토리 제조) pH7.5로 이루어지는 배지 20 리터를 30 리터들이 소형발효기에 넣어 120℃에서 20분 살균하였다. 냉각후, 상기 종배양액 600㎖을 접종하여, 24℃에서 24시간, 매분 10 리터의 통기량과 매분 125 회전의 교반 속도의 조건으로 배양하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체를 얻었다.

이 균체를 200mM의 염화나트륨을 포함하는 20mM의 아세트산-인산 완충액(pH7.5)에 현탁하여, 초음파 파쇄후, 원심 분리하여 균체 추출액을 얻었다. 이 균체 추출액 중의 푸코이단 분해 효소의 활성을 참고예 3에 기재한 방법으로 측정한 바, 배지 1㎖ 중에 5mU의 활성이 검출되었다. 또, 활성 측정에 관하여는 후술한다.

본 추출액에, 최종 농도가 90% 포화가 되도록 황산암모늄을 가하여, 교반 용해한 후, 원심 분리하여, 침전을 상기 균체 추출액과 동일한 완충액으로 현탁하여, 50mM의 염화나트륨을 포함하는 20mM의 아세트산-인산 완충액(pH7.5)으로 충분히 투석하였다. 투석에 의해 생긴 침전을 원심 분리에 의해 제거한 후, 미리 50mM의 염화나트륨을 포함하는 20mM의 아세트산-인산 완충액(pH7.5)으로 평형화한 DEAE-세파로스FF의 컬럼에 흡착시키고, 흡착물을 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 50mM 내 지 600mM의 염화나트륨의 직선 농도 구배에 의해 용출시켜, 활성 분획을 모았다. 이어서, 이 활성 분획에 최종 농도가 4M이 되도록 염화나트륨을 가하여, 미리 4M의 염화나트륨을 포함하는 20mM의 인산 완충액(pH8.0)으로 평형화한 페닐세파로스CL-4B(파마시아사 제조)의 컬럼에 흡착시키고, 흡착물을 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 4M 내지 1M의 염화나트륨의 선형 농도 구배에 의해 용출시켜, 활성 분획을 모았다. 이어서, 이 활성 분획을 한외여과기로 농축한 후, 미리 50mM 염화나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충액으로 평형화한 세파크릴 S-300(파마시아사 제조)로 겔 여과를 하여 활성 분획을 모았다. 이 효소의 분자량을 세파크릴 S-300의 유지 시간으로부터 구한 바 약 46만이었다. 이어서 이 활성 분획에 25mM의 염화나트륨을 포함하는 10mM의 인산 완충액(pH7)으로 투석하였다. 이 효소액을, 미리 250mM의 염화나트륨을 포함하는 10mM의 인산 완충액(pH7)으로 평형화한 모노(Mono) Q HR5/5(파마시아사 제조)의 컬럼에 흡착시켜, 흡착물을 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 250mM에서 450mM의 염화나트륨의 선형 농도 구배에 의해 용출시켜, 활성 분획을 모아, 정제 효소를 얻었다. 이상의 정제 공정을 표 1에 나타낸다. 또, 단백질의 정량은 효소액의 280nm의 흡광도를 측정함으로써 행한다. 그 때 1㎎/㎖의 단백질 용액의 흡광도를 1.0로 하여 계산한다.

공정	총 단백질량(㎎)	총활성(mU)	비활성(mU/㎎)	수율(%)
균체추출액	61,900	101,000	1.63	100
황산암모늄 염석	33,800	88,600	2.62	87.7
DEAE-세파로스FF	2,190	40,400	18.4	40.0
페닐세파로스 CL-4B	48.2	29,000	601	28.7
세파크릴 S-300	7.24	19,600	2,710	19.4
모노 Q	0.824	15,000	18,200	14.9

또한, 하기의 방법에 의해서도 푸코이단 분해 효소를 정제할 수 있다.

플라보박테리움 sp. SA-0082(FERM BP-5402)를 글루코스 0.1%, 펩톤 1.0%, 효모 엑기스 0.05%를 포함하는 인공해수(쟈마린 레보레이토리 제조) pH7.5로 이루어지는 배지 600㎖을 나누어 넣어서 살균한(120℃, 20분) 2 리터의 삼각 플라스크에 접종하여, 24℃에서 20시간 배양하여 종배양액으로 하였다. 가고메 다시마에서 유래하는 푸코이단 0.3%, 펩톤 0.5%, 효모 엑기스 0.01%, 및 소포제(신에츠가가쿠고교 제조 KM70) 0.01%를 포함하는 인공 해수(쟈마린 레보레이토리 제조) pH7.5로 이루어지는 배지 20 리터를 30 리터들이 소형 발효기에 넣어 120℃에서 20분 살균하였다. 냉각한 후, 상기 종배양액 600㎖을 접종하여, 24℃에서 20시간, 매분 10 리터의 통기량과 매분 125 회전의 교반 속도의 조건으로 배양하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체 및 배양액 상청액을 얻었다. 본 배양에서 얻어진 균체를 200mM의 식염을 포함하는 20mM의 아세트산-인산 완충액(pH7.5)에 현탁하여, 초음파 파쇄후, 원심 분리하여 균체 추출액을 얻었다. 이 균체 추출액 중의 푸코이단 분해 효소의 활성을 측정한 바, 배지 1㎖ 중에 20 mU의 활성이 검출되었다.

한편, 이 배양액 상청액을 한외여과(여과막의 배제 분자량 1만)(아미콘사 제 조)로 농축하여, 푸코이단 분해 효소를 측정한 바 배양액 1㎖ 당 6mU의 활성이 검출되었다.

상기 배양액 상청액의 농축액에, 최종 농도가 90% 포화되도록 황산암모늄을 첨가하여, 교반 용해후 원심 분리하여, 침전을 상기 균체 추출액과 동일한 완충액에 현탁하여, 50mM의 식염을 포함하는 20mM의 아세트산-인산 완충액(pH7.5)으로 충분히 투석하였다. 투석에 의해 생긴 침전을 원심 분리에 의해 제거한 후, 미리 50mM의 식염을 포함하는 20mM의 아세트산-인산 완충액(pH7.5)으로 평형화한 DEAE-세파로스FF의 컬럼에 흡착시켜, 흡착물을 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 50mM 내지 600mM의 식염 구배에 의해 용출시켜, 활성 분획을 모았다. 다음에 이 활성 분획에 최종 농도가 4M이 되도록 식염을 가하고, 4M의 식염을 포함하는 20mM의 인산 완충액(pH8.0)으로 미리 평형화한 페닐세파로스 CL-4B의 컬럼에 흡착시켜, 흡착물을 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 4M 내지 1M의 식염 구배에 의해 용출시켜, 활성 분획을 모았다. 이어서 이 활성 분획을 한외여과기(아미콘사 제조)로 농축한 후, 미리 50mM 식염을 포함하는 10mM 인산 완충액으로 평형화한 세파크릴 S-200로 겔 여과를 행하여 활성 분획을 모았다. 이어서 이 활성 분획에 최종 농도가 3.5M이 되도록 식염을 가하고, 3.5M의 식염을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 8)으로 미리 평형화한 페닐세파로스 HP의 컬럼에 흡착시키고, 흡착물을 동 완충액으로 세정한 후, 3.5M 내지 1.5M의 식염 구배에 의해 용출시키고, 활성 분획을 모아 정제 효소를 얻었다. 이 효소의 분자량을 세파크릴 S-200의 유지 시간으로부터 구한 바 약 7만이었다.

실시예 1

(1) 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 생산 균주인 알테로모나스 sp. SN-1009(FERM BP-5747)를 글루코스 0.25%, 펩톤 1.0%, 효모 엑기스 0.05%를 포함하는 인공 해수(쟈마린 레보레이토리사 제조) pH8.0로 이루어지는 배지 500㎖을 나누어 넣어 살균한(120℃, 20분) 2 리터의 삼각 플라스크에 접종하여, 25℃에서 23시간 배양하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체를 모으고, 그 반량의 균체를 10㎖의 추출 완충액〔50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0), 100mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)〕 중에 현탁한 후, 1㎖의 추출 완충액에 용해한 20㎎/㎖의 리소자임 용액을 첨가하여, 빙욕(氷浴) 상에서 30분간 유지하였다. 이어서, 10㎖의 프로테이나제 K 용액〔1㎎/㎖ 프로테이나제 K, 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0), 100mM EDTA, 1% SDS〕를 첨가한 후, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이 후 실온으로 되돌려, 동등한 용량의 TE 완충액〔10mM 트리스 염산 완충액(pH8.0), 1mM EDTA〕포화 페놀을 가하여 1시간 온화하게 교반하여, 10000rpm으로 20분간 원심한 후 상층을 회수하였다(이후 이 조작을 페놀 추출이라 함).

이 상층에, 동일한 양의 TE 완충액 포화 페놀/클로로포름 1:1을 가하여 온화하게 교반하고, 10000rpm에서 20분간 원심한 후 상층을 회수하였다(이후 이 조작을 페놀/클로로포름 추출이라 함). 재차 페놀/클로로포름 추출을 한 후, 수층에 0.1M이 되도록 염화나트륨을 가하고 또 2배량의 에탄올을 가하여 DNA를 석출시켜 유리막대로 권취한 후, 80% 에탄올로 세정하여 가볍게 바람에 말렸다. 이 게놈 DNA를 20㎖의 20㎍/㎖의 리보뉴클레아제 A가 용해된 TE 완충액 중에 용해시켜, 37℃에서 5시간 유지하여 RNA를 분해하였다. 페놀 추출, 페놀/클로로포름 추출후, 전술한 방식으로 에탄올 첨가후 DNA 회수하여, 5㎖의 TE 완충액에 현탁하였다. 이상의 조작에 의해, 게놈 DNA 약 20mg을 얻었다.

(2) 실시예 1-(1)에서 조제한 게놈 DNA 100㎍을 10 유닛의 제한 효소 Sau3AI로 37℃에서 1분 40초 동안 분해하여 부분 분해한 후, 페놀/클로로포름 추출하여 상층을 회수하였다. 상층에 1/10배 용량의 3M 아세트산나트륨 수용액(pH5.0) 및 2.5배 용량의 에탄올을 가하여 DNA를 침전시켜, 원심 분리에 의해 침전물을 회수한 후, 80% 에탄올로 세정하여 바람에 말렸다(이후 이 조작을 에탄올 침전이라 함). 얻어진 부분 분해물을 1.25 내지 5M 염화나트륨 밀도 구배 초원심법에 의해 크기별 분획화하고, 10∼20kbp의 크기를 포함하는 분획으로부터 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다. 얻어진 게놈 DNA 부분 분해물 0.18 ㎍과 노바젠(Novagene)사 제조 람다 블루 스타 BamHI 아암(λ Blue STAR BamHI arm) 0.6 ㎍을 혼합하여, 다카라츠죠사 제조의 DNA 라이게이션 키트를 이용하여 연결시킨 후, 스트라타진(Stratagene)사 제조 기가팩II 골드 키트(GigaPack II Gold kit)를 이용하여 람다 파지에 패키징을 행하여, 알테로모나스 sp. SN-1009의 게놈 DNA 라이브러리를 제작하였다.

(3) 참고예1-(3)에서 얻은 알테로모나스 sp. SN-1009의 정제 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소 단백질 200pmol을, 20mM 탄산수소암모늄으로 평형화한 탈염용의 컬럼(퍼스트 데솔팅 컬럼 PC3.2/10, 파마시아사 제조)에 장입한 후, 동 완충액으로 용출하고, 완충액을 치환하였다. 용출액을 유리 바이알에 모아 농축 건조 고화한 후, 피리딘 10㎕, 4-비닐피리딘 2㎕, 트리-N-부틸포스핀 2㎕, 물 10㎕ 이 장입된 1 사이즈 더 큰 유리 시험관 중에 상기 유리 바이알을 넣고, 유리 시험관을 밀봉한 후, 95℃에서 10분간 반응시켜 피리딜에틸화하였다. 반응 종료후 유리 바이알을 꺼내어, 수회 물과 공비시켜 휘발성 성분을 제거하였다.

얻어진 피리딜에틸화된 푸코스 함유 다당 분해 효소 단백질을 40㎕의 8M 요소를 포함하는 10mM 트리스 염산 완충액(pH9.0), 90㎕의 10mM 트리스 염산 완충액(pH9.0) 및 0.5pmo1의 아크로모박터(Achromobacter) 프로테아제I(다카라츠죠사 제조)을 가하여, 30℃에서 하룻밤 분해하고, 얻어진 분해물로부터 펩티드 단편을 HPLC 시스템(스마트시스템, 파마시아사 제조)으로 정제하였다. 컬럼은 μRPC C2/C18 SC2·1/10(파마시아사 제조)를 이용하고, 100㎕/분의 유속으로 진행시켰다. 용출은 용출액으로서 0.12% 트리플루오로아세트산 수용액(용출액 A) 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴(용출액 B)을 이용하고, 용출액 B의 비율이 0%일 때 샘플을 장입하여, 90분 동안에 용출액 B의 비율을 55%까지 올리는 직선 농도 구배법으로 용출하여, 분리 정제하였다. 각 펩티드 분획에 관해서 아미노산 서열 분석을 하여, 부분 아미노산 서열 F27(서열 번호 9), F34(서열 번호 10), F47(서열 번호 11), F52(서열 번호 12)를 결정하였다.

(4) 실시예 1-(1)에서 조제한 게놈 DNA 20㎍을 제한 효소 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, SacI, SalI, SphI 및 XbaI 각 100 유닛으로 각각 37℃에서 4시간 분해한 후, 페놀/클로로포름 추출하였다. 분해물을 에탄올 침전에 의해 회수하여, 각 10㎍을 다시 동일한 제한 효소 50 유닛으로 각각 37℃에서 16시간 분해한 후, 페놀/클로로포름 추출하여, 에탄올 침전에 의해 분해물을 회수하였다. 이 분해물 각 5㎍을 0.8% 아가로스겔 전기 영동에 제공하여, 서던 블로트법(문헌 : 유전자연구법II, 제218∼221쪽, 동경화학동인)에 의해, 아마샴사 제조의 나일론막〔상품명 하이본드N+(Hybond-N+)〕에 DNA를 전사하였다.

하이브리드화의 프로브로서는 실시예 1-(3)에서 결정한 부분 아미노산 서열 F27(서열 번호 9)로부터 혼합 올리고뉴클레오티드 pFDA27(서열 번호13)을 합성하여 이용하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 20pmo1를 메가라벨 키트(MEGALABEL KIT, 다카라츠죠사 제조)를 이용하여 ³²P로 표지하였다.

상기 조제한 필터를 6×SSC, 1% SDS, 100㎍/㎖의 연어 정자 DNA, 5×덴하르츠를 포함하는 용액 중, 65℃에서 3시간 예비 하이브리드화를 행한 후, 표지 프로브를 0.5pmol/㎖의 농도가 되도록 가하여, 42℃에서 하룻밤 하이브리드화를 행하였다. 하이브리드화 종료후, 우선 6×SSC 중 실온에서 10분간, 1×SSC, 0.1% SDS 중 실온에서 10분간, 1×SSC, 0.1% SDS 중, 42℃에서 30분간 세정하여, 여분의 수분을 제외시킨 후, 후지필름사 제조의 이미징 플레이트에 30분간 노광한 후, 후지필름사 제조 BAS2000 이미징 분석기로 검출하였다.

그 결과, BamHI, EcoRI 및 SalI 분해물로 23kbp 이상의 위치, HindIII 분해물로 약 4.8, 1.4 및 0.3kbp의 위치, PstI 분해물로 23kbp 이상 및 3.6kbp의 위치, SacI 분해물로 23kbp 이상 및 9.8kbp의 위치, SphI 분해물로 23kbp 이상, 4.9kbp 및 3.0kbp의 위치, XbaI 분해물로 약 12, 5.2 및 3.5kbp의 위치에, 각각 프로브와 하이브리드하는 밴드가 확인되었다.

실시예 1-(2)에서 조제한 알테로모나스 sp. SN-1009의 게놈 DNA 라이브러리로부터 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소 유전자를 포함하는 클론을, 노바젠사의 람다 블루 스타 취급 설명서에 따라서, 플라크 하이브리드화법에 의해 스크리닝하였다. 우선, 파지 라이브러리를 대장균 ER1647에 감염시키고, 직경 8.5cm의 L 배지 플레이트 4장에, 1장당 약 500개의 플라크를 형성시켰다. 이 플레이트에 아머샴사 제조의 나일론막〔상품명 하이본드N+〕을 1장째는 약 30초간, 2장째는 약 2분간 접촉시켜, 각 플레이트 2장씩 파지를 전사시켰다. 이 나일론막을 0.5M 수산화나트륨, 1.5M 염화나트륨의 용액에 침지한 여과지 상에서 5분간 변성 처리하고, 이어서, 0.5M 트리스 염산 완충액(pH7.0), 3M 염화나트륨의 용액에 침지한 여과지 상에서 5분간 중화 처리한 후, 2×SSC로 세정하였다. 이 나일론막과 합성 올리고뉴클레오티드 pFDA27(서열 번호 13)을 전술한 서던 하이브리드화와 동일한 조건으로 하이브리드화, 세정, 검출한 바, 18개의 양성 시그널을 얻을 수 있었다. 원래의 플레이트로부터 양성 시그널 부근의 플라크를 취하여, SM 완충액에 현탁하고, 재차, 새로운 플레이트에 플라크를 형성시켜, 같은 조작을 반복함으로써 14개의 양성 시그널을 부여하는 파지를 단리하였다.

노바젠사의 람다 블루 스타 취급 설명서에 따라서, 얻어진 각 파지를 대장균 BM25.8에 감염시킨 후 암피실린 내성의 콜로니를 선택하여, 파지를 플라스미드의 형태로 변환하였다. 얻어진 각 클론의 콜로니를 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화나트륨)에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양한 배양액으로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 조제하였다. 이 플라스미드 DNA를 이용하여, 대장균 JM109(다카라츠죠사 제조)를 형질전환하고, 얻어진 각 클론의 콜로니를 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양한 배양액으로부터 알칼리 용균법에 의해 재차 플라스미드 DNA를 조제하였다. 얻어진 각 클론의 플라스미드를 각각 pSFDA1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16 및 pSFDA17이라 명명하였다.

각 플라스미드를 각각, 람다 블루 스타 벡터의 클로닝 부위의 양단에 있는 제한 효소 NotI로 분해하여, 0.3% 아가로스겔 전기 영동에 의해 해석한 바, 8.4∼17.4kbp의 단편이 삽입되어 있는 것이 분명하게 되었다. 또한, 각 플라스미드를 각각 제한 효소 HindIII로 분해하여, 전술한 바와 같이 서던 블로팅후, 합성 올리고뉴클레오티드 pFDA27(서열 번호 13)에 의해 하이브리드화를 행하고 해석을 한 바, 약 4.8kbp의 밴드를 부여하는 것(pSFDA1 및 pSFDA17), 약 4.8 및 0.3kbp의 밴드를 부여하는 것(pSFDA5, 6, 7, 11 및 pSFDA13), 약 1.4kbp의 밴드를 부여하는 것(pSFDA10), 약 0.3kbp의 밴드와 그 이외 크기의 밴드를 부여하는 것(pSFDA2 및 pSFDA14), 약 4.8kbp의 밴드와 그 이외 크기의 밴드를 부여하는 것(pSFDA16), 5.0kbp 이상의 크기의 밴드를 부여하는 것(pSFDA4,8 및 pSFDA12)의 6개의 그룹으로 나누어졌다. 그러나, 약 1.4kbp의 밴드를 부여하는 pSFDA10 이외는 아가로스겔 전기 영동의 에티디움 브로마이드 염색으로 각각 매우 유사한 크기의 밴드가 복수 검출되는 점에서, 각 플라스미드에는 거의 같은 위치의 게놈 DNA에서, 약 4.8 및 0.3kbp의 HindIII 단편 혹은 어느 한쪽, 또는 그 일부가 삽입되어 있다고 추정되었다. 또한, 이 pFDA27과 하이브리드하는 약 4.8 및 0.3kbp의 HindIII 단편은 게놈 상의 매우 근접한 부분에 있다고 추측되었다. 따라서, 얻어진 14개의 플라스미드는 약 1.4kbp의 밴드를 부여하는 pSFDA10과 그 이외의 플라스미드로 크게 그룹으로 나뉘어, 게놈 DNA HindIII 분해물의 서던 하이브리드화로 검출된 약 4.8, 1.4 및 0.3kbp 중 어느 것, 혹은 약 4.8 및 0.3kbp의 양자를 갖는 것을 추측할 수 있었다. 얻어진 플라스미드 중에서, 약 10.2kbp의 삽입 단편을 갖고, 약 4.8 및 0.3kbp 양자의 HindIII 단편을 포함하는 pSFDA7 및 약 8.4kbp의 삽입 단편을 갖고, 약 1.4kbp의 HindIII 단편을 포함하는 pSFDA10에 대해서, 여러 종류의 제한 효소로 분해한 후 아가로스겔 전기 영동으로 분석하여 제한 효소 지도를 제작함과 동시에, 합성 올리고뉴클레오티드 pFDA27과 하이브리드한 영역을 플라스미드 pUC119 등에 서브 클로닝한 후, 디데옥시법에 의해서 염기 서열을 해석하였다. pSFDA10의 약 1.4kbp의 HindIII 단편 중에서는 pFDA27의 17 염기중 14 염기가 일치하는 서열이 발견되었지만, F27의 아미노산 서열을 암호화하는 서열과는 일치하지 않는 점에서, 이 단편은 pFDA27과 하이브리드하지만, 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소 유전자와는 관계없는 단편으로 생각되었다. 한편, pSFDA7의 약 4.8 및 0.3kbp 양자의 HindIII 단편 중에서, pFDA27의 하나의 서열과 완전히 일치하고, 주위의 서열도 포함시켜 실시예 1-(3)에서 결정한 부분 아미노산 서열 F27 (서열 번호 9)에 일치하는 아미노산을 암호화하는 서열이 발견되었다.

또, 이 약 4.8kbp와 0.3kbp의 HindIII 단편은 제한 효소 지도 상에서 약 3kbp 이상 떨어져 있으며, 참고예 1-(3)에 기재한 알테로모나스 sp. SN-1009로부터 정제된 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 겔 여과법으로 측정되는 분자량 약 10만으로부터 예상되는 상기 효소 유전자의 크기보다 크다는 점에서, 적어도 2종류의 유사한 유전자가 있는 것을 예상할 수 있었다.

pSFDA7을 도입한 대장균 JM109주를 대장균 JM109/pSFDA7이라 표시한다. 또한, pSFDA7을 도입한 대장균 JM109주는 Escherichia coli JM109/pSFDA7이라 표시되며, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 1997년 8월 1일부터 FERM P-16362로서 기탁되고, 상기 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 FERM BP-6340 (국제 기탁으로의 이관 청구일: 1998년 5월 6일)으로서 국제 기탁되어 있다.

pSFDA7에 대해서, 다시 프라이머 신장법을 이용한 디데옥시법에 의해서 상세하게 염기 서열을 해석하고, pSFDA7의 10.2kbp의 삽입 단편 중, 8.3kbp의 염기 서열을 결정한 바, 2646 염기(종지 코돈을 포함함)의 판독 프레임1(이후, ORF-1이라 함)과 2445 염기(종지 코돈을 포함함)의 판독 프레임2(이후, ORF-2라 함)라 칭하는 2개의 판독 프레임이 발견되었다. 게놈 DNA HindIII 분해물의 서던 하이브리드화로 검출된 약 0.3 및 4.8kbp의 HindIII 단편은 정확하게는 각각 140 및 4549 염기쌍의 길이로, 각각 ORF-1 및 ORF-2의 일부 혹은 전체 길이를 포함하고 있었다. ORF-2가 암호화하는 아미노산 서열 중에, 실시예 1-(3)에서 결정한 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소 부분 아미노산 서열 F27(서열 번호 9)과 일치하는 서열 이외에, 부분 아미노산 서열 F34(서열 번호 10), F47(서열 번호 11) 및 F52(서열 번호 12)와 매우 상동성이 높은 서열이 발견되었다. 따라서, ORF-2는 알테로모나스 sp. SN-1009의 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 실질적으로 암호화하는 것으로 생각된다. 한편, ORF-1이 암호화하는 아미노산 서열 중에도, 실시예 1-(3)에서 결정한 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소 부분 아미노산 서열 F27(서열 번호 9)과 일치하는 서열 이외에, 부분 아미노산 서열 F34(서열 번호 10) 및 F52(서열 번호 12)와 상동성이 높은 서열이 발견되었지만, 부분 아미노산 서열 F47(서열 번호 11)에 높은 상동성을 보이는 서열은 발견되지 않았다. ORF-1과 ORF-2가 암호화하는 아미노산 서열을 비교하면, ORF-1의 N 말단 부근에 ORF-2에는 없는 67 아미노산 잔기의 삽입 서열이 있고, 삽입 서열 이후의 아미노산 서열은 70% 이상으로 매우 높은 상동성을 보이는 점에서 ORF-1도 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호하고 있다고 생각되었다. 이상과 같은 식으로, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호한다고 생각되는 유전자(ORF-2) 및 그 유전자와 매우 높은 상동성을 보이는, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는다고 생각되는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 유전자(ORF-1)의 전체 염기 서열이 결정되었다.

그 결과를 도 1에 도시한다. 즉, 도 1은 ORF-1과 ORF-2의 위치를 도시한 도면이다. 도면 중 검은 화살표는 ORF-1의 암호 영역 및 방향을, 도면 중 사선의 화살표는 ORF-2의 암호 영역 및 방향을 각각 나타낸다. 또한, ORF-1의 염기 서열을 서열 목록의 서열 번호 6에, ORF-1이 암호화하는 아미노산 서열을 서열 목록의 서열 번호 2에 나타낸다. 더욱이 ORF-2의 염기 서열을 서열 목록의 서열 번호 5에, ORF-2가 암호화하는 아미노산 서열을 서열 목록의 서열 번호 1에 나타낸다.

이상, 본 발명에 의해 실질적으로 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 암호화하는 것으로 생각되는 유전자(ORF-2) 및 그 유전자에 상동성을 보이고, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 것으로 생각되는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 생각되는 유전자(ORF-1)가 단리, 정제되었다.

실시예 2

실시예 1에서 얻은, 실질적으로 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소를 암호화하는 것으로 생각되는 유전자(ORF-2)의 직접 발현 벡터를 구축하기 위해서, ORF-2의 개시 코돈을 발현 벡터 상의 최적화된 개시 코돈과 일치시켜, ORF-2의 5' 영역의 일부를 삽입한 플라스미드 pEFDA-N을 구축하였다.

우선, 합성 DNA, FDA-N1(서열 번호 14) 및 FDA-N2(서열 번호 15)를 합성하였다. FDA-N1은 서열 목록의 서열 번호 5의 염기 서열 번호 1-13의 서열을 포함하는 15 mer의 합성 DNA이며, FDA-N2는 서열 목록의 서열 번호 5의 염기 서열 번호 4-13의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 15 mer의 합성 DNA이다.

이들 합성 DNA를 0.2M 트리스 염산 완충액(pH7.5), 0.3M 염화나트륨을 포함하는 용액 중에서, 70℃에서 10분간 유지후, 실온까지 서서히 냉각하여 2본쇄를 형성시켜, 합성 DNA 링커 FDA-N을 조제하였다. 얻어진 FDA-N은 서열 목록의 서열 번호 5의 염기 서열 번호 8-13에 있는 SnaBI 부위를 포함하며, 개시 코돈 부분에서 NcoI 부위와, SnaBI 부위의 바로 하류에서 BamHI 부위와 연결 가능한 합성 DNA 링커이다.

한편, T7 프로모터를 사용한 발현 벡터인 pET21d〔노바젠사 제조〕를, T7 프로모터 하류에서 발현을 위해 최적화된 개시 코돈을 포함하는 NcoI 부위와, 다중클로닝 부위 내에 있는 BamHI 부위에서 절단하였다. 이 분해물과, 먼저 조제한 합성 DNA 링커 FDA-N을 DNA 라이게이션 키트(다카라츠죠사 제조)를 이용하여 연결한 후, 대장균 JM109를 형질전환하여, 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지 플레이트 상에서 생육하는 콜로니를 선택하였다. 각 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지에 접종하여, 37℃ 밤새 배양한 후, 배양 균체로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 조제하였다. 플라스미드 DNA를 SnaBI 분해한 후 1% 아가로스겔 전기 영동을 행하여, SnaBI로 절단 가능한 플라스미드를 선택하고, 또한 디데옥시법에 의한 삽입 단편의 염기 서열을 확인하여, pET21d의 NcoI-BamHI 부위 사이에 ORF-2의 개시 코돈에서 SnaBI 부위까지의 영역이 삽입된 플라스미드 pEFDA-N을 얻었다.

이어서, 실시예 1에서 얻어진 플라스미드 pSFDA7 약 5㎍을 30 유닛의 SnaBI로 37℃, 2시간 분해한 후, 1% 아가로스겔 전기 영동에 의해 분리하여, ORF-2의 거의 전체 길이의 영역을 포함하는 약 2.5kbp의 SnaBI 단편을 잘라내어 추출 정제하였다. 이 SnaBI 단편을 앞서 구축한 플라스미드 pEFDA-N의 SnaBI 분해물과 혼합하고, DNA 라이게이션 키트를 이용하여 연결한 후, 대장균 JMl09를 형질전환하여, 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지 플레이트 상에서 생육하는 콜로니를 선택하였다. 앞과 같은 식으로 플라스미드 DNA를 조제하여, SnaBI 분해한 후 1% 아가로스겔 전기 영동을 행하여, 2.5kbp의 SnaBI 단편이 유리하는 플라스미드를 선택하였다. 더욱이 디데옥시법으로 삽입 단편의 방향을 확인하여, ORF-2가 T7 프로모터와 같은 방향으로 삽입되어 있는 플라스미드를 선택하였다. 이렇게 해서 얻은 pET21d의 NcoI 부위에 있는 개시 코돈으로부터 ORF-2의 전체 길이가 삽입되어 있는 발현 플라스미드를 pEFDAII103이라 명명하였다.

이렇게 해서 얻어진 pEFDAII103을 이용하여 대장균 BL21(DE3)주(노바젠사 제조)를 형질전환하였다. 얻어진 대장균 BL21(DE3)/pEFDAII103을 100㎍/㎖의 암피실린 및 5mM의 염화칼슘을 포함하는 5㎖의 L 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하고, 탁도가 O.D.600=0.8의 단계에서, 최종 농도 1mM이 되도록 IPTG을 첨가한 후, 배양 온도를 15℃로 하여 다시 하룻밤 진탕 배양을 하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체를 모으고, 세포 파쇄용 완충액〔20mM 트리스 염산 완충액(pH7.5), 10mM 염화칼슘, 10mM 염화칼륨, 0.3M 염화나트륨〕1㎖에 현탁하고, 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄하였다. 이것을 원심 분리하여 상청액을 회수하여, 대장균 추출액으로 하였다.

대조군으로서, pET21d로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pET21d에 관해서 동시에 같은 조건으로 배양을 하여, 대장균 추출액을 조제하여, 이하의 분석에 이용하였다.

우선, 대장균 추출액을 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 분석한 결과, 대장균 BL21(DE3)/pEFDAII103의 추출액 중에, 대장균 BL21(DE3)/pET21d의 추출액에서는 보이지 않는 분자량 약 9만의 밴드가 관찰되었다. 이 분자량은 서열 목록의 서열 번호 1에 나타낸 ORF-2가 암호화할 수 있는 아미노산 서열로부터 계산되는 폴리펩티드의 분자량 88210과 잘 일치하는 동시에, 알테로모나스 sp. SN-1009로부터 정제된 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 분석한 분자량 약 9만과 일치한다. 이상과 같이, 대장균 BL21(DE3)/pEFDAII103이 ORF-2가 암호화하는 폴리펩티드를 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

이어서, 대장균 추출액의 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 참고예 2에 기재한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 대장균 BL21(DE3)/pEFDAII103의 추출액 중에서, 520mU/㎖의 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성이 검출되었다. 즉, ORF-2가 암호화하는 폴리펩티드는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지고, 본 발명의 유전자를 갖는 대장균 BL21(DE3)/pEFDAII103의 배양액 1㎖ 중에 약 104mU의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 ORF-2가 암호화하는 폴리펩티드가 생산되고 있던 것을 알 수 있었다.

한편, 대장균 BL21(DE3)/pET21d의 추출액으로부터는 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성은 전혀 검출되지 않았다.

실시예 3

ORF-1 및 ORF-2의 개시 코돈으로부터 15 염기까지의 서열은 완전히 일치하며, 그 영역 내에 제한 효소 SnaBI 부위가 있다. 즉, 실시예 2에서 구축한 플라스미드 pEFDA-N 중의 삽입 서열은 ORF-1과 ORF-2로 완전히 동일하기 때문에, 이 pEFDA-N을 ORF-1의 발현 벡터의 구축에 이용할 수 있다.

우선, 실시예 1에서 얻어진 플라스미드 pSFDA7 약 5㎍을 30 유닛의 SnaBI로 37℃, 2시간 분해한 후, 1% 아가로스겔 전기 영동에 의해 분리하여, ORF-1의 거의 전체 길이의 영역을 포함하는 약 3.2kbp의 SnaBI 단편을 절취하여 추출 정제하였 다. 이 SnaBI 단편을 플라스미드 pEFDA-N의 SnaBI 분해물과 섞어, DNA 라이게이션 키트를 이용하여 연결한 후, 대장균 JM109를 형질전환하여, 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지 플레이트 상에서 생육하는 콜로니를 선택하였다.

실시예 2와 같은 식으로 플라스미드 DNA를 조제하여, SnaBI 분해한 후 1% 아가로스겔 전기 영동을 행하여, 3.2kbp의 SnaBI 단편이 유리하는 플라스미드를 선택하였다. 더욱이 디데옥시법에 의한 삽입 단편의 방향을 확인하여, ORF-1이 T7 프로모터와 같은 방향으로 삽입되어 있는 플라스미드를 선택하였다. 이렇게 해서 얻어진, pET21d의 NcoI 부위에 있는 개시 코돈으로부터 ORF-1의 전체 길이가 삽입되어 있는 발현 플라스미드를 pEFDAI103이라 명명하였다.

이렇게 해서 얻어진 pEFDAI103을 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 ORF-1이 암호화하는 폴리펩티드의 발현과 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 확인하였다.

즉, 우선 대장균 BL21(DE3)주를 pEFDAI103을 이용하여 형질전환하였다. 얻어진 대장균 BL21(DE3)/pEFDAI103을 100㎍/㎖의 암피실린 및 5mM의 염화칼슘을 포함하는 5㎖의 L 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하여, 탁도가 O.D.600=0.8인 단계에서, 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG를 가한 후, 배양 온도를 15℃로 하여 다시 하룻밤 진탕 배양하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체를 모아, 세포 파쇄용 완충액 1㎖에 현탁하고, 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄하였다. 이것을 원심 분리하여 상청액을 회수하여, 대장균 추출액으로 하였다.

대장균 추출액을 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 분석한 결과, 대장 균 BL21(DE3)/pEFDAI103의 추출액 중에, 대장균 BL21(DE3)/pET21d의 추출액에서는 보이지 않는 분자량 약 10만의 밴드가 관찰되었다. 이 분자량은 서열 목록의 서열 번호 2에 나타낸 ORF-1이 암호할 수 있는 아미노산 서열로부터 계산되는 폴리펩티드의 분자량 94910과 잘 일치하며, 대장균 BL21(DE3)/pEFDAI103이 ORF-1이 암호화하는 폴리펩티드를 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

이어서, 대장균 추출액의 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 참고예 2에 기재한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 대장균 BL21(DE3)/pEFDAI103의 추출액으로부터 35.8mU/㎖의 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성이 검출되었다. 즉, ORF-1이 암호화하는 폴리펩티드는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 지니고, 본 발명의 유전자를 갖는 대장균 BL21(DE3)/pEFDAI103의 배양액 1㎖ 중에, 약 7.2mU의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 ORF-1을 암호화하는 폴리펩티드가 생산되고 있던 것을 알 수 있다.

한편, 대장균 BL21(DE3)/pET21d의 추출액으로부터는 엔도형 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성은 전혀 검출되지 않았다.

실시예 4

(1) 푸코이단 분해 효소의 생산 균주인 플라보박테리움 sp. SA-0082(FERM BP-5402)를 글루코스 0.25%, 펩톤 1.0%, 효모 엑기스 0.05%를 포함하는 인공 해수(쟈마린 레보레이토리사 제조) pH8.0로 이루어지는 배지 500㎖을 나누어 넣어 살균한(120℃, 20분) 2 리터의 삼각 플라스크에 접종하여, 25℃에서 23시간 배양하였 다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체를 모으고, 그 반량의 균체를 10㎖의 추출 완충액〔50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0), 100mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)〕 중에 현탁한 후, 1㎖의 추출 완충액에 용해한 20㎎/㎖의 리소자임 용액을 첨가하여, 빙욕 상에서 30분간 유지하였다. 계속해서, 10㎖의 프로테이나제 K 용액〔1mg/㎖ 프로테이나제 K, 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0), 100mM EDTA, 1% SDS〕를 첨가한 후, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이 후 실온으로 되돌려, 동등 용량의 TE 완충액〔10mM 트리스 염산 완충액(pH8.0), 1mM EDTA〕 포화 페놀을 가하여 1시간 온화하게 교반하고, 10000rpm으로 20분간 원심한 후 상층을 회수하였다. 이 상층에, 동등 용량의 TE 완충액 포화 페놀/클로로포름 1:1을 가하여 온화하게 교반하고, 10000rpm으로 20분간 원심한 후 상층을 회수하였다. 재차 페놀/클로로포름 추출한 후, 수층에 0.1M이 되도록 염화나트륨을 가하고 또 2배량의 에탄올을 가하여 DNA를 석출시켜 유리 막대로 권취한 후, 80% 에탄올로 세정하여 가볍게 바람에 말렸다. 이 게놈 DNA를 20㎖의 20㎍/㎖의 리보뉴클레아제 A가 용해된 TE 완충액 중에 용해시켜, 37℃에서 5시간 유지하여 RNA를 분해하였다. 페놀 추출, 페놀/클로로포름 추출후, 앞과 같은 식으로 에탄올 첨가후 DNA 회수하여, 5㎖의 TE 완충액에 현탁하였다. 이상의 조작에 의해, 게놈 DNA 약 20mg을 얻었다.

(2) 실시예 4-(1)에서 조제한 게놈 DNA 100㎍을 10 유닛의 제한 효소 Sau3AI로 37℃에서 1분 40초간 분해하여 부분 분해시키고, 페놀/클로로포름 추출하여 상층을 회수하였다. 상층에 1/10배 용량의 3M 아세트산나트륨 수용액(pH5.0) 및 2.5배 용량의 에탄올을 가하여 DNA를 침전시켜, 원심 분리에 의해 침전을 회수한 후, 80% 에탄올로 세정하여 바람에 말렸다. 얻어진 부분 분해물을 1.25∼5 M 염화나트륨 밀도 구배 초원심법에 의해 크기 분획을 행하여, 10∼20 kbp의 크기를 포함하는 분획으로부터 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다. 얻어진 게놈 DNA 부분 분해물 0.2㎍과 노바젠사 제조 람다 블루 스타 BamHI 아암 0.6㎍을 섞어, 다카라츠죠사 제품인 DNA 라이게이션 키트를 이용하여 연결시킨 후, 스트라타진사 제품인 기가팩II 골드 키트를 이용하여 람다 파지에 패키징을 행하여, 플라보박테리움 sp. SA-0082의 게놈 DNA 라이브러리를 제작하였다.

*(3) 참고예 5와 같은 식으로 얻은 플라보박테리움 sp. SA-0082의 정제 푸코이단 분해 효소 단백질 200pmo1을, 20mM 탄산수소암모늄으로 평형화한 탈염용의 컬럼(퍼스트 데솔팅 컬럼 PC3.2/10, 파마시아사 제조)에 장입한 후, 동 완충액으로 용출하고, 완충액을 치환하였다. 용출액을 유리 바이알에 모아 농축, 건조 고체화한 후, 피리딘 10㎕, 4-비닐피리딘 2㎕, 트리-N-부틸포스핀 2㎕, 물 10㎕를 장입한 1 사이즈 더 큰 유리 시험관 중에 상기 유리 바이알을 넣고, 유리 시험관을 봉관한 후, 95℃에서 10분간 반응시켜 피리딜에틸화하였다. 반응 종료후 유리 바이알을 꺼내어, 수회 물과 공비시켜 휘발성 성분을 제외하였다.

얻어진 피리딜에틸화된 푸코이단 분해 효소 단백질을 40㎕의 8M 요소를 포함하는 10mM 트리스 염산 완충액(pH9.0), 90㎕의 10mM 트리스 염산 완충액(pH9.0) 및 0.5pmo1의 아크로모박터 프로테아제I(다카라츠죠사 제조)을 가하여, 30℃에서 하룻밤 분해하고, 얻어진 분해물로부터 펩티드 단편을 HPLC 시스템(스마트시스템, 파마 시아사 제조)으로 정제하였다. 컬럼은 μRPC C2/C18 SC2.1/10(파마시아사 제조)를 이용하여, 100㎕/min의 유속으로 진행시켰다. 용출은 용출액으로서 O.12% 트리플루오로아세트산 수용액(용출액 A) 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세트니트릴(용출액 B)을 이용하여, 용출액 B의 비율이 0%일 때 샘플을 장입하여, 80분 내에 용출액 B의 비율을 55%까지 올리는 선형 농도 구배법으로 용출하고, 용출액 B의 비율이 27% 이상일 때 용출되는 피크로서 용출 분획 L27, L31 및 L36 등을 얻었다. 또한, 분리가 좋지 않았던 용출액 B의 비율이 17∼27%인 분획을 모아, 농축하여, 동일한 HPLC 시스템에 첨가한 후, 용출 패턴을 87분 내에 용출액 B의 비율을 15%에서 40%까지 올리는 선형 농도 구배로 용출하여, 용출 분획 LR8, LR9, LR14 및 LR16 등을 얻었다. 얻어진 각 펩티드 분획에 관해서 아미노산 서열 분석을 행하여, 부분 아미노산 서열 L27(서열 번호 16), L36(서열 번호 17), LR9(서열 번호 18), LR14(서열 번호 19) 및 LR16(서열 번호 20)을 결정하였다.

(4) 실시예 4-(1)에서 조제한 게놈 DNA 2.4㎍을 제한 효소 EcoRI, HindIII, MunI, SpeI, XbaI 및 Sau3AI 각 30 유닛으로 각각 37℃에서 3시간 분해한 후, 페놀/클로로포름 추출하였다. 분해물을 에탄올 침전에 의해 회수하였다. 이 각 분해물 약 0.5㎍을, EcoRI 및 MunI 분해물에는 EcoRI 카세트, HindIII 분해물에는 HindIII 카세트, SpeI 및 XbaI 분해물에는 XbaI 카세트 및 Sau3AI 분해물에는 Sau3AI 카세트(각 카세트 DNA는 모두 다카라츠죠사 제조) 각 20ng(Sau3AI 카세트는 200ng)과 혼합한 후, 다카라츠죠사 제품인 DNA 라이게이션 키트를 이용하여 연결시켰다. 반응물을 에탄올 침전에 의해 회수하여 10㎕의 물에 용해하여, 카세트 DNA 를 이용한 PCR법의 주형 DNA로 하였다.

한편, 실시예 4-(3)에서 결정한 부분 아미노산 서열 LR14(서열 번호 19)의 1∼6의 아미노산 서열로부터 pL14F17(서열 번호 21), 3∼11의 아미노산 서열로부터 pL14F26(서열 번호 22)의 혼합 올리고뉴클레오티드를 각각 아미노산 서열과 동일한 방향으로 합성하였다.

앞서 조제한 주형 DNA 각 1㎕, 카세트 프라이머 C1(다카라츠죠사 제조) 20pmo1, 혼합 올리고뉴클레오티드 pL14F17(서열 번호 21) 100pmo1 및 멸균수를 가하여 22㎕로 하여, 94℃에서 10분간 가열후 급냉하였다. 여기에 10㎕의 10배 농도 Ex Taq 증폭용 완충액(다카라츠죠사 제조), 16㎕의 1.25mM dNTP 혼합액, 2.5 유닛의 다카라 Ex Taq(Takara Ex Taq, 다카라츠죠사 제조) 및 멸균수를 가하여 100㎕로 하고, 또한 광유를 중층(重層)하였다. 이 혼합액을 자동 유전자 증폭 장치 서멀 사이클러(DNA Thermal Cycler 480, 다카라츠죠사 제조)에 의한 증폭 반응에 제공하였다. PCR 반응은 94℃에서 0.5분간의 변성, 45℃에서 2분간의 어닐링, 72℃에서 3분간의 합성 반응의 사이클을 25 사이클 행하고, 최후 72℃에서 7분간 유지하여 합성을 완결시켰다.

이어서, 멸균수로 10배 희석한 1회째의 PCR 반응액을 94℃에서 10분간 가열한 후 급냉한 것을 주형 DNA로 하여 2회째의 PCR 반응을 하였다. 즉, 10㎕의 열처리한 1회째의 PCR 반응액, 카세트 프라이머 C2(다카라츠죠사 제조) 20pmo1, 혼합 올리고뉴클레오티드 pL14F26(서열 번호 22) 100pmol, 10㎕의 10배 농도 Ex Taq 증폭용 완충액, 16㎕의 1.25mM dNTP 혼합액, 2.5 유닛의 다카라 Ex Taq 및 멸균수를 가하여 100㎕로 하고, 또한 광유를 중층하였다. 이 혼합액을 94℃에서 0.5분간의 변성, 55℃에서 2분간의 어닐링, 72℃에서 3분간의 합성 반응의 사이클을 25 사이클 행하고, 최후 72℃에서 7분간 유지하여 합성을 완결시켰다. 또한 동시에, 각각의 반응액에 대하여 카세트 프라이머 C2만 혹은 혼합 올리고뉴클레오티드 pL14F26만을 첨가한 반응액에 관해서도 PCR 반응을 행하여, 각 프라이머의 비특이적 증폭 산물의 대조군으로 사용하였다.

아가로스겔 전기 영동으로 반응액을 분석하여, 비특이적 증폭 산물의 대조군과 비교한 바, 많은 반응액에서 복수개의 증폭 밴드가 검출되었다. 이들 중에서 비교적 백그라운드가 낮고, 1개의 밴드가 강하게 증폭되고 있는 MunI 분해물-EcoRI 카세트의 2회째 PCR 반응액으로부터 약 0.7kbp의 밴드를 추출 정제하였다. 이 DNA 단편과 pT7 블루 T-벡터(pT7blue T-Vector, 노바젠사 제조)를 혼합하여, DNA 라이게이션 키트를 이용하여 연결한 후, 대장균 JM109를 형질전환하고, 100㎍/㎖의 암피실린, 0.004%의 X-Gal 및 1mM의 IPTG를 포함하는 L 배지 플레이트 상에서 생육하는 백색 콜로니를 선택하였다. 각 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 배양 균체로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 조제하고, 약 0.7kbp의 밴드가 삽입된 플라스미드를 선택하여 pT7-Mun이라 명명하였다. 이 pT7-Mun의 삽입 서열을 디데옥시법에 의해 염기 서열 분석을 한 바, 2회째의 PCR 반응에 이용한 pL14F26의 서열에 이어서 부분 아미노산 서열 LR14(서열 번호 19)의 12번째 이후의 아미노산 서열을 암호화하는 영역이 발견되었다. 또한 하류에는 부분 아미노산 서열 L27(서열 번호 16)과 매우 높은 상동성을 보이는 아미노산 서열을 암호화하는 영역이 발견되었다. 이들로부터, 이 약 0.7kbp의 DNA 단편은 푸코이단 분해 효소 유전자의 일부임이 분명하게 되었다. 이 약 0.7kbp의 DNA 단편의 프라이머 pL14F26으로부터 EcoRI 카세트와의 연결점까지의 서열을 서열 번호 23에 나타냈다.

(5) 실시예 4-(1)에서 조제한 게놈 DNA 20㎍씩을 제한 효소 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, SacI, SalI, SphI 및 XbaI 각 100 유닛으로 각각 37℃에서 4시간 분해한 후, 페놀/클로로포름 추출하였다. 분해물을 에탄올 침전에 의해 회수하여, 각 10㎍을 더욱 같은 제한 효소 50 유닛으로 각각 37℃에서 16시간 분해한 후, 페놀/클로로포름 추출하여, 에탄올 침전에 의해 분해물을 회수하였다. 이 분해물 각 5㎍을 0.8% 아가로스겔 전기 영동에 사용하게 하여, 서던 블로트법에 의해 아마샴사 제품인 나일론막 하이본드N+로 DNA를 전사하였다.

한편, 실시예 4-(4)에서 얻어진 pT7-Mun 약 4㎍을 벡터에서 유래하는 BamHI 및 SphI로 분해하여, 유리되는 약 0.7kbp의 푸코이단 분해 효소 유전자의 일부를 포함하는 단편을 추출 정제하였다. 이 DNA 단편을 브카베스트 라벨링 키트(BcaBEST Labeling Kit, 다카라츠죠사 제조)를 이용하여 ³²P로 표지하여, 하이브리드화의 프로브 DNA를 조제하였다.

상기 조제한 필터를 6×SSC, 1% SDS, 100㎍/㎖의 연어 정자 DNA, 5×덴하르츠를 포함하는 용액 중, 65℃에서 1시간 예비 하이브리드화를 행한 후, 표지 프로브를 약 100만cpm/㎖의 농도가 되도록 가하여, 60℃에서 밤새 하이브리드화를 행하 였다. 하이브리드화 종료후, 우선 6×SSC 중 실온에서 10분간, 2×SSC, 0.1% SDS 중 실온에서 10분간, 0.2×SSC, 0.1% SDS 중 실온에서 5분간, 또한 0.2×SSC, 0.1% SDS 중 45℃에서 30분간 세정하여, 여분의 수분을 제거한 후, 후지필름사 제품인 이미징 플레이트에 30분간 노광한 후, 후지필름사 제품인 BAS2000 이미징 분석기로 검출하였다.

그 결과, BamHI, SalI 및 SphI, SalI 분해물로 23kbp 이상의 위치에 1개, EcoRI 분해물로 약 8 및 3kbp의 위치에 2개, HindIII 분해물로 약 11 및 4kbp의 위치에 2개, PstI 분해물로 약 12 및 2.5kbp의 위치에 2개, SacI 분해물로 약 10 및 9.5kbp의 위치에 2개, XbaI 분해물로 약 6kbp의 위치에 1개인, 각 프로브에 강하게 하이브리드하는 밴드를 확인하였다. 이로부터, 플라보박테리움 sp. SA-0082의 게놈 DNA 상에 푸코이단 분해 효소 유전자가 2 종류 있는 것이 강하게 시사되었다.

(6) 실시예 4-(2)에서 조제한 플라보박테리움 sp. SA-0082의 게놈 DNA 라이브러리로부터 푸코이단 분해 효소 유전자를 포함하는 클론을 노바젠(Novagene)사의 람다 블루 스타 취급 설명서에 따라서, 플라크 하이브리드화법에 의해 스크리닝하였다.

우선, 파지 라이브러리를 대장균 ER1647에 감염시켜, 직경 8.5cm의 L 배지 플레이트 5장에, 1장당 약 300개의 플라크를 형성시켰다. 플레이트에 아마샴사 제조 나일론막 하이본드N+를 약 30초간 접촉시켜 파지를 전사시켰다. 이 나일론막을 0.5M 수산화나트륨, 1.5M 염화나트륨의 용액 중에서 5분간 변성하고, 이어서, 0.5M 트리스 염산 완충액(pH7.0), 3M 염화나트륨의 용액 중에서 5분간 중화 처리하여, 2 ×SSC로 세정한 후 바람에 말렸다. 이 나일론막을 자외선 조사 처리하여 DNA를 고정화한 후, 실시예 4-(5)의 서던 하이브리드화과 같은 조건으로 하이브리드화, 세정, 검출을 행한 결과, 36개의 양성 시그널을 얻을 수 있었다. 원래의 플레이트로부터 양성 시그널 부근의 플라크를 취하여, SM 완충액에 현탁하여 파지를 회수하였다. 얻어진 파지액이 몇개인가에 대해서, 재차 새로운 플레이트에 플라크를 형성시켜, 같은 같은 식의 조작을 반복함으로써 9개의 양성 시그널을 부여하는 파지를 단리하였다.

노바젠사의 람다 블루 스타 취급 설명서에 따라서, 얻어진 각 파지를 대장균 BM25.8에 감염시킨 후 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지 플레이트로 도말하여, 암피실린 내성의 콜로니를 선택함으로써 파지를 플라스미드의 형태로 변환하였다. 얻어진 각 클론의 콜로니를 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양한 배양액으로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 조제하였다. 이 플라스미드 DNA를 이용하여, 대장균 JM109(다카라츠죠사 제조)를 형질전환하고, 얻어진 각 클론의 콜로니를 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 L 배지에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양한 배양액으로부터 알칼리 용균법에 의해 재차 플라스미드 DNA를 조제하였다. 얻어진 각 클론의 플라스미드를 각각 pSFLA1, 5, 10, 11, 12, 13, 15, 17 및 pSFLA18이라 명명하였다.

각 플라스미드를 각각, 제한 효소 KpnI, SacI 및 Xbal을 적당히 조합하여 분해한 후, 아가로스겔 전기 영동시킨 다음, 전술한 바와 같이 서던 하이브리드화를 행하여, 각 삽입 단편의 제한 효소 지도를 작성하고 해석하였다. 그 결과, 아가로 스겔 전기 영동의 에티디움 브로마이드 염색으로, 각각 매우 닮은 크기의 밴드가 복수 검출되는 동시에, SacI 분해에 의해 pT7-Mun의 약 0.7kbp 삽입 단편과 하이브리드하는 밴드가 2개가 되는 pSFLA1, 10, 12, 15 및 pSFLA18의 쌍과, 마찬가지로 KpnI 분해에 의해 pT7-Mun의 약 0.7kbp 삽입 단편과 하이브리드하는 밴드가 2개가 되는 pSFLA5, 11, 13 및 pSFLA17의 쌍, 2개 그룹으로 나뉘는 것이 분명하게 되었다. 또한, pSFLA5, pSFLA10 및 pSFLA17의 3개의 플라스미드는 XbaI 분해에 의해 약 6 kbp의 단편을 유리하는 것이 분명하게 되고, 실시예 4-(5)의 서던 하이브리드화로 검출된 약 6kbp의 XbaI 분해물의 밴드는 2개의 밴드가 서로 겹치고 있는 것이 시사되어, 플라보박테리움 sp. SA-0082의 게놈 DNA 상에 푸코이단 분해 효소 유전자가 적어도 2종류 있는 것이 분명하게 되었다.

그래서 각 그룹의 플라스미드로부터 pSFLA10 및 pSFLA17을 선택하여 다시 삽입 단편의 해석을 행하였다. 즉, 이들 플라스미드 약 3㎍을 XbaI로 분해하여, 유리되는 약 6kbp의 단편을 추출 정제하였다. 이들 KbaI 단편을 각각 클로람페니콜 내성 벡터인 pHSG399(다카라츠죠사 제조)의 XbaI 분해물과 섞어, DNA 라이게이션 키트(다카라츠죠사 제조)를 이용하여 연결한 후, 대장균 JM109를 형질전환하고, 30㎍/㎖의 클로람페니콜, 0.004%의 X-Ga1 및 1mM의 IPTG를 포함하는 L 배지 플레이트 상에서 생육하는 백색 콜로니를 선택하였다. 각 형질전환체를 30㎍/㎖의 클로람페니콜을 포함하는 L 배지에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양한 후, 배양 균체로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 조제하여, 제한 효소 분해한 후 아가로스겔 전기 영동을 행하고 해석하였다. 그 결과, pSFLA10에서 유래하는 약 6kbp DNA 가 벡터 DNA 에 대하여 각각 역방향으로 삽입된 pH10X6-1 및 pH10X6-2을 얻었다. 또한 마찬가지로 pSFLA17에서 유래하는 약 6kbp DNA가 삽입된 pH17X6-7 및 pH17X6-11을 얻었다. pHlOX6-1가 도입된 대장균 JM-109주는 에세리시아 콜리(Escherichia coli) JM109/pH10X6-1로 표시되며, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 1998년 2월 24일자로 FERM P-16659로서 기탁되어, 상기 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 FERM BP-6341(국제 기탁의 이관 청구일 : 1998년 5월 6일)로서 국제 기탁되어 있다. pH17X6-7이 도입된 대장균 JM-109주는 Escherichia coli JM109/pH17X6-7로 표시되며, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 1998년 2월 24일자로 FERM P-16660으로서 기탁되어, 상기 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 FERM BP-6342(국제 기탁의 이관 청구일 : 1998년 5월 6일)로서 국제 기탁되어 있다. 이들 플라스미드에 관해서 직접 프라이머 신장법에 의해서, 혹은 제한 효소 분해후 서브 클로닝 등을 행하여 디데옥시법에 의해서 상세하게 염기 서열을 해석한 바, pSFLA10에서 유래하는 약 6kbp의 DNA 단편으로부터 2094 염기(종지 코돈을 포함함)의 판독 프레임 및 pSFLA17에서 유래하는 약 6kbp의 DNA 단편으로부터 2115 염기(종지 코돈을 포함함)의 판독 프레임이 발견되어, 이들 판독 프레임이 암호화하는 아미노산 서열 중에 실시예 4-(3)에서 결정한 부분 아미노산 서열과 매우 높은 상동성을 보이는 영역이 발견되었다.

pSFLA10에서 유래하는 판독 프레임을 fdlA, pSFLA17에서 유래하는 판독 프레임을 fdlB라 명명하였다.

그 결과를 도 3 및 도 4에 도시한다. 즉 도 3은 pSFLA10 내의 fdlA의 위치를 나타낸 도면이며, 도 4는 pSFLA10 내의 fdlB의 위치를 나타낸 도면이다. 도 3중의 검은 화살표는 fdlA의 암호 영역 및 방향을 각각 나타내며, 도 4 중의 검은 화살표는 fdlB의 암호 영역 및 방향을 나타낸다.

fdlA가 암호화하는 아미노산 서열 중에는, 실시예 4-(3)에서 결정한 푸코이단 분해 효소 부분 아미노산 서열 L36(서열 번호 17) 및 LR14(서열 번호 19)와 일치하는 서열 및 부분 아미노산 서열 L27(서열 번호 16), LR9(서열 번호 18) 및 LR16(서열 번호 20)과 매우 상동성이 높은 서열이 발견되었다. 또한, 실시예 4-(3)에서 LR8이라 명명된 펩티드 분획에서는 각 사이클마다 2개의 아미노산 유도체가 아미노산 서열 분석으로 검출되어, 일률적으로 아미노산 서열이 결정되어 있지 않지만, fdlA가 암호화하는 아미노산 서열 중의 2군데의 서열을 적용시킴에 따라 각 사이클에서 검출된 아미노산 유도체를 설명할 수 있다는 점에서, 이 분획에는 이 2군데의 서열을 포함하는 펩티드가 들어가 있었던 것이 분명하게 되었다. 각각의 서열을 LR8-1(서열 번호 24) 및 LR8-2(서열 번호 25)로 명명하였다. 이와 같이 fdlA가 암호화하는 아미노산 서열은 실시예 4-(3)의 푸코이단 분해 효소 부분 아미노산 서열 분석에 의해 분명해진 모든 아미노산 서열과 일치 혹은 높은 상동성을 보이는 점에서 플라보박테리움 sp. SA-0082의 푸코이단 분해 효소를 실질적으로 암호하고 있다고 생각된다.

한편, fdlB가 암호화하는 아미노산 서열 중에도, 푸코이단 분해 효소 부분 아미노산 서열 LR14(서열 번호 19) 및 LR8-1(서열 번호 24)과 일치하는 서열과, 또 부분 아미노산 서열 L27(서열 번호 16), LR16(서열 번호 20) 및 LR8-2(서열 번호 25)와 상동성이 높은 서열이 발견되었지만, 부분 아미노산 서열 L36(서열 번호 17) 및 LR9(서열 번호 18)에 높은 상동성을 보이는 서열은 발견되지 않았다. 그러나, fdlA와 fdlB를 비교하면 염기 서열 및 아미노산 서열의 상동성은 각각 약 67% 및 약 56%보다 높다는 점에서 fdlB도 푸코이단 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호하고 있다고 생각되었다. 이상과 같은 식으로, 푸코이단 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호한다고 생각되는 유전자(fdlA) 및 그 유전자에 매우 높은 상동성을 보이는 유전자(fdlB)의 전체 염기 서열이 결정되었다. fdlA의 염기 서열을 서열 목록의 서열 번호 7에 나타내고, fdlA가 암호화하는 아미노산 서열을 서열 목록의 서열 번호 3에 나타낸다. 또 fdlB의 염기 서열을 서열 목록목록의 서열 번호 8에 나타내고, fdlB가 암호화하는 아미노산 서열을 서열 목록의 서열 번호 4에 나타낸다.

이상, 본 발명에 의해 실질적으로 푸코이단 분해 효소를 암호화하는 것으로 생각되는 유전자(fdlA) 및 그 유전자에 상동성을 보이고, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는다고 생각되는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 생각되는 유전자(fdlB)를 단리, 정제하였다.

실시예 5

우선, 실시예 4에서 얻어진, 실질적으로 푸코이단 분해 효소를 암호한다고 생각되는 유전자(fdlA)의 직접 발현 벡터를 구축하였다.

실시예 4에서 얻어진 플라스미드 pH10X6-1에는 pSFLA10에서 유래하는 약 6kbp의 XbaI 단편이 fdlA 유전자 및 벡터 상의 lac 프로모터와 마주 보는 방향으로 삽입되어 있었다. 이 pHl0X6-1을 fdlA 유전자 내부의 SacI 부위에서 분해하고, 또한 fdlA 유전자의 개시 코돈의 위치에 있는 BspfHI에서 분해한 후, 1% 아가로스겔 전기 영동에 의해 분리하고, fdlA의 N 말단 영역을 암호화하는 약 400bp의 DNA 단편을 잘라내어 추출 정제하였다.

한편, T7 프로모터를 사용한 발현 벡터인 pET21d (노바젠사 제조)를, T7 프로모터 하류에 있는 발현을 위해 최적화된 개시 코돈을 포함하는 NcoI 부위와, 다중 클로닝 부위에 있는 SacI 부위에서 절단한 후, 먼저 조제한 fdlA의 N 말단 영역을 암호화하는 약 400bp의 BspHI-SacI 단편을 삽입하여, 플라스미드 pEFLA10-N을 구축하였다.

이어서, 플라스미드 pH10X6-1을 HindIII로 분해함으로써 fdlA 유전자 내부 및 벡터에서 유래하는 HindIII 부위에서 절단하여, fdlA 유전자의 종지 코돈을 포함하는 C 말단 영역을 암호화하는 약 2kbp의 DNA 단편을 잘라내어 추출 정제하였다. 이 단편을 먼저 구축한 플라스미드 pEFLA10-N의 HindIII 분해물과 연결하여, fdlA 유전자 전체 길이가 재생하는 방향으로 상기 2kbp의 HindIII 단편이 삽입된 플라스미드를 선택하였다. 이렇게 해서 얻어진, pET21d의 NcoI 부위에 있는 개시 코돈으로부터 fdlA의 전체 길이가 삽입되어 있는 발현 플라스미드를 pEFLA10으로 명명하였다.

이렇게 해서 얻어진 pEFLA10을 이용하여 대장균 BL21(DE3)주(노바젠사 제조)를 형질전환하였다. 얻어진 대장균 BL21(DE3)/pEFLA10을 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 5㎖의 L 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하여, 탁도가 O.D.600=0.8인 단계에서, 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 후, 배양 온도를 15℃로 하여 하룻밤 더 진탕 배양하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체를 모으고, 세포 파쇄용 완충액〔20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0), 0.3M 염화나트륨〕0.5 ㎖에 현탁하여, 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄하였다. 이 현탁액의 일부를 취해 대장균 파쇄액으로 하였다. 또한 이것을 원심 분리하여 불용물을 제거하고 대장균 추출액으로 하였다.

대조군으로서, pET21d로 형질전환한 대장균 BL21(DE3)/pET21d에 관해서 동시에 동일한 조건으로 배양을 행하여, 대장균 파쇄액 및 추출액을 조제하여, 이하의 분석에 이용하였다.

우선, 대장균 파쇄액을 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 분석한 결과, 대장균 BL21(DE3)/pEFLA10의 파쇄액 중에서, 대장균 BL21(DE3)/pET21d의 파쇄액 중에는 보이지 않는 분자량 약 7.6만의 밴드가 관찰되었다. 이 분자량은 서열 목록의 서열 번호 3에 나타낸 fdlA가 암호할 수 있는 아미노산 서열로부터 계산되는 폴리펩티드의 분자량 75,740과 잘 일치하는 동시에, 참고예 5에 기재한 플라보박테리움 sp. SA-0082의 보다 정제된 푸코이단 분해 효소의 겔 여과법으로 분석한 분자량 약 7만과 잘 일치한다. 이상과 같이, 대장균 BL21(DE3)/pEFLA10이 fdlA가 암호화하는 폴리펩티드를 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

이어서, 대장균 추출액의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 참고예 3에 기재한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 대장균 BL21(DE3)/pEFLA10의 추출액 중의 푸코이단 분해 활성은 2,300mU/㎖인 것을 알 수 있었다. 즉, fdlA가 암호화하는 폴리펩티드는 푸코이단 분해 활성을 지니고, 본 발명의 유전자를 갖는 대장균 BL21(DE3)/pEFLA10의 배양액 1㎖ 중에 약 230mU의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 fdlA가 암호화하는 폴리펩티드가 생산되어 있던 것을 알 수 있다.

한편, 대장균 BL21(DE3)/pET21d의 추출액으로부터는 푸코이단 분해 활성은 전혀 검출되지 않았다.

실시예 6

실시예 4에서 얻어진, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 것으로 생각되는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, fdlB의 직접 발현 벡터를 구축하였다. 이 fdlB 유전자의 개시 코돈의 위치에는 BspHI의 인식 서열이 존재하지만, 그 상류 서열의 영향으로 메틸화되기 때문에, 숙주로서 이용한 대장균 JM109로부터 회수한 플라스미드는 직접 BspHI로 분해할 수 없었다. 그래서, PCR법을 이용하여 증폭한 DNA 단편을 이용하여 구축하였다.

실시예 4에서 얻어진 플라스미드 pH17X6-7은 pSFLA17에서 유래하는 약 6kbp의 XbaI 단편이 fdlB 유전자 및 벡터 상의 lac 프로모터와 동일한 방향으로 삽입되어 있었다. 우선, pH17X6-7을 fdlB 유전자 내부 및 벡터에서 유래하는 KpnI 부위에서 절단한 후, 자가 결찰시켜 플라스미드 pH17X6-7K를 구축하였다. 이 pH17X6-7K를 주형으로 하고, fdlB의 암호 영역보다도 상류의 위치에서, fdlB와 동일한 방향의 합성 DNA 프라이머 17X6F4(서열 번호 26) 및 벡터에 어닐링 가능한 M13 프라 이머 M4(다카라츠죠사 제조)의 쌍으로 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 실시예 4-(4)와 같은 반응액 조성 중, 94℃에서 0.5분간의 변성, 55℃에서 0.5분간의 프라이머 어닐링, 72℃에서 1분간의 합성 반응의 사이클을 25 사이클 행하고, 최후 72℃에서 7분간 유지하여 합성을 완결시켰다. 반응액을 페놀/클로로포름 추출후, 증폭된 약 1kbp의 DNA 단편을 에탄올 침전에 의해 회수하였다. 이 단편을 fdlB 유전자 중 개시 코돈의 위치에 있는 BspHI 및 암호 영역 내에 있는 MflI 부위에서 절단한 후, 3% 아가로스겔 전기 영동에 의해 분리하여, fdlB의 N 말단 영역을 암호화하는 약 450bp의 BspHI-MflI 단편을 잘라내어 추출 정제하였다.

한편, 실시예 5와 같이 T7 프로모터를 사용한 발현 벡터인 pET21d를 NcoI 부위와 다중 클로닝 부위 내에 있는 BamHI 부위에서 절단한 후, 앞서 조제한 fdlB의 N 말단 영역을 암호화하는 약 450bp의 BspHI-MflI 단편을 삽입하여, 플라스미드 pEFLA17-N을 구축하였다.

이어서, 플라스미드 pH17X6-7을 fdlB 유전자 내부에 있는 NspV 부위 및 fdlB 유전자 하류에 있는 EcoRI 부위에서 절단하여, fdlB 유전자의 종지 코돈을 포함하는 C 말단 영역을 암호화하는 약 2kbp의 NspV-EcoRI 단편을 잘라내어 추출 정제하였다. 이 단편을 앞서 구축한 플라스미드 pEFLA17-N의 NspV-EcoRI 사이에 삽입하였다. 이렇게 해서 얻어진, pET21d의 NcoI 부위에 있는 개시 코돈으로부터 fdlB의 전체 길이가 삽입되어 있는 발현 플라스미드를 pEFLA17이라 명명하였다.

이렇게 해서 얻어진 pEFLA17을 이용하여 실시예 3과 같은 방법으로 fdlB가 암호화하는 폴리펩티드의 발현과 푸코이단 분해 활성을 확인하였다.

즉, 우선 대장균 BL21(DE3)주를 pEFLA17을 이용하여 형질전환하였다. 얻어진 대장균 BL21(DE3)/pEFLA17을 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 5㎖의 L 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하고, 탁도가 O.D.600=0.8인 단계에서, 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG를 가한 후, 배양 온도를 15℃로 하여 하룻밤 더 진탕 배양하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체를 모으고, 세포 파쇄용 완충액 0.5㎖에 현탁하여, 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄하였다. 이 현탁액의 일부를 취해 대장균 파쇄액으로 하였다. 또한 이것을 원심 분리하여 불용물을 제거하고 대장균 추출액으로 하였다.

대장균 파쇄액을 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 분석한 결과, 대장균 BL21(DE3)/pEFLA17의 파쇄액 중에서, 대장균 BL21(DE3)/pET21d의 파쇄액 중에는 보이지 않는 분자량 약 7.7만의 밴드가 관찰되었다. 이 분자량은 서열 목록의 서열 번호 4에 나타낸 fdlB가 암호할 수 있는 아미노산 서열로부터 계산되는 폴리펩티드의 분자량 76,929와 잘 일치하며, 대장균 BL21(DE3)/pEFLA17이 fdlB를 암호화하는 폴리펩티드를 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

이어서, 대장균 추출액의 푸코이단 분해 활성을 실시예 3에 기재한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 대장균 BL21(DE3)/pEFLA17의 추출액으로부터 480mU/㎖의 푸코이단 분해 활성이 검출되었다. 즉, fdlB가 암호화하는 폴리펩티드는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 지니며, 본 발명의 유전자를 갖는 대장균 BL21(DE3)/pEFLA17의 배양액 1㎖ 중에 약 48mU의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 fdlB가 암 호화하는 폴리펩티드가 생산되고 있던 것을 알 수 있다.

한편, 대장균 BL21(DE3)/pET21d의 추출액으로부터는 푸코이단 분해 활성은 전혀 검출되지 않았다.

실시예 7

실시예 5 및 실시예 6에서 얻어진, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 푸코스 황산 함유 다당-U에 대한 작용을 조사하였다.

즉, 50㎕의 100mM 인산 완충액(pH7.5), 50㎕의 2.5% 푸코스 황산 함유 다당-U, 및 10㎕의 4M 염화나트륨의 혼합액에, 10㎕의 실시예 5 혹은 실시예 6에서 얻어진 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 용액을 첨가하여, 25℃에서 유지하였다. 반응 개시부터 16, 40 및 65시간의 시점에서 반응액을 분취하여 HPLC로 반응 생성물을 분석하였다. HPLC의 조건은 하기에 따랐다.

컬럼 : Shodex SB802.5(쇼와덴꼬사 제조)

컬럼 온도 : 25℃

용출액 : 5mM의 아지화나트륨을 포함하는 50mM의 염화나트륨 수용액

유속 : 1㎖/분

검출기 : 시차 굴절률 검출기(Shodex RI-71 쇼와덴꼬사 제조)

또한, 반응 생성물로서는 현재까지 하기의 구조의 것이 알려져 있기 때문에, 하기의 물질을 표준 물질로서 사용하였다. 또, 하기의 화학식 1∼4의 물질은 이하의 방법으로 제조한 것을 이용하였다.

건조 가고메 다시마를 자유 분쇄기 M-2형(나라기카이세이사쿠쇼 제조)에 의 해 분쇄하여, 10배량의 85% 메탄올 중에서 70℃, 2시간 처리후, 여과하였다. 잔류물에 20배량의 물을 가하여, 100℃, 3시간 처리하여, 여과에 의해 추출액을 얻었다. 추출액의 염 농도를 400mM의 염화나트륨 용액과 동일하게 한 후, 5%의 세틸피리디늄 염화물을 이 이상 침전이 생기지 않을 때까지 첨가하여, 원심 분리하였다. 그 침전을, 에탄올로 충분히 세정하여, 세틸피리디늄 염화물을 완전히 제거한 후, 한외여과기(여과막의 배제 분자량 10만)(아미콘사 제조)에 의해 탈염 및 저분자 제거를 하여, 이 때 생긴 침전을 원심 분리에 의해 제거하였다. 이 상청액을 동결 건조하여 정제 가고메 다시마 푸코이단을 얻었다. 수율은 건조 가고메 다시마 분말 중량에 대하여 약 4%였다.

이어서 5%의 상기 정제 가고메 다시마 푸코이단 용액 600㎖과, 100mM의 인산 완충액(pH8.0) 750㎖과 4M의 염화나트륨 150㎖과 1750mU/㎖의 참고예 5에 기재한 푸코이단 분해 효소 용액 3.43㎖을 혼합하여, 25℃에서 144시간 반응시켰다. 반응액을 소공 크기가 3500인 투석막을 이용하여 투석하여, 분자량 3500 이하의 분획을 모았다. 이 분획을 마이크로 아실라이저 G3(아사히카세이사 제조)에 의해 탈염한 후, 10mM 아세트산암모늄으로 평형화한 DEAE-세파로스FF 컬럼(4cm×25cm)을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 제공하게 하였다. 용출은 아세트산암모늄에 의한 농도 구배에 의해 실시하고, 용출액은 50㎖씩 분취하였다. 도 5에 상기 크로마토그래피의 용출을 도시한다. 상기 크로마토그래피에 의해 9개의 분획 (a)∼(i)를 취득하고, 그 중의 (a), (b), (c) 및 (f) 분획을 구조 해석에 사용하였다.

다음에 (a), (b), (c), (f) 분획에 관해서 통상의 방법에 따라서 구조 해석 을 행하여, (a) 분획이 하기 화학식 1, (b) 분획이 하기 화학식 3, (c) 분획이 하기 화학식 4, (f) 분획이 하기 화학식 2의 화합물임을 확인한 뒤에, 각 분획을 상기 반응 생성물 분석의 표준 샘플로서 사용하였다.

또 상기 DEAE-세파로스FF 컬럼을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 있어서의 각 분획의 번호는 (a) : 42-43, (b) : 84-91, (c) : 51-52, (f) : 62-63이었다.

화학식 1

화학식 2

화학식 3

화학식 4

상기 반응 생성물의 분석 결과, 실시예 5에서 얻어진 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 이용한 경우 반응 생성물은 상기 I, II 및 III 뿐이었지만, 실시예 6에서 얻어진 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 이용한 경우의 반응 생성물은 상기 1, 2 및 3 외에도, 4가 대량으로 포함되어 있고, 그 후 반응을 계속하더라도 4는 1로 분해되지 않았다.

즉, 실시예 5와 같은 식으로 얻어진 fdlA가 암호화하는 폴리펩티드는 푸코스 황산 함유 다당-U에 작용하여, 상기 1, 2 및 3과 같은 3당을 최종 절단 단위로서 유리시키지만, 실시예 6과 같은 식으로 얻어진 fdlB가 암호화하는 폴리펩티드는 푸코스 황산 함유 다당-U에 작용하여, 상기 4와 같은 6당도 최종 절단 단위로서 유리시키는 것이 판명되었다.

실시예 8

실시예 5 및 실시예 6에 있어서, fdlA 및 fdlB 유전자를 포함하는 각각의 재조합체 대장균에 의해 각 유전자가 암호화하는 폴리펩티드가 생산되고, 이들 대장 균 추출액 중에서 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성이 검출되어, fdlA 및 fdlB가 암호화하는 폴리펩티드는 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 것이 확인되었다. 그러나, 대장균 추출액을 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 분석한 결과, 대장균 파쇄액과 비교하여 근소한 양의 재조합체 폴리펩티드밖에 검출되지 않고, 생산된 폴리펩티드의 일부만이 활성형의 가용성 폴리펩티드로서 발현되는 것이 시사되었다.

플라보박테리움 sp. SA-0082의 푸코이단 분해 효소는 균체외 분비 효소이며, 막 투과를 위한 분비 시그널이 N 말단에 부가한 전구체의 형태로 발현되는 것이 예상된다. 그래서, fdlA 및 fdlB가 암호화하는 N 말단 아미노산 서열을 조사한 바, 개시 메티오닌으로부터 각각 25번째, 24번째의 알라닌 잔기까지의 영역이 분비 시그널로 예상되었다. 이 소수성의 분비 시그널의 존재가, 실시예 5 및 실시예 6에 기재된 각 재조합체 폴리펩티드의 가용성과 관계가 있다고 생각되었기 때문에, fdlA 및 fdlB 각각의 분비 시그널을 제외한 발현 플라스미드를 구축하였다.

(1) 우선, fdlA의 개시 메티오닌으로부터 26번째 글루타민 잔기의 바로 상류에 제한 효소 BamHI 부위를 도입하기 위해서 프라이머 FDL-Q-Bam(서열 번호 27) 및 프라이머 10X6R4(서열 번호 28)를 디자인하여, 합성하였다. FDL-Q-Bam은 서열 목록 중 서열 번호 7의 염기 서열 번호 76-95의 서열 상류에 BamHI 부위를 배치한 28 mer의 합성 DNA 이다. 또한, 10X6R4는 서열 목록 중 서열 번호 7의 염기 서열 번호 1471-1491의 서열에 상보적인 21 mer의 합성 DNA이다.

실시예 5에서 구축한 pEFLA10을 주형으로 하고, 프라이머 FDL-Q-Bam과 10X6R4의 쌍으로 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 실시예 4-(4)와 같은 반응액 조성 중, 94℃에서 0.5분간의 변성, 50℃에서 1분간의 프라이머 어닐링, 72℃에서 2분간의 합성 반응의 사이클을 25 사이클 행하고, 최후 72℃에서 7분간 유지하여 합성을 완결시켰다. 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분리한 후, 증폭한 약 1.4kbp의 DNA 단편을 추출 정제하였다. 이 단편을 실시예 4-(4)와 같은 방법으로, pT7 블루 T-벡터(노바젠사 제조)에 삽입한 플라스미드 DNA를 조제하여 염기 서열을 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 프라이머 FDL-Q-Bam에 배치한 BamHI 부위 및 fdlA 암호 영역 내에 있는 SnaBI 부위에서 절단한 후, 5% 폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의해 분리하여, fdlA의 개시 메티오닌으로부터 26번째 글루타민 잔기 이후의 N 말단 영역을 암호화하는 약 480bp의 BamHI-SnaBI 단편을 잘라내어 추출 정제하였다.

한편, 실시예 5와 같은 식의 T7 프로모터를 사용한 발현 벡터인 pET21a(노바젠사 제조)를 다중 클로닝 부위 내의 HindIII 부위에서 절단하여, 실시예 5에서 조제한 fdlA 유전자의 종지 코돈을 포함하는 C 말단 영역을 암호화하는 약 2kbp의 HindIII DNA 단편을 T7 프로모터와 fdlA 유전자가 같은 방향이 되도록 삽입하여, 플라스미드 pEFDLA-C를 구축하였다. 이 pEFDLA-C를 다중 클로닝 부위에서 유래하는 BamHI 부위 및 fdlA 암호 영역 내에 있는 SnaBI 부위에서 절단하여, 앞서 조제한 fdlA의 개시 메티오닌으로부터 26번째 글루타민 잔기 이후의 N 말단 영역을 암호화하는 약 480bp의 BamHI-SnaBI 단편을 삽입하여, 플라스미드 pEFDLA101을 얻었다.

이 플라스미드 pEFDLA101은 T7 프로모터의 하류에 pET21a에서 유래하는 14 잔기의 N 말단 리더 서열(서열 번호 29)에 이어서 서열 목록의 서열 번호 3의 26번째 이후의 서열이 연결된 폴리펩티드를 암호하고 있다.

(2) 프라이머 FDL-Q-Bam의 디자인에 이용한 fdlA의 26번째의 글루타민 잔기 이후의 20 염기의 서열은 마찬가지로 fdlB의 25번째의 글루타민 잔기 이후의 서열(서열 목록의 서열 번호 8의 염기 서열 번호 73-92)과 일치한다. 따라서, 실시예 8-(1)에서 이용한 프라이머 FDL-Q-Bam은 그대로 fdlB 발현 벡터의 구축에 이용할 수 있어, 기본적으로 실시예 8-(1)과 같은 방법을 이용하여 fdlB 발현 벡터 pEFDLB101을 구축하였다.

우선, FDL-Q-Bam을 이용하여 PCR 반응을 행하기 위해서, 서열 목록의 서열 번호 8의 염기 서열 번호 1489-1508의 서열에 상보적인 20 mer의 합성 DNA, 17X6R1(서열 번호 30)를 제작하였다. 실시예 6에서 구축한 pEFLB17를 주형으로 하여, 프라이머 FDL-Q-Bam과 17X6R1의 쌍으로 PCR 반응을 행하여, 증폭한 약 1.4kbp의 DNA 단편을 추출 정제하였다. 이 단편을 pT7블루 T-벡터에 삽입하여, 플라스미드 DNA를 조제하고 염기 서열을 확인하였다.

이어서, 얻어진 플라스미드를 프라이머 FDL-Q-Bam에 배치한 BamHI 부위 및 fdlB 암호 영역 내에 있는 NspV 부위에서 절단한 후, 5% 폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의해 분리하여, fdlB의 개시 메티오닌으로부터 25번째의 글루타민 잔기 이후의 N 말단 영역을 암호화하는 약 210bp의 BamHI-NspV 단편을 잘라내어 추출 정제하였다.

한편, 실시예 4에서 얻어진 플라스미드 pH17X6-7을 EcoRI 부위에서 절단하여, fdlB 유전자 전체 길이를 포함하는 약 2.6kbp의 EcoRI 단편을 잘라내어 추출 정제하였다. 이 단편을 pET21a의 다중 클로닝 부위 내의 EcoRI 부위에, T7 프로모터와 fdlB 유전자가 같은 방향이 되도록 삽입하여, 플라스미드 pEFDLB-W를 구축하였다. 이 pEFDLB-W를 다중 클로닝 부위에서 유래하는 BamHI 부위 및 fdlB 암호 영역 내에 있는 NspV 부위에서 절단하여, 앞서 조제한 fdlB의 개시 메티오닌으로부터 25번째의 글루타민 잔기 이후의 N 말단 영역을 암호화하는 약 210bp의 BamHI-NspV 단편을 삽입하여, 플라스미드 pEFDLB101을 얻었다.

이 플라스미드 pEFDLB101은 T7 프로모터의 하류에 실시예 8-(1)에서 얻은 플라스미드 pEFDLA101과 완전히 동일한 14 잔기의 N 말단 리더 서열(서열 번호 29)에 이어서 서열 목록 중 서열 번호 4의 25번째 이후의 서열이 이어진 폴리펩티드를 암호하고 있다.

(3) 실시예 8-(1), (2)에서 얻어진 pEFDLA101 및 pEFDLB101을 이용하여, 실시예 5와 같은 방법으로 재조합체의 배양, 균체 추출액의 조제를 행하여, 실시예 5 및 실시예 6에서 구축한 pEFLA10 및 pEFLA17에 의한 각 재조합체 폴리펩티드의 발현량과 푸코이단 분해 활성을 비교하였다.

즉, pEFLA10, pEFLA17, pEFDLA101 혹은 pEFDLB101을 이용하여 대장균 BL21(DE3)주를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환체를 각각 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 5㎖의 L 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하였다. 배양액의 탁도가 O.D.600=0.8인 단계에서, 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG을 가한 후, 배양 온도를 15℃로 하여 하룻밤 더 진탕 배양을 하였다. 배양 종료후, 배양액을 원심 분리하여 균체를 모으고, 세포 파쇄용 완충액 0.5㎖에 현탁하여, 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄하였다. 이 현탁액의 일부를 취해 대장균 파쇄액으로 하였다. 또한 이것을 원심 분리하여 불용물을 제거하여 대장균 추출액으로 하였다.

각 대장균 파쇄액 및 추출액을 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 분리한 후, 통상의 방법에 따라서 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 행하고 해석한 바, 어느 대장균 파쇄액에서나 예상되는 분자량의 폴리펩티드가 대량 발현되는 것으로 관찰되었다. 동시에 전기영동한 소 혈청 알부민양과의 비교에 의해 그 발현량을 어림잡은 동시에, 각 추출액 중의 푸코이단 분해 활성을 참고예 3에 기재한 방법으로 측정하였다. 이들 결과를 표 2에 통합하여 기재하였다.

플라스미드	유전자	배양액 1 L 당 발현 단백질량(㎎/L) 파쇄액 추출액		배양액 1 ㎖ 당 활성량(mU/㎖) 추출액
pEFLA10	fdlA	5	1	200
pEFDLA101	fdlA	10	10	1300
pEFLA17	fdlB	36	*	34
pEFDLB101	fdlB	75	75	5700
* 검출 한계 이하이므로 어림잡을 수 없슴.

표 2에 나타낸 바와 같이, 파쇄액 중에 포함되는 목적 폴리펩티드의 발현량은 분비 시그널이라 예상되는 서열 대신에 N 말단 리더 서열이 부가하도록 구축된 pEFDLA101(fdlA), pEFDLB101(fdlB) 쪽이 예상 분비 시그널을 갖는 직접 발현 플라스미드 pEFLA10(fdlA), EFLA17(fdlB)에 비해서 어느 유전자의 경우도 2배 정도가 높은 생산량을 보였다.

또한, 분비 시그널을 갖는 경우는 추출액 중에 존재하는 목적 폴리펩티드 양이 파쇄액과 비교하여 극단적으로 적어져, 발현된 폴리펩티드의 대부분이 불용성으로서 존재하고 있는 데에 반하여, 분비 시그널을 제거한 경우는 파쇄액과 거의 등량의 목적 폴리펩티드가 추출액 중에서 검출되어, 발현된 폴리펩티드가 거의 가용성으로서 존재하고 있는 것이 분명하게 되었다. 또한, 추출액 중의 활성량도 목적 폴리펩티드의 존재량에 대응하여 크게 상승하였다.

실시예 9

실시예 2 및 실시예 3에서 얻어진, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 푸코스 황산 함유 다당-F에 대한 작용을 조사하였다.

즉, 500㎕의 50mM 이미다졸-HCl 완충액(pH7.5), 50㎕의 참고예 1-(2)에 기재한 푸코스 황산 함유 다당-F 2.5% 용액, 50㎕의 1M 염화칼슘 및 75㎕의 4M 염화나트륨의 혼합액에, 100㎕의 실시예 2 혹은 실시예 3에서 얻어진 9.7mU/㎖의 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 용액을 첨가하고 또한 증류수를 가하여 전량을 1㎖으로 하였다. 25℃에서 18시간 반응한 후, 반응 생성물을 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC의 조건은 하기에 따랐다.

컬럼 : Shodex SB804(쇼와덴꼬사 제조)

컬럼 온도 : 25℃

용출액 : 5mM의 아지화 나트륨을 포함하는 50mM의 염화나트륨 수용액

유속 : 1㎖/분

검출기 : 시차 굴절률 검출기(Shodex RI-71 쇼와덴꼬 제조)

상기 본 발명의 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 작용에 의해 생성되는 반응 생성물의 분석 결과, 실시예 2 및 실시예 3에서 얻어진 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 이용한 경우의 반응 생성물 중에는 모두 HPLC의 잔류 시간(retention time)으로 8.62분 및 9.30분의 2개의 피크가 검출되었다.

또 실시예 2에서 얻어진 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 이용한 경우와 실시예 3에서 얻어진 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 이용한 경우를 비교하면 실시예 2 쪽이, 9.30분의 물질을 많이 생성하고 있었다.

본 발명에 의해 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 염기 서열이 비로소 분명하게 되고, 이에 따라 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하게 되는 동시에, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 공업적으로 유리한 유전자 공학적 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 따르면, 푸코스 황산 함유 다당 분해 효소의 유도 생산을 위해 배지에 푸코스 황산 함유 다당을 가할 필요가 없어, 생산성은 높다. 또한, 프로테아제나 다른 다당 분해 효소 등의 효소가 동시에 생산되는 경우도 없고, 정제도 용이하다. 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 염기 서열이 제공됨으로써, 아미노산 서열을 기초로 항푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드 항체를 제작하는 것이나, 염기 서열을 기초로 푸코스 황 산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 염기 서열에 특이적인 프로브나 프라이머를 제작하는 것이 가능해졌다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1. 서열 목록의 서열 번호 3 또는 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열로 구성되는, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열로 구성되는 단리된 유전자.
2. 제1항에 있어서, 상기 유전자가 서열 목록의 서열 번호 7 또는 서열 번호 8로 나타낸 DNA 서열로 구성됨을 특징으로 하는 유전자.
3. 제1항에 따른 유전자를 가지는 재조합 DNA.
4. 제3항에 따른 재조합 DNA가 삽입되고, 미생물, 동물 세포 또는 식물 세포를 숙주 세포로 하는 발현 벡터.
5. 제4항에 따른 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
6. 제5항에 따른 형질전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 수집하는 것을 특징으로 하는, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드의 제조 방법.
7. 서열 목록의 서열 번호 3 또는 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열로 구성되고, 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드.

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