KR100454174B1

KR100454174B1 - 엔도글리코세라미데이즈를 암호화하는 유전자

Info

Publication number: KR100454174B1
Application number: KR1019960026582A
Authority: KR
Inventors: 히로유끼 이즈; 요고 구로메; 요시야 이즈미; 무쓰미 사노; 이꾸노신 가또; 마꼬또 이또
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1996-06-29
Publication date: 2005-04-06
Also published as: EP0751222A3; DE69635849T2; EP0751222B1; EP0751222A2; CN1136316C; CN1145954A; US5795765A; KR970001542A; DE69635849D1

Abstract

본 발명은 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드 또는 기능상 그것과 동등한 변형체 폴리펩티드들을 암호화하는 서열이 있는 분리된 DNA 와, 유전자 재조합 기술에 의하여 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드 또는 기능상 그것과 동등한 변형체 폴리펩티드들을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

엔도글리코세라미테이즈를 암호화하는 유전자

본발명은 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 당 사슬 공학분야에서 당지질 (糖脂質) 의 구조, 기능 및 기타 분석 등에 유용한 효소인, 엔도글리코세라미데이즈를 암호화하는 누클레오티드 서열과 그것의 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드의 공업적 제조 방법에 관한 것이기도 하다.

스핑고당지질 분자에서, 스핑고신 염기의 1 차 알코올의 히드록실기는 글리코시드 결합에 의해 단당류나 올리고당류에 결합되어 있는데, 거기에 지방산이 산-아미드 결합의 형성에 의해 추가로 결합된다. 스핑고신 염기와 지방산을 포함하는 부분을 세라미드라고 부른다 [지질의 화학(Shinshitsu no Kagaku) 제 365 페이지, 도꾜 가가꾸 도진 (Tokyo Kagaku Dojin), 1974 년]. 스핑고지질은 세포 표면층의 한 중요한 성분으로서 동물들에 널리 분포되어 있으며, 세포 항원성, 신호전달, 분화 등의 각종 기능들에 관련하여서 뿐만 아니라 혈액형 물질들에 관련하여서도 많은 주목이 있어 왔다.

엔도글리코세라미데이트 (EC3.2.1.123) 는 스핑고당지질의 당 사슬과 세라미드 사이의 글리코시드 결합을 가수분해하여 완전한 형태의 당 사슬과 세라미드를 유리시키는 효소이다. 세레브로시데이즈와는 달리, 이 효소는 단당류가 세라미드에 결합하여 형성된 세레브로시드에는 작용하지 않는다. 엔도글리코세라미데이즈는 로도콕쿠스 (Rhodococcus) 균주의 방선균 (放線菌)에서 처음 분리되었다 [생물화학저널 (The Journal of Biological Chemistry) 제 261 권, 제 14278 - 14282 페이지 (1986년)]. 로도콕쿠스 균주는 또한 서로 다른 기질 특이성을 갖는 3 종류의 서로 다른 엔도글리코세라미데이즈 (I, Ⅱ, Ⅲ) 를 생성하는 것으로 알려져 있기도 하다 [생물화학저널, 제 264 권, 제 16 호, 제 9510 - 9519 페이지 (1989년)].

그 밖의 알려진 종류의 엔도글리코세라미데이즈에는 거머리 [생화학 및 생물리학 연구소식 (Biochemical and Biophysical Research Communications), 제 141 권, 제 346 - 352 페이지 (1986년)], 지렁이 [생화학 및 생물리학 연구소식, 제 149 권, 제 167 - 172 페이지 (1987년)], 박테리아 [유럽생화학저널 (European Journal of Biochemistry), 제 205 권, 제 729 - 735 페이지 (1992년), 그리고 조개 [FASEB 저널 (The FASEB Journal), 제 8 권, 제 A1439 페이지 (1994년)] 등이 생산하는 엔도글리코세라미데이즈들이 있다.

그러나, 상기의 생산체 생물들을 이용하는 방법에 의해서는 높은 순도로 엔도글리코세라미데이즈를 많은 양 생산하기가 극히 어려웠다. 이것은 상기 생산체들이 생산하는 엔도글리코세라미데이즈의 양이 매우 적고, 글리코시데이즈와 스핑고마이엘리네이즈 등의 기타 공존하는 효소들로 인해 어려운 정제 과정을 필요로 하기 때문이다. 따라서, 적은 비용으로 고도로 순수한 효소를 생산하는 방법이 요구되어 왔다. 각종 생물체들에서의 엔도글리코세라미데이즈의 정제에 관한 보고들이 있었다. 그러나, 엔도글리코세라미데이즈의 아미노산 서열 및 유전자 구조는 아직 해명된 바가 없으며, 그 때문에 유전자공학 기술에 의한상기 효소의 생산이 지연되고 있는 실정이었다.

그러므로, 본 발명의 목적은 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은 상기 DNA 가 삽입된 재조합체를 사용하여 유전자 공학 기술로 고도로 순수한 엔도글리코세라미데이즈를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적들을 달성하기 위해, 본 발명자들은 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 분리하여 그 염기 서열을 밝혀내려는 노력으로 집중적인 연구를 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 완전한 염기 서열을 해명하고 유전자 공학 기술을 사용하여, 간단하면서도 쉬운 방법으로 고도로 순수한 엔도글리코세라미데이즈를 생산하는데에 마침내 성공하였다. 본 발명은 이러한 사실들을 기초로 하여 이루어진 것이다.

한 구현예에서, 본 발명은 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드 또는 기능상 그것과 동등한 변형체 폴리펩티드를 암호화하는 서열이 있는 분리된 DNA 에 관한 것이다. 특히, 상기 분리된 DNA 는 다음의 (a) 내지 (d) 로 이루어져 있는 군에서 선택된 DNA 서열을 포함한다 :

(a) 서열 ID 번호: 1 또는 서열 ID 번호: 3 의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열, 또는 그것의 단편;

(b) 서열 ID 번호: 2 또는 서열 ID 번호: 4 의 DNA 서열, 또는 그것의 단편;

(c) 서열 ID 번호: 1 또는 서열 ID 번호: 3 의 아미노산 서열에서 하나 또는 그이상의 아미노산의 결실, 부가, 삽입 또는 치환의 결과로 생긴 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열, 또는 그것의 단편; 그리고

(d) 상기 (a) 내지 (c) 의 어느 하나와 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 서열.

또 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 DNA를 포함하는 재조합 DNA, 그 재조합 DNA를 포함하는 벡터, 그리고 그 벡터에 의해 형질전환된 원핵생물 또는 진핵생물의 세포에 관한 것이다.

또 하나의 구현예에서는, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드 또는 기능상 그것과 동등한 변형체 폴리펩티드들을 제조하는 방법에 관한 것이다 :

(a) 본 발명의 세포를 배양하는 단계 ; 그리고

(b) 단계 (a) 에서 얻어진 배양물로부터 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드 또는 기능상 그것과 동등한 변형체 폴리펩티드를 회수하는 단계.

또 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조한 또는 본 발명의 분리된 DNA 가 암호화하는 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드 또는 기능상 그것과 동등한 변형체 폴리펩티드들에 관한 것이다.

또 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 DNA 와 특이적으로 하이브리다이즈하는 합성 올리고누클레오티드 탐식자 또는 프라이머에 관한 것이다.

또 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편에 관한 것이다.

본 발명은 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 아미노산 서열과 동 효소를 암호화하는 누클레오티드 서열을 처음으로 해명하였으며, 이에 의해 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 제공하하였다. 본 발명은 또한 유전자 공학 기술을 사용하여, 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 활성이 있는 폴리펩티드를 공업적 규모로 생산하는 방법을 제공한 것이기도 하다.

제 1 도는 pM36H, pM36K 및 pBS1K 에 삽입된 단편들의 제한 효소 지도들과, 각 삽입물들의 위치 그리고 엔도글리코세라미데이즈(EGCase) Ⅱ 를 암호화하는 유전자를 나타낸다.

제 2 도는 플라스미드 pTEG2 의 구축도이다.

제 3 도는 플라스미드 pTEG3 의 구축도이다.

제 4 도는 플라스미드 pTEGP1 의 구축도이다.

여기에 언급되는 엔도글리코세라미데이즈는 스핑고당지질의 당 사슬과 세라미드 사이의 글리코시드 결합을 가수분해하여 완전한 형태의 당 사슬과 세라미드를 유리시키는 효소를 가리키며 각종 생물체들에서 얻어지는 것들을 포함한다. 예를 들면, 로도콕쿠스 균주로부터 3 종류의 서로 다른 엔도글리코세라미데이즈 (엔도글리코세라미데이즈 I, Ⅱ 및 Ⅲ) 가 얻어지는 것으로 알려져 있고, 이것들이 본 발명의 엔도글리코세라미데이즈의 바람직한 예들이다. 엔도글리코세라미데이즈의 활성은, 예를 들면, 생물화학 저널 제 266 권 제 12 호, 제 7919-7926 페이지 (1991년) 에 기술된 방법, 또는 생물화학저널 제 264 권 제 16 호, 제 9510 - 9519 페이지 (1989년) 에 기술된 방법에 의해서 측정될 수가 있다.

본 명세서에 사용되고 있는 바의 "엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드" 라는 용어 (간혹 본 명세서에서는 간단히 "엔도글리코세라미데이즈" 라고 부르기도함) 는 천연의 엔도글리코세라미데이즈의 아미노산 서열을 가지는 것 뿐만아니라 예를 들면, 아미노산(들) 의 결실, 치환, 삽입, 또는 부가에 의한 아미노산 서열의 부분변화에 기인하는 변형체들 까지도, 그것들이 상기한 방법들에 의한 활성 측정시 엔도글리코세라미데이즈 활성을 보여주여 주는 한에는, 포함하는 것이다. 여기에 사용된 "천연의 엔도글리코세라미데이즈" 는 로도콕쿠스 균주에 의해 생산되는 것들을 포함하는 것이지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 또한 그밖의 다른미생물들, 이를테면 다른 방선균들, 박테리아, 효모균, 진균, 자낭진균, 그리고 담자진균 등에서 얻어지는 것들과 식물, 동물, 곤충, 그리고 기타 생물체들에서 얻어지는 것들도 포함된다.

여기에 사용되고 있는 바의 "기능상 동등한 변형체" 라는 용어는 다음과 같이 정의된다 :

자연 발생의 단백질은 그것을 암호화하는 유전자의 다형성 (多形性) 및 변이에 기인하여서 뿐만아니라, 생체내에서 혹은 정제과정 중에 단백질 그 자체의 변형 등에 기인하여 그 자신의 아미노산 서열상의 아미노산 결실, 삽입, 부가, 치환 그리고 기타 변이 등을 겪을 수가 있다. 생리적, 생물학적 활성의 관점에서 무(無)변이 단백질과 실질적으로 동등한 폴리펩티드들이 몇몇 존재하는 것은 잘 알려져 있는 사실이다. 대응하는 단백질과 구조상으로는 다르지만, 기능상의 의미있는 차이가 없는 폴리펩티드를 기능상 동등한 변형체라고 부른다.

단백질의 아미노산 서열에 대해 상기와 같은 변이들을 인위적으로 도입시켜 얻어진 폴리펩티드들에도 마찬가지로 똑같이 적용된다. 그리하여 더욱 다양한 변형체들이 얻어질 수가 있지만, 결과로서 생기는 변형체들은 그 생리적 활성이 원래의 무변이 단백질의 그것과 실질적으로 동등한 한에서는 기능상 동등한 변형체인 것으로 해석된다.

예를들면, 에셔리키아 콜리에서 발현된 단백질의 N-말단의 메티오닌 잔기는 보고에 의하면 메티오닌 아미노펩티데이즈의 작용에 의해 종종 제거되나, 상기 발현되는 단백질 중 어떤 것은 메티오닌 잔기를 갖고 있으며 다른 것은 그렇지 아니하다. 그러나, 메티오닌 잔기의 존재 유무는 대부분의 경우 단백질의 활성에 영향을 미치지 아니한다. 또한 사람 인터루킨 2 (IL-2) 의 아미노산 서열 중의 특정 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 결과로 생긴 폴리펩티드가 IL-2 활성을 유지하고 있다는 사실은 잘 알려져 있는 것이기도 하다 [ 사이언스(Science), 제 224 권, 제 1431 페이지 (1984 년)].

게다가, 유전자 공학에 의한 단백질 제조의 경우, 원하는 단백질은 흔히 융합 단백질 (fused protein) 의 형태로 발현된다. 예를 들면, 원하는 단백질의 발현을 높이기 위한 목적에서 원하는 단백질의 N-말단에 또 다른 단백질-유래의 N-말단 펩티드 사슬을 부가하며, 또는 원하는 단백질의 N-말단 혹은 C-말단에 적당한 펩티드 사슬을 부가하여, 그 단백질을 발현시키고, 부가된 펩티드 사슬에 대해 친화성을 나타내는 캐리어를 사용함으로써 원하는 단백질의 정제가 촉진된다.

또한, 특정 아미노산을 결정짓는 유전자상의 코돈 (3염기의 조합) 에 관해서는, 각 아미노산에 대해 1 종류 내지 6 종류가 존재하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 아미노산 서열에 따라 다르기는 하지만, 한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 갯수는 많을 수가 있다. 사실상, 유전자는 안정된 것이 아니며, 핵산 변이를 겪는 일이 허다하다. 유전자의 변이는 암호화되는 아미노산 서열에 영향을 미치지 아니할 수 있다(침묵성 변이) ; 이 경우에는, 똑같은 아미노산 서열을 암호화하는 다른 유전자가 생성된 것이라고 말할 수가 있다. 심지어는 어떤 특정 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 분리될 때에도, 그것을 함유하고 있는 생물체의 세대진행에 따라 똑같은 아미노산 서열을 암호화하는 여러 가지 유전자들이 생성되는 가능성은 그러므로 무시할 수 없다.

더욱이, 다양한 유전자 공학 기술에 의해 똑같은 아미노산 서열을 암호화하는 여러 유전자들을 인위적으로 만들어 내는 것은 어려운 일이 아니다.

예를 들면, 유전자 공학에 의한 단백질의 제조에 사용되는 호스트에서 원하는 단백질을 암호화하는 천연 유전자의 사용 코돈이 이용도가 낮은 경우, 단백질의 발현량은 간혹 불충분하다. 이 경우, 암호화되는 아미노산 서열은 변하지 않도록 하면서 상기 호스트에서의 이용도가 높은 또 다른 코돈으로 상기 코돈을 인위적으로 바꾸어 주면 원하는 단백질의 발현이 증가된다. 특정 아미노산 서열을 암호화하는 여러 유전자들을 인위적으로 제조하는 일은 물론 가능하다. 그러한 인위적으로 제조된 서로 다른 폴리누클레오티드들은, 여기에 명시된 아미노산 서열을 암호화하는 한에서는, 그러므로 본 발명의 범위에 포함된다.

게다가, 원하는 단백질의 아미노산 서열 중의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 적어도 한 가지 변화, 이를 테면 결실, 부가, 삽입 또는 치환의 결과로 생긴 폴리펩티드는 그 원하는 단백질의 활성과 기능상 동등한 활성을 갖는 것이 일반적이다 ; 그러한 폴리펩티드들을 암호화하는 유전자들도 또한 본 발명의 범위에 포함되며, 천연원(源)에서 분리된 것이든 인위적으로 제조된 것이든 관계없다.

일반적으로, 기능상 동등한 변형체들을 암호화하는 유전자들은 대개가 서로 상동적이다. 본 발명의 유전자와 하이브리다이즈할 수 있고, 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 플리펩티드를 암호화하는 핵산 분자들은 그러므로 본 발명의 범위에 포함하는 것이기도 하다.

로도콕쿠스 균주에서 얻어진 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 와 관련하여 아래에 본 발명을 상세히 기술한다.

먼저, 정제된 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 부분 아미노산 서열에 관한 정보를 얻는다. 구체적으로, 예를 들면 생물화학 저널 제 266 권, 제 12 호, 제 7919-7926 페이지 (1991년) 에 기술된 방법에 의해 정제된 바의 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ를 에드만 분해법 [생물화학 저널, 제 256 권, 제 7990 - 7997 페이지 (1981년)] 으로 처리하여 종래의 방법에 의한 아미노산 서열 분석을 한다. 그러나, 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 N-말단이 차단되어 있기 때문에, 바로 아미노산 서열 분석을 할 수가 없다. 차단된 N-말단 아미노산 잔기를 탈보호화 혹은 방출시킨 후에, 상기 효소를 아미노산 서열분석을 하여 부분 아미노산 서열을 결정한다. 혹은, 특이성이 높은 단백질 가수분해 효소 이를테면 리실엔도펩티데이즈 등의 작용에 의해 상기 효소를 부분적으로 가수분해시킬 수도 있으며, 그 결과로 생기는 펩티드 단편들을 분리, 정제하여 아미노산 서열분석을 거칠 수도 있다. 상기 얻어진 부분 아미노산 서열의 정보를 기초로 하여, 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 유전자를 클론한다. 이 목적을 위해, 통상의 PCR 법 또는 하이브리다이제이션 (hybridization) 법을 이용할 수가 있다.

다음으로, 상기의 부분 아미노산 서열의 정보를 기초로 하여, 서던(Southern) 하이브리다이제이션 탐식자로 사용하기 위한 합성 올리고누클레오티드를 설계한다. 따로, 로도콕쿠스 종 M-777 의 게놈 DNA를 MluI, SalI, PstI 및 BamHI 등의 적당한 제한 효소로 완전히 소화시키고 분리를 위해 아가로오즈 겔 전기영동을 하며 [분자 클로닝, 실험 안내서(Molecular Cloning, A Laboratory Monual) 의 제 6 장, 제 3-20 페이지, 제 2 판, 마니아티스 (T. Maniatis) 등, 콜드 스프링 하버 래버러토리 출판부(1989년)], 분리된 단편들은 종래의 방법으로 나일론막에 블로팅시킨다 [분자 클로닝 실험 안내서의 제 9 장 제 34 페이지, 제 2 판, 마니아티스 등, 콜드 스프링 하버 래버러토리 출판부 (1989년)]. 하이브리다이제이션은 통상의 조건하에서 수행될 수가 있다. 예를 들면, 6 × SSS (1 × SSC 는 물 1L 에 NaCl 8.77g 과 시트르산 나트륨 4.41g을 녹여 제조함), 0.5 % SDS, 5 × 덴하르트 용액 (소 혈청 알부민, 폴리비닐피롤리돈과 피콜을 각각 0.1 % 농도로 함유) 및 100 ㎍/ml 연어 정액 DNA를 함유하는 프리하이브리다이제이션 용액으로 65℃에서 나일론막을 블로킹시키며, ³²P 로 표지된 각각의 합성 올리고뉴클레오티드를 첨가하고, 그 다음에는 65℃에서 밤새 항온배양시킨다. 나일론막을 0.1 % SDS를 함유하는 2 × SSC에서 62℃에서 30분간 씻어낸후, 합성 올리고누클레오티드 탐식자와 하이브리다이즈한 DNA 단편을 찾아내기 위해 방사능사진활영을 한다. 탐지된 밴드에 해당하는 DNA 단편을 겔로부터 추출, 정제한 후, 그 DNA 단편을 통상의 방법에 의해 플라스미드 벡터에 삽입한다. 유용한 플라스미드 벡터들에는 시중 구입가능한 pUC18, pUC19, pUC119 그리고 pTV118N (모두 다까라 슈조의 제품들임) 등이 있으나, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

그 다음에는, 상기 얻어진 재조합 플라스미드를 호스트에 도입하여 그 호스트를 형질 전환시킨다. 유용한 호스트 세포들에는 박테리아 (예를 들면, 에셔리키아 콜리), 바실루스 섭틸리스, 방선균 등의 원핵생물 세포와, 호모균, 진균, 동물, 식물 등의 진핵생물 세포 등이 있다.

호스트가 에셔리키아 콜리인 경우에는, 그것이 형질전환될 수 있고 원하는 유전자를 발현시킬 수 있는 한에는 야생형 균주 또는 변이체 균주일 수 있다. 상기의 플라스미드 도입은 통상의 방법, 이를테면 [분자 클로닝, 실험 안내서, 마니아티스 등, 콜드 스프링 하버 래버러토리 출판부 (1982)년] 에 기술된 방법 등에 의해 달성될 수가 있다.

그 다음에 원하는 DNA 단편을 품고 있는 형질전환체를 선택한다. 이러한 목적을 위해, 플라즈미드 벡터의 특성들이 활용된다. 예를 들면, pUC19 의 경우, 그 속에 도입된 외래 유전자를 갖고 있는 콜로니들은 암피실린-함유 플레이트상에서 암피실린-저항성 콜로니들을 선택하는 방법에 의해, 또는 암피실린, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드 (X-gal) 및 이소프로필-β-D-티오갈락토피라논시드 (IPTG) 를 함유하는 플레이트상에서 백색의 암피실린-저항성 콜로니들을 선택하는 방법에 의해 선택된다.

그 다음에는, 상기 콜로니군 중에서 원하는 DNA 단편이 포함된 벡터를 갖고 있는 콜로니를 선택한다. 이러한 선택은 콜로니하이브리다이제이션 [분자 클로닝, 실험 안내서, 제 2 판, 마니아티스 등, 콜드 스프링 하버 래버러토리 출판부 (1989년) 의 제 1 장, 제 90 - 104 페이지] 이나 플라크 하이브리다이제이션 [분자 클로닝, 실험 안내서, 제 2 판, 마니아티스 등, 콜드 스프링 하버 래버러토리 출판부 (1989년) 의 제 2 장, 제 108 - 117 페이지]을 이용함으로써 달성되며, 벡터의 종류에 따라 적절히 선택한다. PCR 법 [분자 클로닝, 실험 안내서, 제 2 판, 마니아티스 등, 콜드 스프링 하버 래버러토리 출판부 (1989년) 의 제 14 장, 제 15 - 19 페이지] 도 또한 적용가능하다.

일단 원하는 DNA 단편을 함유하고 있는 벡터가 선택되면, 이 벡터속에 삽입된 원하는 DNA 단편의 염기 서열을 통상의 방법, 이를테면 디데옥시 사슬 종결체법 (dideoxy chain terminator method) [분자 클로닝, 실험 안내서, 제 2 판, 마니아티스 등, 콜드 스프링 하버 래버러토리 출판부 (1989년) 의 제 13 장, 제 3 - 10 페이저] 에 의한 방법으로 결정한다. 이렇게 결정된 염기 서열을 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 부분 아미노산 서열, 분자량 등과 비교해서 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 유전자 구조와 완전 아미노산 서열을 알아낸다.

원하는 DNA 단편이 완전한 전체 길이의 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 를 포함하는 것이 아닌 경우에는, 로도콕쿠스 종 M-777 의 게놈 DNA를 다른 제한효소로 소화시켜서, 상기 얻어진 DNA 단편의 일부를 탐식자로 사용, 하이브리다이제이션 등의 방법에 의해 소화물 (digest) 들로부터 빠진 부분을 얻은 다음, 그 빠진 부분을 연결함으로서 전체 길이의 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ를 얻을 수가 있다.

상기 얻어진 바의 결과로서 얻어지는 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 유전자의 전부 또는 일부를 적당한 플라스미드 벡터에 삽입하고, 호스트 세포속으로 형질전환시킨다. 그리하여 얻어진 형진전환체를 통상의 조건하에서 배양하여 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 활성이 있는 폴리펩티드를 생산하게 한다.

예를 들어, 에셔리키아 콜리와 pTV118N을 각각 호스트 세포와 플라스미드 벡터로서 사용하는 경우, 형질전환체를 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 L 배지 (0.1 % 트립톤, 0.05 % 효모 추출액, 0.1 % NaCl, pH 7.2)에서 37 ℃에서 밤새 배양시킨다 ; 600 nm에서 흡광도가 대략 0.5에 도달하면, IPTG를 첨가하고, 37℃에서 4 시간 더 배양시킨다. 그리고 나서, 세포들을 초음파 처리 등에 의해 회수, 분해 및 파괴시켜 세포내에 생산 축적된 원하는 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ를 용해시킨 다음, 원심분리하여 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 무세포 (cell-free) 추출액인 상청액을 얻는다. 경우에 따라서는 발현된 원하는 효소가 봉입체 (封入體) 의 형태로 생산될 수 있다.

유전자 산물의 발현은, 예를 들어, 엔도글리로세라미데이즈 Ⅱ 활성을 측정함으로써 확인될 수가 있다. 재조합체가 예를 들어, 에셔리키아 콜리인 경우, 활성은 재조합체 에셔리카 콜리 추출액을 효소액으로 사용하여, 생물화학 저널 제 266 권 제 12 호, 제 7919-7926 페이지 (1991년) 에 기술된 방법에 따라 측정될 수가 있으며 또는 정제된 아시알로-GMI을 기질로 사용하는 파아크 (Park) 와 존슨 (Johnson) 의 방법에 따라 활성을 측정하고 있는, 생물화학저널 제 264 권 제 16 호 제 9510 - 9519 페이지 (1989 년) 에 기술된 방법에 따라 측정될 수도 있다.

원하는 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 발현을 주목하는 경우에는, 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 발현의 최적 조건을 조사한다.

엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 는 통상의 방법에 의해 형질전환체의 배양물로부터 정제될 수가 있다. 즉, 형질전환체의 세포들을 원심분리에 의해 모으고, 초음파처리 등에 의해 파괴시킨 다음, 원심분리 등을 거치게 하여 세포에서 벗어난 무세포 추출물을 얻고, 그것을 통상의 단백질 정제 방법들, 이를 테면 염석 (鹽析) 그리고 이온 교환 크로마토그라피, 겔 여과 크로마토그라피, 소수성 (硫水性) 크로마토그라피 및 친화성 크로마토그라피 등의 각종 크로마토그라피 등에 의해 정제할 수가 있다. 사용된 호스트-벡터 시스템에 따라, 형질 전환체가 세포외적으로 발현 산물을 분비할 수 있다: 이러한 경우, 상기 기술된 것과 동일한 방식으로 배양 상청액으로부터 산물을 정제할수 있다. 호스트가 에셔리키아 콜리인 경우, 발현 산물은 간혹 불용성의 봉입체로서 형성되기도 한다. 이경우에는, 배양후에 세포들을 원심분리에 의해 모으고, 초음파처리 등에 의해 파괴시킨 다음, 원심분리 등을 거치면 봉입체가 포함된 불용성의 분획물이 분리된다. 그 봉입체들을 씻어 준 후, 통상의 단백질 용해제 이를 테면 요소나 구아니딘 히드로클로리드 등으로 봉입체를 용해시키고, 그 다음에는 이온 교환 크로마토그라피, 겔 여과 크로마토그라피, 소수성 크로마토그라피 그리고 친화성 크로마토그라피 등의 각종 크로마토그라피에 의해 정제할 수가 있으며, 필요하다면, 그 후 투석 (透析) 또는 회석 (稀釋)에 의한 리폴딩 (refolding) 처리를 수행하여 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ을 보유하는 엔도글리코세라미드 Ⅱ 의 제조물을 얻을 수가 있다. 이 제조물은 각종 크로마토그라피에 의해 정제되어 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 활성이 있는 고도의 순수한 제조물을 얻을 수가 있다.

본 발명의 DNA 는 상기 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절 (分節) 이 있는 분리된 DNA 이며, 서열 목록에 나타난 서열 ID 번호 : 1 의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분절이 있는 DNA 가 예시된다. 또한 엔도글리코세라미데이즈 활성 또는 기능상 동등한 활성이 있는 서열 목록에 나타난 서열 ID 번호 : 1 의 아미노산 서열의 일부를 암호화하는 DNA 분절이 있는 DNA 도 예시된다. 그와 같은 DNA 들의 좋은 예들에는 서열목록에 나타난 서열 ID 번호 : 2 의 DNA, 및 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 의 일부 등이 있다.

본 발명에서는, 상기의 DNA 들과 하이브리다이즈하고 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드 또는 기능상 그것과 동등한 변형체 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 도 또한 포함된다. 또한, 본 발명의 유전자들에는 신호 서열을 암호화하는 서열이 있는 유전자 또는 그렇지 않은 유전자들도 있다. 예를 들어, 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 완전한 아미노산 서열 (신호 서열을 포함하는) 은 서열 ID 번호 : 1 에 나타나 있고 : 그것의 DNA 서열은, 서열 ID 번호 2 에 나타나 있다. 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 완전 아미노산 서열 (신호 서열을 포함하지 않는, N 말단으로부터의 서열)은 서열 ID 번호 : 3 에 나타나 있고 ; 그것의 DNA 는, 서열 ID 번호 : 4 에 나타나 있다.

엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 DNA 는 또한 본 발명의 누클레오티드 서열을 이용한 하이브리다이제이션에 의해 다른 세포 유래의 유전자 또는 cDNA 로부터도 얻어질 수가 있다. 이 경우에는, 예를 들면, 다음의 방법이 적용가능하다.

먼저, 원하는 유전자원(源)에서 얻은 염색체 DNA, 혹은 역전사효소 (逆轉寫酵素) 에 의해 mRNA 로부터 제조된 cDNA 를 종래의 방법으로 플라즈미드 벡터나 파아지 벡터에 연결시키고 호스트에 도입하여 도서관을 만든다. 그 다음에는 플레이트상에서 그 도서관을 배양한다 ; 그 결과로 생기는 콜로니 또는 플라크들을 각기 니트로셀룰로오스나 나일론막에 옮기고 변성처리를 하여 DNA가 막에 고정되게 한다. 이 막을 ³²P 등으로 표지된 탐식자 (사용 탐식자는 서열 목록 중의 서열 ID 번호 : 1 또는 서열 ID 번호 3 에 나타난 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 유전자 또는 그 유전자의 일부분일 수 있다 ; 예를 들면, 서열 ID 번호: 2 또는 서열 ID 번호 : 4 에 나타난 유전자 또는 그 유전자의 일부분을 사용할 수가 있다) 를 함유하는 용액에서 항온배양시켜 막 표면의 DNA 와 탐식자간의 하이브리드를 형성시킨다. 예를 들면, DNA가 고정되어 있는 막을 65 ℃ 에서 20 시간 동안 6 x SSC, 1 % SDS, 100 ㎍/ml 연어 정액 DNA 및 5 x 덴하르트 용액을 함유하는 응액 중의 탐식자와 하이브리다이즈시킨다. 하이브리다이제이션 후, 비특이적으로 흡착된 부분을 씻어내고, 그 다음에 방사능사진촬영 등을 하여 탐식자와 하이브리드를 형성한 클론들을 확인한다. 이 과정을 단 하나의 클론만이 하이브리드를 형성하였을 때까지 반복한다. 그리하여 얻어진 클론에는 원하는 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입되어 있다.

그 다음에는 얻어진 유전자의 염기 서열을, 예를들어 다음의 방법으로 결정하여, 얻어진 유전자가 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 원하는 유전자와 동일한 것인지를 확인한다. 재조합체가 에셔리키아 콜리인 경우, 하이브리다이제이션에 의해 얻어진 클론에 대한 염기 서열분석은 에셔리키아 콜리를 시험관 등에서 배양하여, 플라즈미드를 종래의 방법에 의해 추출하고, 추출된 플라즈미드를 제한효소로 소화시켜서, 삽입부분을 분리하고 그것을 M13 파아지 벡터 등에서 서브클로닝 (subcloning) 을 하여 그 염기 서열을 디데옥시법에 의해 결정함으로써 이루어질 수가 있다. 재조합체가 파아지인 경우, 상기 사용된 것과 기본적으로는 동일한 과정을 이용하여 염기서열을 결정할 수가 있다. 배양에서부터 염기 서열분석까지의 기본적인 실험 기술들은 예를 들면 [분자 클로닝, 실험 안내서, 제 2 판, 마니아티스 등, 콜드 스프링 하버 래버러토리 출판부 (1989)] 에 기술되어 있다.

그리하여 얻어진 유전자의 정체가 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 원하는 유전자인지 확인하기 위해서는, 결정된 염기 서열을 본 발명의 엔도글리코세라미데이즈 유전자의 염기 서열 및 서열 목록 중의 서열 ID 번호 : 1 또는 서열 ID 번호 : 3 에 나타난 아미노산 서열과 비교한다.

얻어진 유전자에 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를암호화하는 완전한 부위가 포함되어 있지 아니한 경우, 본 발명의 엔도글리코세라미데이즈 유전자와 하이브리다이즈하는 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 완전한 부위의 염기 서열은 얻어진 유전자로부터 합성 DNA 프라이머를 제조하여, 빠진 부위를 PCR에 의해 증폭시키거나 혹은 얻어진 유전자 단편을 탐식자로 사용하여 DNA 도서관 또는 cDNA 도서관을 스크린함으로써 결정될 수가 있다.

엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드는 다음과 같이 유전자 공학 기술에 의한 방법으로 얻어질 수가 있다 :

먼저, 상기 얻어진 바의 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 통상적인 적당한 호스트 세포,이를테면 에셔리키아 콜리, 바실루스 섭틸리스, 방선균, 효모균, 동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포 등에서 해당 유전자를 발현시킬 수 있는 발현 벡터에 연결시킨 후, 호스트 세포에 도입하여, 재조합체를 수득한다. 이 재조합체를 배향함으로서, 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드가 생산될 수가 있다. 진핵 생물체 유래의 엔도글리코세라미데이즈는 당사슬이 있을 수 있다. 당 사슬 생합성 능력이 없는 세포 예를 들면, 에쇼리키아 콜리, 바실루스 섭틸리스, 방선균 등의 원핵 생물체를 호스트로 사용하거나 또는 당 사슬 생합성 능력을 상실한 변이체 효모균, 진균, 동물, 곤충 또는 식물 세포를 사용함으로써, 엔토글리코세라미데이즈 활성이 있고 당사슬은 존재하지 않는 폴리펩티드가 발현될 수가 있다.

어떤 발현 시스템의 경우, 발현된 엔도글리코세라미데이즈는 불용성의 봉입체 형태로 재조합세포에서 축적된다. 이 경우에는, 온화한 조건하, 예를 들면, 요소를 사용하여 봉입체를 회수, 용해시킨 후, 변성제를 제거하여 효소의 원래 활성을 회복시켜 준다. 발현은 상기한 바의 방법에 의해 엔도글리코세라미데이즈 활성을 측정함으로써 확인될 수가 있다.

엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드는 통상의 크로마토그래피 기술에 의해 재조합체로부터 정제될 수가 있다. 예를 들면, 세포들을 파괴시킨 후 원하는 폴리펩티드를 용해시키는 경우, 상청액을 소수성(疎水性) 상호작용, 이온 교환 또는 겔 여과 크로마토그라피하여 발현된 바의 원하는 폴리펩티드를 얻는다. 원하는 폴리펩티드 가욜용성 형태로 재조합체 내에서 축적되는 경우, 배양 세포들을 파괴시키고, 그후 요소 등의 변성제를 사용하여 침전물을 회수, 용해시킨다. 그리고 나서 변성제를 제거시킨 다음, 리폴딩 (refolding) 처리 및 이어서 상기한 바의 크로마토그라피 처리하여 원하는 활성의 플리펩티드를 얻는다.

본 발명은 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 1 차 구조와 그것의 유전자 구조를 제공한다. 본 발명의 유전자 구조의 해명으로 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드의 유전자 공학에 의한 생산이 가능하게 된다. 유전자 공학 기술을 이용하는 본 발명의 방법에 의해, 엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 고도의 순수한 폴리펩티드 제조물을 적은 비용으로 생산할 수가 있다.

실시예

다음의 실시예들을 본 발명을 구체적으로 설명하는 것이지만 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고 있는 것은 아니다.

실시예 1. 엔도글리코세라미테이트 Ⅱ 구조 유전자의 클로닝

(1) 게놈 DNA의 추출 및 정제

균류학적 펩톤 [옥소이드 (OXOID) 제품], 0.2% NaCl 및 0.1% 효모 추출액을 함유하는 배지 (pH 7.0) 900 ml 에 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 생산체인 로도콕쿠스 종 M-777을 접종하고, 28℃에서 3일간 동안 진탕 배양하였다. 배양의 완결 후, 배양액을 원심분리하였다 ; 세포들을 모았고 10mM 트리스-HCl 및 20mM EDTA를 함유하는 완충액 (pH 8.0) 4.5 ml 에 현탁시킨 다음, 동결, 해동시켰다. 이 세포 현탁액에, 50mM 트리스-HCl, 50mM EDTA 및 4mg/ml 라이소자임을 함유하는 완충액 (pH 8.0) 2.5 ml를 첨가한 다음, 30℃에서 16 시간 동안 항온배양시켰다. 이 혼합물에, 추출 완충액 (50mM 트리스-HCl, 1% SDS, 0.4mg/ml 프로테이네이즈 K, pH 7.5) 10ml를 첨가하고, 50℃에서 16 시간 동안 항온배양시킨 후, 또다른 추출 완충액 10ml를 첨가하고, 16 시간 동안 항온배양시켰다. 그 항온배양 혼합액을 실온까지 냉각되게 한 후, TE 완충액 (10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH8.0) 으로 미리 포화시킨, 같은 부피의 페놀/클로로포름 용액을 첨가하고, 16 시간 동안 부드럽게 회전 진탕한 다음 3,500 rpm에서 30 분간 원심분리하였으며, 그후 상청액을 회수하였다. 이 용액을 5mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액 (pH8.0) 에 대해 투석하여 게놈 DNA 용액을 얻었다.

(2) 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 부분 아미노산 서열분석

먼저 생물화학 저널 제 266 권 제 12 호, 제 7919-7926 페이지 (1991년) 에 기술된 방법에 따라 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ를 정제하였다. 정제된 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 N-말단 아미노산 서열은 N-말단의 차단상태 때문에 에드만 분해법으로는 결정될 수가 없었다.

이러한 발견사실을 유념하여, 내부의 아미노산 서열을 다음과 같이 결정하였다 :

4μ 의 피리딘, 1μl 의 4-비닐피리딘, 1μl 의 트리부틸포스핀 및 5μl 의 증류수를 함유하는 시험관에, 정제된 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 를 함유하는 더 작은 샘플관을 집어 넣었고, 바깥쪽 시험관을 진공 밀봉시킨 다음,100℃에서 5분간 가열하여 기체상에서 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 시스테인 잔기들을 피리딜에틸화시켰다. 이렇게 S-피리딜에틸화된 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 1nmol 샘플을 4M 요소를 함유하는 50μl 의 20mM 트리스 완충액 (pH 9.0) 에 용해시켰다 ; 8 pmol 의 리실엔도펩티데이즈 [피어스(Pierce) 제품)를 첨가한 다음 37℃에서 16시간 동안 소화시켰다. 그 다음에 스마트 (SMART) 시스템 [파마시아 (Pharmacia) 제품]을 사용하여, μRPC C2/18 SC2.1/10 칼럼 (파마시아 제품)을 통해 0.065 % 트리플루오로아세트산 (TFA)을 함유하는 증류수로부터 0.05 % TFA를 함유하는 아세토니트릴까지의 밀도 기울기에 대해 역상 크로마토그래피를 수행하여, 펩티드 단편을 정제하였다.

정제된 펩티드 단편은 모델 477 기체상 펩티드 서열분석장치 [어플라이드 바이오시스템즈 (applied Biosystems) 제품]를 사용, 에드만 분해법에 의해 분석되어 부분 아미노산 서열들 EGC1 (서열 ID 서열 번호 : 5), EGC2(서열 ID 번호 : 6), EGC4 (서열 ID 번호 : 7), EGC5 (서열 ID 번호 : 8), EGC7 (서열 ID 번호 : 9), EGC8 (서열 ID 번호 : 10) 및 EGC11 (서열 ID 번호 : 11) 이 결정되었다.

(3) 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 유전자가 포함된 DNA 단편의 클로닝

위의 실시에 1 (1)에서 준비된 게놈 DNA 30㎍을 제한 효소 MluI, PstI 및 SalI 각각 100U 의 양으로 37℃에서 6 시간 동안 소화시켰다 ; 각 효소 100U 를 더 첨가한 후, 16시간 계속반응시켰다. 이 반응 혼합액 (DNA 5㎍ 에 상당하는 양)을 0.7 % 아가로오즈 겔 전기영동한 다음, DNA를 나일론막 [Hybond-N⁺, 아메샴 (Amersham) 제품] 에 이동시키기 위해 서던블로팅법 [이덴시 겡뀨오 (Idenshi Kenkyuhou) Ⅱ, 제 218 - 221 페이지, 도꾜 가가꾸 도진 (Tokyo Kagaku Dojin) 출판]을 썼다. 이 막은 2 장으로 준비되었다.

사용된 하이브리다이제이션 탐식자는 실시예 1 (2)에서 결정된 부분 아니모산 서열 EGCl 을 기초로 하여 합성된 합성 올리고누클레오티드들 EGIH1 (서열 ID 번호 : 12)과 EGIH 2 (서열 ID 번호 : 13) 였다. MEGARABEL^TM [다까라 슈조 (Takara Shuzo) 제품]을 사용, 상기의 합성 올리고누클레오티드 각 pmol을 ³²P로 표지시켜 표지 탐식자를 얻었다. 상기 준비된 2 장의 막 각각은 6 × SSC (1 × SSC 는 물 1L 내의 NaCl 8.77g 과 시트르산 나트륨 4.41g 의 수용액임), 0.5 % SDS, 100㎍/ml 태평양 청어 정액 DNA 및 5 × 덴하르트 용액 (소 혈청 알부민, 폴리비닐피롤리돈 및 피콜을 각각 0.1 % 함유)을 함유하는 용액으로 65 ℃에서 5 시간 동안 프리하이브리다이즈시킨 다음, 각각의 표지 탐식자를 0.5 pmol/ml의 농도로 첨가하고 65℃에서 밤새 하이브리다이즈시켰다. 그리고나서 각각의 막을 6 × SSC로 실온에서 10 분간, 2 × SSC 및 0.1% SDS 로 실온에서 10분간, 그리고 0.2 × SSC 및 0.1% SDS 로 62℃에서 30분간 씻어주었다 : 과량의 용액을 제거한 후, 각각의 필터를 이미징 플레이트 (후지포토필름 제품) 에 3 시간 노출시켰으며, BAS2000 이미지 분석장치 (후지포토필름 제품)를 사용, 이미지를 탐지하였다.

그 결과, (탐식자로서 사용된) 합성 올리고누클레오티드 EGIH1 과 하이브리다이즈한 밴드가 MluI 소화의 경우 약 4.4 kbp 에 해당하는 위치에서, PstI 소화의 경우 약 1.9kbp, 그리고 SalI 소화의 경우 약 1.2kbp 에 해당하는 위치들에서 나타났다. 또한, 합성 올리고누클레오티드 EGIH2 와 하이브리다이즈한 다수의 비특이적 밴드들도 탐지되었으며, 뿐만아니라 합성 올리고누클레오티드 EGIH1 의 경우에도 탐지되었다. 이러한 사실을 유념하여, 이후의 실험들에는 MluI 소화물을 이용하였다.

제한효소 HincⅡ 에 의한 pUC19 (다까라슈조 제품) 의 소화물에, 인산화 MluI 링커 (다까라 슈조 제품)를 삽입, 결찰시켜, MluI 부위가 새로 도입된 플라스미드를 구축하였으며, pUC19M 으로 명명하였다. 제한 효소 MluI 20㎍ 으로 소화시킨 게놈 DNA를 0.7 % 아가로오즈겔 전기영동하였다 ; 상기의 하이브리다이제이션에서 나타난 밴드에 해당하는 아가 부분을 잘라내었으며 EASYTRAP^TM (다까라 슈조 제품)을 사용하여 추출, 정제하였다 ; 그 결과로 얻어진 DNA 단편을 제한효소 MluI을 사용하여 pUC19M 소화물에 삽입, 결찰시켰다.

이 플라스미드로 에셔리키아 콜리 JM109를 형질전환시킨 후, 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 L-아가 배지를 함유하는 직경 8.5cm 의 5 원형 페트리디쉬 상에서 배양하여 디쉬당 200개 내지 1,000 개의 콜로니가 형성되게 하였다. 이들 디쉬들로부터 500 개의 콜로니들을 선택하여 같은 배지의 플레이트상에 있는 나일론막 (Hybond-N⁺, 아메샴 제품) 에 이동시켰다. 이 나일론막을 37℃에서 3시간 항온배양시킨 후, 0.5M NaoH 및 1.5M NaCl을 함유하는 용액에 함침된 필터 페이퍼 상에 5 분간 (변성), 그리고 0.5M 트리스-HCl 완충액 (pH7.0) 및 3M NaCl을 함유하는 용액에 함침된 필터 페이퍼 상에 5 분간 (중화) 놓은 다음, 2×SSC 로 씻어주었다. 이 나일론막과 탐식자로서의 합성 올리고누클레오티드 EGIH1 (서열 ID 번호 : 12)을 사용하여, 상기한 조건과 똑같은 조건하에서 하이브리다이제이션을 수행하였다 ; 양성 시그널이 있는 2 개의 클론들이 얻어졌다. 이들 에셔리카아 콜리 JM109 클론들을 각각 1-25 및 3-6 으로 명명하였다. 이들 클론들로부터, 알칼리 분해법 (alkali lysis method) [분자 클로닝 : 실험안내서, 제 2 판, 마이나티스등 편집, 제 1 장, 제 25 - 28 페이지, 콜드 스프링 하버래버러토리, 1989년] 에 의해 플라스미드 DNA 들을 분리, 정제하였으며, 각각 pEGCM125 및 pEGCM36 으로 명명하였다. 이것들을 몇가지의 제한효소 (MluI, EcoRI, HindⅢ) 로 소화시켰고 전기영동하여 절단패턴을 분석하였다. 그 결과, pEGCM125 는 2 개의 MluI 삽입물들을 갖는 것으로 밝혀졌다.

이러한 발견사실을 유념하여 이후의 실험에는 pEGCM36을 이용하였다.

24 종류의 제한효소를 사용하여 pEGCM36을 소화시켰고, 전기 영동하여 절단 패턴을 분석하였다. 또한, 상기한 바의 서던 블로팅법으로 콜로니들을 나일론막 (Hybond-N⁺, 아메샴 제품) 에 이동시킨 다음, 상기한 조건과 똑같은 조건하에서 합성 누클레오티드 EGIH1 (서열 ID 번호 : 12)을 탐식자로 사용하여 하이브리다이즈시켰다. 탐식자와 하이브리다이즈한 밴드들 중, 제한 효소 HincⅡ 에 의한 소화로 얻어진 약 1kbp DNA 단편과 제한효소 KpnI 에 의한 소화로 얻어진 약 1.1 kbp DNA 단편을 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제하여 각각 pUC19 의 HincⅡ 제한부위 또는 KpnI 제한부위 내로 서브클로닝시켰다. 그 결과로 얻어지는 플라스미드들은 각각 pM36H 및 pM36K 로 명명되었다. 이들 플라스미드들을 적당한 제한 효소 (PstI, SphI, SmaI / NaeI) 로 더 소화시키고 DNA 결찰 키트 (다까라 슈조 제품)를 사용하여 자가-결찰 (self -ligation) 시켜, 여러 가지의 결실 변이체 (deletion variation) 들을 얻었다.

이들 결실 변이체들과 pM36H, pM36K 및 pEGCM 36 의 염기 서열들은 디데옥시 사슬 종결체법 (분자 클로닝 : 실험 안내서, 제 2 판, 마니아티스 등 편집, 제 13 장, 제 3-10 페이지, 콜드 스프링 하버 래버러토리, 1989 년) 에 의해 그 말단으로부터 결정되었다; pM36H 삽입물과 pM36K 삽입물은 pEGCM36 삽입물의 한쪽 말단에서 서로 겹친다는 사실이 밝혀졌다. 또한 부분 아미노산 서열들 EGC1 (서열 ID 번호 : 5), EGC2 (서열 ID 번호 : 6), EGC4 (서열 ID 번호 : 7), EGC5 (서열 ID : 8), EGC8 (서열 ID 번호 : 10) 및 EGC11 (서열 ID 번호 : 11)을 암호화하는 염기 서염들을 동일한 틀 상에 존재하며, 신호 펩티드-유사 서열을 암호화하는 DNA 서열은 상기 틀의 앞쪽에 (upstream) 존재한다는 사실도 밝혀졌다.

그러나, 여기서 결정된 염기 서열들중 어느 것도 부분 아미노산 서열 EGC7 (서열 ID 번호 : 9)을 암호화하는 어떠한 염기 서열도 갖고 있지 않았으며, 또는 부분 아미노산 서열들 EGC1, EGC2, EGC4, EGC5, EGC8 및 EGC11을 암호화하는 틀의 아래쪽에서 어떠한 종결 코돈 (stop codon) 도 존재하지 않았다.

(4) 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 C - 말단 부위를 암호화하는 유전자가 포함된 DNA 단편의 클로닝

엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 유전자의 완전한 길이에 맞추기 위한 목적에서, pEGCM36 에는 없는 C - 말단 근접 부위를 암호화하는 DNA 단편을 스크린하기 위해 위의 실시예 1 (3) 에서와 똑같은 방법으로 서던 하이브리다이제이션법을 수행하였다. 사용된 탐식자는 pM36K 의 HincⅡ 소화에 의한 얻어지는 약 200 bp 단편이었으며, C-말단에 가장 가까운 DNA 서열을 포함하고 있다. 구체적으로 pM36K를 HincⅡ 로 소화시키고 1 % 아가로오즈 겔 전기영동하였다 ; 그 결과를 생기는 약 200 bp DNA 단편을 잘라 내었다.

이 HincⅡ 소화물 단편을 SpinBind^TM (다까라 슈조 제품)를 사용하여 추출, 정제하였다; 그 결과로 얻어지는 정제된 DNA 단편을 BcaBEST^TM 표지 키드 (다까라 슈조 제품)를 사용, ³²P 로 표지시켜 표지된 탐식자를 얻었다. 위의 실시예 1 (1)에서 준비된 게놈 DNA 50 ㎍을 제한효소 BamHI, PStI 및 HincⅡ 각각 180 U 로 37 ℃에서 6 시간 소화시켰다. 이 반응 혼합액으로부터, 10 ㎍ 의 DNA 에 상당하는 양에서, 위의 실시예 1 (3) 에서와 똑같은 방법으로 막을 준비하였다. 각각의 막은 6 x SSC (1 x SSC 는 물 1L 내의 NaCl 8.77 g과 시트르산 나트륨 4.41 g의 수용액임), 0.5 % SDS, 100 ㎍ / ml 태평양 청어 정액 DNA 및 5 x 덴하르트 용액 (소혈청 알부민, 폴리비닐피롤리돈 및 피콜을 각각 0.1 % 농도로 함유)을 함유하는 용액으로 68 ℃에서 3 시간 동안 프리하이 브리다이즈시킨 후, 표지 탐시자를 0.1 pmol/ml 의 농도로 첨가해 준 다음, 68 ℃에서 밤새 하이브리다이즈시켰다. 그리고나서 각각의 필터를 6 × SSC 로 실온에서 10 분간, 2 × SSC 및 0.1% SDC 로 실온에서 10분간, 그리고 0.2 × SSC 및 0.1% SDS 로 70℃에서 30분간 씻어주었다 : 과량의 용액을 제거한 후, 각각의 필터를 이미징 플레이트 (후지포토필름 제품)에 10 시간 노출시켰으며, BAS2000 이미지 분석장치 (후지포토필름 제품)를 사용, 이미지를 탐지하였다.

그 결과, 탐식자와 하이브리다이즈한 밴드가 BamHI 소화의 경우 약 2.7kbp 에 해당하는 위치에서, PstI 소화의 경우 약 1.3kbp, HincⅡ 소화의 경우 약0.3kbp 에 해당하는 위치들에서 나타났다. BamHI 20㎍ 으로 소화시킨 게놈 DNA를 0.7% 아가로오즈 겔 전기영동하였다 ; 상기의 하이브리다이제이션에서 약 2.7kbp 에서 나타난 밴드에 해당하는 아가 부분을 잘라내었으며 EASYTRAP^TM (다까라 슈조 제품)을 사용하여 추출, 정제하였다 ; 그 결과로 얻어진 DNA 단편을 pUC19 의 BamHI 제한부위에 삽입시켰다.

이 플라스미드로 에셔리키아 콜리 JM109를 형질전환시킨 후, 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 L-아가 배지를 함유하는 직경 8.5cm의 10 원형 페트리디쉬 상에서 배양하여 디쉬당 200개 내지 1,000 개의 콜로니가 형성되게 하였다. 이들 디쉬들로부터 500 개의 콜로니들을 선택하여 같은 배지의 플레이트상에 있는 나일론막 (Hybond-N⁺, 아메샴 제품) 에 이동시켰다. 이 나일론막을 37℃에서 10시간 항온배양시킨 후, 0.5M NaoH 및 1.5M NaCl을 함유하는 용액에 함침된 필터 페이퍼 상에 5 분간 (변성), 그리고 0.5M 트리스-HCl 완충액 (pH7.0) 및 3M NaCl을 함유하는 용액에 함침된 필터 페이퍼 상에 5 분간 (중화) 놓은 다음, 2×SSC 로 씻어주었다. 이 나일론막과 탐식자로서의 pM36K 의 약 200bp HincⅡ 단편을 사용하여, 상기와 동일한 방식으로 상기한 조건과 똑같은 조건하에서 하이브리다이제이션을 수행하였다 ; 양성 시그널이 있는 1 개의 클론들의 얻어졌다. 이 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 분해법으로 제조하였으며 pEGCB20 으로 명명되었다.

이 클론을 여러 가지의 제한효소 (BamHI, EcoRI, HincⅡ, HindⅢ, KpnI, PstI, SacI, SalI SmaI, SphI, XbaI)로 소화시키고 전기영동하여 절단 패턴을 분석하였다. 또한, 상기한 바의 서던 블로팅법으로 콜로니들을 나일론막 (Hybond-N⁺, 아메샴 제품) 에 이동시킨 다음, 상기한 조건과 똑같은 조건하에서 pM36K 의 약 200bp HincⅡ 단편을 탐식자로 사용하여 하이브리다이즈시켰다. 탐식자와 하이브리다이즈한 밴드들 중, 제한 효소 SphI 에 의한 소화로 얻어진 약 1Kbp DNA 단편을 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제하여 pUC19 의 SphI 제한부위 속으로 서브클로닝시켰다; 그 결과로 얻어지는 플라스미드는 pBS1K 로 명명되었다. 이플라스미드를 적당한 제한효소 (MluI, NaeI, SphI) 로 더 소화시키고 서브클로닝하였다.

이들 서브클론들과 pBS1k 의 염기 서열들은 디데옥시법에 의해 그 말단으로부터 결정되었다. 그 결과, 부분 아미노산 서열 EGC7 (서열 ID 번호 : 9)을 암호화하는 염기 서열과 함께, pM36K 의 약 200bp HincⅡ 단편의 염기 서열이 나타났다. 더욱이, 위의 실시예 1 (3)에서 결정된 pEGCM36 의 MluI 삽입물과 pEGB20 의 BamHI 삽입물 사이의 부위에 걸쳐서 1473bp 의 전사해독틀 (ORF) 이 발견되었다. 이 ORF 내에서, 위의 실시예 1(2)에서 결정된 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 아미노산 서열들을 암호화하는 모든 누클레오티드 서열들이 발견되었다.

상기의 결과들을 기초로하여, 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 유전자의 완전한 염기 서열 및 1 차 구조가 결정되었다. 그 결과들은 표 1 에 주어져 pM36H, pM36K 및 pBS1K 삽입물들의 제한효소 지도와 이들 삽입물들 및 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 유전자의 위치가 나타나 있다. 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 유전자의 ORF 의 염기서열 한 예가 서열 목록 중의 서열 ID 번호 : 2 에 나타나 있다. 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 아미노산서열은 서열 목록 중의 서열 ID 번호 : 1에 나타나 있다. 서열 목록 중의 서열 ID 번호: 1 과 서열 ID 번호 : 2에서 알 수 있는 바와 같이, 엔도글리코세라미데이즈 유전자에서 개시 코돈에 해당하는 염기서열은 GTG 이다.

실시예 2 : 엔도글리코세라미테이즈 Ⅱ 의 발현을 위한 플라스미드의 구축

에셔리키아 콜리에서의 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 발현을 위한 플라스미드는, 2 개 부위로 존재하는 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 구조 유전자를 실시예 1 에서 얻어진 바와 같이 pEGCM36 및 pEGCB20 으로부터 분리하고, 상기 유전자의 에셔리키아 콜리 내 발현에 적당한 플라스미드에 상기 유전자를 결찰시키고, 그리고 상기 결찰 산물을 에셔리키아 콜리 세포내로 도입함으로써 구축되었다. 똑같은 원리가 다른 호스트 세포에도 적용된다 ; 임의의 선택된 호스트 세포 내에서의 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 발현을 위한 플라스미드는, 2 개 부위로 존재하는 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 구조 유전자를 pEGCM36 및 pEGCB20 으로부터 분리하고, 상기 유전자의 호스트 세포내 발현에 적합한 플라스미드에 상기 유전자를 결찰시키고, 그리고 상기 결찰 산물을 호스트 세포내로 도입함으로써 구성될 수 있다.

먼저, pEGCM36을 제한 효소 AccⅢ 로 소화시킨 후, DNA 블런팅키트 (다까라 슈조 제품)를 사용하여, 말단-평탄화 (terminal-blunting)시키고, 이어서 제한 효소 MluI 으로 추가적으로 소화시켰다. 그리고 나서, 이를 아가로오즈 겔 전기영동하였으며, 약 1 kbp EGCM36-AccⅢ/MluI 단편을 얻기 위해 상기 겔로부터의 추출 및 정제를 수행하였다. 이와는 별도로, 실시예 1 에서 서브클로닝에 의해 pEGCB20 으로부터 얻어진 pBS1K를 제한 효소 MluI 및 SphI 으로 소화시켜 아가로오즈 전기영동하였으며, 그 후 약 500 bp BS1K-Mlu/SphI 을 절단하여 추출하였다. 이러한 EGCM36-AccⅢ/MluI 및 BS1k-Mlu/SphI 단편을 pTV118N (다까라 슈조 제품) 에 동시에 결찰시키고 삽입하여, pTEG2 를 얻었다. 이때, 상기 pTV118N은 미리 제한효소 EcoRI 으로 소화되고, 말단-평활화되며, 그리고 제한효소 SphI 으로 추가적으로 소화된다 (제 2 도).

이러한 플라스미드는 신호 - 유사 서열이 없으며, 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ를 암호화하는 영역의 N - 말단면의 상류 방향에 LacZα - 유래 펩티드를 포함하는 6 아미노산 잔기 (서열 ID 번호 : 14)를 암호화하는 서열을 포함하기 때문에, lacZα 과의 융합 복합체로 엔도글리코라미데이즈 Ⅱ 의 발현이, lacZ 의 개시코돈 및 SD 서열을 사용함으로써 유도될 수 있을 것으로 예상된다.

비슷하게, EGCM36 - AccⅢ/MluI 및 BS1k - MluI/SphI 단편을 동시에 pTVⅡSN (Takara shuzo 에 의해 생산됨) 에 결찰시키고 삽입하여 pTEG3를 수득하였다. 이때 상기 pTUⅡ18N은 미리 제한효소 SaⅡ 으로 소화되고, 말단-평활화되며, 그리고 제한효소 SphI 으로 추가적으로 소화된다 (제 3 도). 이러한 플라스미드는 신호 - 유사 서열이 없으며, 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ를 암호화하는 영역의 N-말단면의 상류 방향에 lacZα - 유래 펩티드를 포함하는 18 아미노산 잔기 (서열 ID 번호 : 15)를 암호화하는 서열을 포함한다.

신호 - 유사 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 구축하였다.

실시예 1에서 수득한 pM36H를 제한효소 AccⅢ 및 PmaCI 으로 소화시키고, 아가로즈 겔 전기 영동을 수행한 후, 약 90bp M36H-AccⅢ-PmaCI 단편을 얻기 위해 상기 겔로부터의 추출 및 정제를 수행하였다.

또한, 상기 기술한 pTEG2를 제한효소 AccⅢ 및 HindⅢ 로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동을 수행한 후, 약 1.6kpp TEG2 - AccⅢ/HindⅢ 단편을 얻기 위해 상기 겔로부터의 추측 및 정제를 수행하였다. 이러한 M36H - AccⅢ/PmaCI 및 TEG2-AccⅢ/HindⅢ 단편을 동시에 pTV118N 에 결찰시키고 삽입하여, pTEGP1을 수득하였다. 이때, 상기 pTV118N은 미리 제한효소 PstI 으로 소화되고, 말단-평활화되며, 그리고 제한효소 HIndⅢ 로 추가적으로 소화된다 (제 4 도).

호스트로 에세리키아 콜리를 이러한 플라스미드로 형질 전환시켜 재조합체를 수득하였다.

각각 pTEG2, pTEG3 및 pTEGP1가 혼입된 에세리키아 콜리 JM109 균주를, 각각 에세리키아 콜리 JM109/pTEG2, 에세리키아 콜리 JM109/pTEG3 및 에세리키아 콜리 JM109/pTEGP1 으로 표시하였다. 이들 균주 중에서, 에세리키아 콜리 JM109/pTEGP1을 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP-5530 으로 수탁하였다.

실시예 3. 에세리키아 콜리 내에서 재조합 엔도글리코세라미테이즈 Ⅱ 의 발현

실시예 2에서 수득한 에세리키아 콜리 JM109/pTEG2, 에세리키아 콜리 JM109/pTEG3 및 에세리키아 콜리 JM109/pTEGP1 을 각각 100㎍/ml 암피실린을 포함하는 L 배지 (0.1 % 트립톤, 0.05 % 효모추출물, 0.1% NaCl, pH7.2) 5 ml 에 접종하고, 37℃에서 밤새 진탕 배양시켰다 ; 배양액 100μl를 동일한 배지 120μl 내로 옮겼다. 37℃에서 밤새 진탕 배양후에 약 0.5 의 혼탁도 (600 nm에서 흡광도) 에 도달하였을 때, IPTG를 최종농도가 1mM이 되도록 첨가한 후, 37℃에서 4 시간 동안 진탕배양하였다. 배양이 완결된 후에, 배양액을 원심분리하였으며 ; 세포를 수집하고, 0.5mM 4-(아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 히드로클로라이드를 함유하는 10mM 트리스 - HCl 버퍼 (pH8.0) 3ml 내에서 현탁시키고, 초음파로 분쇄한 후, 원심분리하였다 ; 결과로 얻어지는 상층액을 조 효소 용액으로 사용하기 위해 수집하였다.

이러한 조 효소 용액의 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 의 활성은, 기질로서 정제된 아시알로-GM1을 사용하는, 문헌 "The Journal of Biochemistry, Vol. 264, No. 16, pp 9510 ∼ 9519 (1989)" 에 기술된 파아크 및 존슨 (Park and Johnson)의 방법을 통해 결정하였다. 50mM 소듐아세테이트 버퍼(pH5.5) 50μl 내의 50nmol 정제 아시알로 - GM1, 10㎍ 의 소혈청 알부민 및 적당한 양의 효소 및 트리톤 X-100의 반응 혼합 용액을 37℃ 에서, 15분간 항온배양시켰다. 상기 반응을 카보네이트 - 시아니드 용액 (pH11) 250μl을 첨가하여 마무리지었다. 그 다음, 결과로 얻어지는 환원당을 파아크 및 존슨 방법 [Journal of Biological Chemistry, Vol. 181, pp 149 - 151 (1949)]을 통해 정량하였다. 대조군을 위해, 기질 용액을 37℃에서 15분간 항온배양시킨 후, 알칼리 용액을 첨가하고, 이어서 효소를 첨가하였다. 효소 1 단위는, 상기 기술한 조건하에서 1 분당 정제 아시알로-GM1 으로부터 글루코스 1μ 몰의 방출을 촉매할 수 있는 효소의 양으로 정의된다.

결과적으로, 이러한 상청액 내의 활성은, 에세리키아 콜리 JM109/pTEG2 에 대해서는 약 19 mU/ml, 에세리키아 콜리 JM109/pTEG3 에 대해서는 약 244 mU/ml 및 에세리키아 콜리 JM109/pTEGP1 에 대해서는 약 15mU/ml 인 것으로 결정되었다. 다시 말해서, 에세리키아 콜리 JM109/pTEG2 배양액 1 리터로부터는 재조합 엔도글리코세라미데이즈 Ⅱ 약 0.5U 을, 에세리키아 콜리 JM109/pTEG3 배양액으로부터는 약 6.1U 을, 그리고 에세리키아 콜리 JM109/pTEG1 배양액으로부터는 약 0.4U을 얻을 수 있음이 밝혀졌다.

본 기술분야의 당업자에게 명백한 본 발명의 상기 기술된 실시예들의 다른 변형도 다음의 청구범위 내인 것으로 여겨진다.

제 1 도는 pM36H, pM36K 및 pBS1K 에 삽입된 단편들의 제한 효소 지도들과, 각 삽입물들의 위치 그리고 엔도글리코세라미데이즈(EGCase)Ⅱ를 암호화하는 유전자를 나타낸 것이다.

제 2 도는 플라스미드 pTEG2 의 구축도이다.

제 3 도는 플라스미드 pTEG3 의 구축도이다.

제 4 도는 플라스미드 pTEGP1 의 구축도이다.

Claims

엔도글리코세라미데이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 갖으며, (a) 또는 (b)의 DNA 서열을 갖는 분리된 DNA:

(a) 서열 ID 번호: 1 또는 서열 ID 번호: 3의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열; 또는

(b) 서열 ID 번호: 2 또는 서열 ID 번호: 4의 DNA 서열.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 로도콕쿠스 속의 균주에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 로도콕쿠스 종 M-777 에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA.
제 1 항의 분리된 DNA 을 포함하는 재조합 DNA.
제 4 항의 재조합 DNA를 포함하는 벡터.
제 5 항에 있어서, 상기의 재조합 DNA 는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 5 항 또는 제 6 항의 벡터에 의해 형질전환된 원핵생물 또는 진핵생물의 세포.
엔도글리코세라미데이즈 활성이 있는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법:

(i) 제 7 항의 세포를 배양하는 단계; 그리고

(ii) (a) 또는 (b) 의 DNA 서열에 의해 암호화되는 엔도글리코세라미데이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 회수하는 단계:

(a) 서열 ID 번호: 1 또는 서열 ID 번호: 3 의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열; 또는

(b) 서열 ID 번호: 2 또는 서열 ID 번호: 4 의 DNA 서열.
제 8 항의 방법에 의해 생산되거나 또는 제 1 항의 분리된 DNA에 의해 암호화되는 엔도글리코세라미데이즈 활성을 갖고, 하기 (a) 또는 (b)의 DNA 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드.

(a) 서열 ID 번호: 1 또는 서열 ID 번호: 3의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열; 또는

(b) 서열 ID 번호: 2 또는 서열 ID 번호: 4의 DNA 서열.
서열 ID 번호 : 12의 DNA 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오타이드 탐식자.